Memoire Online - Evaluation in vitro des propriétés antifalcémiantes et antihémolytiques de l'extrait aqueux de spirulina platensis (oscillatoriaceae) du Cameroun

M . T C H O U L E G H E U F r a n ç o i s E m i l e e t M m e T C H O U L E G H E U Jeannette

L a réalisation d e c e t r a v a i l n ' a u r a i t p a s été possible sans l'aide d e plusieurs personnes à qui j'adresse mes sincères rem e r c i e m e n t s .

+ l e P r . M O U N D I P A FEW O U Paul, Chef d e D é p a r t e m e n t d e Biochimie e t tous les

enseignants, pour l ' e n c a d r e m e n t e t l e s enseignements d e qualité reçus p e n d a n t m a formation ;

+ l e P r . P I E M E Constant Anatole pour m'avoir intégré dans l e Laboratoire d e

Biochimie d e l a Faculté d e M é d e c i n e e t des Sciences B i o m é d i c a l e s , d ' a v o i r accepté d e diriger c e travail, pour s a rigueur scientifique, ses conseils, s a disponibilité, son enthousiasme, s a patience e t son attention apportées à m e s s o l l i c i t a t io n s p e n d a n t c e t r a v a i l , t r o u v e z i c i p r o f e s s e u r l'expression d e m a profonde gratitude ;

+ l e P r . B I A P A N Y A Prospère pour son e n c o u r a g e m e n t e t son expertise apporté pour

+ l e D r . K O TUE T A P T U E Charles e t l e D r . G U E G U I M Cédric d e m'avoir orienté

chez u n encadreur b i e n v e i l l a n t , p a s s i o n n é par l a recherche, par u n t r a v a i l p o i n t i l l e u x e t aussi pour leurs e n c o u r a g e m e n t s quotidien tout a u long d e c e travail ;

+ l e D r . C H E T C H A Bernard pour avoir facilité mon autorisation administrative d e

recherche a u service d ' H é m a t o - O n c o l o g i e d e l ' H ô p i t a l C e n t r a l d e Yaoundé ;

+ l e personnel d u Laboratoire d e Biochimie d e l a Faculté d e M é d e c i n e e t des Sciences

B i o m é d i c a l e s d e l'Université d e Yaoundé 1 dans lequel l'ensemble d e nos tests a été effectué ;

+ tous mes aînés d e laboratoire principalement, N Y A N K W I K E U Prudence,

Y E M BEAU L é n a Natacha, K E N G N E F O T S I N G Christian, T C H O U P O Arnaud, F E U D J I O A l f l o d i t t e Flore, N A N F A C K Pauline, N GONG A N G B e a t r i c e , dont les conseils, les critiques e t les e n c o u r a g e m e n t s m ' o n t é t é d'une aide précieuse ;

+ tous mes camarades d e promotion, merci pour votre solidarité e t votre contribution à

M e s sincères rem e r c i e m e n t s e t gratitudes vont é g a l e m e n t à l'endroit d e :

+ mes parents pour l ' é d u c a t i o n , l e s e n c o u r a g e m e n t s , l e soutien quotidien d e toute nature

+ m e s a î n é s S A N K O T C H O U L E G H E U C h i m è n e , W E P E Y O U T C H O U L E G H E U Willy, T C H A M D J O U T C H O U L E G H E U Hermance, TATA T C H O U L E G H E U H y p p o l i t e , N O U B E Y O U T C H O U L E G H E U G a ë l l e , K A M D O U M T C H O U L E G H E U Prince, N G U E U D J I T C H O U L E G H E U V a l è r e , qui ont toujours été l à pour m e soutenir

f i n a n c i è r e m e n t e t m a t é r i e l l e m e n t , m ' encourager dans les moments les plus difficiles q u i f u r e n t pour m o i l e s gages d e réussite ;

+ mes t a n t e s M m e N G A M E N I E v o d i n e , T A P O K O Angèle p o u r l ' a m o u r , l e soutien e t

+ l a famille G O Y A P Roger e t l a f a m i l l e K A M P C H I M i c h e l , p o u r l ' a c c u e i l c h a l e u r e u x ,

l e soutien qu'elle m ' a accordé d e m a p r e m i è r e année à l'Université jusqu'à nos jours ;

+ l a grande f a m i l l e T C H O U L E G H E U , K E M ENI, N D J I L E pour l e soutien d e tous les

+ mes amis S I E W E T C H I E N C H E U Rosine, N G O U A M O U D J O N G O U Stafford, L E U S S I Franck, Y E M BEAU Sylvie, N O U D J A T C H E U B I A W A S t è v e , T A D I E U Christian, C H U I S S E U Hans, D A D E W O U Paul, D J U I K O U Aim é r a n c e , D O U A N G U E Stéphanie, K O N L A C K O r n e l l a , Z O A Thierry Alexis, F A A B E C O Isaac, N G A M E N I Adrien, N K E N M ENI Célestin qui ont toujours été l à pour m e soutenir e t m'encourager dans les moments difficiles ;

+ tous les patients d r é p a n o c y t a i r e s d u service d ' H é m a t o - O n c o l o g i e d e l ' H ô p i t a l C e n t r a le

d e Yaoundé pour l e don d e sang u t i l i s é p o u r l a réalisation d e c e travail ;

+ tout l e personnel d u service d ' H é m a t o - Oncologie d e l'Hôpital Central d e Y a o u n d é pour

leur e n c o u r a g e m e n t e t assistance pour les p r é l è v e m e n t s d e nos échantillons

+ tous ceux dont les noms n e figurent pas ici e t qui ont d'une manière o u d'une autre

contribué à l a réalisation d e c e travail, veuillez accepter mes sincères excuses e t toute m a reconnaissance e n votre égard;

I .1 .1 . D é f i n it i o n e t historique d e la d r é p a n o c y t o s e 4

I .1 .3 . E p i d é m i o l o g i e e t étiologie d e l a d r é p a n o c y t o s e 8

I .2 .1 . Fonction des globules rouges e t rôle d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e 1 8

I I .3 .2 . Collecte des échantillons d e sang chez les sujets d r é p a n o c y t a i r e s 2 9

I I .3 .3 . Evaluation i n vitro des propriétés a n t i f a l c é m ia n t e s d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a

I I .3 .4 . Evaluation i n vitro d e l'activité a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a

I I .4 . A N A L Y S E S STATISTIQUES E T EXPRESSION DES R E S U L T A T S 3 5

I I I .1 .2 . Effet d e L ' extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s à différentes concentrations sur l a

Figure 1 : Distribution historique e t c o n t e m p o r a i n e d e la d r e p a n o c y t o s e 9

Figure 3 : Schéma physiopathologique d e l a d r é p a n o c y t o s e 1 2

Figure 4 : E c h a n g e s d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e . 2 0

F i g u r e 5 : Photographie d e l a ferme d e production d e spiruline d e N o m a y o s - C a m e r o u n . 2 6

Figure 7 : Pourcentage d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n e n fonction d u temps d'induction des

Figure 8 : Pourcentage d e l a f a l c i f o r m a ti o n e n fonction d e l a concentration e n extrait e t d e l a

Figure 9 : Etat morphologique des hématies d'un d r é p a n o c y t a i r e observées a u microscope

Figure 1 0 : T aux d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a t io n e n fonction d e l a concentration d'extrait e t

Figure 1 1 : T aux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t i o n après 2 h e n fonction d e l a concentration.

Figure 1 2 : T aux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t i o n après 4 h e n fonction d e l a concentration.

Figure 1 3 : Taux d e réversibilité de la f a l c i f o r m a t i o n a p r è s 2 4 h e n fonction d e l a concentration.

F i g u r e 1 4 : T a u x d e r é v e r s i b i li t é e n f o n c ti o n d u t e m p s à l a c o n c e n t r a t i o n 8 0 0 u g / m L . 4 1

F i g u r e 1 5 : T a u x d e r é v e r s i b i li t é e n f o n c ti o n d u t e m p s à l a c o n c e n t r a t i o n 1 6 0 0 u g / m L . 4 2

Figure 1 6 : Pourcentage d ' h é m o l y s e induite par différentes concentrations d'aspirine . 4 3

Figure 1 7 : Pourcentage d ' h é m o l y s e induite par l'aspirine ( 0 ,7 m g / m L ) e n présence d e l'extrait.

Figure 1 8 : T aux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h m o l y s e induite par l'aspirine 0 ,7 m g /m L . 4 4

Figure 1 9 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration e n N a C l . 4 5

Figure 2 0 : T aux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e milieu hypotonique

Figure 2 1 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration d u triton-100 . 4 7

Figure 2 2 : Taux d'inhibition d e l'extrait sur l'hémolyse induite par l e triton-100 à l a

Figure 2 3 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration e n peroxyde d'hydrogène.

Figure 2 4 : Taux d'inhibition d e l ' e x t r a i t s u r l'hémolyse induite par le p é r o x y d e d'hydrogène

T a b l e a u 2 : Classification taxonomique d e S p i r u li n a p l a t e n s is 2 6

A F S S A P S : Agence Française d e Sécurité Sanitaire des Produits d e Santé

C R E R S H : Com i t é Régionale d ' E t h i q u e d e l a Recherche pour l a Santé Hum aine d u Centre

I E C D : I n s t i t u t E u r o p é e n d e Coopération e t d e Développement

N A D P H : N i c o t i n a m i d e A d é n i n e D i n u c l é o t i d e Phosphate ( réduit)

L a d r é p a n o c y t o s e est une maladie génétique très répandue e n Afrique, à laquelle s'associe une anémie hémolytique chronique e t des complications v a s o - o c c l u s i v e s e t infectieuses. Les moyens d e prise e n charge e t traitements usuels les plus utilisés, les transfusions sanguines, l ' a l l o g r e f f e sont c o u t e u x e t prédisposent les malades aux risques d'infections. C'est dans l e cadre d'optimiser l a prise e n charge d e cette maladie par les substances naturelles que cette étude a été réalisée e n vue d e d é t e r m i n er l'activité a n t i f a l c é m i a n te e t a n t i h é m o l y t iq u e d e l'extraits aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s d u C a m e r o u n . L a spiruline récoltée à Nom a y o s - Y a o u n d é a été séchée, broyée e t macérée pendant 2 4 h dans d e l'eau distillée e t l e filtrat a été lyophilisé. L a détermination des taux d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a t io n induite par le m é t a b i s u l f i t e d e sodium ( M B S ) 2 % e t d u taux d e réversibilité a été effectuée à des concentrations d e 1 0 0 , 2 0 0 , 4 0 0 , 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L d'extrait d e spiruline e t à différents temps ( 2 h , 4 h e t 2 4 h ) . L ' activité a n t i h é m o l y t i q u e induite d e l'extrait a été étudiée à l a concentration 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L , par l a méthode c o l o r i m é t r i q u e avec différents inducteurs tels que l'aspirine, l a solution hypotonique, l e triton X - 1 0 0 e t l e peroxyde d'hydrogéné. L e rendement d'extraction était d e 1 4 ,0 1 5 % . L a durée maximale d e f a l c i f o r m a t io n induite était d e 2 h 3 0 e t l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n est passé d e 2 7 ,9 9 #177; 3 ,1 5 % ( a u temps initial) à 9 1 ,4 4 #177; 3 ,7 0 % soit u n taux d e 6 9 ,3 % d'induction d e l a f a l c i f o r m a t io n . L e taux d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a ti o n après 2 h 3 0 variait d e 1 5 ,1 0 #177; 0 ,6 0 % à 6 6 ,0 9 #177; 4 ,6 9 % pour l a concentration d e 1 0 0 u g / m L à 1 6 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t d e s p i r u l i n e . C e taux d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a t io n s'est révélé dose-dépendant. L a meilleure concentration d e l'extrait était d e 1 6 0 0 u g / m L . Concernant les résultats d e taux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n à des concentrations d e 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L , i l s v a r i a i e n t d e 3 7 ,5 4 #177; 6 ,3 5 % à 8 2 ,3 4 #177; 5 ,6 3 % e n fonction d u t e m p s . L a concentration 1 6 0 0 u g / m L d'extrait d e spiruline était l a plus active après 2 4 h . E n outre, l'extrait a d é m o n t r é u n effet a n t i h é m o l y t i q u e significatif ( p < 0 ,0 5 ) par rapport a u contrôle négatif sur tous les inducteurs. E n fonction d e chaque i n d u c t e u r , n o u s avons obtenu r e s p e c t i v e m e n t p o u r l e s c o n c e n t r a t i o n s 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L

d'extrait d e spiruline les taux d'inhibition d e l'hémolyse suivants : 5 3 .0 3 #177; 9 ,4 6 % e t
9 6 ,6 7 #177; 5 ,7 7 % ( l'aspirine) ; 8 0 #177; 8 ,6 6 % e t 7 1 ,2 5 % ( l a solution hypotonique) ; 3 6 ,5 6 #177; 9 ,5 3 % e t 4 5 ,6 7 #177; 2 2 ,5 5 % ( l e triton-100) ; 2 4 ,2 6 #177; 9 ,5 5 % e t 3 6 ,7 6 #177; 1 ,2 7 % ( l e peroxyde d'hydrogéné).

M o t s clés : D r é p a n o c y t o s e , S p i r u l i n a p l a t e n s i s , activité a n t i f a l c é m i a n t e , activité

Sickle-cell anaemia i s a widespread genetic disease i n Africa, which i s a s s o c i a t e d w i t h chronic haemolytic anaemia and v a s o - o c c l u s i v e and infectious complications. The most commonly used means o f m a n a g e m e n t a n d t r e a t m e n t , b l o o d transfusions and a l l o g r a f t i n g are expensive and predispose patients t o the risk o f infection. I t i s within the framework o f optimising the m a n a g e m e n t o f t h i s disease b y natural substances that this study was conducted t o d e t e r m ine the a n t i f a l c e m i c and a n t i h e m o l y t i c activity o f aqueous extracts o f S p i r u l i n a p l a t e n s i s from Cameroon. The S p i r u l i n a harvested i n N o m a y o s - Y a o u n d é was dried, crushed and m a c e r a t e d for 2 4 hours i n distilled water and the filtrate was freeze-dried. Determination o f the inhibition rates o f f a l c i f o r m a t i o n induced b y sodium m e t a b i s u l f i t e ( M B S ) 2 % and the reversibility rate was carried out a t concentrations o f 1 0 0 ,2 0 0 ,4 0 0 ,8 0 0 and 1 6 0 0 u g / m L o f

s p i r u l i n a extract and a t d i f f e r e n t t i m e s ( 2 h , 4 h and 2 4 h ) . The induced a n t i h e m o l y t i c activity o f the e x t r a c t w a s studied a t 8 0 0 u g / m L and 1 6 0 0 u g / m L c o n c e n t r a t i o n , b y the c o l o r i m e t r i c m e th o d w i t h different inducers such a s aspirin, h y p o t o n i c solution, triton X - 1 0 0 and hydrogen p e r o x i d e . The extraction y i e l d w a s 1 4 .0 1 5 % . The maximum duration o f i n d u c e d f a l c i f o r m a t i o n w a s 2 h 3 0 and the percentage o f f a l c i f o r m a t i o n increased from 2 7 .9 9 #177; 3 .1 5 % ( a t the initial time) t o 9 1 .4 4 #177; 3 .7 0 % , giving a f a l c i f o r m a ti o n induction rate o f 6 9 .3 % . The f a l c i f o r m a t io n inhibition rate a f t e r 2 h 3 0 ranges from 1 5 .1 0 #177; 0 .6 0 % t o 6 6 .0 9 #177; 4 .6 9 % for the concentration o f 1 0 0 u g / m L

t o 1 6 0 0 u g / m L o f s p i r u l i n a extract. This rate o f inhibition o f f a l c i f o r m a ti o n was found t o b e dose-dependent. The best concentration o f the extract i s 1 6 0 0 u g / m L . The results for the reversibility rate o f f a l c i f o r m a t io n a t c o n c e n t r a t i o n s o f 8 0 0 u g / m L and 1 6 0 0 u g / m L varied from 3 7 .5 4 #177; 6 .3 5 % t o 8 2 .3 4 #177; 5 .6 3 % a s a function o f t i m e . T h e 1 6 0 0 u g / m L concentration o f s p i r u l in a

Key words: Sickle cell disease, S p i r u l i n a p l a t e n s i s , a n t i f a l c e m ic activity, a n t i h e m o l y tic activity.

L a d r é p a n o c y t o s e est une affection génétique héréditaire grave à transmission a u t o s o m ale récessive dans laquelle les globules rouges prennent l a form e d e faucille a u lieu d e leur forme normale d e disque. C ' e s t une h é m o g l o b i n o p a t h i e qui est due a u r e m p l a c e m e n t d e l'acide glutamique hydrophile par l a valine hydrophobe e n position six d e l a chaîne J d e l'hémoglobine. Cette substitution modifie son affinité pour l'oxygène e t s a solubilité dans les conditions d e faible pression e n oxygène. I l s'en suit une p o l y m é r i s a t i o n e n t r a i n a n t l a f a l c i f o r m a t io n des globules ( H u y n h - M o y n o t , 2 0 1 1 ) . Une fois f a l c i f o r m é s ces globules rouges contenant l'hémoglobine S ( H b S ) acquièrent une structure rigide qui n e leur permet pas d e circuler facilement dans les petits vaisseaux, c e qui cause une v a s o - o c c l u s i o n e t les complications diverses d e l a maladie ( N a y a l e x , 2 0 1 4 ) . I l s ' a g i t e n effet des crises douloureuses, d e l a susceptibilité accrue aux infections, d e l ' h y p e r h é m o l y s e provoquant l'anémie, d e l a production accrue des radicaux libres e n d o g è n e s , p r i n c i p a l e m e n t l e radicale ° O H qui est l e plus abondant chez les d r é p a n o c y t a i r e s ( K a u r e t a l ., 2 0 1 3 ) .

Selon l ' O M S , dans l e monde, cette h é m o g l o b i n o p a t h i e touche plus d e 5 0 millions d e personnes sous l a form e h o m o z y g o t e s S S , e t 2 5 0 millions des porteurs hétérozygotes A S . S e l o n l'organisation mondiale d e l a lutte contre l a d r é p a n o c y t o s e , 5 0 0 milles enfants d r é p a n o c y t a i re s n a i s s e n t c h a q u e année d o n t 4 0 0 milles e n Afrique ( O M S , 2 0 1 1 ) . L a d r é p a n o c y t o s e c o n n a î t u n e p r é v a l e n c e maximale e n Afrique sub-saharienne e t constitue aujourd'hui u n r é e l p r o b l è m e d e santé publique pour l a plupart des pays noirs a f r i c a i n s . E n Afrique centrale e t d e l'Ouest, 2 0 à 4 0 % des sujets sont porteurs d u trait d r é p a n o c y t a i r e . A u Cam e r o u n , l a p r é v a l e n c e d u trait d r é p a n o c y t a i r e e s t e s t i m é e à 2 5 - 3 0 % dans s a forme hétérozygote A S , e t d e 2 % dans s a forme homozygote S S ( I E C D , 2 0 1 6 ) . E n Afrique e n général e t a u Cam e r o u n e n particulier, cette h é m o g l o b i n o p a t h i e est u n réel problème d e santé publique car, l a d r é p a n o c y t o s e S S reste très meurtrière: 5 0 % à 9 0 % des enfants d r é p a n o c y t a i r e s décèdent avant leur 5 è m e anniversaire s'il n e s o n t p a s pris e n charge ( M c G a n n e t a l ., 2 0 1 7 ) .

