Memoire Online - Caracterisation genetique de glossina pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de campo du sud forestier camerounais

GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris Licencié-ès Science en Biochmie Matricule : CM04-09SCI1597

THESE DE MASTER OF SCIENCE (M.Sc) EN BIOCHIMIE DE M. GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris

Je soussigné, Pr. TUME Christopher, Président du jury de thèse de Master de GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris, certifie que la thèse de Master of Science présentée publiquement le 02 février 2016 à Université de Dschang, par GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris pour l'obtention du diplôme de Master of Science (M.Sc) en Biochimie, option Biochimie Clinique intitulé « Caractérisation génétique de Glossina pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de Campo du Sud forestier camerounais » a été corrigée selon les recommandations des membranes de jury.

En foi de quoi la présente attestation est délivrée pour servir et valoir ce que de droit.

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Je soussigné, GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris, matricule CM04-09SCI1597, atteste que la présente thèse est le fruit de mes propres recherches effectuées à l'Unité de Parasitologie et d'Entomologie Moléculaire du Département de Biochimie de la Faculté des Sciences de l'Université de Dschang en collaboration avec le Laboratoire de Biochimie, d'immunologie et de Biotechnologie de la Faculté de Médecine et des Science Biomédicales de l'Université de Yaoundé I et le laboratoire de biologie moléculaire de la Faculté des Sciences de l'Université de Yaoundé I, sous la direction de Dr. SIMO Gustave.

Cette thèse est authentique et n'a été antérieurement présentée pour l'acquisition de quelque grade universitaire que ce soit.

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Je dédie ce travail à mes parents papa Djoumsié Pierre et maman Nzogang Christine

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Avant toute chose, je rends gloire à DIEU qui m'a aimé et m'a aidé à mener ses travaux jusqu'à la fin.

Je ne saurais commencer sans remercier « l'European Foundation Initiative for Negleted Tropical Disease » (EFINTD), « l'Appui Intégré pour le Renforcement des Equipes Scientifiques du Sud » (AIRES-SUD) et UMR177 IRD-CIRAD, pour leurs appuis financiés

et le laboratoire de biologie moléculaire de la Faculté des Sciences de l'Université de Yaoundé I et le Laboratoire de Biochimie, d'immunologie et de Biotechnologie de la Faculté de Médecine et des Science Biomédicales de l'Université de Yaoundé I, qui m'ont offert un cadre idéal pour la réalisation de ce travail.

+ Dr. Simo Gustave, qui m'a donné l'occasion de réaliser les travaux de recherche dans le domaine de la biologie moléculaire. Vos critiques non seulement dans la compréhension des manipulations mais aussi dans la rédaction de ce mémoire m'ont permis de vaincre plusieurs difficultés. Je saisis cette occasion pour vous adresser ma profonde reconnaissance ;

+ Pr. Njiokou Flobert qui m'a donné cette opportunité d'exercer mes travaux de recherche au sein de son laboratoire ;

+ Pr. Kuiate Jules- Roger, Chef de département de Biochimie pour m'avoir autorisé à prendre une inscription en Master II. Je saisis cette occasion pour vous adresser ma profonde reconnaissance ;

+ Mr. Melachio Tanekou Trésor Tito, le principal mentor de ce travail, pour sa disponibilité, ses encouragements et ses apports techniques qui m'ont permis de comprendre l'utilisation des différents logiciels. Je ne saurais jamais vous remercier assez ;

+ Enseignants du département de biochimie pour leur encadrement et pour les énormes sacrifices fait pour notre formation académique. Il s'agit de : Pr. Gatsing Donatien, Pr. Kuete Victor, Pr. Telefo Phelix, Pr. Tume Christopher, Pr. Womeni Hilaire, Pr. Zambou Ngoufack François Dr. Agbor Esther, Dr. Biapa Prospère, Dr. Kaktcham Pierre Marie, Dr. Kengne Anne Pascale, Dr. Klang Julie, Dr. Kouitcheu Laure, Dr. Kuate Dieudonné, Dr. Mbaveng Armelle, Dr. Ngoh Newilah Gérard, Dr. Njateng Guy Sedar Senghor, Mme Goka Stéphanie, Mr. Innocent Mbulli Ali ;

+ Ainés de laboratoire pour leurs conseils et leurs soutiens techniques. Il s'agit de : Mme Tchouomene Labou Judith, Mr. Fogué Soubgwi Pythagore, Mme Kame Ginette, Mr. Noubouossie Sylvain, Mr. Tiofack Zebaze Arnol, Mr. Kanté Sartrien, et Mr. Ofon Elvis Amih;

+ Amis pour l'organisation et le travail en groupe. Il s'agit de : Natheu Kamhoua Cerge, Marbou Takougoum Wiliane, Wam Elvis Chongsi et Temgoua Jules;

+ Mr. Kenfack Michel et Mme Fouafack Fernande pour leur accueil chaleureux et leur encadrement qui m'ont aidé a surmonté mes difficultés durant mon séjour dans la ville de Yaoundé ;

+ Frères et soeurs Tsafack Tsanang Henri, Kouakam Hugues, Tekoudjou Jule-Fleury, Ngouomo-Guy Aurélien, Mekengmo Irène, Kengni Darine, Messop Zita et Fomo Dorinette pour leurs soutiens moraux ;

+ Tantes Noubouossie Thérèse, Kouguem Clotilde pour leurs soutiens moraux et financiers ;

+ Tous ceux qui de près ou de loin, ont contribué d'une manière ou d'une autre à la réalisation de ce travail. Merci infiniment.

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I.10.3. Les types de marqueurs moléculaires utilisés dans la génétique des populations 21

II.4.2.2. Séparation des produits amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 29

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Figure 7 : Distribution des espèces de glossines appartenant au groupe Fusca, Morsitans

Figure 8 : Carte du Foyer de la THA de Campo (Institut National de Cartographie

Figure 9: Différentes étapes de la PCR 27
Figure 10: Photo d'un gel d'agarose montrant les produits d'amplification des ITS1 de

différentes espèces de glossines. 33
Figure 11: Exemple de photo montrant les profils des bandes obtenues sur gel d'agarose et

illustrant les amplicons issus de l'amplification du locus 55.3. 35
Figure 12: Photo d'un gel de polyacrylamide montrant les profils des allèles obtenus pour

Figure 15: Valeurs de la FIS en fonction des loci et pour les populations de G. p. pallicera42

Figure 16: Les valeurs de la FIS en fonction des loci et pour les populations de G. p.

palpalis 42
Figure 17 : Courbe de régression des FIS en fonction des allèles nuls pour G. p. palpalis

43
Figure 18 : Courbe de régression des FIS en fonction des allèles nuls pour G. p. pallicera 43 Figure 19: Dendrogramme illustrant les différences et les similarités génétiques entre

les espèces de glossines 46
Figure 20: Dendrogramme illustrant les différences et les similarités entre les populations

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Tableau 1: Séquences et températures d'hybridation des amorces utilisées pour le

Tableau 2: Nombre de glossines amplifiées en fonction des espèces et des loci

Tableau 3: Nombre et pourcentage de G. p. pallicera et G. p. palpalis amplifiés à

Tableau 4 : Génotypes multilocus obtenus pour chaque glossine analysée et pour les

Tableau 5: Hétérozygotie et les valeurs de FIS en fonction des loci chez G. p.

