II.5.2 Méthodes
II.5.2.1 L'interrogatoire des parents ou tuteurs
Les responsables des enfants préalablement
informés et consentants étaient soumis à un questionnaire
(voir annexe 3) par l'investigateur principal et/ou les enquêteurs.
II.5.2.2 Le prélèvement et l'examen
biologique des selles
? Collecte des selles
Pour chaque enfant inclus dans l'étude, un
échantillon de selles fraiches a été prélevé
dans une boite stérile telle qu'habituellement effectué pour les
examens de routine et acheminé au laboratoire d'analyse médical
de l'hôpital. Des écouvillonnages rectaux été
réalisés chez les nouveau-nés et les enfants chez qui il
été difficile d'obtenir un échantillon de selles par
émission normale. L'acheminement des selles au laboratoire se faisait
immédiatement après la collecte par l'investigateur principal
à l'aide d'un porte vaccin contenant les pots de coproculture, sur
lesquels étaient mentionnés les éléments
d'identification des enfants (codifiés), accompagnés de la fiche
de suivi au laboratoire conçue pour la cause. Sur chaque
échantillon de selle deux types de tests ont été
effectués: la recherche des virus et la recherche des parasites
intestinaux (formes végétatives, oeufs et kystes (KOAP).
? Examens biologiques des selles
Les examens biologiques ont été
réalisés sur les paillasses de sérologie et de
parasitologie du laboratoire l'Hôpital Régional de Bertoua. Pour
le bon déroulement de l'étude il a été
établit au sein du laboratoire un protocole qui contenait les
procédures à suivre concernant les techniques.
- Recherche des parasites dans les échantillons
de selles prélevés
Cet examen a été fait dans l'heure qui suivait
l'arrivée des prélèvements au laboratoire. Il s'agissait
d'un examen simple sans concentration. Nous faisions : un examen macroscopique
qui permet de classer les selles selon leur aspect en (pâteuses,
semi-liquides avec présence ou non de glaire, liquides) et leur couleur
(jaunâtre, verdâtres, brune, blanchâtre,
décolorée) ; un
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Diarrhées chez les enfants de 0 à 5 ans à l'Hôpital
Régional de Bertoua.
examen direct entre lame et lamelle à l'état
frais dans du sérum physiologique, puis dans une solution de Lugol.
Principe
L'examen direct dans du sérum physiologique permet de
mettre en évidence les formes végétatives, vivantes et
mobiles des protozoaires ainsi que leurs kystes, mais également les
oeufs ou les adultes des helminthes. L'observation de toute la lame se fait
d'abord a l'objectif 10× puis a l'objectif 40×. La coloration (au
Lugol) permet d'une part de différencier les kystes d'Entamoeba
histolytica (noyaux colore en jaune) de ceux d'Entamoeba
coli, et d'autre part de bien distinguer les kystes de Giardia (forme du
kyste bien nette).
Mode opératoire
Nous avons prélevé à plusieurs endroits
(2 à 3 endroits selon l'aspect des selles) de l'échantillon de
selle une petite quantité de selle. Ce prélèvement a
été étalé sur une lame porte objet portant une
goutte d'eau physiologique à une extrémité et une goutte
de Lugol à l'autre, puis les étalements ont été
recouvert par des lamelles 22x22, et les préparations (non
épaisses) ont été observées au microscope optique
respectivement à l'objectif 10× et 40× en commençant
par celle faite avec le sérum physiologique.
- Recherche des virus dans les échantillons de
selles prélevés
Tous les prélèvements étaient
destinés à la recherche des rotavirus. Le test utilisé
était celui le « Vikia Rota-Adéno bioMérieux »
qui permet de rechercher respectivement les rotavirus et Adénovirus dans
les échantillons de selles par l'intermédiaire d'une technique
immunochromatographique sur membrane. Ce sont des tests spécifiques qui
présentent une rapidité et une facilité d'exécution
excellentes.
Principe
Vikia Rota-Adeno est un test qualitatif basé sur
l'association d'anticorps monoclonaux spécifiques respectivement de
rotavirus et d'adénovirus. Ce test repose sur un système de
réactions immunologiques réalisées sur une bandelette par
migration (format ICT ou lateral flow) [notice du test].