L a prise e n charge a u Cam e r o u n s e fait dans quelques centres hospitaliers. M ais l e nombre reste très limité par rapport à l a p r é v a l e n c e d e cette pathologie e t l'accès même à ces centres n'est pas aisé pour l a population rurale. L a prise e n charge prend e n compte l'aspect p r é v e n t i f p a r l a s u p p l é m e n t a t i o n e n f o l a t e s , l a prévention des infections, l'hydratation orale par l'eau alcaline, l e repos, l a mise sous oxygène, l e maintien à chaud, l a prescription des

antalgiques, l a transfusion sanguine lorsque l e taux d ' h é m o g l o b i n e est bas e t l e volet curatif consiste à l a greffe d e l a moelle osseuse e t l a thérapie génétique ( P i e l e t a l ., 2 0 1 7 ) .

Cependant, les différents t r a i t e m e n t s préconisés aux malades présentent d e nom b r e u s e s limites tant a u niveau d u coût que des risques liés aux problèmes d'incompatibilités e t d e toxicité médicamenteuse. Face à tout ceci, les patients s e tournent vers les plantes pour s e soigner. E n e f f e t , d e p u i s des m i l l é n a i r e s , l ' h o m m e utilise les plantes à des fins thérapeutiques. Les travaux d e Ram dé-Tiendrébéogo e t a l . ( 2 0 1 8 ) ont montré que 2 m g / m L d u macéré h y d r o é t h a n o l i q u e des feuilles d e Ficus s y c o m o r u s ( utilisées e n médecine traditionnelle a u B u r k i n a F a s o dans l e t r a i t e m e n t d e l a d r é p a n o c y t o s e ) avait une activité d e inhibition d e 3 1 ,0 2 #177; 0 ,0 0 % tandis que celle d e 3 m g / m L d u décocté aqueux des feuilles était d e 2 2 ,5 #177; 0 ,0 0 % . T hep h i n l a p e t a l ., ( 2 0 1 3 ) ont révélé que 3 1 2 5 11 g / m L d'extrait d e feuille d e P a n d a n o u s o d o r u s p a n d a n u s peut inhiber 8 3 ,2 5 % d'hémolyse induite par l'ion ferreux. K o t u e e t a l ., ( 2 0 1 4 ) ont mis e n exergue que 2 7 4 0 11 g / m L d'extrait d ' H e m o d y a avait une activité d e 7 2 ,4 1 % d'inhibition

d e l a f a l c i f o r m a t i o n , 6 4 ,4 7 % d e réversibilité, 5 5 ,3 7 % d'inhibition d e l'activité d u lactate déshydrogénase e t 3 5 ,2 4 % d'amélioration d u r a p p o r t F e 2 + / F e 3 + . U n e étude m e n é e p a r N a n f a c k

e t a l . ( 2 0 1 3 ) avec les extraits aqueux d e Z a n t h o x y l l u m h e i t z i i montre que cette dernière inhiberait 3 9 ,5 % d e f a l c i f o r m a t io n e t aurait aussi des propriétés reverses. Par ailleurs i l a été d é m o n t r é que 5 3 u g / m L d'extrait d e composés phénoliques d e P h a s e o lus v u l g a r u s L ont des

propriétés a n t i f a l c é m i a n te s , a n t i o x y d a n t e s e t d e stabilité m e m b r a n a i r e avec

8 2 ,2 6 #177; 2 ,0 % d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a t i o n e t 6 9 ,8 6 #177; 3 ,5 % d e réversibilité d e l a

f a l c i f o r m a t io n ( N k e n m e n i e t a l ., 2 0 1 9 ) . C ' e s t fort d e tout c e qui précède que l e présent travail, dans l e b u t d e c o n t r i b u e r à l ' a m é l i o r a t io n d e l a p r i s e e n charge d e l a m a l a d i e , n o u s n o u s sommes proposés d'étudier les propriétés a n t i f a l c é m i a n t e s e t a n t i h é m o l y t i q u e s d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s .

S p i r u l i n a p l a t e n s i s , p l u s couramment appelée l a spiruline est une algue bleu-verte d e l a f a m i l l e des c y a n o b a c t é r i e s faisant partie des plus anciennes form e s d e vies terrestres ( D o u d o u , 2 0 0 8 ) . Elle est douée des vertus nutritionnelles e t thérapeutiques. Elle est utilisée dans l a réhabilitation n u t r it i o n n e l l e , p o u r l e r e n f o r c e m e n t d u s y s t è m e immunitaire, e t dans l a protection contre l e cancer e t l'hypertension artérielle ( H T A ) ( G i r a r d i n , 2 0 0 5 ; F a l q u e t e t H u r n i , 2 0 0 6 ; A m a e t a l ., 2 0 1 6 ) . Plusieurs raisons j u s t i f i e n t l ' i n t é r ê t p o r t é sur l a Spiruline dans notre étude. E n effet l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s d u Cam e r o u n est riche e n m a c r o n u t r i m e n ts , m i c r o n u t r i m e n ts e t composés p h y t o c h i m i q u e s b i o a c t i f s p a r m i s lesquels les p o l y p h é n o l s , les f l a v o n o ï d e s , l a bêta carotène, l a p h y c o c y a n i n e , les acides phénoliques e t l e calcium s p i r u l a n doués d'activités a n t i o x y d a n t e s ( A m a e t a l ., 2 0 1 6 ) . Par ailleurs une étude ressente révèle que

l a s u p p l é m e n t a t i o n e n spiruline perm e t d e réduire l e nombre d e crise, d e transfusion sanguine e t d'hospitalisation chez les enfants d r é p a n o c y t a i r e s ( M a l a m e t a l ., 2 0 1 7 ) . Cependant aucune étude n ' a mis e n exergue i n vitro l e mode d'action d e l a spiruline sur les hématies des d r é p a n o c y t a i r e s . P o u r m e n e r c e t t e é t u d e , n o u s avons é m i s h y p o t h è s e selon laquelle :

L'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a des propriétés a n t i f a l c é m i a n t e s e t

Pour vérifier cette hypothèse nous nous sommes fixés pour o b j e c t i f g é n é r a l d'étudier i n vitro les propriétés a n t i f a l c i m ia n t e s e t a n t i h é m o l y t i q u e s d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a platens i s .

? d é t e r m i n er i n vitro l'effet d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l a f a l c i f o r m a tio n

des hématies ( l'inhibition e t l a réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n des hématies) ;

? d é t e r m i n er i n vitro l'activité a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s is

sur les g l o b u l e s r o u g e s e n présence des différents inducteurs d'hémolyse ( milieu hypotonique, triton X - 1 0 0 , peroxyde d'hydrogène e t l'aspire).

CHAPITRE I : R E V U E D E L A LITTÉRATURE

CHAPITRE I : REVUE D E L A LITTÉRATURE

E n général, l a d r é p a n o c y t o s e est une h é m o g l o b i n o p a t h i e regroupant u n ensemble d e maladies génétiques transmissibles, caractérisées par une synthèse a n o r m ale d ' h é m o g l o b i n e , protéine sanguine servant a u transport des gaz respiratoires ( oxygène, dioxyde d e carbone) ( C h e t c h a e t a l ., 2 0 1 8 ) . L a d r é p a n o c y t o s e S S o u anémie f a l c i f o r m e quant à elle est une affection génétique héréditaire grave à transmission a u t o s o m ale récessive dans laquelle les globules rouges prennent l a forme d e faucille a u lieu d e leur forme normale d e disque. C ' e s t une h é m o g l o b i n o p a t h i e due l a substitution d e l'acide glutamique hydrophile par l a valine hydrophobe e n position six d e l a chaîne J d e l'hémoglobine. Cette substitution modifie son a f f i n i t é p o u r l ' o x y g è n e e t s a solubilité d a n s l e s c o n d i t i o n s d e f a i b l e p r e s s i o n d ' o x y g è n e . I l s ' e n suit l a p o l y m é r i s a t i o n e t l a f a l c i f o r m a t io n des globules ( H u y n h - M o y n o t , 2 0 1 1 ) .

L e p r e m i e r article s c i e n t i f i q u e s u r l a d r é p a n o c y t o s e est apparu i l y a plus d e 1 0 0 ans.

? E n 1 9 1 0 , Jam e s H e r r i c k , cardiologue décrit l e premier cas d e l a d r é p a n o c y t o s e . Il

rapporta l a présence d e globules rouges e n faucille a u niveau d u frottis sanguin d'un patient c a r i b é e n . S o n bilan h é m a t o l o g i q u e m o n t r e une anémie très prononcée.

? E n 1 9 1 5 , Cook e t M e y e r ont mis e n évidence l a transmission héréditaire d e cette

m a l a d i e . E n e f f e t , l o r s d ' a n a l y s e s p l u s p o u s s é e s , i l s o n t r e t r o u v é l e s d r é p a n o c y t e s dans l e frottis sanguin d u père d'un d r é p a n o c y t a i r e .

? E n 1 9 2 7 , Hahn e t G i l l e p s i e ont rem arqué que l a déformation des globules rouges n ' a

? E n 1 9 4 0 , S h e r m a n , é t u d i a n t e n m é d e c i n e , s u g g è r e même qu'un bas niveau e n oxygène

? E n 1 9 4 9 , N e e l a démontré que l a transmission d e cette maladie e s t g é n é t i q u e . L a même

année, Pauling e t I t a n o montrent qu ' elle est due à une structure a n o r m ale d e l ' h é m o g l o b i n e , moins s o l u b l e . D ' o ù l a première découverte d e l 'o r i g i n e m o l é c u l a i r e d ' u n e m a l a d i e génétique.

? L'année 6 0 , fut l'année d e découverte d u gène d e l a chaîne 13-globine, situé sur l e

? E n 1 9 5 7 , I n g r a m m o n t r e q u e l a d r é p a n o c y t o s e e s t d u e à u n r e m p l a c e m e n t s u r l e codon

? E n 1 9 8 0 , Kan e t a l ont mis a u point u n test génétique prénatal d e l a d r é p a n o c y t o s e c e qui perm e t ainsi aux parents malades o u t r a n s m e t t e u r s d e l a d r é p a n o c y t o s e d'établir u n diagnostic génotype d e l'enfant à naître.

? E n 1 9 9 9 , L e d e r b e r g , suggère suite à l a r e s s e m b l a n c e m o n t r é e p a r H a l d a n e comparant

les cartes d e répartition d e l a malaria d ' une part e t d e l a d r é p a n o c y t o s e d ' a u t r e part que l ' h é m o g l o b i n e S pouvait apporter u n avantage dans les régions o ù l a malaria était présente.

L a d r é p a n o c y t o s e est une affection caractérisée par une production d e l ' h é m o g l o b i n e S ( H b S ) anormale due à une mutation ponctuelle, faux sens e t non conservative d e l'acide g l u t a m i q u e p a r l a valine e n position 6 d e l a chaîne J d e l a globine ( tableau 1 ) .

Tableau 1 : Cause moléculaire d e l a d r é p a n o c y t o s e ( H i e r s o , 2 0 1 5 )

L'hémoglobine S a tendance à s e polymériser dans s a forme désoxygénée, c e qui est à l'origine des multiples manifestations des s y n d r o m e s d r é p a n o c y t a i r e s ( H u y n h - M o y n o t , 2 0 1 1 ) parmi lesquels :

? L'anémie : elle désigne u n manque d'hémoglobine ( o u d e globules rouges) e t s e traduit par une fatigue excessive e t une sensation d e f a i b l e s s e . L o r s q u e l'anémie est assez sévère, l e malade peut avoir des difficultés à respirer ( e s s o u f f l e m e n t) e t une accélération des b a t t e m e n ts

d u coeur ( t a c h y c a r d i e ) . L e s signes visibles sont l a fatigabilité e t une couleur jaune des yeux o u d e l a peau, appelée jaunisse ( o u i c t è r e ) , e t une coloration foncée des urines, conséquence d'un taux élevé d e l a bilirubine produit d e l a dégradation d e l ' h é m o g l o b i n e des hématies. L a sévérité d e l'anémie varie a u cours d u tem p s . E l l e peut s'aggraver b r u t a l e m e n t e n cas d e f o n c t i o n n e m e n t

e x c e s s i f d e l a r a t e , o n parle d e séquestration splénique ( splénique : qui s e rapporte à l a rate), o u e n cas d'infections à l'origine d e crises dites aplasiques ( elles sont dues à l ' a r r ê t t e m p o r a i r e d e fabrication des globules rouges) ( Beaune e t a l , 2 0 0 9 ) .

? Aggravation d e l ' a n é m i e , e l l e e s t g é n é r a l e m e n t c a u s é e par:

? Séquestration splénique : l e f o n c t i o n n e m e n t i n t e n s i f d e l a rate est une manifestation

qui s e retrouve s u r t o u t c h e z l ' e n f a n t . L a rate est u n organe situé e n haut à gauche d e l'abdomen e t dont l'un des rôles est d e filtrer l e sang e t d ' é l i m i n er les substances nuisibles ( bactéries, toxines... ) . Les manifestations d e l a séquestration splénique sont : des douleurs a b d o m i n ales, une a u g m e n t a t i o n très soudaine d u v o l u m e d e l a rate ( s p l é n o m é g a l i e ), une pâleur marquée e t d e manière générale, une aggravation d e toutes les manifestations d e l'anémie ( o r p h a n e t , 2 0 1 1 ) .

L a séquestration splénique peut mettre l a vie e n danger, surtout chez les enfants d e moins d e sept ans. E n cas d e séquestration splénique, i l est conseillé d e conduire l e malade e n urgence à l'hôpital d e référence.

? Crises aplasiques : elles s e c a r a c t é r i s e n t p a r d e s manifestations telles que d e l a fièvre,

des maux d e tête ( céphalées), des douleurs abdominales, une perte d'appétit o u des v o m i s s e m e n t s . Ces manifestations sont transitoires. Ces crises peuvent être liées à une infection par l e p a r v o v i r u s B 1 9 o u à u n manque e n vitamine B 9 ( acide folique) qui doit être prise

r é g u l i è r e m e n t p a r l e s personnes d r é p a n o c y t a ir e s . L ' i n f e c t io n par le p a r v o v i r u s B 1 9 s e manifeste par une éruption sur l a peau ( érythème) ; c'est une affection fréquente e t bénigne qui passe souvent inaperçue chez les enfants non d r é p a n o c y t a i r e s ( o r p h a n e t , 2 0 1 1 ) .

? Les crises douloureuses o u crises v a s o - o c c l u s i v e s : ils sont dues à l a « mauvaise »

irrigation e n sang d e certains organes, s e manifestent par des douleurs vives e t brutales dans c e r t a i n e s p a r t i e s d u corps e t p e u v e n t , à l a longue, e n t r a î n e r l a destruction d e certains organes o u parties d'organes : l a nécrose. Ces douleurs sont les m a n i f e s t a t i o n s l e s p l u s fréquentes d e l a maladie : elles peuvent être soudaines ( o u aiguës) e t transitoires ( c'est-à-dire durer quelques heures o u quelques jours) o u chroniques ( c'est-à-dire durer plusieurs s e m a i n e s ) . I l arrive aussi que les deux types d e crises coexistent chez u n même individu ( douleur chronique à laquelle

s ' a j o u t e n t d e s crises b r u t a l e s ) . E l l e s sont favorisées par l a d é s h y d r a t a t i o n , c ' e s t p o u r q u o i i l est recommandé d e boire beaucoup d'eau, mais elles sont aussi favorisées par l e froid, l'altitude, l e stress, les efforts excessifs, les infections... Toutes les parties d u corps peuvent peut être c o n c e r n é e s , m ais certains organes s o n t p l u s sujets que d'autres aux crises v a s o - occlusives : les

o s , les pieds e t l e s m a i n s , l e s p o u m o n s , l e c e r v e a u . L e s crises s e m a n i f e s t e n t d i f f é r e m m e n t s e lo n l e o u les organe(s) a t t e i n t ( s ) . I l p e u t s ' a g i r d e douleurs a b d o m i n a l e s , f r é q u e n t e s chez l ' e n f a n t e t plus r a r e m e n t c h e z l'adulte ( Beaune e t a l , 2 0 0 9 ) .

? Atteinte des o s e t des articulations ( atteinte o s t é o - a r t i c u l a i r e ) : l'atteinte o s t é o -

a r t i c u l a i r e est très f r é q u e n t e , s u r t o u t après l'âge d e cinq ans. Elle s e manifeste par des douleurs osseuses o u articulaires l e plus s o u v e n t b r u t a l e s e t qui peuvent changer d e localisation dans l e corps. Elles sont dues à des gonflements à l'intérieur d'un o s ( oedème i n t r a - o s s e u x ) . Les douleurs surviennent surtout dans les o s des jambes e t des bras e t dans l a colonne vertébrale mais peuvent aussi toucher l e bassin, l a poitrine o u l a tête. Les crises douloureuses, sont d i f f i c i l e m e n t prévisibles. A terme, des parties d'os peuvent être détruites ( infarctus osseux o u

o s t é o n é c r o s e ) c e q u i p e u t conduire à des complications articulaires ( Beaune e t a l , 2 0 0 9 ) :

? L e s y n d r o m e pied-main o u d a c t y l i t e : c e syndrome concerne e x c l u s i v e m e n t l ' e n f a n t,

a v a n t l ' â g e d e deux a n s . L e ( s ) p i e d ( s ) et/ou l a o u les m a i n ( s ) d e v i e n n e n t c h a u d s , g o n f l é s , e t l e s mouvements sont douloureux. Cela peut être l a p r e m i è r e manifestation d e l a maladie chez les jeunes enfants, associée o u non à d e l a fièvre.

? L e s y n d r o m e thoracique aigu : i l s e manifeste par une fièvre, une gêne o u des

difficultés respiratoires ( dyspnée), une respiration rapide, une toux, e t des douleurs dans l a poitrine. L a radiographie des poumons montre l a présence anormale d e taches blanches ( infiltrats pulmonaires). Chez l'enfant i l est souvent d û o u associé à une infection des

? Les accidents vasculaires cérébraux ( A V C ) o u « attaques cérébrales » : les manifestations sont très variables, e t peuvent être transitoires ( o n parle alors d'accidents i s c h é m i q u e s t r a n s i t o i r e s o u A I T ) : pertes d e sensibilité o u d e force dans u n b r a s , u n e j a m b e , l a moitié d u visage, o u tout l e côté d u corps, paralysie d'un côté d u corps o u d'un membre ( h é m i p l é g i e ) , maux d e tête ( céphalées), difficultés soudaines à parler ( aphasie), troubles d e l ' é q u i l i b r e , c o n v u l s i o n s ( m o u v e m e n ts saccadés d e s m e m b r e s a v e c p e r t e d e c o n s c i e n c e ) , p a r f o is coma. Des maux d e tête violents o u des difficultés d'apprentissage s o u d a i n e s p e u v e n t être des signes d'alerte.