Tableau 6: Hétérozygotie et les valeurs de FIS en fonction des loci chez G. p.

Tableau 9: Variation de FST entre les populations de différentes espèces. 48

Tableau 10 : Variation de FST entre les sous populations de G. p. pallicera 48

Tableau 11 : Variation de FST entre les sous populations de G. p. palpalis 49

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AIRES-SUD: Appui Intégré pour le Renforcement des Equipes Scientifiques du Sud

CIRAD : Centre de coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le

RESUME

Les Trypanosomiases humaines et animales africaines restent un problème majeur de santé au Cameroun. Ces maladies sont transmises par un vecteur appelé mouche tsétsé ou glossine. Glossina pallicera pallicera est une des espèces les plus répandue et responsable de la trypanosomose animale africaine (TAA) dans le foyer de Campo. Toutefois, très peu d'informations sont disponibles sur la biologie et la structure de ces populations de vecteurs. Pour mieux appréhender la structure génétique des populations de glossines du sud forestier camerounais, nous avons entrepris une étude sur la caractérisation moléculaire de Glossina pallicera pallicera du foyer de la Trypanosomiase Humaine Africaine (THA) de Campo.

Pour y parvenir, des prospections entomologiques ont été menées dans trois villages (Akak, Campo Beach et Rio Campo) du foyer de THA de Campo. Au cours de ces prospections des glossines ont été capturées à l'aide des pièges pyramidaux. La méthode du CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) a été utilisée pour extraire l'ADN des pattes des mouches tsétsé et par la suite, neuf marqueurs microsatellites ont été utilisés pour caractériser génétiquement G. p. pallicera.

Dans cette étude, 72 mouches tsétsé appartenant à 5 espèces différentes ont été utilisées: 45 Glossina pallicera pallicera, 17 Glossina palpalis palpalis, 4 Glossina submorsitans, 3 Glossina caligenea, 2 Glossina nigrofusca et une Glossina fuscipes. Parmi les neuf marqueurs microsatellites utilisés, quatre d'entre eux n'ont pas été considérés pour les études de génétique des populations parce que moins de 50% des échantillons ont été amplifiés par ces marqueurs. Pour les cinq marqueurs utilisés pour les analyses génétiques, le taux d'amplification variait d'un marqueur à l'autre: 91,11% pour 55.3 ; 97,77% pour PGP13 ; 97,77% pour GPCAG ; 95,55% pour C102 et 84,44% pour PGP24. Les cinq marqueurs microsatellites ont montré plusieurs génotypes de G. p. pallicera circulant dans les villages du foyer de la THA de Campo. Ces résultats indiquent des polymorphismes génétiques au sein des populations de G. p .pallicera du même village et des différents villages. Nos résultats ont révélé un déficit en hétérozygote non significatif (FIS (indice de fixation des individus dans les sous-populations) = 0,04 ; P = 0,31) entre les populations de G. p. pallicera. Cependant, un déficit en hétérozygote significatif (FIS = 0,145 ; P = 0,0001) a été observé pour les populations de G. p. palpalis. Ce déficit en hétérozygote serait dû à la forte variation entre les valeurs de FIS des différents marqueurs. Entre les sous-populations de G. p. pallicera, aucune différence significative n'a été observée pour les valeurs du FST (indice de fixation entre sous-populations de la population totale) indiquant l'absence de structuration au sein des sous-populations des différents villages. Néanmoins, des différences significatives ont été observées entre G. p. pallicera et d'autres espèces de mouches tsétsé.

Ces premières investigations portant sur la génétique des populations de Glossina pallicera pallicera ont révélé une absence de sous-structuration entre ces populations de vecteurs et différents génotypes circulant dans les villages du foyer de la THA de Campo.

Mots clés : marqueurs microsatellites, Glossina pallicera pallicera, PCR, génétique des populations

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ABSTRACT

Human and animal African trypanosomiasis remains a major health problem in Cameroon. These diseases are transmitted by a vector called the tsetse fly or Glossina. Glossina pallicera pallicera is one of the most widespread species and is responsible for animal African trypanosomosis (AAT) in the focus of Campo. However, very little information about its biology and population structure is available. In order to better understand the genetic structure of tsetse fly populations of the Southern Cameroon forest, we carried out a study on the molecular characterization of Glossina pallicera pallicera in the human African trypanosomiasis (HAT) focus of Campo.

For this purpose, we carried out entomological studies in three villages (Akak, Campo Beach and Rio Campo) of the HAT focus of Campo. Flies were captured using pyramidal traps. The CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) method was used to extract DNA from tsetse thy legs and thereafter, nine microsatellite markers were used to genetically characterize G. p. pallicera.

In this study, 72 tsetse flies belonging to 5 different species were used: 45 Glossina pallicera pallicera, 17 Glossina palpalis palpalis, 4 Glossina submorsitans, 3 Glossina caligenea, 2 Glossina nigrofusca and one Glossina fuscipes. Amongst the nine microsatellite markers used, four of them were not considered for the population genetics studies because less than 50% of samples were amplified by these markers. For the five markers considered for the genetic analyses, the amplification rate varied from one marker to another: 91.11 % for 55.3; 97.77 % for PGP13; 97.77 % for GPCAG; 95.55 % for C102 and 84.44 % for PGP24. The five microsatellite markers showed several genotypes of G. p. pallicera circulating in villages of the Campo sleeping sickness focus. These results indicate the genetic polymorphisms within G. p .pallicera populations of the same village and of different villages. Our results revealed no significant heterozygote deficiency (FIS (index of fixing of the individuals in the subpopulations) = 0.04; P = 0.31) between G. p. pallicera populations. However, a significant heterozygote deficiency (FIS = 0.145; P = 0.0001) was observed for G p. palpalis populations. This heterozygote deficiency could be due to strong variations between FIS values at different loci. Between G. p. pallicera subpopulations, no significant difference was observed for the FST (index of fixing between subpopulations of the total population) values; indicating no structuration within subpopulations of different villages. Nevertheless, significant differences were observed between G. p. pallicera and other tsetse flies species.

These first investigations on the population genetics of G p. pallicera have revealed an absence of sub-structuration between these vector populations and different genotypes circulating in villages of the Campo sleeping sickness focus.

Key words: Microsatellite markers, Glossina pallicera pallicera, PCR, population genetics

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INTRODUCTION

Les Trypanosomoses Africaines sont des maladies parasitaires causées par des protozoaires flagellés appelés trypanosomes. Ces parasites entrainent chez l'homme la trypanosomiase humaine africaine (THA) encore appelée maladie du sommeil, et chez l'animal la trypanosomose animale africaine (TAA) encore connue sous le nom de "nagana". Ces maladies constituent une entrave pour le développement de plusieurs pays africains. Les trypanosomes sont transmis aux mammifères par des piqûres d'insectes hématophages appelés mouches tsétsé ou glossines. Ces glossines responsables de la transmission des trypanosomoses africaines appartiennent au genre Glossina. Il existe plusieurs espèces de glossines et leur distribution est fonction des facteurs éco climatiques. Chaque espèce de glossine ne transmet qu'un nombre limité d'espèces de trypanosomes et la distribution des espèces de trypanosomes peut être liée à celle des glossines. De manière générale, la distribution des trypanosomoses africaines suit celle de leur vecteur et couvre environ 10 millions de Km², soit un tiers du continent africain (Brunhes et al., 1994).