Le test est composé :
? d'une cassette plastique contenant :
o Une membrane de chromatographie sur laquelle sont fixés
:
? dans la zone de test, un anticorps monoclonal anti-rotavirus
(zone «R ») et un anticorps monoclonal anti-adénovirus (zone
« A »)
? dans la zone de contrôle, un anticorps polyclonal
anti-IgG de souris (zone « C »)
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Régional de Bertoua.
o Un support imprégné d'un conjugué
constitué du mélange d'un anticorps monoclonal anti-rotavirus
couplé à des microsphères de polystyrène de couleur
bleue et d'un anticorps monoclonal anti-adénovirus couplé
à des microsphères de polystyrène de couleur rouge.
> Un flacon de tampon de dilution des selles :
Tampon phosphaté (pH 7,2) + azoture de sodium 0,9 g/l
prêt à l'emploi.
L'échantillon émulsionné dans le tampon de
dilution du test est introduit au niveau du puits échantillon et migre
par capillarité le long de la membrane.
? Si l'échantillon contient des rotavirus, ceux-ci
forment un complexe antigène-anticorps avec les anticorps
spécifiques de ce virus présents sur les microsphères de
polystyrène de couleur bleue.
? Si l'échantillon contient des adénovirus,
ceux-ci forment un complexe antigène-anticorps avec les anticorps
spécifiques de ce virus présents sur les microsphères de
polystyrène de couleur rouge.
Les complexes antigène-anticorps migrent le long de la
membrane et se fixent aux anticorps anti-rotavirus et/ou aux anticorps
anti-adénovirus, formant des complexes visualisés par une ligne
bleue et/ou rouge dans la zone de test respectivement « R » et/ou
« A » de la membrane.
L'absence de cette/ces ligne(s) suggère un résultat
négatif.
A titre de contrôle, une ligne de couleur apparaîtra
toujours dans la zone de contrôle
« C » si le test a été effectué
correctement.
Préparation des échantillons
> Dévisser le bouchon du flacon de dilution et
extraire la tige nécessaire au prélèvement de la selle.
> Prélever une quantité d'environ 50 mg de
selle (soit l'équivalent d'un quart de petit pois) à l'aide de la
tige du flacon.
> Introduire cet échantillon dans le flacon contenant
le tampon de dilution.
> En cas de selle liquide, prélever la selle
à l'aide de la pipette et distribuer 2 gouttes de cet échantillon
(environ 50 micro litres) dans le flacon contenant le tampon de dilution.
> Revisser le bouchon du flacon de dilution.
> Agiter vigoureusement jusqu'à
homogénéisation.
Mode opératoire
> Retirer la cassette du sachet scellé et l'utiliser
rapidement
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Régional de Bertoua.
> Placer la cassette sur une surface plane et propre
> Casser l'embout du flacon contenant l'échantillon
dilué
> Renverser le flacon et tenir verticalement.
> Transférer 2 gouttes d'échantillon
dilué (environ 80 micro litres) dans le puits
échantillon de la cassette et déclencher le
chronomètre.
> Eviter la formation de bulles d'air dans le puits.
> Attendre l'apparition de la ligne de contrôle
« C » et éventuellement des lignes « R
» et/ou « A ».
> Lire le test 10 à 15 minutes après avoir
déposé l'échantillon.
a b
Figure 12: Photos des échantillons de selles et
kits pour le test de rotavirus et adénovirus
La photo 'a'' montre les échantillons de
selles d'enfants et 2 kits de vikia rota-adenovirus prêts à
l'emploi ;
La photo 'b'' indique le transfert de 2 gouttes de
l'échantillon dilué dans le puits de la cassette.
Interprétation des résultats
> Résultats positifs : deux ou
trois lignes distinctes apparaissent : une dans la zone de contrôle (C),
et/ou deux dans la zone de test, bleue en R et/ou rouge en A.
o Si présence d'une ligne bleue en R :
l'échantillon est positif en rotavirus (photo a).
o Si présence d'une ligne rouge en A :
l'échantillon est positif en adénovirus (photo b)
o Si présence des deux lignes, bleue en R et rouge en
A : l'échantillon est positif en rotavirus et adénovirus. (photo
c)
> Négatifs : Une ligne
colorée apparaît dans la zone de contrôle (C). Aucune ligne
n'apparaît dans la zone de test R et A. (photo d)
> Non valide : la ligne de contrôle
n'apparaît pas.
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Régional de Bertoua.
a b
c d
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Figure 13: Photos montrant les différents
résultats possibles avec le test après lecture.
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