? L a susceptibilité accrue aux infections : Les principaux facteurs expliquant l a grande

sensibilité des d r é p a n o c y t a i r e s aux infections sont l ' a s p l é n i e fonctionnelle ( non-
fonctionnement de l a rate) e t les troubles d e l a phagocytose. E n effet i l y a l a suppression d e l'activité m a c r o p h a g i q u e e t immunologique d e l a rate avec diminution d e l a synthèse d ' I g M

spécifiques ; l a diminution d e l a production d e t u f t s i n e , qui stimule l a migration des polynucléaires e t favorise l a phagocytose ; l e défaut d ' o p s o n i s a t i o n qui rend inopérante l a voie

c o m p l é m e n t a i r e alterne d e défense contre l'infection ; les débris tissulaires dus à l a nécrose qui sont des sites d e colonisation b a c t é r i e n n e . L e s enfants, e t dans une moindre mesure les adultes, sont très sensibles aux infections bactériennes q u i p e u v e n t s e développer d e manière fulgurante e t doivent donc être traitées r a p i d e m e n t . L e s personnes sont plus s p é c i a l e m e n t sensibles aux p n e u m o n i e s ( infections des p o u m o n s ) , à l a grippe, mais aussi aux hépatites ( infections d u foie), aux méningites ( infections d e l'enveloppe d u cerveau), aux infections urinaires e t aux

septicémies ( infections graves généralisées). E n outre, les infections provoquent des
complications propres à l a d r é p a n o c y t o s e : aggravation brutale d e l ' a n é m i e , a u g m e n t a t i o n d u risque d e crises v a s o - o c c l u s i v e s , e t a u g m e n t a t i o n d u risque d'occlusion des vaisseaux e n général... L e risque d'infection e s t d o n c une conséquence très sévère d e l a d r é p a n o c y t o s e , c e la reste une cause d e mortalité dans l'enfance. Cependant, les t r a i t e m e n t s préventifs perm e t te n t g é n é r a l e m e n t d'éviter les infections graves. Chez l'enfant, i l est très important d e prévenir les sources d e bactéries ( foyers infectieux) chroniques ( a u niveau des d e n t s , d e s a m y g d a l e s , d e s o s ,

d e l a vésicule biliaire...) e n s'assurant d'une bonne hygiène, d e maintenir à jour leurs v a c c i n a t i o n s , e t d e s ' a s s u r e r q u ' i l s p r e n n e n t l ' a n t i b i o t iq u e q u i l e u r e s t p r e s c r i t ( pénicilline) tous les jours, sans oubli ( o r p h a n e t , 2 0 1 1 ) .

I .1 .3 . E p i d é m i o l o g i e e t étiologie d e l a d r é p a n o c y t o s e

L e d r é p a n o c y t o s e est l'affection génétique l a plus fréquente dans l e monde ( P i e l e t a l ., 2 0 1 3 ) . Selon l'Organisation M o n d i a l e d e l a Santé ( O M S ) , environ 5 % d e l a population mondiale seraient porteuses d'une mutation d r é p a n o c y t a i r e avec une forte concentration e n

Afrique s u b s a h a r i e n n e ( figure 1 ) . Selon l'organisation mondiale d e lutte contre l a
d r é p a n o c y t o s e , o n enregistre 5 0 0 mille enfants naissant chaque année atteints d e cette pathologie dans l e m o n d e , d o n t 4 0 0 mille e n A f r i q u e . L a p r é v a l e n c e d u t r a i t d r é p a n o c y t a i r e est très élevée e n Afrique ( 1 0 à 2 5 % ) e t atteint 1 0 à 1 5 % e n Afrique c e n t r a l e , 6 à 1 0 % e n Afrique d e l ' O u e s t ( C eli n e , 2 0 0 9 ) . L ' O M S enregistre environ 5 % d e décès d'enfants d r é p a n o c y t a i re s d e moins d e 5 ans sur l e continent africain e t environ 9 à 1 6 % s e trouve e n Afrique d e l'ouest ( A t e c b o s e t a l ., 1 9 9 7 ) . A u Cam e r o u n , l a p r é v a l e n c e des porteurs sains d r é p a n o c y t a i r e est

e s t i m é e à 2 5 - 3 0 % ( f o r m e h é t é r o z y g o t e ) , e t d e 2 % d a n s s a f o r m e h o m o z y g o t e S S ( I E C D , 2 0 1 6 ) . L a morbidité e t l a mortalité associées à cette pathologie restent élevées avec l e seuil d e 1 % des patients a t t e i g n a n t l ' â g e adulte ( O M S , 2 0 1 6 ) .

I n i t i a l e m e n t , l a d r é p a n o c y t o s e était retrouvée dans les régions e n d é m i q u e s pour l e paludisme : Afrique sub-saharienne, bassin méditerranéen ( notamment e n Grèce e t e n Italie), Moyen Orient e t certaines parties d u sous-continent indien e t dans l a péninsule Arabique ( L a b i e , 2 0 1 0 ; P i e l e t a l ., 2 0 1 0 ) . Suite à d'importants mouvements des populations, l a

d r é p a n o c y t o s e s'est étendue indépendamment d u paludisme, p r i n c i p a l e m e n t l e long des côtes orientales des Amériques, dans les Caraïbes e t e n Europe d e l'Ouest ( P i e l , 2 0 1 3 ) . Les flux migratoires récents ont é g a l e m e n t fait d e l a d r é p a n o c y t o s e l a p r e m i è r e maladie génétique e n France hexagonale ( Roberts e t M o n t a l e m b e r t , 2 0 0 7 ) .

Figure 1 : Distribution historique e t contemporaine ( 2 0 1 0 ) d e l a d r é p a n o c y t o s e ( P i e l e t a l ., 2 0 1 0 )

L ' h é m o glob ine hum a i n e norm ale e st un p i g m e n t pro t é i q u e c o m p l e x e coloré rouge, riche

e n fer e t contenu dans les h é m a t i e s . E l l e représente 9 5 % des protéines i n t r a c e l l u l a i r e s . S o n rôle physiologique principal est d'assurer l e transport des gaz respiratoires entre les poumons e t tissus ( E l l e u c h , 2 0 0 4 ) e t s u b s i d i a i r e m e n t participer aussi a u maintien d e l'équilibre a c i d o - basique grâce à u n échange d e proton avec les groupements aminés e t c a r b o x y l i q u e s d e certains ses acides constitutifs ( G ir a u d e t e t a l ., 2 0 0 8 ) . Elle est une h é m o p r o t é i n e d e structure

t é t r a m é r i q u e d e poids moléculaire 6 4 4 5 8 d a l t o n s ( Raisonner, 2 0 0 2 ) , constituées d e quatre sous-unités polypeptidiques identiques deux à deux : deux polypeptides o u globines alpha ( á d e 1 4 1 acides a m i n é s ) d o n t l e u r s gènes d e structures s o n t p o r t é s par le chromosome 1 6 e t deux g l o b i n e s n o n - a l p h a ( d e 1 4 6 a c i d e s a m i n é s ; b ê t a , â p o u r l ' h é m o g l o b i n e a d u l t e A , H b A ; gamma, ã pour l'hémoglobine foetale, H b F e t delta, ä pour l'hémoglobine A 2 , H b A 2 ) portés par l e chromosome 1 1 . Ces c h a i n e s sont unies par des liaisons non covalentes ( figure 2 ) ( Tertian, 2 0 0 8 ) . Chaque c h a i n e d e globine possède u n groupe prosthétique appelé hème ( donc s a biosynthèse est catalysée par l ' h è m e synthétase), constitué d'une p r o t o p o r p h y r i n e I X e t d'un atome d e fer divalent qui fixe l'oxygène ( B e u l t l e r e t a l ., 2 0 0 1 ) . Son affinité pour oxygène

d i m i n u e a v e c l ' a u g m e n t a t i o n d e l a c o n c e n t r a t i o n e n p r o t o n s H ( a c i d o s e ) , d i o x y d e d e carbone ( C O ₂ ) , ions C l - , 2 ,3 - d i p h o s p h o - g l y c é r a t e ( 2 ,3 - D P G ) , tem p é r a t u r e f a v o r i s a n t l a dissociation d e l'oxyhémoglobine ( H b O ₂ ) e t par conséquence, favorise une meilleure oxygénation tissulaire ( L i a n e t a l ., 1 9 7 1 ) .

Figure 2 : Ultra structure d e l ' h é m o g l o b i n e ( C o u q u e , 2 0 1 3 )

Les h é m o g l o b i n o p a t h i e s regroupent l'ensemble des pathologies liées à une anomalie génétique d e l ' h é m o g l o b i n e ( C o u p r i e , 2 0 0 0 ) . L ' a n o m a l i e porte sur les chaînes d e globine, elle peut être quantitative o u qualitative: dans l e p r e m i e r cas une chaîne peut être absente o u e n quantité i n s u f f i s a n t e , c ' e s t l e cas des t h a l a s s é m i e s ; alors que dans l e second cas i l s'agit d'une mutation ponctuelle d'un gène codant pour une c h a i n e , c'est l e cas d e l a d r é p a n o c y t o s e S S ( V i n a t i e r , 2 0 1 0 ) . E n e f f e t c e s a n o m a l i e s g é n é t i q u e s p o r t a n t sur les c h a i n e s d e globine peuvent

e n t r a i n e r des modifications structurales d e l ' h é m o g l o b i n e e t c o m prom e t t r e leurs fonctions physiologiques: c'est l e cas d e l a d r é p a n o c y t o s e dont l a p h y s i o p a t h o l o g i e s'explique à plusieurs niveaux.

L o r s q u e l a pression e n oxygène est basse, i l y a l a p o l y m é r i s a t i o n , l a r i g i d i f i c a t i o n e t l a diminution d e solubilité d e l ' h é m o g l o b i n e S ( H b S ) . Ceci Explique les deux signes majeurs d e l a maladie : l ' a n é m i e hémolytique e t l ' o b s t r u c t i o n d e l a m i c r o c i r c u l a t io n ( figure 3 ) . Cette polymérisation est réversible dans les conditions d e r é o x y g é n a t i o n . A p r è s plusieurs cycles d e

d é s o x y g é n a t i o n e t r é o x y g é n a t i o n , les cellules perdent leur flexibilité e t deviennent
d é f i n i t i v e m e n t d é f o r m é e s e n d r é p a n o c y t e s i r r é v e r s i b l e s . L a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' H b S résulte d e l a form a t i o n d ' une liaison hydrophobe entre l e groupe isopropyl d e l a valine d e l a chaîne J d e l a d é s o x y h é m o g l o b i n e e t une cavité formée par les chaînes d e l a phénylalanine 8 5 ( noyau benzénique) e t d e l a leucine 8 8 ( groupe isopropyl) d ' une autre molécule d e d é s o x y h é m o g l o b in e H b S . l a p o l y m é r i s a t i o n peut être m o d u l é e par différents facteurs parmi lesquels l a saturation e n oxygène qui est i n d i r e c t e m e n t corrélée à l a p o l y m é r i s a t i o n , l a concentration d e l ' H b S qui est i n d i r e c t e m e n t corrélée a u temps d e p o l y m é r i s a t i o n e n cas d e d é s o x y g é n a t i o n , l a teneur e n 2 ,3 D P G ( i l diminue l ' a f f i n i t é d e l ' H b pour 1 ' 0 ₂ e t favorise s a conformation d é s o x y e t donc l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' H b ) , l e p H e t l a tem p é r a t u r e ( l a p o l y m é r i s a t i o n a u g m ente e n milieu acide e t lorsque l a tem p é r a t u r e a u g m ente), l e déficit e n g l u c o se-6-phosphate déshydrogénase ( E .C 1 o x y d o - r é d u c t a s e , enzyme d e l a voie d e pentose phosphate, impliquée dans régénération d u coenzyme r é d u i t N A D P H ) ( G a l a c t e r o s , 1 9 9 7 ; G i r o t , 2 0 0 3 ) .

Figure 3 : Schéma physiopathologique d e l a d r é p a n o c y t o s e ( E l i o n e t a l ., 1 9 9 6 ) .

A u niveau cellulaire, l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' H b S induit toute une série d e modifications dans l ' h é m a t i e : l a déshydratation des h é m a t i e s . E n effet l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' H b S modifie l a

p e r m é a b i l i t é d e l a m e m b r a n e d e s g l o b u l e s r o u g e s a u x c a t i o n s ( N a , K , M g , C a ) . Elle a u g m ente l a perm é a b i l i t é d e l a membrane d u globule rouge, favorise l ' e n t r é e d e C a 2 * dans l a cellule. C e qui active les canaux causant l ' e x t e r n a l i s a t io n d u K * d e l a cellule pour maintenir

l ' é q u i l i b r e o s m otique e t h y d r i q u e . D a n s cette circonstance l 'eau e t l e s ions chlorures ( C l -) fuient

d ' e n d o c y t o s e c e qui empêche s a détection par les pompes à ATP, chargées d e son évacuation.

D e p l u s , l a d é s h y d r a t é é r y t h r o c y t a i r e a u g m e n t e l a p e r m é a b i l i t é a u M g . S a concentration i n t ra

é r y t h r o c y t a i r e dim i n ue f o r t e m e n t , e n t r a i n a n t une a u g m e n t a t i o n d e l ' a c t i v a t i o n d u C o -

t r a n s p o r t e u r K e t C l - responsable d ' une fuite encore plus importante d e K * e t C l .. Cet ensemble

d e perturbation des échanges ioniques m e m b r a n a i r e s e n t r a i n e non s e u l e m e n t l a déshydratation des h é m a t i e s mais aussi l a form a t i o n d e grandes fibres d e p o l y m ères d ' H b S entraînant toute une série d'altérations m e m b ra n a i re p a r m i l e s q u e l le s l a libération des h é m i c h r o m e s e t induisant

e n particulier des a g g l o m é r a t s d e protéine bande 3 sur les membranes é r y t h r o c y t a i r e s o ù s ' a c c u m u l e n t des immunoglobulines G ( I g G ) anti-bande-3 donnant ainsi des signaux d e leur

destruction par les macrophages. L a libération d e l ' h è m e e t d e F e 3 + favorise u n

m i c r o e n v i r o n n e m e n t o x y d a n t d e s p h o s p h a t i d y l s é r i n e s ( G i r o t , 2 0 0 3 ) .

L a d r é p a n o c y t o s e est une pathologie a u cours d e laquelle i l existe une tendance à l ' h y p e r v i s c o s i t é . L a libération p r é m a t u r é e des r é t i c u l o c y t e s dans l a circulation sanguine d u fait d ' une é r y t h r o p o ï è s e accrue a tendance à créer dans u n contexte i n f l a m m a t o ir e , une adhérence des érythrocytes à l ' e n d o t h é l i u m vasculaire. C ' est l e facteur essentiel d u r a l e n t i s s e m e n t d e l a vitesse sanguin e laissant l e tem p s à l a d é s o x y h é m o glob i n e d e s e p o l y m é r i s e r, prendre u n e forme

d e faucille e t finir par obstruer c o m p l è t e m e n t l e vaisseau, avec pour conséquence les crises v a s c o - o c l u s i v e . E n outre, i l y a activation des plaquettes e t l ' a u g m e n t a t i o n d u taux d e fibrinogène a u cours des crises v a s o - o c c l u s i v e s ( G i r o t , 2 0 0 3 ) .

E n Afrique e t e n A m é r i q u e , l a d r é p a n o c y t o s e est une affection héréditaire relativement fréquente e t constitue u n r é e l p r o b l è m e d e santé p u b l i q u e . L e s hématies prennent l a forme e n faucille ( d r é p a n o c y t e ) quand l a concentration d'oxygène s'abaisse e t f o r m e n t d e s thromboses suite à une hémolyse ( C h e t c h a e t a l ., 2 0 1 8 ) . I l est donc f o n d a m e n t a l d e pouvoir déceler cette hémoglobine anormale afin d e développer des bons moyens d e prise e n charge e t limité son

I l c o n s i s t e à p r i v e r l e s g l o b u l e s r o u g e s d ' o x y g è n e . O n a l e t e s t d ' E m m e l s i m p l e e t l e test d ' E m m e l a u m é t a b i s u l f i t e d e sodium 2 % . L e test d ' E m m e l simple est u n test classique, u n examen microscopique d e cellules spontanément désoxygénées entre lame e t lamelle. I l consiste à placer une goutte d e sang entre lame e t lam e l l e , l u t e r à l a paraffine o u à l a vaseline, l a i s s e r à l a température d u laboratoire o u mettre à l'étuve e t lire après 2 4 o u 4 8 heures ( E m m e l, 1 9 1 7 ) . L a technique a u m é t a b i s u l f i t e d e sodium quant à elle est plus rapide que l a p r e m i è r e , l a lecture s e fait a u bout d e 5 à 3 0 minutes. L'intérêt d e ces deux techniques est qu'elles sont fiables pour révéler l a présence des d r é p a n o c y t e s . Cependant elles n e perm e t t e n t pas l a distinction des formes hétérozygotes des formes homozygotes. D'où i l s'est avéré nécessaire d e faire recours à d'autres techniques plus spécifiques.

Les techniques phénotypiques d'étude d e l'hémoglobine font intervenir les méthodes b i o c h i m i q u e s d e séparation des p r o t é i n é s . I l s'agit d e :

? Électrophorèse à p H alcalin ( 8 ,4 - 9 ,5 ) : Elle utilise différents supports ( papier, gel

Principe : i l est basé sur l a séparation des différentes fractions d e l ' h é m o g l o b i n e ( contenues dans l ' h é m o l y s â t ) dans u n champ électrique sur une plaque d'acétate d e cellulose à p H alcalin e n fonction d e l e u r p o i d s moléculaire e t d e leur charge électrique.

E n effet, L e sang est prélevé sur anticoagulant E D T A e t lavé e n l'eau physiologique. Les globules rouges sont ensuite l y s é s par l'eau distillée pour obtenir l ' h é m o l y s â t . L'étape suivante consiste à faire deux dépôts d ' h é m o l y s â t ( à 3 c m d u pôle négatif d e l a cuve contenant l e tampon B d e migration) sur l e support d'acétate d e cellulose p r é a l a b l e m e n t traité avec l e tampon approprié ( A ) , laissé migré 2 h ( à 2 0 0 volts ; à 0 ,5 0 m A ; à 2 0 ° C ) puis séchée l a plaque e t e n fin l a colorer avec l e noir amide, l e rouge ponceau S o u l a benzidine. Cette technique permette d'une part d e poser l e diagnostic e n mettant e n évidence l a présence d'une fraction d ' h é m o g l o b i n e d e migration différente des h é m o g l o b i n e s norm ales e t d'autre part différencier les form e s h o m o z y g o t e s des form e s h é t é r o z y g o t e s , a i n s i que l a présence éventuelle d'une autre anomalie d e l ' h é m o g l o b i n e a s s o c i é e ( B a l é d e n t e t G i r o t , 2 0 1 6 ) .

Principe : i l est basé sur l a séparation des différentes fractions d'hémoglobine e n fonction d e leur point isoélectrique dans u n gradient d e p H .

Dans c e s y s t è m e d e gradient l a protéine arrête d e migrer quand elle arrive à son point isoélectrique ( p H i ) o u s a charge nette est nulle. Cette technique offre u n m e i l l e u r p o u v o i r d e résolution e t une meilleure séparation des différentes d ' h é m o g l o b i n e s ( B a l é d e n t e t G i r o t, 2 0 1 6 ) .

Principe : i l repose sur l'étude des gènes e t d e l'ADN par amplification moléculaire suivi d'une analyse directe ( o l i g o s o n d e s spécifiques-D O T B L O T - P C R ) o u d e séquençage a u locus d'intérêt.