La Nagana demeure un obstacle pour le développement de l'élevage et de l'agriculture en milieu rurale. On estime que 50 millions de bovins et 70 millions de petits ruminants sont exposés aux risques de la TAA (Trail et al., 1985). La productivité du bétail et l'utilisation des animaux pour l'agriculture (engrais, traction) sont également affectées. Alors que la population humaine augmente à raison de 3,2% par an, les productions de viande et de lait n'augmentent respectivement que de 1,4 et 2,3%. Ainsi, on estime qu'à partir du 21^ème siècle, une importation de 2 à 5 millions de tonnes de viande et de 10 à 15 millions de tonnes de lait pour un coût annuel de 15 milliards de dollars US serait nécessaire pour couvrir les besoins des populations vivant dans les pays où sévit la TAA (Pangui, 2001). Pour lutter contre les trypanosomoses africaines, deux principales stratégies sont déployées notamment l'utilisation des médicaments et la lutte contre le vecteur. Jusqu'à nos jours, seulement trois trypanocides sont disponibles et des résistances ont été signalées contre ces médicaments dans plusieurs pays africains. Quant à la lutte anti-vectorielle, plusieurs méthodes de lutte ont été développées: l'utilisation des insectes stériles (TIS) et des écrans, le piégeage (Cuisance, 1989), l'utilisation des insecticides s'est souvent heurtée aux écologistes à cause de la rémanence des produits utilisés et leur action négative sur la biodiversité (Koeman et Pennings, 1970). L'utilisation de certaines de ces techniques de lutte n'a donné des résultats positifs que dans des îles (Salano et al., 2010). Cependant, des tentatives visant l'éradication des populations de glossines continentales se sont soldées par des échecs, à cause de la grande capacité de dispersion des glossines qui ré-envahissent rapidement les zones traitées (Cuisance, 1985). Pour faire face à ce problème, des études sur la structure génétique des populations de vecteurs ont été envisagées. Au cours des dernières décennies, des outils

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moléculaires ont été développés pour caractériser les populations de glossines afin de mieux comprendre leur écologie et leur structure génétique. C'est dans ce contexte que des marqueurs microsatellites ont été identifiés pour affiner la caractérisation génétique des vecteurs. Les microsatellites sont des séquences d'ADN répétées en tandem se caractérisant par une hyper-variabilité et une abondance dans le génome (Schwenkebecker et al., 2004). Ils sont largement utilisés dans les études génétiques et phylogénétiques et ont déjà montré leur intérêt dans la caractérisation de plusieurs espèces de glossine (Schwenkebecker et al., 2004). Ces marqueurs ont notamment permis de confirmer l'isolement génétique des populations insulaires de glossines (Camara et al., 2006). Les méthodes de lutte déployées à partir des études sur la structure génétique des populations de glossines ont présenté un grand succès dans la région du Niayes au Sénégal (Solano et al., 2010).

En Afrique centrale et occidentale, des marqueurs microsatellites ont été utilisés pour analyser la structure génétique des populations de Glossina palpalis palpalis et Glossina palpalis gambiensis du Cameroun et du Burkina Faso respectivement. Ces travaux ont révélé une diversité génétique importante au sein des populations de ces glossines, et surtout un niveau de structuration lié à la distance géographique entre les populations étudiées (Melachio et al., 2011 ; Solano et al., 2000). La plupart d'études réalisées sur la structure génétique des populations de glossines se sont concentrées sur des glossines péri-domestiques responsables de la transmission des trypanosomes chez l'homme. Quant aux glossines trouvées essentiellement en zone forestière comme G. p. pallicera, très peu d'études génétiques ont été menées sur ces insectes malgré le fait que ces glossines soient responsables de la TAA. Il est évident qu'une étude sur la génétique des populations de G. p. pallicera améliorerait nos connaissances sur l'épidémiologie et la lutte contre des trypanosomoses animales.

L'objectif principal de ce travail est de faire une caractérisation génétique de G. p. pallicera afin de fournir des données sur la structure génétique des populations de ces vecteurs avec pour finalité d'obtenir des informations qui pourraient contribuer à la planification d'une lutte anti-vectorielle. De manière spécifique, nous avons:

? analysé le polymorphisme génétiquement au sein des populations de G. p. pallicera en utilisant des marqueurs microsatellites ;

? évalué le polymorphisme génétique de G. p. pallicera en comparaison à d'autres espèces de glossines.

? évalué la structuration génétique entre les populations de G. p. pallicera.

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I. REVUE DE LA

Au milieu du XVème siècle, les explorateurs portugais rapportèrent que les caravanes assurant le commerce de sel et d'or entre le désert du Sahara et l'Afrique occidentale devaient, au niveau du Mali, se débarrasser de leurs dromadaires qui étaient décimés lors de la traversée des zones à glossines (Cattand, 2001). Les conquêtes des Maures au XVIIème siècle furent bloquées au-delà du sud du Sahara à cause des chevaux qui périssaient suite aux attaques des glossines. Dès lors, toutes les expéditions s'effectuant à chevaux étaient freinées dès qu'elles devaient traverser les zones humides.

Les premières espèces de glossines ont été décrites en 1830 par Wiedemann (G. longipalpis) et Robineau-Desvoidy (G. p. palpalis) (Rageau et al., 1953 ). En 1850, le nom «tsétsé» fut introduit par Gordon Cumming dans son livre «Five years of a Hunter's Life in the Far Interior of Africa» ; cette onomatopée était utilisée par les indigènes au Botswana pour désigner les mouches, Glossina morsitans, qui décimaient les troupeaux de boeufs. C'est en 1857 que David Livingstone a évoqué le rôle des glossines dans la transmission de la maladie ; soupçonnant qu'elles injectaient un venin à leur hôte. En 1875, Louis Figuier écrivait «cette suceuse de sang sécrète, par une glande située à la base de sa trompe, un venin si actif que trois ou quatre mouches suffisent pour tuer un boeuf».

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Les premiers trypanosomes ont été découverts dans l'intestin de taons en 1680, dans le sang de truite en 1841, puis chez la grenouille, la taupe et le rat (Morlais, 1998). Leur intérêt médical ou vétérinaire n'a été démontré que plus tard. En 1880, Griffith Evans qui était un vétérinaire de l'armée Indienne, mit en évidence, chez des chevaux et chameaux malades, le parasite qui sera nommé plus tard Trypanosoma evansi ; montrant ainsi la pathogénicité de ce parasite. En 1894, Bruce trouva des trypanosomes dans le sang de bovins souffrant de nagana. Il réussit ensuite à infecter des chevaux avec des mouches tsétsé, démontrant alors le rôle vecteur des glossines (Cattand, 2001). T. b. brucei fut décrit en 1899 par Plimmer et Bradford.

Le premier cas de la THA a été enregistré au 14^ème siècle en Afrique et a été décrit par l'historien Ibn Khaldoun. Cet historien a parlé de la mort de l'empereur malien, sultan Mari Jata après une maladie caractérisée par une somnolence diurne prolongé (Williams, 1996). En 1734, l'anglais Akins publie le premier rapport médical sur la maladie du sommeil où il décrit plus précisément les stades avancés de la maladie, dénommée «sleeping distemper» (Cox, 2004). Livingstone (1852), missionnaire écossais soupçonne la relation entre une mouche et la maladie et rapporte l'existence de la maladie sur les rives du lac Tanganyika où il perdit tout le bétail après que celui-ci fût piqué par la mouche tueuse. En 1901, Forde découvre des trypanosomes (nommés Trypanosoma gambiense par Dutton en 1902) dans le sang d'un

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malade. Puis, Castellani en 1903 rapporte la présence du protozoaire dans le liquide céphalorachidien (LCR) de la majorité des malades. La même année, Bruce fournit la preuve que la maladie du sommeil est transmise par la mouche tsétsé. En 1910, Stephens et Fantham décrivent chez un patient de Rhodésie un nouveau trypanosome Trypanosoma rhodesiense. De morphologie différente, ce dernier s'avère plus virulent pour l'homme que T. gambiense et est transmis par la glossine (Mulligan, 1970). C'est en 1917 que la première équipe mobile de dépistage de la maladie du sommeil mis sur pied par le Docteur Eugene Jamot a vu le jour au Cameroun.

L'Afrique a connu trois grandes flambées de la maladie du sommeil (Laveissière et Penchenier, 2000). La première commence en 1885 au confluent des fleuves Oubangui et Zaïre et s'étend jusqu'au lac Victoria. Elle fait près de trois cent mille et cinq cent mille morts respectivement dans le bassin du Congo et les foyers Busoka. La deuxième commence en Afrique centrale et s'étend dès 1920 en Afrique de l'ouest. Devant l'ampleur de la situation, les autorités coloniales de l'époque prirent des mesures permettant la création d'équipes mobiles de dépistage et de traitement, l'instigateur fut le célèbre docteur Eugène Jamot. La pandémie fut alors maîtrisée. La réémergence des foyers historiques et l'émergence de nouveaux foyers marquent la troisième épidémie.

I.5. Répartition géographique des trypanosomoses africaines

La distribution des trypanosomoses africaines suit celle de leur vecteur (Glossina sp.). Elle se situe en Afrique intertropicale entre les latitudes 15° Nord et 20° Sud (Brunhes et al., 1994). La trypanosomose animale touche le tiers de la superficie totale de l'Afrique. Les glossines sont les vecteurs de la trypanosomose dans 37 pays africains, couvrant environ 10 millions de kilomètres carrés. Près de 50 millions de bovins, 230 millions de moutons et 40 millions de chèvres sont exposés à la trypanosomose animale. Le risque est plus grave dans les zones subhumides et les parties plus humides des zones semi-arides qui détiennent le plus grand potentiel d'expansion agricole du continent. Cette maladie entraîne chaque année le décès de 3 millions de bétails, la perte de 500 000 tonnes de viande ainsi qu'un million de tonnes de lait (Duvallet, 2006). La répartition géographique des trypanosomoses animales dépend de l'espèce de trypanosome ainsi que de son hôte spécifique. Selon les données publiées par le PATTEC (2010), les dix régions du Cameroun sont susceptibles d'être endémiques. Par ailleurs, les régions de l'Adamaoua, du Nord et l'extrême Nord constituent les zones les plus atteintes car, caractérisées par une forte densité de l'élevage bovin et des

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petits ruminants. Les travaux menés par la mission d'éradication des glossines dans les régions du Cameroun ont permis de contrôler le vecteur principal de la nagana dans le plateau de l'Adamaoua. Les autres zones du Cameroun restent pour la plupart incontrôlées.

Quant à la THA, 37 pays d'Afrique et environ 60 millions d'hommes sont exposés aux risques de cette maladie et près de 70 000 personnes portent une infection active. On estime à moins de 7 000 le nombre de personnes détectées chaque année (Simarro et al., 2011) et près de 100 le nombre de morts de suite de la maladie du sommeil par jour (Launois et al., 2004). La THA se présente sous deux formes : la forme chronique qui sévit en Afrique Centrale et occidentale et qui est due à T. b. gambiense et la forme aiguë présente en Afrique orientale et Australe et qui est causée par T. b. rhodesiense (Steverding, 2008). Au début du 21ème siècle, plusieurs foyers actifs de la THA existaient au Cameroun. Ces foyers (Figure 1) étaient regroupés dans quatre grandes régions géographiques: les foyers de l'Ouest (Fontem, Mamfé et Plaines des Mbos), les foyers côtiers (Douala et Campo) les foyers de l'Est (Bafia et le bassin du Nyong; Doumé, Abong-Mbang et Lomié) et les foyers du nord (Logone et Chari). Aujourd'hui, plusieurs de ces foyers ont disparu à cause des modifications du milieu ou de la lutte. C'est ainsi que l'urbanisation a entraîné la disparition du foyer de Douala et le climat devenu rude pour les glossines a favorisé l'extinction du foyer du Logone et Chari. Les foyers de Bafia et du Haut-Nyong ont été éteints grâce à la lutte anti-vectorielle et l'assainissement du réservoir animal.

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Figure 1 : Différents foyers de la THA au Cameroun (Simo, 2001). I.6. Les parasites responsables des trypanosomoses africaines

Les trypanosomes sont les parasites responsables des trypanosomoses africaines. La classification phylogénique des trypanosomes les situe dans le sous-règne des Protozoaires, le phylum des Sarcomastigophora, le sous-phylum des Mastigophora, la classe des Zoomastigophora, l'ordre des Kinetoplastidae, la famille des Trypanosomidae et le genre

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Trypanosoma (figure 2) (Hoare, 1972). Les trypanosomes africains pathogènes du bétail appartiennent à la section des Salivaria, aux sous-genres Nannomonas (T. congolense), Duttonella (T. vivax), Trypanozoon (T. b. brucei, T. evansi et T. equiperdum), et Pycnomonas (T. suis) (Sidibé et Desquesnes, 2003). Les bovins sont parfois infectés par plusieurs espèces de trypanosomes pathogènes comme T. congolense, T. b. brucei et T. simiae.

I.7. Vecteurs

Les glossines sont des insectes hématophages qui transmettent les trypanosomes chez leurs hôtes spécifiques. Les vecteurs de la nagana sont retrouvés principalement au bord des cours d'eau et des lacs, dans des galeries forestières et des vastes étendues de savane arbustive. Ces glossines ont été intensivement étudiées en raison de leur importance médicale, vétérinaire et économique.

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I.7.1. Histoire des glossines

Les glossines ont été décrites pour la première fois en 1930, mais elles étaient déjà connues des populations autochtones d'Afrique. Des documents en l'Egypte Pharaonique, datant plus de 3000 ans avant J.C., mentionnent un insecte "skaïti" qui provoque la perte du bétail. Des archives de l'Empire perse (datant depuis 1000 ans avant J.C.) décrivait la glossine comme un insecte «mortel pour les bêtes et les nouveau-nés» (Gros, 2004). En outre, les fossiles ont été trouvés dans les gisements fossilifères florissant dans le Colorado (Nord de l'Amérique) (Cockerell, 1917). Cela indique que les glossines existent depuis trente-quatre millions d'années. Le nom mouche tsétsé a ensuite été adopté par le scientifique et est maintenant utilisé en référence à toutes les espèces de mouches et sous-espèces appartenant au genre Glossina.

I.7.2. Taxonomie

La mouche tsétsé est un insecte diptère cyclorrhaphe appartenant à la famille des Glossinidae qui ne comporte qu'un seul genre, Glossina. Les trois sous-genres correspondent à trois groupes anciennement définis sur les caractéristiques morphologiques et écologiques. Il existe 33 espèces et sous-espèces de tsétsé, réparties en trois sous genres ou groupes (figure 3) dont les caractéristiques écologiques et comportementales sont très différentes (Leak, 1999).