C e t t e technique consiste p rem i è r e m e n t à recueillir les cellule s f oe tales puis à l e s cultiver. Les cellules obtenues sont h o m o g é n é i s é e s dans une solution l y s a n t e qui sera ensuite traitée par

l a p r o t é i n a s e p o t a s s i q u e e t l ' A D N sera e x t r a i t p a r l e m é l a n g e p h é n o l c h l o r o f o r m e e t p r é c i t é p a r

l ' a l c o o l é t h y l i q u e à basse température ( - 2 0 ° C ) e t e n fin analysé ( B a l é d e n t e t G i r o t , 2 0 1 6 ) .

Les c o m p l i c a t i o n s d e l a d r é p a n o c y t o s e sont variables selon les individus mais é g a l e m e n t selon l a période d e vie ( chez u n même individu). O n les classe généralement e n deux catégories : les complications a i g ü e s e t les complications chroniques.

+ A n é m i e a i g ü e : l e syndrome anémique constituait l e principal m o t i f d ' h o s p i t a l i s a tio n

des patients d r é p a n o c y t a i r e s . E n effet, i l est l a cause d ' i n t e r n e m e n t d e ces patients dans 2 5 ,4 % des cas ( C h e t c h a e t a l ., 2 0 1 8 ) ;

+ Crises h y p e r a l g i q u e s : elles c o n s t i t u e n t l a deuxième cause d e décès l a plus récurrente

+ S y n d r o m e infectieux i n d é t e r m i n é : l e s cris e s h y p e r h é m o l y t i q u e s e t l e s p n e u m o p a t h ie s

font également parties des complications a i g ü e s , comme les trois motifs cités ci-dessus, ils représentent 1 7 ,3 % des cas ( C h e t c h a e t a l ., 2 0 1 8 ) .

Les complications c h r o n i q u e s p e u v e n t s u r v e n i r à tout âge mais touchent s u r t o u t l e s adultes. Elles regroupent :

+ Atteintes o s t é o - a r t i c u l a i r e s : elles s e traduisent par des douleurs répétées, différentes

d e celles des crises, lancinantes, aggravées par des mouvements e t l a marche e t s e calmant généralement a u repos. L a fragilisation des o s due à leur mauvaise minéralisation est plus fréquente e t e s t p r é s e n t e dans 1 4 ,6 8 % des cas ( N g o l e t e t a l ., 2 0 1 7 ) .

+ Atteintes p u l m o n a i r e s : ici une hypertension artérielle p u l m o n a i r e peut a p p a r a i t r e , l a

m a n i f e s t a t i o n principale e st un a c c r o i s s e m e n t d e l ' e s s o u f f l e m e n t l o r s des efforts qui aboutissent à des lésions a u niveau des poumons ( O r p h a n e t , 2 0 1 1 ) .

+ Atteinte cardiaque : l'anémie s'accentue souvent e t conduit à une augmentation

compensatrice d u volume cardiaque e t u n souffle a u coeur. C e n ' e s t p a s i n q u i é t a n t . C e p e n d a n t , c e r t a i n e s p e r s o n n e s p e u v e n t a v o i r d e s performances cardiaques qui se d é g r a d e n t a v e c l ' â g e . P a r

exemple, l e coeur s e fatigue plus vite lors des efforts. L e suivi régulier perm e t d e détecter c e problème ( O r p h a n e t , 2 0 1 1 )

+ Atteintes rénales : les reins peuvent également être atteints. Cela s e traduit l e plus

s o u v e n t p a r l a présence d'albumine dans les urines ( album i n u r i e ) . L e mauvais fonctionnement des reins peut progresser vers une insuffisance rénale chronique o ù l e rein n'assure plus s a fonction.

+ Atteinte oculaire : des s a i g n e m e n t s à l'intérieur des yeux ( h é m o r r a g i e s i n t r a o c u l a i re s )

p e u v e n t s u r v e n i r c h e z les enfants ( d e plus d e 1 5 ans g é n é r a l e m e n t ) . E l l e s l i m i t e n t p l u s o u moins

+ Troubles d e l'érection : environ 4 0 % des hommes adultes souffrent d'érections

involontaires prolongées pendant 1 0 à 1 5 minutes e t jusqu'à plusieurs jours, e t devenant r a p i d e m e n t d o u l o u r e u s e s , i l s ' a g i t d e p r i a p i s m e . C ' e s t u n e grande urgence car, s i c e l a dure plus d'une heure, i l expose à u n risque d e lésions définitives des corps érectiles d u pénis e t donc

+ Ulcères des jambes : certains patients p e u v e n t a v o i r d e s p l a i e s plus o u moins profondes

( u l c è r e s ) s u r l e bas d e s j a m b e s e t l e dessus des p i e d s . L e s ulcères s u r v i e n n e n t p l u s s o u v e n t c h e z les h o m m e s q u e les f e m m e s d e plus d e 1 8 a n s . I l s p e u v e n t m e t t r e l o n g t e m p s à s e r é s o r b e r , c ' e s t pourquoi i l est important d e faire traiter r a p i d e m e n t toute plaie à l a jam b e pour éviter l'évolution vers l'ulcère, o u son aggravation. L'ulcère cutané représente 2 9 ,5 1 % d e complications chroniques chez les patients d r é p a n o c y t a i r e s ( N g o l e t e t a l ., 2 0 1 7 )

+ Calculs dans l a vésicule biliaire : des calculs ( sorte d e cailloux appelés lithiases)

peuvent s e former à l'intérieur d e l a vésicule biliaire ( lithiase biliaire). L a lithiase biliaire est courante e t survient r e l a t i v e m e n t tôt dans l a vie. Ils peuvent b r u t a l e m e n t p r o v o q u e r d e vives

douleurs dans l e ventre, e n haut à droite o u sous l'épaule droite ( coliques biliaires).
Vomissements, fièvre, sueurs o u frissons peuvent accompagner ces douleurs e t t é m oignent d'une c o m p l i c a t i o n . D a n s c e cas, i l e s t nécessaire d e c o n s u l t e r e n u r g e n c e . 4 0 ,3 1 % des malades

e n sont atteints après l'âge d e 1 8 ans ( N g o l e t e t a l ., 2 0 1 7 ) .

+ Atteinte hépatite : o n peut constater, parfois dès l'enfance, une augmentation d u

v o l u m e d u foie ( h é p a t o m é g a l i e ) . L ' h é p a t o m é g a l i e est e n général indolore, mais peut entraîner une gêne a b d o m i n a l e , r e s s e m b l a n t à u n « poids » dans l e v e n t r e . L e foie peut durcir e t , à terme, n e peut plus fonctionner normalement ( insuffisance hépatique). L'atteinte d u foie peut être

favorisée par des hépatites virales o u toxiques ( dues à l a prise d e certains médicaments par exemple) o u par l'excès d e fer.

? Retard d e croissance : Souvent, dans les pays o ù l a prise e n charge est bonne, les

enfants ont s e u l e m e n t u n léger retard d e croissance e t leur puberté peut être retardée e n raison d e l'anémie. Les adultes sont souvent minces, mais rarement plus petits que l a moyenne ( O r p h a n e t , 2 0 1 1 ) .

Ils sont basés sur l a mise e n place des centres spécialisés, des opérations d e d é p i s t a g e , d e soins e t d e suivi, l e dépistage néo-natal, des transfusions ponctuelles, l'éducation des parents, l a bonne pratique des règles h y g i é n o - d i é t é t i q u e s , l a s u p p l é m e n t a t i o n quotidienne e n acide folique o u v i t a m i n e B 9 , e n antibiotique e t l e t r a i t e m e n t d e s c o m p l i c a t i o n s l i é e s à l a maladie.

Les t r a i t e m e n t s spécialisés d e l a d r é p a n o c y t o s e regroupent :

? Transfusion sanguine : l a transfusion sanguine est l e t r a i t e m e n t g é n é r a l e m e n t u t i l is é

dans l a prise e n charge d u patient d r é p a n o c y t a i r e . Elle peut être effectuée lorsqu'on a une dim i n u t i o n importante d u taux d'hémoglobine ( 6 à 7 g / d L ) o u e n cas d'anémie a i g ü e ;

? Échanges transfusionnels : d e loin préférés aux transfusions sanguines, ils peuvent s e

faire m a n u e l l e m e n t e n soustrayant l e sang total e t effectuer une transfusion d e globules rouges. Ils présentent n é a n m oins u n risque d e surcharge e n fer car i l est difficile d'ajuster l e v o l u m e d e globules rouges transfusés a u volume s o u s t r a i t . E l l e s p e u v e n t a u s s i c o n s i s t e r à une soustraction sélective d e globules rouges des patients, compensée par des concentrés d e globules rouges sains à l'aide d'un séparateur d e cellules. Ils minimisent l e risque d ' a c c u m u l a t i o n d u fer e t p e r m e t d e t r a i t e r l e s v o l u m e s s a n g u i n s i m p o r t a n t s ( H A S , 2 0 1 0 ) ;

? Prise e n charge des infections : I l est g é n é r a l e m e n t p r o p o s é pour les bébés une prise

journalière d e pénicilline ; aux enfants des vaccins supplémentaires contre les pneumocoques, l e virus d e l a grippe e t d e l'hépatite B , e t avant tout une bonne hygiène d e vie des patients ( O r p h a n e t , 2 0 1 1 ) .

? Prise d e l ' H y d r o x y u r é e o u h y d r o c a r b a m ide : c e médicament agit e n réduisant les

crises v a s o - o c l u s i v e , les é v è n e m e n t s p u l m o n a i r e s par s t i m u l a t i o n d u gène d e synthèse d e l ' H b F ; i l diminue ainsi l a production des radicaux libres e t empêche l a capture d u N O par

l'hémoglobine libre libérée a u cours d e l ' h y p e r h é m o l y s e des globules rouges ( Chirico e t

? prise e n charge d e l a douleur : l a Haute Autorité d e Santé ( H A S ) e t l ' A g e n c e française

d e sécurité sanitaire des produits d e santé ( A F S S A P S ) préconisent dans leurs protocoles d e prise e n charge d e l a douleur les étapes suivantes ( H A S , 2 0 1 0 ) : E n première intention, une a d m i n i s t r a t io n intraveineuse d e K é t o p r o f è n e , Pour les crises modérées, l a N a l b u p h i n e peut suffire, mais l e soulagement insuffisant doit conduire à prescrire l a morphine sans attendre. Pour les crises les plus s é v è r e s , l a morphine est donnée d ' e m b l é e . P u i s pompe d'analgésie auto contrôlée ( P C A ) s i l'enfant a plus d e 6 ans

? T r a i t e m e n t des complications : l a prise e n charge des patients d r é p a n o c y t a i r e s passe

par une mise e n route des mesures préventives après l e dépistage néonatal. Une surveillance régulière d e l'état basal permet une prise e n charge rapide des complications a i g ü e s e t chroniques. D e v a n t toute c o m p l i c a t i o n , i l est réalisé une h y p e r h y d r a t a t i o n d e façon systématique avec une prise d'antalgiques e t d'antibiotiques e n fonction d u type d e

c o m p l i c a t i o n . U n e transfusion sanguine e n cas d ' a n é m i e profonde o u d ' i n f e c t i o n grave peut é g a l e m e n t être effectuée ( H A S , 2 0 1 0 ) .

? A l l o g r e f f e des cellules souches hém a t o p o ï é t i q u e s : l a greffe d e cellules souches

h é m a t o p o ï é t i q u e s est l e seul traitement potentiellement curateur permettant d'espérer une

d i s p a r i t i o n c o m p l è t e e t définitive des crises douloureuses e t des s y m p t ô m e s liés à l'an é m i e . E lle vise à remplacer des hématies S S par des hématies A A o u A S e t nécessite une compatibilité entre l e donneur e t l e receveur. Toutefois, d e par s a toxicité potentielle immédiate e t à long term e elle est réservée aux enfants atteints de form e s sévères ( A w a , 2 0 0 8 )

? Thérapie génique : L a thérapie génique constitue u n autre mode d e t r a i t e m e n t d ' un

trouble génétique par lequel o n insère d e nouveaux gènes dans les cellules hum a i n e s . D a n s l e cas d e l a d r é p a n o c y t o s e , l e s cellules souches d e l a moelle osseuse d u malade sont p r é l e v é e s , u n vecteur porteur d u gène sain est introduit dans les cellules afin d e les corriger e t les cellules traitées sont r é i n j e c t é e s a u malade ( C o t t i e r e t G u e r r y , 2 0 0 0 ) .

I .2 .1 . F o n c t i o n des globules rouges e t rôle d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e

Les globules rouges sont d e petites cellules a n u c l é é e s , d e form e biconcave contenant

e s s e n t i e l l e m e n t ( 2 / 3 ) l ' h é m o g l o b i n e . I l s assurent p r i n c i p a l e m e n t grâce à l ' h é m o g l o b i n e qui est u n p i g m e n t r e s p i r a t o i r e , l e transport d e l'oxygène, des poumons aux tissus, e t a u s s i l e transport

d u dioxyde d e carbone ( C O ₂ ) des tissus aux p o u m o n s . L ' i n t é g r i t é d e s a membrane cellulaire e t l e maintien d e s a structure est indispensable à son bon fonctionnement. L a membrane é r y t h r o c y t a i r e est constituée d'une b i c o u c h e p h o s p h o l i p i d i q u e dont les deux couche sont opposées l'une d e l'autre par leur pole hydrophobe. L e s parties hydrophiles regardent l a périphérie d e l a b i c o u c h e . L a face externe d e l a b i c o u c h e est dirigée vers l e cytoplasm e , e s t e n contact avec l e c y t o s q u e l e t t e protéique globulaire. Des molécules d e c h o l e s t é r o l v i e n n e n t s e positionner dans les zones hydrophobes. Cette b i c o u c h e est é g a l e m e n t traversée de part e n part par des protéines t r a n s m e m b r a n a ir e s , sur ces protéines s e fixent des sucres d é t e r m i n a n t les groupes s a n g u i n s . L e s plus i m p o r t a n t e s p r o t é i n e s m e m b r a n a i r e s d e s érythrocytes sont l a bande

3 q u i p r é s e n t e u n a n t i p o r t p o u r l e passage des ions d u chlore ( C l ) e t les s i a l o g l y c o p r o t é i n e s qui jouent l e rôle d e transporteurs d e dioxyde d e carbone ( C O ₂ ) ( G i r a s o l e e t a l ., 2 0 1 2 ) .

Les transports t r a n s m e m b r a n a i re s peuvent être regroupés e n deux mécanismes ( Figure

4 ) : les transports passifs selon l e gradient d e concentration e t les transports actifs contre l e gradient d e concentration. L a pompe à sodium correspond à une A T P a s e magnésium-dépendante qui permet l a sortie d e 3 N a * d u globule rouge e t l'entrée d e 2 K * . L e fonctionnement d e cette pompe nécessite u n apport énergétique fourni par l ' A T P issu d e l a glycolyse a n a é r o b i e . I l existe é g a l e m e n t u n e pompe A T P a s e magnésium-dépendante q u i r e j e tte

h o r s d e l ' h é m a t i e u n i o n C a . L e transport des anions, notamment les ions C l - e t H C O 3 -,

s'effectue a u niveau d e l a protéine bande 3 t r a n s m e m b r a n a ir e . L a sortie d'acide carbonique est contrebalancée par une entrée d'ions C l - . L a protéine 3 p e r m e t é g a l e m e n t l e t r a n s p o r t d e l'eau à travers l a membrane é r y t h r o c y t a i r e . ( L e n o r m a n d , 2 0 0 1 ; Portier e t a l ., 2 0 0 7 ) .

Figure 4 : E c h a n g e s d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e ( P a u r e g u i b e r r y , 2 0 1 5 ) .

Les globules rouges ont g é n é r a l e m e n t une durée d e vie entre 1 0 0 e t 1 2 0 jours. Ce pendant dans l a d r é p a n o c y t o s e cette durée d e vie est réduite entre 1 0 - 1 6 jours à cause d e présence d e l'hémoglobine anormale S ( Courtois e t a l ., 2 0 0 7 ) .

L'hémolyse est u n phénomène physiologique irréversible qui aboutit à l a rupture d e l a membrane des hématies provoquant l a libération des éléments i n t r a - é r y t h r o c y t a ir e s dans l e plasma notamment l'hémoglobine ( M e z z o u e t a l ., 2 0 0 6 ) . E n effet l'accumulation d e modifications sur l a membrane d u globule rouge a u cours d u v i e i l l i s s e m e n t ( p e r o x y d a tio n lipidique m e m b r a n a i r e , perte d e résidus d'acide s i a l i q u e e t formation d e n é o - a n t i g è n e s d e sénescence) sont autant d e signaux qui perm e t t e n t aux macrophages d'identifier les globules rouges à é l i m i n e r p a r phagocytose avec réutilisation des composants ( B e a u m ont e t H e r g a u x , 2 0 0 5 ) . Chez les d r é p a n o c y t a i r e i l y a u n d é p a s s e m e n t d u processus physiologique d e lyse des globules rouges ( G R ) qui devient pathologique. C e phénomène est d û à une destruction excessive des hématies o u à u n r a c c o u r c i s s e m e n t d e leur durée d e vie influencé par plusieurs f a c t e u r s .

I .2 .3 .1 . M é c a n i s m e s naturels e t facteurs influençant l ' h é m o l y s e chez les d r é p a n o c y t a i r e s

L a physiopathologie complexe d e l a d r é p a n o c y t o s e est basée sur l'instabilité e t l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' h é m o g l o b i n e a n o r m ale ( H b S ) . C e qui induit des altérations structurales d e l a membrane d u globule rouge provoquant une l i p o p e r o x y d a t i o n avec des réactions radicalaires importantes, dont l a conséquence est l'accélération d u processus d ' h é m o l y s e . E n effet, les globules rouges d r é p a n o c y t a i r e s produisaient plus d e radicaux libres que les globules rouges normaux suite à l'auto-oxydation d e l'hémoglobine S e n m é t h é m o g l o b i n e . C e c i explique l e déséquilibre dans les proportions des radicaux libres générés ( impliqués dans l ' a c t i v a t i o n d e

l ' a p o p t o s e ) e t l e répertoire a n t i o x y d a n t i n h é r e n t a u s y s t è m e , o n parle d u stress o x y d a t i f o u stress oxydant ; d'où l a dim i n u t i o n d e l a durée d e vie des globules rouges chez les d r é p a n o c y t o s e ( H e b b a n n i e t a l ., 2 0 1 4 ) . Par ailleurs i l existe chez les d r é p a n o c y t a i r e s plusieurs formes d e déficiences d ' e n z y m e s ( e n z y m o p a t h i e s ) pouvant causer l'an é m i e h é m o l y t iq u e , l a plu s courante est l a déficience e n glucose 6 -phosphate déshydrogénase ( G 6 P D , E .C 1 o x y d o - r é d u c t a s e ) . L e déficit d e cet e n z y m e provoque u n déficit e n N A D P H qui s e répercute sur l a régénération d u g l u t a t h i o n r é d u i t e t p a r c o n s é q u e n t s u r l'activité d u g l u t a t h i o n p e r o x y d a s e a u niveau d u globule r o u g e . C e qui s e t r a d u i t p a r u n d é f a u t e n peroxydes e t p a r c o n s é q u e n t l ' h y p e r h é m o l y s e ( B é r a u d , 2 0 1 4 ) . D e plus les hématies déformées, rigides, présentent des lésions m e m b r a n a i r e s . L a dim i n u t i o n d e l a plasticité des h é m a t i e s , leur rétention dans les très petits vaisseaux, tout cela v a accélérer leur destruction par les cellules réticulaires macrophages après une i n f l a m m a t io n . Cette destruction accélérée s'effectue surtout dans l a rate e t l e foie, avec libération d'un excès d'hémoglobine dans l e plasma ( H i e r s o , 2 0 1 5 ) . L'hémolyse est manifestée par une augmentation des taux sériques e n hémoglobine associée à une augmentation d u lactate déshydrogénase ( L D H , E .C 1 o x y d o - r é d u c t a s e ) , d e phosphate, d e l a créatine kinase ( C K , E .C 2 transférase) e t aussi par une dim i n u t i o n d u taux d ' h a p t o g l o b i n e e t d ' h é m o g l o b i n e g l y c o s y l é e ( A l i e t a l ., 2 0 1 4 ) .