- Le groupe palpalis Robineau-Desvoidy, 1830, regroupe les espèces de petite taille vivant près des zones humides (mouches riveraines). Elles sont généralement moins mobiles, restant confinées dans leur habitat. Ce groupe réunit les vecteurs majeurs de la maladie du sommeil chez l'homme comme G. fuscipes, G. palpalis et leurs sous-espèces. G. p. pallicera appartient à l'espèce pallicera Bigot, 1891.

- Le groupe morsitans Zumpt, 1935, réunit les espèces de taille moyenne, très mobile, occupant la savane. A ce groupe, appartiennent les vecteurs majeurs des trypanosomoses animales comme G. pallidipes, G. morsitans spp., G. longipennis et G. austeni.

- Le groupe fusca Townsend, 1921, regroupe des glossines de grande taille des zones boisées (mouches de forêts) se nourrissant sur des animaux. Elles sont sans intérêt médical et sont considérées jusque-là comme des vecteurs de moindre importance dans la mesure où leur habitat naturel est moins fréquenté par l'homme et le bétail. Néanmoins, des espèces comme Glossina brevipalpis sont des vecteurs non négligeables des trypanosomoses animales.

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I.8. Biologie du vecteur I.8.1. Morphologie

Les glossines sont des insectes dont la principale caractéristique est de posséder une seule paire d'ailes. La paire postérieure étant transformée en deux petites massues appelées "haltères". Les glossines ont une taille qui varie entre 6 et 16 mm sans le proboscis. On les reconnaît facilement grâce à leur trompe située horizontalement dans le prolongement de la tête, leurs ailes qui se recouvrent au repos et qui présentent une cellule en forme de hache entre la 4^ème et la 5^ème nervure, leurs antennes qui portent une soie particulière plumeuse, l'arista (figure 4). Les mâles sont généralement plus petits que les femelles. Le poids des adultes est fonction de l'espèce. L'appareil reproducteur externe du mâle se distingue par la phallique (callosité fortement convexe) qui est observable sur la face ventrale de l'abdomen alors que chez la femelle, on observe plutôt des plaques génitales (figure 5). L'anus et la vulve sont situés à l'extrémité postérieure et sont entourés par des plaques dont le nombre, la forme, et la pilosité varient selon les espèces (Launois et al., 2004). Contrairement aux moustiques et aux tabanidés (taons) chez qui, seules les femelles piquent et se nourrissent de sang, les mâles butinant le nectar des fleurs, les mâles et les femelles des mouches tsétsé sont hématophages (Gouteux, 1995).

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Figure 5 : Vue ventrale des appareils génitaux mâle et femelle des glossines, (Laveissiere et al., 2000).

I.8.2. Cycle de vie

Les mouches tsétsé ont un cycle de vie original. Les femelles ne peuvent fertiliser plus d'un oeuf à la fois. Elles conservent chaque oeuf dans leur utérus pour avoir une progéniture développée intérieurement au cours des premiers stades larvaires, la stratégie est appelée viviparité adénotrophique. Pendant ce temps, la femelle alimente sa progéniture avec une substance laiteuse qui est sécrétée par une glande modifiée dans l'utérus. Dans le troisième stade larvaire, la larve laisse l'utérus de la mouche tsétsé et commence une vie indépendante. Cette étape de la vie est courte et d'une durée de quelques heures. La larve nouvellement indépendante rampe dans le sol, forme une coque externe dure appelée pupe dans laquelle elle achève sa transformation morphologique. Les pupes sont petites et mesurent moins de 1,0 cm de long (Jordan, 1986). Cette étape de la vie a une durée variable, généralement trente à quarante jours selon les espèces de glossines, selon la température et l'humidité du sol. Dans les pupes, les larves complètent les deux derniers stades larvaires et le stade de pupaison. À la fin du stade de pupaison, la jeune mouche utilise des mouvements de la tête pour sortir de la pupe, après quoi il se déplace dans le sol jusqu'à la surface (figure 6).

Hors du sol, cette jeune mouche (ténérale) étend ses ailes, son abdomen se gonfle et sa trompe horizontale se développe. Elle recherche par la suite un hôte pour prendre son premier repas de sang. Ce repas fournira les ressources nécessaires au jeune mouche pour durcir sa cuticule et développer ses muscles. Les jeunes mâles sont attirés par les phéromones sexuelles

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émises par les jeunes mouches femelles (qui copulent seulement une fois dans leur vie). Les mâles placent un spermatophore au fond de l'utérus des femelles. Le sac de spermatophore vide est éjecté quelques heures après copulation. La première larviposition aura lieu 18 jours après la copulation puis dans un intervalle de 10-11 jours en fonction de la température et la disponibilité de la nourriture (Cuisance, 1989). Techniquement la mouche tsétsé subit des processus standards de développement en insectes qui comprend la formation d'ovocytes, l'ovulation, la fécondation, le développement de l'oeuf, cinq stades larvaires, un stade de pupaison, l'émergence et la maturation de l'adulte.

I.8.3. Comportement nutritionnel des glossines

Les glossines sont des insectes hématophages dont les mâles se nourrissent environ une fois tous les quatre jours et dont les femelles se nourrissent trois fois au cours de la

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gestation: la première fois au cours de la formation de la paroi intra-utérine entre la deuxième et troisième phase du stade larvaire, la seconde à un moment donné et la troisième seulement après larviposition (Itard et Cuissance, 2004). Chaque espèce de mouche tsétsé à une préférence alimentaire. Certaines espèces du groupe palpalis sont opportunistes et adaptent leurs régimes aux conditions locales. Ils se nourrissent volontiers sur les animaux à sang chaud ainsi que sur les animaux à sang froid. D'autres ont des préférences très marquées. G. f. fuscipes préfèrent se nourrir sur les lézards tandis que G. f. quanzensis préférera se nourrir du sang des porcs (Omolo et al., 2009). Les mouches ténérales ont une préférence alimentaire supérieure à celle des vieilles mouches qui préfèrent se nourrir des hôtes sur lesquels elles ont pris leur premier repas de sang.

Les mouches tsétsé ont des récepteurs sensibles au CO2, à certains phénols (4-méthylphénols, 3-n-propylphénol etc.), à des corps cétoniques (acétone) et à l'alcool (1-octèn-3-ol) trouvés dans l'urine, les excréments et d'autres sécrétions. Ceux-ci sont exploités par les mouches pour suivre leur hôte. Les glossines se déplacent dans une série de vols courts vers leur hôte suivants le gradient de concentration de ces odeurs. Le facteur visuel est important à de courtes distances. Il est activé par le système olfactif pendant le repos. Ce facteur est plus développé chez les mouches riveraines en comparaison avec les mouches de savane. G. p. pallicera, la glossine d'intérêt dans cette étude se nourrit de préférence sur les bovidés, les suidés, les primates, les humains et les animaux à sang froid (Gouteux et al., 1982).