I .2 .3 .2 . Les m é c a n i s m e s d e s inducteurs d e l ' h é m o l y s e

L ' h é m o l y s e peut être produire par l'introduction d'agents c h i m i q u e s tel que certains

m é d i c a m e n t s , c a p a b l e s d e modifier l'intégrité cellulaire e n induisant une réorganisation e t des c h a n g e m e n t s morphologiques qui résultent d'une cascade d'effets à partir d e l'altération d e l a membrane lipidique conduisant f i n a l e m e n t à l a form a t i o n d e s p h é r o c y t e s e t par conséquent à l a lyse des érythrocytes ( Portier e t a l ., 2 0 0 7 ; M a n a a r g a d o o - C a t i n e t a l ., 2 0 1 6 ) .

? M é c a n i s m e d e l ' h é m o l y s e induite par l'aspirine : l'exposition des érythrocytes

hum a i n s à des agents oxydants tel que l'aspirine à forte concentration favorise l ' h é m o l y s e par p e r o x y d a t i o n lipidique d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e . E n effet l'aspirine, précurseur d'acide salicylique d e par son effet oxydant, peut e n t r a i n e r l a production des radicaux libres, ces derniers attaquent l a membrane e t par conséquent causer l ' h é m o l y s e ( H o u c h e r e t a l ., 2 0 0 1 ) .

? M é c a n i s m e d e l ' h é m o l y s e induite par l a solution hypotonique : lorsqu'un

é r y t h r o c y t e est placé dans u n milieu h y p o t o n i q u e , i l subit une pression o s m otique considérable. E n absence d e contre-pression appliquée dans l e cytoplasme, l'eau ( hypotonique) diffuse dans l a cellule ( hypertonique) via les a q u a p o r i n e s e t protéines bandes 3 e t crée petit à petit u n gonflement des hématies, au-delà d'un certain seuil, l a membrane s'éclate e t l'hémoglobine intracellulaire passe dans l e milieu extérieur ( h é m o l y s e ) ( A m r a n e e t A o u a r t i l a n e , 2 0 1 8 ) .

? M é c a n i s m e d e l'hémolyse induite par l e t r i t o n X - 1 0 0 : L e t r i t o n X - 1 0 0 est u n

d é t e r g e n t n o n ionique qui possède une partie polaire hydrophile e t une queue hydrophobe. Les molécules d u t r i t o n X - 1 0 0 s'insèrent dans l a b i c o u c h e lipidique jusqu'à saturation provoquant ainsi l a perturbation d e l'organisation des lipides m e m b r a n a i r e s qui sera t o t a l e m e n t solubilisée sous forme d e micelles o u d e liposomes à des concentrations très élevée e n détergent ( M u t h u

? M é c a n i s m e d e l ' h é m o l y s e i n d u i t e p a r l e peroxyde d'hydrogène : L'hémolyse induite

par l e peroxyde d'hydrogène résulte des dommages o x y d a t i f s destructeurs d e l a membrane cytoplasm i q u e suite à l a p e r o x y d a t i o n lipidique des acides gras p o l y i n s a t u r é s ( A G P I ) présents dans celle-ci (Singh e t R a j i n i , 2 0 0 8 ) . Lorsque l e H ₂ O ₂ traverse cette m e m b r a n e , i l p e u t causer

l a d é g r a d a t i o n d e l ' h è m e d e l ' h é m o g l o b i n e a i n s i q u e l e s i o n s F e , c e qui génère l e radical

hydroxyle qui est très r é a c t i f p a r l a réaction d e Fenton. Ces radicaux induisent une c h a i n e d e p e r o x y d a t i o n lipidique a b o u t i s s a n t à l'hémolyse ( O k o k o e t E r e , 2 0 1 2 ) . L a réaction d e Fenton est initiée suite à l a formation initiale d e l`anion s u p e r o x y d e qui e s t à l`origine d u phénomène radicalaire car e n donnant l e peroxyde d`hydrogène i l peut alors s e transformer e n radical hydroxyle :

L e t r a i t e m e n t des a n é m i e s h é m o l y t i q u e s passe i n e x o r a b l e m e n t par l e t r a i t e m e n t des causes d e cette anémie. I l y a presque autant d e traitements qu'il y a d e causes. U n certain nombre d e médicaments anti-hémolytiques sont disponibles. C e sont les substances qui présentent l a capacité à retarder o u à inhiber l a lyse des globules rouges. Par exemple: l'acide folique o u vitam ine B 9 , u n c o m p l é m e n t d e f e r , d e s s u p p l é m e n t s d e vitam ine B e t d e s corticoïdes Sous forme des c o m p r i m é s . ( B a c h h y e t a l ., 2 0 1 5 ) .

I l existe plu sieurs plantes donc l e s e f f e t s anti-h é m o l y ti q u e s ont été déjà d é m o n t r é s . C 'est l e cas par exemple d e l'effet protecteur d u décocté aqueux des feuilles ( D A F ) e t d u macéré h y d r o é t h a n o l i q u e des feuilles ( M H F ) d e Ficus s y c o m o r u s contre l ' h é m o l y s e des érythrocytes d e patients d r é p a n o c y t a i r e s h o m o z y g o t e s ( S S ) e t double hétérozygotes ( S C ) . E n effet Ram dé-Tiendrébéogo e t a l . ( 2 0 1 8 ) ont montré que l e M H F ( 2 m g / m L ) avait une activité d'inhibition d e 3 1 ,0 2 #177; 0 ,0 0 % tandis que celle d u D A F ( 3 m g / m l ) é t a i t d e 2 2 ,5 #177; 0 ,0 0 % . T h e p h i n l a p e t a l .

( 2 0 1 3 ) ont révélé que 3 1 2 5 u g / m l d'extrait d e feuille d e P a n d a n o u s o d o r u s p a n d a n u s Peut

inhiber 8 3 ,2 5 % d'hémolyse induite par l'ion ferreux. D e même i l a été démontré
r e s p e c t i v e m e n t p a r ces auteurs que les extraits s u i v a n t p o u r r a i e n t i n h i b e r l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène : 4 0 .6 % pour 5 mg/ml d'extrait d e feuille d e Fiber betel ; I C 5 0 = 9 5 1 .4 #177; 3 6 ì g / m l d'extrait d e feuille d e M e n t h a l o n g ifo l i a ( C h a k r a b o r t y e t Shah, 2 0 1 1 ; M a g a l h ã e s e t a l ., 2 0 0 9 ) .

S p i r u l i n a p l a t e n s i s e s t u n e microscopique algue bleu-verte découvert i l y a 3 ,6 milliards d ' a n n é e s . À l a naissance d e l'univers, ces c y a n o b a c t é r i e s p r o d u i s a i e n t d e l'oxygène à p a r t i r d u dioxyde d e carbone pour les autres formes d e vie présentes à c e moment-là. Elles ont ainsi rendu l ' a t m o s p h è r e respirable perm e t t a n t une possible vie aérobie, e t ont servi d e nourriture aux poissons, mammifères marins e t à l'espèce humaine. L a spiruline a survécu aux périodes glaciaires grâce à s a capacité dite d e c r y p t o b i o s e , c ' e s t - à - d i r e qu'elle est capable d e s e rétracter sous form e d'agrégat d e f i l a m e n t s s i les conditions d e tem p é r a t u r e e t d ' h u m i d i t é lui sont d é f a v o r a b l e s , c o n s e r v a n t a u centre d e cet agrégat u n minimum d'humidité pour s a survie, e n attendant que les conditions redeviennent favorables ( M a n n e t , 2 0 1 6 ) .

L a spiruline s e développe n a t u r e l l e m e n t dans des lacs alcalins riches e n sels minéraux des régions chaudes e t ensoleillées, soit dans une zone t r o p i c o - é q u a t o r i a l e entre l e 3 5 ° d e latitude nord e t 3 5 ° d e latitude Sud. Zone qui c o m porte plusieurs pays p r i n c i p a l e m e n t d a n s trois continents. E n A f r i q u e ces pays sont : T c h a d , K e n y a , T a n z a n i e ( lac N a t r o n ) , D j i b o u t i , É t h i o p i e , Congo, Zambie, A l g é r i e , S o u d a n , e t T u n i s i e . E n Europe les pays concernés sont: F r a n c e , C o r s e , Espagne ; e t e n A s i e o n liste: I n d e , T h a ï l a n d e , M y a n m a r , Sri Lanka, Pakistan, Chine e t e n A m é r i q u e : Pérou, M e x i q u e , Uruguay, Équateur, C a l i f o r n i e , H aïti, République Dom i n i c a i n e . Son habitat naturel est une eau : n a t r o n é e ( contenant d u bicarbonate d e sodium naturel dont l e p H doit être compris entre 8 ,5 e t 1 1 ) ; saumâtre ( d e 2 0 à 7 0 g d e sel par litre d'eau) ; chaude ( entre 3 5 e t 4 0 ° C ) ; riche e n n u t r i m e n t s apportés par les affluents des lacs e t des sols ( f e r , azote, urée, acide phosphorique, sulfate d e magnésium...) e t riche e n gaz carbonique e t oxygène. S a croissance varie durant l a journée, e n dessous d e 1 5 ° C e t au-dessus d e 3 9 ° C , elle s ' a r r ê t e ; o ù l e r a y o n n e m e n t solaire e s t i m p o r t a n t ( M a n n e t , 2 0 1 6 ) .

E n dehors des conditions naturelles d e culture d e l a s p i r u l i n e , p e u t faire une culture hors sol. L e bassin d e culture idéal est e n béton o u e n p o l y c h l o r u r e d e vinyle ( P V C ) . Elle s e cultive sous serres pour protéger des i n t e m péries: fientes d ' o i s e a u x , p o l l e n s , feuilles, soleil ; mais aussi pour éviter les pluies diluviennes qui dilueraient l e milieu d e culture, tout e n l a i s s a n t p a s s e r l a l u m i è r e . L a taille d u bassin d e culture est d e 1 5 à 1 8 c e n t i m è t r e s d e profondeur e t d e plusieurs centaines d e mètres d e longueur, soit 2 5 0 à 3 5 0 m ² p o u r p e r m e t t r e u n contrôle des constances p h y s i c o - c h i m i q u e s p l u s i e u rs f o i s p a r j o u r . S o n p H d o i t ê t r e a u t o u r d e 1 1 , l a t e m p é r a t u r e d e l ' e a u entre 3 0 - 3 5 ° C . Les intrants c h i m i q u e s utilisés sont tracés e t d e qualité, ils répondent à u n cahier des charges rigoureux. U n contrôle d e l a qualité e t d e l a pureté d e l'eau par des organism e s certifiés e t indépendants est nécessaire pour assurer une spiruline d e bonne qualité. I l est nécessaire d e brasser constamment l e bassin d e production à l ' aide d'une grande roue à aube, d e 2 m d e diamètre dont l a vitesse d e rotation est d e 1 0 tours p a r m i n u t e o u d ' une pompe afin que tous les f i l a m e n t s d e spiruline soit exposés a u s o l e i l . L a culture doit utiliser une souche d e spiruline d e q u a l i t é . A i n s i u n bassin d e 4 m ² d e 2 0 c m d e p r o f o n d e u r p r o d u i t 4 0 g d e spiruline sèche par jour ( M a n n e t , 2 0 1 6 ) . I l existe huit p r i n c i p aux facteurs qui influent sur l a pro d u c t i v ité d e l a spiruline:

CHAPITRE I I : M A T É RIE L E T M É T H ODES

CHAPITRE I I : M A T É R I E L E T M É T H O D E S

L ' e f f e t d e l ' e x t r a i t sur l a réversibilité d e l a falciform a t i o n a été réalisé e n incubant 5 0 u L d e sang à température ambiante avec 5 0 u L d e l ' e x t r a i t aux différentes concentrations pendant 2 h , 4 h , 2 4 h . L e pourcentage d e falciform a t i o n a été calculé avant e t après les incubations. L e pourcentage d e falciform a t i o n est alors d é t e r m i n é d e l a même façon que précédemment. Les pourcentages obtenus nous ont p e r m i s d e calculer les différents taux d e réversibilité d e l a falciform ation ( % R ) selon l a form ule suivante :

F 0 : est l e pourcentage d e falciform ation initiale e t F n l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n minim ale obtenue e n présence d ' e x t r a i t o u d e phénylalanine (Joppa e t a l ., 2 0 0 8 ) .

Les concentrations ayant montrés des meilleurs activités antifalcém iantes ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont été utilisées pour évaluer i n vitro l ' a c t i v é antihém olytique d e l ' e x t r a i t aqueux d e spiruline.

I I .3 .4 . Évaluation i n vitro d e l ' a c t i v i t é antihém olytique d e l ' e x t r a i t aqueux d e Spirulina

L ' e f f e t antihém olytique d e l ' e x t r a i t d e plante est évalué i n vitro sur les érythrocytaire. C e dernier est facile à isoler d u sang e t s a membrane présente des sim ilitudes avec d'autres membranes cellulaires ( S h o b a n a e t V i d h y a , 2 0 1 6 ) .

L e sang utilisé p o u r p r é p a r e r l e s suspensions é r y t h r o c y t a i re s a été prélevé dans des tubes E D T A chez des patients d r é p a n o c y t a i r e s homozygotes S S . Après centrifugation à 3 0 0 0 t rs p e n d a n t 5 m i n , l e c u l o t r é c u p é r é e s t l a v é 3 fois avec l a solution PBS i s o - s a l i n e f o r m é e d e tampon phosphate d e potassium 1 0 m M , p H = 7 ,4 e t 1 5 4 m M d e N a C l . Chaque lavage consistait e n une suspension des cellules dans d u PBS I s o salin e t une centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 5 m i n . Après l a dernière centrifugation, l e culot est r e s u s p e n d u à nouveau dans une solution d u PBS i s o - s a l i n à raison d e 1 volume d u culot e t 9 volumes d u PBS, permettant ainsi d'obtenir u n h é m a t o c r i t e à 1 0 % ( Rani e t a l . , 2 0 1 4 ) .

I I .3 .4 .2 . M i s e a u point des tests d e l ' h é m o l y s e induite i n vitro par différents inducteurs

Pour tester l'effet a n t i h é m o l y t i q u e d e notre extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s , les deux concentrations 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ayant montré des meilleures activités a n t i f a l c é m i a n te s ont été utilisées. A u préalable, des tests sur modèle é r y t h r o c y t a i r e d e l ' h é m o l y s e induite par différents agents « milieu hypotonique, acide salicylique, triton X - 1 0 0 e t l ' H ₂ O ₂ ) ont été faits e n absence d e l'extrait afin d e d é t e r m i n e r l a concentration qui induit une h é m o l y s e maximale.

L ' e x p o s i t i o n des globules rouges ( R B C ) à certains conditions p h y s i c o chimiques tels que l e milieu h y p o t o n i q u e , l ' u t i l i s a ti o n d'un p e r t u r b a t e u r m e m b r a n a i r e comme les détergents o u les espèces réactifs oxygénées ( R O S ) , provoque une rupture d e s a membrane cytoplasm i q u e provoquant ainsi l a libération d e l ' h é m o g l o b i n e qui sera alors dosée par spectrophotométrie d ' a b s o r b a n c e visible à 5 4 0 n m .

À 4 . 5 m L d e N a C l hypotonique ( 4 ,5 m g / m L ) , ont été ajouté 5 0 ì L d e l'aspirine d e concentrations variant entre 0 e t 0 , 7 m g / m L préparées à partir d e comprimés d'aspirine d e 1 0 0 0 m g . L e tube t é m o i n reçoit l e m ê m e v o l u m e d u tampon phosphate i s o - salin ( P B S ) , puis une quantité d e 5 0 0 ì L d e l a suspension é r y t h r o c y t a i r e est ajoutée dans chaque tube. Ces tubes sont ensuite homogénéisés e t incubés à 3 7 ? C pendant 3 0 min dans u n bain marie. Les tubes sont centrifugés ( 3 0 0 0 t r s ; 5 m i n ) e t l ' a b s o r b a n c e d e s u r n a g e a n t e s t m e s u r é e à 5 4 0 n m ( H o u c h e r e t a l ., 2 0 0 1 ) .

Afin d e déterminer l a concentration d u N a C l qui provoque l a lyse des globules rouges, o n a additionné 1 0 0 u L d e l a suspension érythrocytaire ( 1 0 % ) à 5 m L d e N a C l à différentes concentrations ( 3 ,5 - 8 ,5 m g / m L ) , ainsi q u ' u n témoin négatif ( N a C l isotonique 9 m g / m L ) e t u n témoin positif ( l ' e a u distillée). Après incubation pendant 3 0 m i n à température ambiante, l e mélange a été centrifugé 1 0 m i n à une vitesse d e 3 0 0 0 t r s , à l a fin o n a effectué une lecture des densités optiques à 5 4 0 n m ( L o u e r r a d e t a l ., 2 0 1 6 ) .

Huit cent m icrolitres d u triton-100 à différentes concentrations ( 0 ,0 0 1 % , 0 ,0 3 % , 0 ,0 4 % , 0 ,0 5 % , 0 ,1 % , 1 % ) ont été m élangés avec 2 ,2 m L d u tampon phosphate ( 0 ,2 M , p H = 7 ,4 contenant 0 ,9 % d e N a C l ) e t 5 0 0 u L d e l a suspension érythrocytaire ( 1 0 % ) . L e m élange a été incubé 1 h , à 3 7 ° C , puis centrifugé à 3 0 0 0 r p m pendant 5 m i n . L a densité optique d u surnageant a été mesurée à 5 4 0 n m , o n a préparé d e même façon l e contrôle m ais e n absence d u triton - 1 0 0 ( M uthu e t D u r a i r a , 2 0 1 5 ) .

5 0 0 u L d e H ₂ O ₂ à différentes concentrations initiales ( 9 % ; 6 % ; 3 % ; 1 % ; 0 ,5 % ; 0 ,3 % ; 0 ,2 % ) ont été m élangés avec u n volume d e 2 5 0 u L d e l a suspension d e globules rouges, après une durée d e 3 h d ' i n c u b a t i o n à 3 7 ° C , o n a ajusté par l e PBS j u s q u ' à 4 ,5 0 0 m L puis l e m élange a été soumis à une centrifugation pendant 1 0 min avec une vitesse d e 3 0 0 0 t r s . L ' a b s o r b a n c e des surnageants a été lue à 5 4 0 n m . Les contrôles ont été préparés e n rem plaçant l ' H ₂ O ₂ par l ' e a u distillée pour l e contrôle positif e t par l a solution PBS pour l e contrôle négatif (Jam e s e t A l e w o , 2 0 1 4 ) .

U n volume d e 5 0 0 u L d ' e x t r a i t s à différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) a été ajouté à 2 5 0 ì L d e l a suspension érythrocytaire, l e m élange a été incubé pendant 5 min à une température ambiante, puis additionné 4 0 0 ì L d u détergent triton X - 1 0 0 à 1 % ; après une incubation d ' u n e heure à 3 7 ° C suivie d ' u n e centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 1 0 m i n , une lecture des D O à 5 4 0 n m a été réalisée. L e contrôle préparé e n absence d e l ' e x t r a i t rem placé par l e même volume e n tampon phosphate isosalin e t u n standard (quercétine) ont été réalisé ( M uthu e t D u r a i r a , 2 0 1 5 ) .

? Effet d e l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l ' h é m o l y s e induite par l ' H ₂ O 2

Deux cent cinquante m i c r o l i t r e s d e l a suspension é r y t h r o c y t a i r e e t 5 0 0 ì L d'extrait à différentes concentrations ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) ont été incubés pendant 3 0 min à température ambiante puis o n a ajouté 5 0 0 ì L d e H ₂ O ₂ ( 9 % ) , e t après une incubation pendant 3 h à 3 7 ° C , o n a ajusté l e volume f i n a l à 4 5 0 0 ì L par le PBS, à l a fin une centrifugation à 3 0 0 0 t r s pendant 1 0 min e t une lecture des D O à 5 4 0 n m e t d e même façon o n a réalisé l e test standard e n utilisant l a q u e r c é t i n e comme molécule d e r é f é r e n c e . L e contrôle a été réalisé e n absence d'extrait e t e n présence d e l'eau distillée. ( Jam e s e t A l e w o , 2 0 1 4 ) .

Pour chaque activité ci-dessus , les tests ont été effectués par groupe d e q u a d r u p l e t s , l e s résultats classés sous form e d e moyen #177; écart type standard, les calculs, les courbes e t diagrammes étaient faits à l'aide d u logiciel Excel 2 0 1 3 e t les données ont été analysées e n utilisant l'analyse d e variance à u n facteur ( One Way ANOVA) suivi d u test Post-hot d e D u n n e t t pour les c o m paraisons multiples.

CHAPITRE III : R É S U L T A T S E T DISCUS S I O N

L e r e n d e m e n t d ' e x t r a c t i o n obtenu à l'issu d e l a macération aqueuse était d e 1 4 ,0 1 5 % .

I I I .1 .2 . E f f e t d e L ' extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s à différentes con centrations sur l a f a l c i f o r m a t i o n .

I I I .1 .2 .1 . I n d u c t i o n i n vitro d e l a f a l c i f o r m a t i o n par le m é t a b i s u l f i t e d e sodium ( M B S ) 2 %

L a figure 7 présente l e pourcentage d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n e n fonction d u temps d'induction des globules rouges d r é p a n o c y t a i r e s avec l e M B S ( 2 % ) .

Figure 7 : Pourcentage d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n e n fonction d u temps d'induction des globules rouges d r é p a n o c y t a i r e s avec l e M B S ( 2 % ) .

I l ressort que l e sang S S additionné a u M B S 2 % ( V / V ) a induit l a f a l c i f o r m a t i o n des h é m a t i e s . A u temps i n i t i a l T = 0 ( heure), ( o ù l e M B S 2 % était remplacé par l e N a C l 0 ,9 % ) l e pourcentage moyen d e f a l c i f o r m a ti o n é t a i t d e 2 7 ,9 9 #177; 3 ,1 5 % . A u bout d e 2 h 3 0 m i n d'induction, c e pourcentage est passé à 9 1 ,3 8 #177; 1 ,2 2 % soit 6 9 ,3 0 % d'induction d e l a f a l c i f o r m a t i o n . L e maximum d e d r é p a n o c y t e s atteint, c e temps ( 2 h 3 0 m i n ) a été considéré comme celui d e l a f a l c i f o r m a t io n maximale.

I I I .1 .2 .2 . A c t i v i t é inhibitrice d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s à différentes concentrations sur l a f a l c i f o r m a t i o n .

L a figure 8 ci-dessous présente l a variation des pourcentages d e f a l c i f o r m a t i o n des h é m a t i e s S S e n fonction des différentes concentrations d'extrait e t d e phénylalanine ( contrôle positif).

Figure 8 : Pourcentage d e l a f a l c i f o r m a ti o n e n fonction d e l a concentration e n extrait e t d e l a phénylalanine a 2 h 3 0 m i n .

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine.

I l découle d e cette figure 8 qu'après 2 h 3 0 m i n d'incubation d e s h é m a t i e s S S e n présence d u M B S 2 % ( t é m o i n négatif), l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n variait s i g n i f i c a t i v e m e n t d e 2 0 ,9 8 #177; 1 ,7 2 % à 7 7 ,4 3 #177; 3 .5 2 % à ( p < 0 ,0 5 ) . Par ailleurs, nous observons une différence significative entre l e témoin négatif e t les concentrations 4 0 0 u g / m L , 8 0 0 u g / m L ; 1 6 0 0 u g / m L d e phénylalanine d'une part, e t d'autre part, entre l e t é m o i n négatif e t les concentrations 8 0 0 u g / m L ; 1 6 0 0 u g / m L d e l ' e x t r a i t . E n outre, i l e s t à noter qu'aucune différence significative n ' a été observée entre les différentes concentrations d'extrait e t d e phénylalanine à différentes concentrations. L'analyse statistique montre une corrélation négative entre l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n e t l a concentration d'extrait o u d e phénylalanine ( pour l'extrait o n a r = - 0 ,8 6 4 ; p = 0 ,0 0 0 e t p o u r l a phénylalanine o n a r = 0 ,7 9 2 ; p = 0 ,0 0 0 )

L a figure 9 représente l ' é t a t m o r p h o l o g i q u e des h é m a t i e s d'un d r é p a n o c y t a i r e observées a u microscope optique ( o b j e c t i f 4 0 x ) après 2 h 3 0 m i n d'incubation e n présence d e M B S 2 % plus e x t r a i t d e spiruline à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L ( figure 9 .1 ) e t e n présence d e M B S 2 % sans extrait ( figure 9 .2 ) . E n ( figure 9 .2 ) , i l y a une p r é d o m i n a n c e des d r é p a n o c y t e s

com p a r a t i v e m e n t à ( figure 9 .1 ) . C e c i t é m o i g n e l'effet inhibiteur d e l'extrait d e s p i r u l i n e ( fig u re 9 ) .

Figure 9 : Etat morphologique des hématies d'un d r é p a n o c y t a i r e observées a u microscope optique.

L a figure 1 0 ci-dessous ressort les différents taux d ' i n h i b i t i o n d e l a f a l c i f o r m a tio n obtenus à différentes concentrations d e l'extrait.

Figure 1 0 : T aux d'inhibition d e l a f a l c i f o r m a t io n e n fonction d e l a concentration d'extrait e t d e phénylalanine.

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine.

Les taux d'inhibition varie d e 1 5 ,1 0 #177; 0 ,6 0 % à 6 6 ,0 9 #177; 4 ,6 9 % pour les concentrations d e

1 0 0 à 1 6 0 0 u g / m L d'extraits d e spiruline e t d e 2 3 ,8 5 #177; 6 ,2 1 % à 6 9 ,6 4 #177; 1 1 ,9 0 % pour les mêmes concentrations respectives d e phénylalanine e t n u l p o u r l e t é m o i n n é g a t i f s a n s extrait.

I I I .1 .2 .3 . Évaluation i n vitro d e l'activité l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l a réversibilité

Les annexes III, I V , V présentent l'activité d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l a réversibilité d e

Nous avons obtenu une baisse d e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n i n i t i a l e n fonction d e l a concentration après 2 h , 4 h e t 2 4 h d'incubation avec l'extrait. Après 2 h , i l p a s s e d e 5 4 ,4 6 #177; 3 ,2 5 %

à 3 2 ,8 6 #177; 4 ,8 2 % e t d e 5 4 ,4 6 #177; 3 ,2 5 % à 2 4 ,4 7 #177; 1 ,6 7 % pour l'extrait e t l a p h é n y l a m i n e
r e s p e c t i v e m e n t . P a r a i l l e u r s , a p r è s 4 h d'incubation q u i i l p a s s e d e 5 4 ,4 6 % à 2 2 ,0 5 #177; 3 ,9 7 % e t d e 5 4 ,4 6 % à 2 0 ,4 9 #177; 3 ,2 6 % pour les concentrations d'extrait e t d e phénylalanine respectivement. Enfin après 2 4 h d'incubation i l varie d e 5 4 ,4 6 % à 9 ,5 7 #177; 3 ,1 0 % e t d e 5 4 ,4 6 % à 2 0 ,4 9 #177; 3 ,2 5 % pour les concentrations d ' e x t r a i t e t d e l a p h é n y l a l a n i n e r e s p e c t i v e m e n t. P a r c o n t r e , o n a observé une faible a u g m e n t a t i o n d u pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n dans l e t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine par rapport a u pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n initial. L e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n initial passe d e 5 4 ,4 6 % à 7 2 ,0 2 % entre l e temps initial e t 2 4 h ( annexes III, I V ,

L'analyse statistique ressort qu'après 2 h e u r e s i l y a une différence entre l e pourcentage

d e f a l c i f o r m a t io n initial comparé à ceux d e toutes les concentrations mais seuls ceux des
c o n c e n t r a t i o n s 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L s o n t s i g n i f i c a t i f s ( p < 0 ,0 5 ) . E n o u t r e , a p r è s 4 h e u r e s e t

2 4 heures d'incubation toutes les concentrations d'extrait e t phénylalanine réduisent significativement ( p < 0 ,0 5 ) l e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n e n comparaison avec l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n i n i t i a l. D e p l u s , p o u r une même concentration l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t io n diminue avec l e temps. Nous notons aussi, une corrélation négative ( p < 0 ,0 1 ) entre l e pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n e t l a concentration d'extrait o u d e p h é n y l a m i n e pour tous les intervalles d e temps ( (pour l ' e x t r a i t a p r è s 2 h o n a ( r = - 0 ,7 2 6 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 4 h ( r = - 0 ,8 1 1 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 2 4 h ( r = - 0 ,9 4 0 ; P = 0 ,0 0 0 ) e t pour l a phénylalanine o n a après ( 2 h ( r = - 0 ,7 2 3 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 4 h ( r = - 0 ,8 1 1 ; p = 0 ,0 0 0 ) ; 2 4 h ( r = 0 ,9 0 5 ; p = 0 ,0 0 0 ) ) : plus l a concentration d'extrait o u d e phénylalanine est grande plus l e pourcentage d e f a l c i f o r m a ti o n e s t p e t i t . Alors l e taux d e r é v e r s i b i l i t é d e l a f a l c i f o r m a t io n e s t c o n c e n t r a t i o n - d é p e n d a n t e t v a r i e avec l e temps.

Les figures 1 1 , 1 2 , 1 3 , nous m o n t r e n t r e s p e c t i v e m e n t l e s graphes d e taux réversibilité d e f a l c i f o r m a t io n e n fonction d e l a concentration e n e x t r a i t e t p h é n y l a l a n i n e après 2 h , 4 h , 2 4 h .

Figure 1 1 : T aux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n après 2 h e n fonction d e l a concentration. * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine.

Figure 1 2 : T aux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n après 4 h e n fonction d e l a concentration. * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u témoin négatif sans extrait e t s a n s phénylalanine.

Figure 1 3 : Taux d e réversibilité de la f a l c i f o r m a t i o n a p r è s 2 4 h e n fonction d e l a concentration. * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine. Les figures 1 4 e t 1 5 présentent les différents taux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a tio n e n fonction d u temps d'incubation.

Figure 1 4 : Taux d e réversibilité e n fonction d u temps a l a concentration 8 0 0 u g / m L .

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine .

F i g u r e 1 5 : T a u x d e r é v e r s i b i l i t é e n f o n c t i o n d u t e m p s a l a c o n c e n t r a t i o n 1 6 0 0 u g / m L .

* = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans phénylalanine .

I l ressort qu'il existe une différence significative à ( p < 0 ,0 5 ) pour les différents temps d'incubation aux concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L . L e s différents taux d e réversibilité étant d e 3 7 ,5 4 #177; 6 ,3 5 % ; 4 4 ,2 2 #177; 6 ,8 3 % ; 7 4 ,9 0 #177; 8 ,5 3 % aux t e m p s r e s p e c t i f s 2 h ; 4 h ; 2 4 h pour l a concentration 8 0 0 u g / m L d'extrait e t d e 3 9 ,7 5 #177; 2 ,3 1 ; 5 9 ,3 8 #177; 7 ,4 1 ; 8 2 ,3 4 #177; 5 ,6 3 % pour l a concentration 1 6 0 0 u g / m L respectivement aux mêmes temps. L a phénylalanine présente les taux d e 3 2 ,1 6 #177; 2 ,9 9 % ; 4 2 ,0 3 #177; 7 ,7 3 % ; 6 2 ,4 6 #177; 8 ,0 3 % pour l a concentration 8 0 0 u g / m L e t d e 4 5 ,9 6 #177; 2 ,9 9 % ; 5 5 ,3 7 #177; 1 5 ,0 4 % ; 7 2 ,4 5 #177; 3 ,2 5 % pour l a concentration 1 6 0 0 u g m L .

D e nombreuses études ont montré que les membranes plasm a t i q u e s des hématies hum a i n s ont des stabilités variables e n fonction d u milieu dans l e q u e l e l l e s s e trouvent ( I b e h e t a l ., 1 9 9 2 ) . Dans l e cadre d e l a gestion des patients souffrant d e l a d r é p a n o c y t o s e , l a recherche d e molécules o u d e substances actives capables d e protéger l'intégrité m e m b ra n a ir e des hématies devient d e plus e n plus importante. C'est ainsi que nous avons procédés aux tests a n t i h é m o l y t i q u e s e n utilisant différents modèle d e substance prouvant créer une h é m o l y s e des h é m a t i e s .

I I I .1 .3 .1 . A c t i v i t é a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l'Aspirine

L a f i g u r e l'induction d e l ' h é m o l y s e à différentes concentrations d'aspirine.

Figure 1 6 : Pourcentage d ' h é m o l y s e induite par différentes concentrations d'aspirine.

Les résultats obtenus ( figure 1 6 ) présentent une hémolyse maximale e t significative ( p ? 0 ,0 5 ) d e 8 3 ,9 4 #177; 4 ,0 5 % à l a concentration d e 0 ,7 m g / m L d e l'aspirine c o m p a r a t i v e m e n t a u témoin négatif ( l'aspirine était remplacée par l e PBS) 9 ,2 4 #177; 1 ,4 8 % . 1 0 0 % d'hémolyse sont obtenus pour l e contrôle positif.

L a figure 1 7 présente l e pourcentage d ' h é m o l y s e induite par l'aspirine à l a concentration d e 0 ,7 m g / m L e n présence d e l'extrait e t d e l a q u e r c é t i n e .

Figure 1 7 : Pourcentage d ' h é m o l y s e i n d u i t e p a r l ' a s p i r i n e ( 0 ,7 m g / m l ) e n présence d e l'extrait.

* * = p < 0 , 0 1 , * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans q u e r c é t i n e . Les histogrammes d e mêmes lettres n e s o n t p a s significativement différentes p < 0 , 0 5

L a figure 1 8 montre l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l'aspirine à l a

Figure 1 8 : T aux d'inhibition d e l'extrait sur L ' h m o l y s e induite par l'aspirine 0 ,7 m g / m L .

L'étude d e l'effet d'inhibition des différentes concentrations d'extrait d e spiruline sur l'hémolyse induite par l'aspirine montre que les c o n c e n t r a t i o n s 8 0 0 u g /m L e t 1 6 0 0 u g / m L

d'extraits présentent des activités a n t i h é m o l y t i q u e s significatives à p < 0 ,0 5 ( p = 0 ,0 0 0 ) par
rapport a u contrôle négatif sans extrait e t sans q u e r c é t i n e . Nous notons également une différence significative ( p = 0 ,0 0 0 ) entre les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extraits d'une part, e t d'autre part entre l'extrait e t l a q u e r c é t i n e aux m ê m e s concentrations sus-cités.

I I I .1 .3 .2 . A c t i v i t é a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e hypotonique

L a figure 1 9 présente l'induction d e l ' h é m o l y s e à différentes concentrations d e N a C l .

Figure 1 9 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration e n N a C l .

Les résultats d e l'hémolyse i n vitro réalisée sur les globules rouges des d r é p a n o c y t a i r e s par la solution hypotonique d u N a C l ( Figure 1 9 ) m o n t r e n t q u e l e maximum d'hémolyse est obtenu à l a concentration 0 ,3 5 % d e N a C l avec u n taux d'hémolyse d e 7 8 ,0 5 #177; 8 ,1 0 % . E n effet, plus l e milieu est concentré e n N a C l , plus l e taux d'hémolyse des globules diminue. L'activité h é m o l y t i q u e l a plus élevée est observée dans l e milieu l e moins c o n c e n t r é , c ' e s t - à - d i r e l e plus hypotonique ( 0 ,3 5 % ) , tandis que dans l e milieu s e rapprochant d e l ' i s o t o n i c i t é , à partir d e l a

concentration 0 ,5 5 % , l e taux d'hémolyse diminue e t jusqu'à atteindre u n minimum d e
1 4 ,4 0 #177; 1 ,7 1 % à l a c o n c e n t r a t i o n e n N a C l 0 ,8 5 % .

L a figure 2 0 présente l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o ly s e induite par le milieu

Figure 2 0 : T aux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e milieu hypotonique ( N a C l 0 ,3 5 % ) .

Les résultats d e l'évaluation d e l'activité d'inhibition d e l'extrait e t q u e r c é t i n e sur l ' h é m o l y s e induite par l a solution hypotonique N a C l 0 ,3 5 % montre que les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extrait e t d e q u e r c é t i n e inhibent l ' h é m o l y s e . L ' analyse statistique montre que l'extrait d e spiruline e t l a q u e r c é t i n e à des c o n c e n t r a t i o n s , 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L inhibent significativement ( p ? 0 ,0 5 ) l ' h é m o l y s e . A u c u n e différence significative n ' a été observée entre les différentes concentrations d'extrait e t d e q u e r c é t i n e aux deux concentrations.

I I I .1 .3 .3 . Activité a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e détergent Triton X - 1 0 0

L a figure 2 1 révèle l e pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration d u t r i t o n X - 1 0 0

Figure 2 1 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration d u triton-100.

Des résultats obtenus, nous notons une différence significative entre l'effet d u triton - 1 0 0 aux concentrations utilisées e t les contrôles négatifs pour lequel l e triton est remplacé par l e PBS.