I.8.4. Ecologie de la glossine

La végétation est l'élément essentiel des biotopes de la glossine car elle entretient une humidité, une température et une luminosité qui convient à cette dernière. Les glossines du groupe palpalis ont pour habitat le bord des cours d'eau, les lacs et la forêt. La plupart des espèces du groupe fusca vivent dans la forêt ombrophile des basses-terres ou dans les galeries forestières. Par contre, les glossines du groupe morsitans occupent de vastes étendues de savane arborescente. Plusieurs espèces se sont adaptées à des conditions écologiques atypiques. C'est ainsi qu'il existe des espèces du groupe palpalis qui ont des biotopes péri-domestiques en zone forestière ou préforestière, particulièrement G. p. pallicera.

I.8.5. Distribution géographique des mouches tsétsé

Les mouches tsétsé sont distribuées de façon discontinue sur 11 millions de kilomètres carrés de la superficie de l'Afrique sub-saharienne. Cette zone se situe entre 14° N

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et 29° S. La répartition des différents groupes de mouches est liée à leurs préférences d'habitat. Les mouches appartenant au groupe Fusca se trouvent principalement dans la forêt ou dans la forêt dense riveraine, tandis que celles du groupe Morsitans sont limitées principalement aux savanes boisées. Les mouches tsétsé appartenant au groupe Palpalis habitent la forêt tropicale, et elles se trouvent principalement dans la végétation riveraine (Leak, 1999). La distribution de chacun de ces groupes est représentée dans la figure 7. Cette figure montre que les différents groupes et espèces de mouches sont inégalement répartis sur les zones infestées. En général, les groupes Fusca et Palpalis se trouvent principalement en Afrique centrale et occidentale tandis que les groupes Morsitans sont largement distribués dans les zones sèches d'Afrique de l'Ouest et de l'Est. La répartition géographique des mouches tsétsé est entravée par des conditions climatiques extrêmement chaudes ou froides (au-dessus de 2000 m d'altitude), la mauvaise pluviométrie, la végétation clairsemée, la nourriture insuffisante et la nature des sols (inadaptés pour la pénétration des larves).

Figure 7 : Distribution des espèces de glossines appartenant au groupe Fusca, Morsitans et Palpalis en Afrique (Leak, 1999).

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En plus de G. p. pallicera, on retrouve aussi au Cameroun G. p. palpalis, G. caligenea, G. tabaniformis, G. nigrofusca, G. m. morsitans, G. m. submorsitans, G. longipalpis, G. nigrofusca, G. tachinoïdes, G. fuscipes, G. haningtoni, G. fuscipleuris, G. nashi, G. newsteadi, G. brevipalpis (Melachio et al., 2011 ; Eouzan et Ferrara , 1978 ; Rageau et Adam, 1953 ; Pollock, 1982).

G. p. pallicera est une mouche des zones forestières denses sempervirentes. Elle peut occuper les plantations de café mais reste en général sous le couvert arboré moins fréquenté par l'homme. Elle se nourrit essentiellement de gros mammifères, bovidés, suidés et primates (Gouteux et al., 1982). Les bovidés fournissent l'essentiel des repas sanguins (60%) à cette espèce (Gouteux et al., 1982). L'homme n'est pas un hôte négligé et représente près de 10% des repas (Laveissière et al., 1980).

I.9. Lutte contre les trypanosomoses

Deux stratégies alternatives sont généralement utilisées pour lutter contre les trypanosomoses africaines. La première stratégie est principalement médicale ou vétérinaire et vise à réduire la propagation du parasite par le traitement des mammifères (Hommes et animaux) infectés; la seconde stratégie est entomologique et met l'accent sur le contrôle de la mouche tsétsé.

Le dépistage systématique par des équipes mobiles permet de détecter les malades au stade précoce. Ce qui permet de les traiter et d'éviter la progression de la maladie. Il permet aussi de reduire le réservoir humain. Cependant, des animaux domestiques et sauvages ont été identifiés comme des réservoirs potentiels (Simo et al., 2000; Njiokou et al., 2006, 2010) à partir desquels des trypanosomes peuvent être réintroduits dans la population humaine. Gérer le réservoir animal est difficile parce qu'il est constitué d'une variété d'animaux domestiques (porcs, moutons, chèvres, chiens...) et sauvages (singes, rats, crocodiles...). Dans un tel contexte, contrôler le vecteur apparaît comme une méthode alternative pour lutter contre le réservoir animal. De nombreuses techniques ont été utilisées dans le but de réduire les populations de glossines. Ces méthodes comprennent :

Cette technique ancienne consistait à abattre les animaux sauvages sur lesquels se nourrissaient les mouches tsétsé (Hocking et al., 1963; Jordan, 1986). Dans l'île de Principe

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par exemple, les porcs sauvages ont été entièrement éliminés dans les années 1930, ce qui a entrainé la disparition des mouches. Dans les années 1950, les mouches ont ré-envahi cette île. Cependant, la nouvelle population des glossines était indemne de la maladie. L'élimination des animaux sauvages n'est pas facile à réaliser, surtout quand il consiste à détruire les petits animaux comme le phacochère, le potamochère et les petites antilopes qui sont également des hôtes de nombreuses espèces de trypanosomes. Ce procédé d'abattage des animaux sauvages avait été abandonné, car il était moins efficace et n'assurait pas la protection de la faune sauvage.

La destruction de la végétation peut se faire par usage des bulldozers, des feux de brousse, par défrichage partiel ou total suivi quelque fois du remplacement de la végétation naturelle par des cultures. Ces méthodes sont onéreuses, nécessitent une main d'oeuvre abondante et présentent un inconvénient majeur car elles perturbent l'équilibre de l'environnement, augmente des quantités importantes de CO2 dans l'atmosphère, ce qui conduit au réchauffement climatique. De plus, elle favorise la mise en place des glossines péri-domestiques plus dangereuses (Nash, 1940; Morris, 1946; Kernaghan et Davies, 1960; Maillot, 1966; Challier, 1968).

Les insecticides ont été utilisés pour lutter contre les mouches tsétsé durant le XXe siècle. Cette technique a été étendue après la seconde guerre mondiale avec des grandes campagnes aériennes (aéronefs) et terrestres (pulvérisateurs) basée sur utilisation des insecticides organiques comme le DDT (Dichlorodiphényltrichloroéthane). Le problème majeur est le risque de pollution. Ces insecticides n'étaient pas spécifiques à une espèce et pouvaient donc affecter d'autres arthropodes non-pathogènes. De plus les modalités de la lutte chimique contre les glossines sont complexes et doivent tenir compte des facteurs climatiques, du relief et de la végétation (Kirkby et Blasdale, 1960; Macdonald, 1960 ; Mahood, 1960; Maclennan, 1963).

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L'usage des pièges ou des écrans occupe une place importante dans les stratégies de lutte contre les glossines. Les pièges et les écrans sont souvent imprégnés d'insecticides. Les pièges se sont avérés plus efficaces avec de nombreux modèles actuellement disponibles: le piège Vavoua (Lavéissière et Grébaut, 1990), le piège pyramidal (Gouteux et Lancien, 1986), et le piège biconique (Challier et Lavéissière, 1973). Ces pièges et écrans sont composés de couleurs attractives (bleu) et de couleurs sombres (noir). L'usage des pièges exigent cependant une logistiqu e importante et un personnel qualifié ayant une bonne connaissance de l'écologie des mouches.

La technique du lâché des insectes stériles (TIS) repose sur la libération de mâles irradiés rendus ainsi stériles. Ces insectes en surnombre par rapport aux mâles sauvages de l'espèce cible s'accouplent avec les femelles sauvages, entraînant des accouplements infertiles, ce qui est « catastrophique » pour la dynamique de leur population, qui décline jusqu'à l'extinction si elle est isolée. Cette technique a l'avantage de toucher exclusivement l'espèce ciblée. La TIS s'applique aux glossines qui présentent une faible densité des populations, un faible taux de reproduction, un accouplement en général unique (Bouyer ,2006). Le problème majeur dans cette technique réside sur l'élevage de masse des glossines, la compétitivité des mâles de laboratoire et l'effectif des individus à lâcher (Lavéissière et al., 2000).

Ces méthodes de lutte anti-vectorielle ayant présenté plusieurs limites, de nouvelles études se sont axées dans le domaine de la biologie moléculaire et celles-ci a permis le développement d'autres méthodes de lutte.

I.10. Génétique des populations

La génétique des populations est un domaine de la biologie qui étudie la composition génétique d'une population biologique (l'étude de la distribution, de la fréquence allélique) (Postlethwalt, 2009) et des modifications dans la composition génétique sous l'influence de quatre processus d'évolution: la sélection naturelle, la dérive génétique, les mutations et le flux des gènes. Elle tient compte également des facteurs de recombinaison, de la subdivision

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de la population et de la structure de la population. Elle essaye d'expliquer les phénomènes comme l'adaptation et la spéciation.La génétique des populations s'est développée dans les années 1920 et 1930 grâce au travail de Fisher, Haldane et Wright (BS). Leur réalisation devait intégrer les principes de la génétique Mendélienne qui avait été redécouverte à la fin du siècle avec la sélection naturelle darwinien.

I.10.1. Principe fondamental de la génétique des populations

La génétique de population concerne la constitution génétique de la population et comment cette constitution change avec le temps. Une population est un groupe localisé d'individus appartenant à la même espèce. Par exemple, toutes les G. p. pallcera qui vivent dans une forêt isolée représente une population. Un gène simple dans cette population peut avoir plusieurs formes alternatives, qui expliquent des variations entre les phénotypes des organismes. Un patrimoine héréditaire est l'ensemble complet d'allèles pour un gène dans une population simple; la fréquence d'allèle mesure la fraction du patrimoine héréditaire composé d'allèle simple. L'évolution se produit quand il y a des changements des fréquences des allèles dans une population d'organismes se reproduisant. L'Allèle est l'état héréditaire dans lequel un locus se présente. Le déséquilibre de liaison est expression d'une association non aléatoire entre les loci. Le flux des gènes est toutes les formes de migration des gamètes, des individus ou des groupes d'individus d'une sous-population à une autre. Cette force s'oppose à la dérive génétique et favorise l'homogénéisation de la population. Le gène est une portion d'ADN qui code pour une information. Un génotype est la composition allélique d'un individu à un locus donné ou à une série de loci spécifique. L'homozygote est l'état d'un locus chez un individu diploïde présentant deux fois le même allèle. L'hétérozygote est l'état d'un locus chez un individu diploïde présentant deux allèles différents. Un locus est l'emplacement d'un gène sur un Chromosome. Ce terme est vulgairement utilisé pour désigner une portion d'ADN soumise à une étude. Le polymorphisme est le terme qui désigne l'existence de plusieurs formes (allèles) à un locus donné. Une population structurée est une population constituée de plusieurs sous-populations entre lesquelles il existe très peu ou pas de flux de gènes. La panmixie décrit un mode de reproduction sexuée où les zygotes sont formés par rencontre aléatoire de tous les gamètes de la population.

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I.10.2. Facteurs affectant la génétique des populations

Les facteurs qui peuvent provoquer un changement de la composition génétique d'une population sont: la sélection naturelle, les mutations, la dérive génétique et le flux des gènes.

La sélection naturelle est un processus au cours duquel la survie et/ou le succès reproducteur d'un individu dépend de son phénotype ou de son génotype d'une manière plus ou moins directe. Au cours des générations et grâce à une combinaison de caractères avantageux hérités de leurs parents, seuls les individus les mieux adaptés participeront à l'établissement de la prochaine génération.

Les mutations sont des changements dans la séquence de l'ADN du génome des cellules qui sont provoquées par les rayonnements, les virus, les transposons, les produits chimiques mutagéniques, les erreurs qui se produisent pendant la méiose ou la réplication de l'ADN. Si des dommages se produisent naturellement dans l'ADN, des mécanismes de réparation peuvent s'effectuer dans les cellules. Néanmoins, la réparation ne renvoie parfois pas à l'ADN original. Ces erreurs créent de grands changements structuraux dans l'ordre de duplication de l'ADN, l'inversion ou la suppression des régions entières, ou échange accidentel des parties entières entre différents chromosomes (translocation).

La dérive génétique est une force évolutive qui traduit l'échantillonnage aléatoire des allèles de la population parentale qui seront représentés dans la descendance. Elle est directement liée à la taille finie des populations naturelles. Plus les populations seront de taille restreinte, plus l'influence de la dérive génétique sera importante. Elle agit en faveur de l'augmentation de la différenciation entre populations.

Le flux génétique est l'échange des gènes entre les populations de la même espèce. Il peut également être défini comme le transfert des allèles d'une population à l'autre. La migration dans ou hors d'une population peut être responsable d'un changement marqué des fréquences d'allèle. L'immigration peut avoir comme conséquence l'addition de nouvelles variantes génétiques pour établir le patrimoine héréditaire d'une espèce ou d'une population particulière. Réciproquement, l'émigration peut enlever des variantes génétiques. Le flux

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génétique est entravé par des chaines de montagnes, des océans, des déserts ou même des structures synthétiques. Le flux maintenu de gène entre deux populations peut mener à une combinaison de deux patrimoines héréditaires, réduisant la variation génétique entre les deux groupes. C'est pour cette raison que le flux génétique agit fortement contre la spécialisation.

I.10.3. Les types de marqueurs moléculaires utilisés dans la génétique des populations

Un marqueur moléculaire est un fragment d'ADN (information génétique) ou son expression moléculaire (ARN, protéines) permettant la caractérisation génétique d'un individu ou d'une population. Ces marqueurs ont plusieurs domaines d'utilisation comme les études d'apparentement, les études de systématique (la définition des espèces jumelles), les études phylogénétiques (relations entre espèces) mais surtout les études de structure génétique des populations (estimation des effets de la dérive génétique, des flux de gènes) (Raymond, 1996). Il existe plusieurs catégories de marqueurs moléculaires: la SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism), l'AFLP (Amplied Fragment Lenght Polymorphism), la SNP (Single-Nuleotide-Ploymorphism), les microsatellites. Les microsatellites sont les marqueurs les plus fréquemment utilisés dans les études sur la caractérisation génétique des espèces de parasites ainsi que leur vecteur (Sunnucks, 2001). Les allozymes et les marqueurs mitochondriaux sont aussi très utilisés dans la génétique des populations.

Les allozymes sont en fait des enzymes du métabolisme de base des cellules. Les allozymes sont moins polymorphes, notamment chez les organismes parasites, et requièrent de travailler sur du matériel frais, ce qui s'avère souvent difficile, en particulier dans les pays du Sud. Le matériel biologique à utiliser doit se trouver en quantité suffisante, ce qui est souvent difficile pour les organismes parasites, souvent de taille modeste et difficilement cultivable.