L a figure 2 2 présente l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e

Figure 2 2 : Taux d'inhibition d e l'extrait sur l'hémolyse induite par l e triton-100 à l a

* * = p < 0 , 0 1 , * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u témoin négatif sans extrait n e t sans q u e r c é t i n e . Les histogrammes d e mêmes lettres n e s o n t p a s significativement différentes p < 0 , 0 5

L e s résultats d e l'évaluation d e l'inhibition d e l'extrait e t d u standard sur l ' h é m o l y s e induite par l e triton X - 1 0 0 à l a concentration 1 % montre que l ' e x t r a i t d e spiruline e t l a q u e r c é t i n e ont des activités inhibitrices d ' h é m o ly s e é l e v é e s . E n effet, i l existe u n e différence s i g n i f ic a t iv e entre l e t é m o i n négatif e t l'extrait ( 8 0 0 u g /m L , p = 0 ,0 3 0 ) . E n revanche, à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L , l'extrait e t l a q u e r c é t i n e inhibent significativement ( p < 0 ,0 5 ) l'hémolyse. M ais aucune différence s i g n i f i c a t i v e ( p > 0 ,0 5 ) n'est observée e n t r e l'effet i n h i b i t e u r d e l'extrait e t celui d e l a q u e r c é t i n e étudiée p a r a l l è l e m e n t à la m ê m e concentration, 8 0 0 u g / m L ( p = 0 ,5 3 4 ) o u 1 6 0 0 u g / m L ( p = 0 ,7 6 7 ) . Les différents taux d'inhibition d'hémolyse obtenus pour les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L sont respectivement d e ( figure 2 3 ) 3 6 ,5 9 #177; 9 ,5 3 % ; 4 5 ,9 5 #177; 1 0 ,7 1 % p o u r l ' e x t r a i t e t 4 5 ,6 7 #177; 2 2 ,5 5 % ; 5 7 ,8 8 #177; 1 5 ,3 3 % p o u r l a q u e r c é t i n e a u x m ê m e s c o n c e n t r a t i o n s .

I I I .1 .3 .4 . Activité a n t i h é m o l y t i q u e d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde
d'hydrogène

L a f i g u r e 2 3 p r é s e n t e l e p o u r c e n t a g e d ' h é m o l y s e e n f o n c t i o n d e l a c o n c e n t r a t i o n e n

Figure 2 3 : Pourcentage d'hémolyse e n fonction d e l a concentration e n peroxyde d'hydrogène. L e s résultats d e l'étude d e l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène montrent que toutes les concentrations d e peroxyde d'hydrogène étudiées induisent plus o u moins l'hémolyse par comparaison d e leurs pourcentages d e l'hémolyse à celui d u témoin négatif qui a donné

témoin négatif, une hémolyse maximale plus significative ( p < 0 ,0 5 ) est obtenue à l a concentration 9 % d e peroxyde d'hydrogène.

L a figure 2 4 présente l e taux d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e

Figure 2 4 : Taux d'inhibition d e l ' e x t r a i t s u r l'hémolyse induite par l e peroxyde d'hydrogène

* * = p < 0 , 0 1 , * = p < 0 , 0 5 différences significatives par rapport a u t é m o i n négatif sans extrait e t sans

q u e r c é t i n e . Les histogrammes d e mêmes lettres n e s o n t p a s significativement différentes p < 0 , 0 5

L'étude d e l'activité d'inhibition d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène montre que l'effet e s t p l u s prononcé pour l a concentration 1 6 0 0 u g / m L que celle d e 8 0 0 u g / m L t a n t p o u r l ' e x t r a i t q u e p o u r l a q u e r c é t i n e . C e p e n d a n t , l ' a n a l y s e s t a t i s t i q u e m o n tre que seul l a concentration 1 6 0 0 u g / m L d'extrait e t d u standard inhibe s i g n i f i c a t i v e m e n t ( p < 0 ,0 5 ) l'hémolyse induite par le peroxyde d'hydrogène à l a concentration 9 % par comparaison avec l e t é m o i n négatif. L ' effet c o m paré d'inhibition d e l a q u e r c é t i n e e t d e l'extrait n e révèle aucune différence significative ( p > 0 ,0 5 ) pour l a concentration 8 0 0 u g / m L ( p = 0 ,9 1 1 ) e t celle 1 6 0 0 u g / m L ( p = 0 ,5 9 4 ) . D e m ê m e , a u c u n e différence s i g n i f i c a t i v e n ' e s t o b s e r v é entre l'activité inhibitrice d e l ' e x t r a i t à s a concentration 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L ( p = 0 ,0 5 8 ) e t idem p o u r l a q u e r c é t i n e à ces deux c o n c e n t r a t i o n s ( p = 0 ,1 1 5 ) .

L ' extraction constitue une étape prim o r d i a l e dans l'évaluation d e l'activité biologique des plantes naturelles. L e rendement obtenu a u cours d e notre étude était d e 1 4 ,0 1 5 % . Cette valeur est inférieure à celle obtenue par A m a e t a l . ( 2 0 1 6 ) qui, lors d'une extraction aqueuse

d e spiruline ont obtenu u n rendement d e 1 6 ,8 4 % . Cette variation pourrait s'expliquer par l a différence d e taux d ' h u m i d i t é d e nos différents l y o p h i s a t s et/ou leurs degrés d e pureté ( N a c z k

L'évaluation d e l'activité a n t i f a l c é m i a n te ( inhibition e t l a réversibilité) d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a été faite à différentes concentrations e n présence d u sang des d r é p a n o c y t a i r e s homozygotes S S . E n e f f e t , n o u s avons observé e n présence d u M B S 2 % une différence significative à ( p ? 0 ,0 5 ) entre l e contrôle négatif ( absence d'extrait) e t les concentrations d e l'extrait ( 8 0 0 e t 1 6 0 0 u g / m L ) . Les taux d'inhibitions d e l a f a l c i f o r m a tio n étant concentration-dépendant e t variant entre 1 5 ,1 0 #177; 0 ,6 0 % e t 6 6 ,0 9 #177; 4 ,6 9 % . E n effet, S a w a d o g o e t a l . ( 2 0 1 7 ) ont obtenu dans une étude menée a u Burkina Faso sur les patients d r é p a n o c y t a i r e s u n taux d'inhibition d e 9 7 % à l a concentration d e 2 0 0 m g / m L avec l e macéré aqueux total d e J a t r o p h a c u r c a s . Par ailleurs D j o t é e t a l . ( 2 0 2 0 ) ont montré dans une étude menée a u Cam e r o u n sur les patients d r é p a n o c y t a i r e s que les extraits d'huiles d ' A z a d i r a c h ta indica J inhibaient 7 7 ,6 6 #177; 1 , 3 % d e f a l c i f o r m a t io n e t avaient une activité d e réversibilité d e l a

f a l c i f o r m a t io n d e 6 2 ,2 6 #177; 4 .4 % . E n outre, l'activité d e l'extrait d e l a spiruline sur l a réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n montre que l'effet est aussi dose-dépendant, pour u n taux d e réversibilité m a x i m a l s i g n i f i c a t i f ( p < 0 ,0 5 ) d e 8 2 ,3 4 #177; 5 ,6 3 % contre 7 2 ,4 5 #177; 3 ,2 5 pour l a phénylalanine après 2 4 heures d'incubation des h é m a t i e s a v e c l ' e x t r a i t à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L ( sans l e M B S à 2 % ) . C e taux d e réversibilité obtenue avec l ' e x t r a i t d e spiruline corrobore celui d e Seck e t a l . ( 2 0 1 5 ) qui ont obtenu 8 0 % d e réversibilité avec l ' e x t r a i t m é t h a n o l i q u e ( E M ) d e L e p t a d e n ia h a s t a t a D e c n e à 5 m g / m L e n 1 2 0 minutes. I l est supérieur à celui 3 9 ,5 #177; 3 ,3 6 % obtenu par N a n f a c k e t a l . ( 2 0 1 3 ) après 2 4 heures avec l ' e x t r a i t d e f r u i t d e X a n t h o x y l u m h e i t z i i 2 5 0 u g / m L . Les acides animés phénylalanine, tyrosine, a r g i n i n e ont révélé les propriétés a n t i f a l c i m i a n te s attribuées à leur activité d'inhibition d e l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' h é m o g l o b i n e S e t d ' a m é l i o r a tio n

d u rapport F e 2 + / F e 3 + ( N o g u c h i e t Shedder 1 9 7 8 ; E k e k e e t S h o d e , 1 9 9 0 ; N w a o g u i k p e e t

U w a k w e , 2 0 0 5 ) . Par ailleurs, Seck e t a l . ( 2 0 1 5 ) é t u d i a n t l ' a c t i v i t é a n t i f a lc é m ia n t e d'extraits d e racines d e L e p t a d e n i a h a s t a t a D e c n e ; N k e m e n i e t a l . ( 2 0 1 9 ) étudiant les propriétés a n t i f a l c é m i a n te s e t a n t i o x y d a n t e s des composés phénoliques extraits des grains d u haricot noir ( P h a s e o l u s v u l g a r i s L .) ont démonté l'implication d e ces groupes d e composés b i o a c t i f s dans

l'inhibition e t l a réversibilité d e l a f a l c i f o r 2 ... . m a t io n . Ainsi, l'activité a n t i f a l c é m i a n t e d e l'extrait d e l a Spiruline sur l a f a l c i f o r m a t i o n des h é m a t i e s à h é m o g l o b i n e S S s'expliquerait par

l a présence d e composés phénoliques e t ces acides aminés principalement l a tyrosine, l a phénylalanine e t l ' a r g i n i n e donc l a présence e t l a concentration est grande dans l a spiruline ( M a n n e t , 2 0 1 6 ; A m a e t a l ., 2 0 1 6 ) . C e r é s u l t a t t r è s proche entre l'activité d e l ' e x t r a i t b r u t d e l a spiruline comparée à celle d e l a phénylalanine ( standard) pourrait s'expliquer par u n effet synergique d e ces acides a m i n é s e t p o l y p h é n o l s présentes dans l'extrait qui, e n inhibant l a p o l y m é r i s a t i o n d e l ' h é m o g l o b i n e S inhibent par conséquence l a f a l c i f o r m a ti o n d'une part e t qu'en améliorant l e rapport F e 2 + / F e 3 + convertissent l a m é t h é m o g l o b i n e e n hémoglobine a u g m entant ainsi leur affinité pour l'oxygène e t donc l a réversibilité ( d é f a l c i f o r m a ti o n ) des h é m a t i e s f a l c i f o r m e s . Ceci justifierait par ailleurs l a superposition observée entre les courbes d e réversibilité d e l'extrait e t celles d e l a phénylalanine à certaines concentrations ( figure 1 1 ,1 2 ) .

L'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a révélé les effets protecteurs d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e e n présence des agents inducteurs d e l ' h é m o l y s e . E n effet les résultats obtenus

d u test d e l'hémolyse induite par l'aspirine e n milieu hypotonique N a C l 0 ,4 5 % montrent une hémolyse maximale très significative ( P ? 0 ,0 5 ) d e 8 3 ,9 4 #177; 4 ,0 5 % à l a concentration d e 0 ,7

m g / m L d'aspirine c o m p a r a t i v e m e n t a u t é m o i n négatif ( sans aspirine). C e c i s e justifierait par l'effet oxydant d e l'aspirine qui à forte concentration e n t r a i n e l a production des radicaux libres attaquant l a membrane e t conduisant à s a p e r o x y d a t i o n lipidique avec pour conséquence l a lyse m e m b r a n a i r e e t libération d e l'hémoglobine ( H o u c h e r e t a l ., 2 0 0 1 ) . Cependant, l'étude d e l'effet inhibiteur d e l'extrait sur l ' h é m o l y s e induite par l'aspirine 0 ,7 m g / m L montre que les deux concentrations, 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extraits ont des activités a n t i h é m o ly t iq u e s très significatives ( P = 0 ,0 0 0 ) soit 9 6 % d ' i n h i b i t i o n . C e t t e forte activité serait due à l a présence des a n t i o x y d a n t e s e t a n t i r a d i c a l a i re s dans l a spiruline p r é c i s é m e n t s a richesse e n p o l y p h é n o l s ,

f l a v o n o ï d e s , p h y c o c y a n i n e , c a r o t é n o ï d e , vitam i n es e t minéraux antioxydants ( vitam ine E , sélénium, zinc) ( A m a e t a l ., 2 0 1 6 ) qui protégeraient l a membrane des hématies d e l a p e r o x y d a t i o n lipidique ( L e g e r , 2 0 0 0 ; P i n e r o e t a l ., 2 0 0 1 ) . C e taux d'hémolyse e n absence d e l'extrait ( 8 3 ,9 4 #177; 4 ,0 5 % ) est inférieur à celui d e H o u c h e r e t a l . ( 2 0 0 1 ) qui ont obtenu une hémolyse maximale d'environ 8 8 % avec une concentration 0 ,5 m g / m L d'acide salicylique pur

C o n c e r n a n t l ' h é m o l y s e induite par le peroxyde d ' h y d r o g è n e , l e s résultats m o n t r e n t q u e , par comparaison avec l e témoin n é g a t i f , u n e h é m o l y s e m a x i m a l e p l u s s i g n i f i c a t i v e ( P < 0 ,0 5 ) d e

8 2 ,2 1 #177; 4 ,2 5 % est obtenue à l a concentration 9 % d e peroxyde d'hydrogène e n absence d e

l'extrait e t d e l a q u e r c é t i n e ( standards). O n obtient m ê m e à une faible concentration d e 0 ,2 % d e peroxyde d'hydrogène u n taux d ' h é m o l y s e d e 4 3 ,3 7 #177; 6 ,2 7 % . Ces forts taux d ' h é m o l y s e m ê m e à faibles concentrations d e peroxyde d'hydrogène serait d û a u f a i t q u e l e peroxyde d'hydrogène

e n t r a i n e des dommages o x y d a t i f s destructeurs d e l a membrane cytoplasm i q u e suite à l a p e r o x y d a t i o n lipidique des acides gras p o l y i n s a t u r é s présents dans celle-ci ( Singh e t R a j i n i , 2 0 0 8 ) . E n e f f e t , l o r s q u e l e H ₂ O ₂ t r a v e r s e l a m e m b r a n e p l a s m i q u e , i l p e u t c a u s e r l a dégradation

d e l ' h è m e d e l ' h é m o g l o b i n e p a r o x y d a t i o n d e s i o n s F e e n F e , avec production des radicaux

hydroxyles ( H O ° ) qui sont très instables e t très réactifs par la réaction d e Fenton. Ces radicaux induisent une c h a i n e d e p e r o x y d a t i o n lipidique aboutissant à l a lyse des hématies ( O k o k o e t Ere, 2 0 1 2 ) . L'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s a révélé u n effet protecteur contre l ' h é m o l y s e induite par l e peroxyde d'hydrogène. D e plus, plusieurs études ont prouvé que certains des

c o m posés p h é n o l i q u e s , n o tam m e n t l e s flav o n o ïdes possèdent des propriétés a n t i r a d i c alaires, e n neutralisant o u e n piégeant les radicaux libres ( H a t i a e t a l ., 2 0 1 4 ) . E n outre, les p o l y p h é n o ls

s o n t c o n n u s c o m m e c h é l a t e u r s d e m é t a u x d e t r a n s i t i o n t e l s q u e l e F e , r é d u i s a n t a i n s i l a vitesse

d e réaction d e Fenton par transfère d'électrons. Ils peuvent aussi empêcher les oxydations causées par l e radical hydroxyle ( T s a o , 2 0 1 0 ) e t empêcher l e passage d e H ₂ O ₂ à travers l a membrane é r y t h r o c y t a i r e e t l a génération des radicaux libres ( H a p n e r e t a l ., 2 0 1 0 ) . A u cours d e cette étude, nous avons obtenu u n taux maximal d'inhibition d e 3 6 ,7 6 #177; 1 ,2 7 % avec l a concentration 1 6 0 0 u g / m L d'extrait d e spiruline. C e taux est inférieur à celui obtenu par C h a k r a b o r t y e t Shah. ( 2 0 1 1 ) ( 4 0 ,6 % ) avec 5 0 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t d e feuilles d e Fiber betel, inférieur à 5 4 % pour l'extrait d e A c a l y p h a indica à 2 0 0 0 0 u g / m L ( K a d a l i e t a l ., 2 0 1 6 ) . E t supérieur à 1 5 ,7 0 #177; 0 .5 3 % obtenu par O k o k o e t Ere. ( 2 0 1 2 ) avec 2 0 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t b r u t d e C a r i c a papaya L a différence d ' e f f e t i n h i b i t e u r e n t r e l a concentration 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g /m L s'expliquerait par l e fait que l e H ₂ O ₂ est u n puissant pro-oxydant e t nécessite d e forte concentration d ' a n t i o x y d a n t p o u r s a neutralisation ( M ilane e t a l . , 2 0 0 4 ) .

Les résultats d e l'hémolyse induite par l e triton X - 1 0 0 à différentes concentrations d u détergent montrent une h é m o l y s e significative ( p < 0 ,0 5 ) entre l'effet d u triton X - 1 0 0 aux c o n c e n t r a t i o n s u t i l i s é e s e t l e contrôle n é g a t i f p o u r l e q u e l l e triton est remplacé par l e PBS. A l a concentration 1 % d e d é t e r g e a n t i l y a une hémolyse maximale e t significative à ( P = 0 ,0 0 ) avec u n taux d e 1 0 0 % , c e résultat corrobore celui d e P r e t é e t a l . ( 2 0 1 1 ) qui ont obtenu 1 0 0 % hémolyse à l a concentration 1 M m d e triton X - 1 0 0 . Cette hémolyse totale serait due à l a nature chimique due triton X - 1 0 0 . E n e f f e t l e triton X - 1 0 0 a l a capacité d e p e r t u r b e r l a membrane des

globules rouges e t des cellules e n général. C'est u n détergent d e synthèse non ionique qui est constituée d'une partie polaire hydrophile e t d'une queue h y d r o p h o b e . L e s m o l é c u l e s d u triton X - 1 0 0 entrent e n interaction avec les parties hydrophobes des lipides d e l a membrane é r y t h r o c y t a i r e j u s q u ' à saturation, c e q u i p r o v o q u e l'extraction des lipides e t p u i s l a perturbation

d e l'organisation d e l a m e m b r a n e . A des concentrations très élevée, les globules rouges seront totalement solubilisés sous forme d e micelles o u d e liposomes ( M u t h u e t durais, 2 0 1 5 ) . Cependant, l'étude des propriétés a n t i h é m o l y t i q u e s d e l'extrait sur l'effet d u triton X - 1 0 0 à l a concentration 1 % , m o n t r e que l ' e x t r a i t e t l a q u e r c é t i n e o n t d e s activités inhibitrices d ' h é m o ly s e très p r o n o n c é e s . E n e f f e t , l ' a n a l y s e statistique d e comparaison d u pourcentage d'hémolyse d u t é m o i n négatif sans l'extrait e t sans l a q u e r c é t i n e à ceux d e l'extrait e t d u standard ( q u e r c é tine) à l a 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L montre qu'à l a concentration 8 0 0 u g / m L , seul l'extrait inhibe s i g n i f i c a t i v e m e n t ( P = 0 ,0 3 0 ) l ' h é m o ly s e induite par l e triton 1 % . E n revanche, à l a concentration 1 6 0 0 u g / m L , l'extrait e t l a q u e r c é t i n e inhibent significativement ( P < 0 ,0 5 ) l ' h é m o l y s e . Ceci montre q u ' i l y a une corrélation positive entre l a concentration e t l ' a c t i v é inhibitrice d e l'extrait

e t d u standard s u r l ' h é m o l y s e i n d u i t e p a r l e triton X - 1 0 0 à 1 % : p l u s l a concentration e s t g r a n d e plus grand est l e taux d'inhibition d e l ' h é m o l y s e . L e taux maximal d'inhibition 4 5 ,9 5 #177; 1 0 ,7 1 % obtenu pour l a concentration 1 6 0 0 u g / m L avec l'extrait d e spiruline sera alloué à l a capacité des p o l y p h é n o l s d e l'extraits d e spiruline d ' i n t e r a g i r a v e c les pôles polaires externe d e l a b i c o u c h e lipidique e t empêcher leur solubilisation par le d é t e r g e n t e t donc prévenir l'hémolyse o u alors leur capacité à recouvrir l a membrane e t empêcher l e triton d e s'infiltrer dans l a b i c o u c h e lipidique e t par conséquent empêcher l a solubilité m e m b r a n a i r e . C e taux est supérieur à 1 4 ,9 7 #177; 0 ,1 5 % obtenu par A m r a n e e t A o u a r t i l a n e . ( 2 0 1 8 ) à une concentration d e 1 5 0 0 u g / m L avec les extraits des feuilles d ' E c b a l l i u m e l a t e r i u m .

L'étude d e l'hémolyse induite par l a solution hypotonique sur les hématies d r é p a n o c y t a i r e s m o n t r e que l e maximum d'hémolyse a été obtenu à l a concentration 0 ,3 5 % d e N a C l avec u n taux d'hémolyse d e 7 8 ,0 5 #177; 8 ,1 0 % . I l ressort qu'il y a une corrélation négative entre l a concentration e n sels e t l e pourcentage d ' h é m o l y s e : plus l e milieu est concentré e n N a C l plus l e taux d'hémolyse des globules diminue. E n effet l'activité hémolytique l a plus élevée est observée dans l e milieu l e moins concentré, Nos résultats corroborent ceux d e N k e n m e n i e t a l . ( 2 0 1 9 ) qui ont obtenu e n absence d e l'extrait une hémolyse hypotonique d e 8 0 % ; 1 6 % pour les concentrations d e N a C l 0 ,3 5 % e t 0 ,8 5 % respectivement. Ceci s e justifie par l e fait que dans l e milieu isotonique les concentrations e x t r a c e l l u l a ir e s s o n t p r e s q u e égales à celles intracellulaires ; dans cette condition, i l y a pratiquement équilibre d e pression

osmotique entre les deux milieux. Par contre, dans l e milieu hypotonique l a concentration e x t r a c e l l u l a i re est faible par rapport à celle intracellulaire e t i l y a déséquilibre d e l a pression o s m o t i q u e . I l e n résulte une pénétration d e l'eau dans l a cellule afin d ' é t a b l i r l ' é q u i l i b r e . C e t t e pénétration progressive f i n i t p a r l y s é l a membrane cellulaire au-delà d'un certain seuil. Dans notre étude, les résultats d e l'évaluation d e l'activité d'inhibition d e l'extrait e t q u e r c é t i n e sur l'hémolyse induite par l a solution hypotonique N a C l 0 ,3 5 % montre que les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d'extrait e t d e q u e r c é t i n e inhibent s i g n i f i c a ti v e m e n t l ' h é m o l y s e . L e s taux d'inhibitions suivants ont été obtenu pour les concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L d ' e x t r a i t 8 0 #177; 8 ,6 6 % ; 7 1 ,2 5 % r e s p e c t i v e m e n t . N o s r é s u l t a t s s o n t s i m i l a ir e s à 7 6 ,6 6 % o b t e n u p a r A m r a n e e t A o u a r t i l a n e . ( 2 0 1 8 ) avec l'extrait d ' E c b a l l i u m e l a t e r i u m à l a concentration d e 1 0 0 0 u g / m L . L ' e f f e t a n t i h é m o l y t i q u e d e l ' e x t r a i t d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l'hémolyse induite par la solution hypotonique pourrait être soit attribué à s a richesse e n sels minéraux A m a e t a l . ( 2 0 1 6 ) qui é t a b l i t l ' é q u i l i b r e d e concentration e t d e pression o s m o t i q u e , s o i t à s a capacité d e s e fixer sur l ' a q u a p o r i n e e t e m p ê c h e r l ' e a u d'entrer dans l'hématie ( L o u e r r a d e t a l ., 2 0 1 6 ) .

CONCLUSION E T PER SPE C T I V E S

CONCLUSION E T PERSPECTIVES

Parvenu, a u term e d e cette étude dont l'objectif était d e d é t e r m i n er les propriétés a n t i f a l c é m i a n te s e t a n t i h é m o l y t i q u e s d e l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s d u C a m e r o u n , i l e n ressort que : l'extrait aqueux d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s d u Cam e r o u n ,

? Possède les propriétés a n t i f a l c é m i a n te s , p e r m e t l a réversibilité de la f a l c i f o r m a t i o n avec

u n effet dose-dépendant. les meilleures activités obtenues aux concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L .

? Possède é g a l e m e n t les propriétés a n t i h é m o l y t i q u e s sur différents d'inducteurs d e l ' h é m o l y s e à des concentrations 8 0 0 u g / m L e t 1 6 0 0 u g / m L avec les taux d'inhibition variant d e 3 6 % à 9 6 %

? L'étude d e l'effet d e l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l e potentiel d'inhibition d e l a

? L'étude d e l'effet d e l'extrait d e S p i r u l i n a p l a t e n s i s sur l e rapport F e 2 + / F e 3 +

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ANNEXES

Annexe I : Autre M a t é r i e l

Cellule d e M a l a s s e z , s p e c t r o p h o t o m è t r e (J e n w a y ) , balance électronique ( J A 2 0 0 3 N ) ,

lyophilisateur, microscope ( Olympus), centrifugeuse ( 9 0 - 3 ) , lame, lam elle, papier aluminium, tubes à e s s a i s , t u b e s E D T A , tubes e p p e n d o f f , barreau aim a n t é ( R o u c a i r e ) , a g i t a t e u r m a g n é t iq u e

( I K A - C M A - H S 7 ) , balance électrique ( M E T T L E R TOLEDO E L 6 0 2 ) , p H mettre, ( P H S - 5 5 0 ) ,

v o l t e x ( T o p r i x F B 1 5 0 2 4 ) , papier filtre w a t t m a n 4 , ainsi que les a u t r e s v e r r e r i e s d e laboratoire.

Annexe I I : Pourcentage d e f a l c i f o r m a t i o n e n fonction d u temps d'incubation à l a c o n c e n t a t io n

Annexe III : Pourcentages e t taux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a ti o n obtenus après 2 h à différente s concentrations.

Concentrations ( u g / m L )	Initial		Témoin ( - )		1 0	0		2 0 0		4 0 0		8 0 0		1 6 0	0
% d e f a l c i f o r m a t i o n extrait	5 4 , 4	6	6 4 , 9		4 5	, 8 5		4 4 , 2		3 9 , 4	1	3 4 , 5		3 2 ,	8 6
après 2 h ( % )	#177; 3 , 2	5	#177; 1 , 3		#177; 1	0 , 1	7	#177; 6 , 9	6	#177; 7 , 9	8	#177; 4 , 1	0	#177; 4	, 8 2
% d e f a l c i f o r m a t i o n phénylalanine après 2 h ( % )	5 4 , 4 #177; 3 , 2	6 5	6 4 , 9 #177; 1 , 3		4 6 #177; 3	, 3 5 , 7 3		4 1 , 4 #177; 2 , 3	4 1	4 1 , 2 #177; 3 , 7	1 3	3 7 , 9 #177; 4 , 3	4 8	2 4 , #177; 1 ,	4 7 6 7
Taux d e réversibilité extrait a p r è s 2 h ( % )	0 0 , 0 #177; 0 , 0	0 0	- 1 9 , #177; 1 , 2	1 7 9	1 5 #177; 1	, 2 , 1 4		1 5 , 1 #177; 1 , 7	6 1	2 8 , 1 #177; 3 , 3	5 4	3 7 , 5 #177; 6 , 3	4 5	3 9 , #177; 2 .	7 5 3 1
Taux d e réversibilité d e phénylalanine après 2 h ( % )	0 0 , 0 #177; 0 , 0	0 0	- 1 9 , #177; 1 , 2	1 7 9	1 0 #177; 2	, 4 4 , 9 9		2 3 , 2 #177; 2 , 9	6 5	2 4 , 6 #177; 9 , 9	1 3	3 2 , 1 #177; 3 , 2	6 5	4 5 , #177; 8 ,	9 6 8 1

Annexe I V : Pourcentages e t taux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t io n obtenus après 4 h à différente s concentrations.

Concentrations ( u g / m L )	Initial			Témoin (-)			1 0 0		2 0	0		4 0 0		8 0 0		1 6 0 0
% d e f a l c i f o r m a t io n extrait	5 4	,4	6	6 7	,8 2		3 7 ,0	1	3 3	,1 1		2 7 ,8	9	3 0 ,4	5	2 2 ,0	5
après 4 h ( % )	#177; 3	,2	5	#177; 3	,1		#177; 4 ,8		#177; 2	,0 2		#177; 3 ,6	8	#177; 3 ,8	4	#177; 3 ,9	7
% d e f a l c i f o r m a tio n	5 4	,4	6	6 7	,8 2		4 1 ,4	4	3 1	,1 6		3 3 ,4	5	3 1 ,6	5	2 0 ,4	9
p h é n y l a l a n i n e a p r è s 4 h ( % )	#177; 3	,2	5	#177; 3	,1		#177; 1 ,3	5	#177; 2	,7 5		#177; 5 ,1	8	#177; 4 ,1	3	#177; 3 ,2	6
Taux d e réversibilité extrait	0 0	,0	0	- 2	4 ,5	3	2 4 ,9	2	3 9	,0 4		4 8 ,9	3	4 4 ,2	2	5 9 ,3	8
après 4 h ( % )	#177; 0	,0	0	#177; 5	, 2 1		#177; 4 ,0	2	#177; 1	7 ,3	6	#177; 6 ,8	0	#177; 6 ,8	3	#177; 7 ,4	2
Taux d e réversibilité d e	0 0	,0	0	- 2	4 ,5	3	2 3 ,6	8	4 1	,7 6		3 8 ,8	4	4 2 ,0	2	5 5 ,3	7
phénylalanine après 4 h ( % )	#177; 0	,0	0	#177; 5	,2 1		#177; 8 ,8	1	#177; 3	,2 5		#177; 9 ,9	3	#177; 2 ,9	5	#177; 2 ,9	9

Annexe V : Pourcentages e t taux d e réversibilité d e l a f a l c i f o r m a t i o n obtenus après 2 4 h à différente s concentrations.

C o n c e n t r a t i o n s ( u g / m L )	Initial			T é m o i n ( - )			1 0 0		2 0	0		4 0	0		8 0 0		1 6 0 0
				7 2	,0 2
% d e f a l c i f o r m a t io n extrait	5 4	,4	6				3 6 ,0	3	2 8	,6		2 4	,9	1	1 3 ,6	1	9 ,5 7
				#177; 1	,2
après 2 4 h ( % )	#177; 3	,2	5				#177; 5 ,3	5	#177; 6	,1 5		#177; 3	,4		#177; 4 ,5	4	#177; 3 ,1	0
				7 2	,0 2
% d e f a l c i f o r m a tio n	5 4	,4	6				3 7 ,5	1	3 5	,1 6		2 5	,5	9	2 3 ,0	9	2 0 ,4	9
				#177; 1	,2
phénylalanine après 2 4 h ( % )	#177; 3	,2	5				#177; 4 ,7	8	#177; 5	,4 7		#177; 3	,0	1	#177; 3 ,4	7	#177; 3 ,2	5
				- 3	2 ,2	4	3 3 ,7	6
Taux d e réversibilité extrait	0 0	,0	0						4 7	,4 3		5 4	,0	6	7 4 ,8	9	8 2 ,3	4
				#177; 3	,6 2		#177; 1 0	,2
après 2 4 h ( % )	#177; 0	,0	0						#177; 1	1 ,0	5	#177; 7	,1	4	#177; 8 ,5	3	#177; 5 .6	3
							2
				- 3	2 ,2	4	3 1 ,6	2
Taux d e réversibilité d e	0 0	,0	0						4 5	2 ,6		4 9	,0	3	6 2 ,4	5	7 7 ,4	4
				#177; 3	,6 2		#177; 1 1	,2
phénylalanine après 2 4 h ( % )	#177; 0	,0	0						#177; 5	,2 9		#177; 8	,4	4	#177; 8 ,0	3	#177; 3 ,2	2
							7

Annexe V I : Notice d'informations des participants e t c o n s e n t e m e n t éclairé pour participer à

TITRE: Investigation des propriétés a n t i f a l c é m iantes i n vitro d e l'extrait aqueux d u s p i r u l i n a p l a t e n i s

Investigateur Principal: T E G U E M T C H O U L E G H E U APO LL I NAIRE ( étudiant e n

M aster B i o c h i m i e , f a c u l t é des s c i e n c e s , u n i v e r s i t é d e Yaoundé I

T é l : 6 9 3 1 3 2 7 9 0 mail: t e g u e m a p o l l i n a ir e @ g m a il .o m

E n c a d r e u r : P I E M E CONSTANT A N A T O L E ( M a i t r e d e Conférence à l'université d e Y a o u n d é 1 ) .

Cette recherche a pour but d ' i n v e s t i g u e r l'effet a n t i f a l c é m i a n t e s e t a n t i o x y d a n t e s i n vitro d e l'extrait aqueux d u s p i r u l i n a p l a t e n s i s

- une fiche d'identification v o u s s e r a r e m i s e e t i l y aura u n entretien entre vous e t l ' i n v e s t i g a t e u r;

- une petite quantité d e sang ( 4 ,5 m l ) sera prélevée dans u n tube contenant d e l ' E D T A par

ponction veineuse à votre pli d u coude par u n personnel q u a l i f i é , a p r è s nettoyage préalable d e

l ' e n d r o i t p a r l ' a l c o o l . L e sang collecté sera acheminé a u Laboratoire d e Biochimie d e l a Faculté d e M é d e c i n e e t des Sciences Biomédicales ( F M S B ) d e l'Université d e Yaoundé l o ù les tests a n t i f a l c i m i a n t s seront effectués.

L a participation à l'étude est volontaire. Vous êtes libre d'accepter o u d e refuser. Une fois engagée dans l ' é t u d e , v o u s pouvez à t o u t m o m e n t l a q u i t t e r s a n s être c o n t r a i n t d ' y rester.

S i les résultats escomptés sont c o n f i r m é s , i l s ' a g i t l à d'un départ p o u r l a mise a u point d'un

Cela devra perm e t t r e à brève échéance d'initier l e t r a i t e m e n t d e l a d r é p a n o c y t o s e .

Les résultats issus d e notre étude constitueront une base d e données qui sera exploitée par les

i n v e s t i g a t e u r s , p r é s e n t é e p u b l i q u e m e n t ( dans l e cadre d e l a soutenance d e M aster) e t m ê m e publiée dans des journaux e t revues scientifiques e t n e fera jamais l'objet d'une forme d e m a r k e t i n g .

Très peu d e risques, voire aucun n'est connu à l'exception d e l a petite douleur qu'on pourra r e s s e n t i r p e n d a n t l a prise d e sang. Cette prise sera effectuée par u n p e r s o n n e l m é d i c a l qualifié ( infirmier o u technicien d e laboratoire), e n r e s p e c t a n t l a procédure standard avec m a t é r i e l s t é rile e t à usage unique.

S i a u cours d e cette étude vous croyez avoir été l é s é , n ' a v o i r pas e u les bénéfices p o t e n t i e l s , o u bien n'avoir pas été informé d e certains aspects néfastes liés à l'étude o u à votre droit bafoué, vous serez libre d e vous plaindre auprès d u directeur d e l'institution hospitalière, auprès d u Comité National d ' E t h i q u e o u d u M i n i s t è r e d e l a Santé Publique a u Cam e r o u n .

L a participation à cette étude est libre e t non payante. L a fiche individuelle, l e form u l a i r e d e c o n s e n t e m e n t é c l a i r é e t les protocoles d'analyses vous s e r o n t d o n n é s g r a t u i t e m e n t . A u s s i b i e n , les participants à cette étude n e devront pas être payés.

j e soussigné ... ... ... ... ... ... ... ... .... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... a v o i r informé l e

participant ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... s u r l a nature, l e caractère volontaire, les bénéfices éventuels d e l'étude, l a procédure devant être utilisée pour s a réalisation, e t les risques éventuels quelques minimes qu'ils soient. I l lui a été demandé d e poser des questions sur les différents aspects d e l ' é t u d e . L e s réponses ont été c l a i r e s , p r é c i s e s e t sans ambiguïté.

J e soussigné ...................................................déclare avoir été bien inform é d e l a nature, d e l a procédure, des bénéfices e t risques éventuels d e l'étude « investigation des propriétés a n t i f a l c i m i a n t e s i n vitro d e l'extrait aqueux d u s p i r u l i n a p l a t e n s i s » . J ' a c c e p t e d e participer v o l o n t a i r e m e n t à cette étude e t j e serai libre d e l a quitter à tout moment sans porter préjudice aux bénéfices que j e pourrai e n tirer des résultats d e l'étude.

I n v e s t i g a t e u r P a r t i c i p a n t o u r e p r é s e n t a n t l é g a l d u patient

Annexe VII: Clairance éthique

Le Comité Régional d'Ethique de la Recherche pour la Santé Humaine du Centre ICRERSWC) a reçu fa demande de clairance éthique pour le projet de recherche intitulé a Investigation de' propriétés entlrerclrniantes In vitro de l'extrait aqueux du spiruline platensis (Cysnobectereceee)r

Aprés son évaluation, il ressort que le sujet est digne d'interét, les oblecuts sont bien définis et la procédure de recherche ne comporte pas de méthodes Invasives prepudiciables aux participants Par ,ailleurs. le formulaire de consenlement éclairé destiné aux participants est acceptable

Pour ces raisons, le Comité Régional d'eMique approuve pour une pér ode de six 06) mas. le mise en oeuvre de la présente version du protocole

L Interessé est responsable du respect scrupuleux du protocole et ne devra y apporW 7111.1=1 amendement aussi mineur soit-il sans l'avis favorable du Comité Régional attique. En off
· d

collaborer pour toute descente du Comité Regional d'éthique pour le suie de la 121tre en oeuvre du protocole approuve

et soumettre le rappel final de I élude au Comte Régional d'éthique et aux aulnes compétentes conoemées par l'élude

La présente clairance peut étre retirée en cas de Iton-respect de la ngfementa0on en nuour N des directives sus mentionnées

En foi de quoi la présente Clairance Ethlque est dééwée pour SO M et vicie ce que de droit

Annexe I I X : Accord d e principe

je Iowa mar Pi eri e1.tii IVIUDA 1⁷Ycml jalepk. Pii te 4r 3 l 1tC'VitAl Central de l'iounde. ntarlaue m0i1 anon i* ytrur la recherche de iix U 4S ICROULZGHEAJ Apothriatea, ehutiait Miniver** de Y+roua& L laus le 'hem .

I1V TIL ATK*1 1.45 iibjf3llL'lis Attn1'ALt LPALANTLIM' HMV 1311 AOLIE ` L'
31911.12.4A POLAr[N5[5 Wysrent>tltletwe , r; derts k iervice iiLlernatok ie dr Cnitt»l da l'lroundc x 1s is Ftilli infi. LD11 du &cleelr CFHETÇHA lrriiuni. War Wit durec d 1I rnc».

Ciltitercat CV tenu au strict rsapcct du reglemenl imeneur de lliOdai Ciattroti cie Yuoaindi.

Ei foi de quoi. la presents aufonsatioai hxii eat deJsmbe pour 'emir el vnk~~r Ct qur de mei.