Les marqueurs cytoplasmiques correspondent à des loci présents dans le génome mitochondrial. L'ADN mitochondrial s'est montré extrêmement informatif dans des études phytogéographiques, car il présente des taux d'évolution relativement rapides et ne subit pas de recombinaisons entre loci (Avise et al., 1987 ; Avise, 2000). Cependant, pour les études de génétique des populations, les propriétés de ces marqueurs sont loin d'être idéales car l'ADN

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mitochondrial présente une hérédité uniparentale, typiquement maternelle. Ces marqueurs sont haploïdes et ne peuvent par conséquent pas renseigner clairement sur le régime de reproduction locale de l'espèce étudiée (De Meeûs, 2012).

Ce sont des séquences d'ADN formées par des répétitions continues (en tandem) de motifs (2, 3 etc.) composés de 1 à 6 nucléotides. Les microsatellites ont une taille relativement petite. L'existence des microsatellites dans les génomes est connue depuis plusieurs décennies mais ils ont été longtemps considérés comme des séquences de peu d'intérêt. Ce n'est qu'à la fin des années 1980 qu'on a réalisé qu'il s'agissait probablement d'un des plus puissants marqueurs mendéliens qu'on ait mis en évidence jusqu'à présent. Leur fonction biologique reste floue (Epplen et al., 1993). Certaines études montrent que les variations de longueur de certains microsatellites ont des effets phénotypiques sur la physiologie et le développement de certains organismes (King et Soller, 1998).

Les avantages importants des loci microsatellites comme marqueurs pour les études de génétique de populations sont les suivants:

- les loci microsatellites ont des taux de mutations et de polymorphismes (10^-3, 10^-4) très élevés dans les populations naturelles (Ellegren, 2000 ; Balloux et Lugon-Moulin, 2002 ; Ellegren, 2004)

- sont codominants et relativement aisés à manipuler ; - ont des séquences relativement courtes ;

- sont amplifiables par PCR à partir des tissus conservés dans l'alcool pendant une durée assez longue et dans n'importe quelle condition (De Meeus, 2012).

Grâce à leur ubiquité, leur abondance dans le génome et leur fort taux de mutation qui leur confère un niveau de polymorphisme élevé, les microsatellites sont couramment utilisés dans de nombreux domaines d'études comme

- la génétique des populations (Bossart et Pashley Prowell, 1998), la cartographie du génome (Bell et Ecker, 1994; Zheng et al., 1996), l'analyse des traits quantitatifs (Gorman et al., 1996),

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- la génétique humaine (Sutherlands et Richards, 1995), de plus en plus dans la phylogénie et l'histoire de l'humanité (Bowcock et al., 1994; Goldstein et al., 1995).

Avec le développement des outils de la génétique moléculaire, une nouvelle page s'est ouverte dans la lutte anti-vectorielle. Aujourd'hui, deux approches sont envisageables dans la lutte anti-vectorielle: la suppression et l'éradication. Le choix d'une des approches va dépendre de l'isolement ou non des populations de glossines. La suppression désigne la baisse des densités de glossines en deçà d'un seuil de transmission et qui est adoptée lorsque la population de glossines concernées n'est pas génétiquement isolée des populations voisines. L'éradication quant à elle désigne la destruction complète de la population de glossines concernées. Elle est adoptée lorsque cette population est génétiquement isolée des autres (Solano et al., 2010a, 2010b). Pour faire le choix entre suppression et éradication, il est obligatoire d'entreprendre des études sur la génétique des populations de glossines.

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II. MATERIEL ET

Le foyer de la maladie du sommeil de Campo (2 O 20'N, 9 O 52'E) est situé à 80 Km de la ville de Kribi dans la région du Sud Cameroun (figure 8). C'est un foyer hypo-endémique de THA où aucune évolution épidémique de la maladie n'y a été signalée depuis plusieurs années (Melachio et al., 2011) . Le foyer de la THA de Campo se trouve le long de la côte Atlantique et s'étend le long du fleuve Ntem qui constitue la frontière entre le Cameroun et la Guinée Equatoriale. Le climat est de type équatorial avec quatre saisons. La végétation est constituée d'une forêt dense équatoriale moins dégradé avec des terres agricoles, des zones marécageuses et des marais le long de la côte (Simo et al., 2014). Il s'agit d'une zone de forêt équatoriale avec un réseau hydrographique dense, des zones marécageuses et des mangroves. Cette zone est riche en faune sauvage et fait partie du parc national de ?Campo Ma'an? (Njiokou et al., 2004a). L'agriculture, la pêche et la chasse sont les principales activités menées dans cette localité.

Figure 8 : Carte du Foyer de la THA de Campo (Institut National de Cartographie Yaoundé Cameroun, 1976).

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L'ADN a été extrait de 6 pattes de glossines en utilisant le CTAB 5% (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide) selon la méthode décrite par Navajas et al. (1998). Brièvement, les tubes contenant les pattes des glossines ont été sorties du congélateur, puis laissés ouverts sur la paillasse toute la nuit dans le but de faire évaporer l'alcool contenu dans les tubes. Après l'évaporation complète de l'éthanol, 600 ul de la préparation du CTAB (composition en annexe 1) ont été ajoutés, puis les pattes ont été broyées à l'aide des pistons. Le mélange obtenu a été incubé pendant une heure au bain marie. Ensuite, 600 ul d'un mélange de chloroforme et d'alcool isoamylique (24/1, v/v) ont été ajoutés dans chaque tube. Après une homogénéisation lente pendant 10 minutes, l'ensemble a été centrifugé à 8000 trs/min pendant 10 minutes. La phase supérieure (phase aqueuse) contenant les acides nucléiques a été transférée dans un nouveau tube où 430 ul d'isopropanol ont été ajoutés afin de précipiter les acides nucléiques. L'ensemble a été homogénéisé puis incubé à -20°C pendant une heure pour faire précipiter l'ADN. Une fois cette incubation terminée, les tubes ont été centrifugés à 13000 trs/min pendant 10 minutes et le surnageant a été vidé en conservant le culot d'acides

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nucléiques (extrait d'ADN). Ce culot a été lavé avec 900 ul d'éthanol 70°C et centrifugé à 13000trs/min pendant 10 minutes. L'éthanol a été entièrement vidé et les tubes contenant le culot d'acides nucléiques ont été laissés ouverts sur la paillasse pendant deux heures afin d'éliminer alcool résiduel. Le culot a été suspendu dans 50 ul d'eau et conservé à -20 °C pour les analyses moléculaires ultérieures.

La PCR est une technique moléculaire permettant d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité exponentielle de copies, suffisante pour être détectée et étudiée. Au cours des réactions PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant. Chaque cycle comprend trois étapes:

? L'hybridation des amorces qui se fait à une température définie selon la nature des amorces (cette température varie généralement de 40 à 65°C). Au cours de cette étape, les amorces qui sont des oligonucléotidiques se lient, par appariement des bases complémentaires au moyen des liaisons hydrogènes, à la séquence cible à copier.

? L'élongation à 72°C, qui est la température d'activité optimale de la Taq ADN polymérase. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d'ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3'OH libre des amorces hybridées (Borde, 2006). La figure 9 ci-dessous récapitule les différentes étapes de la PCR.

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II.4.2. Identification moléculaire de G. p. pallicera

Pour confirmer l'appartenance taxonomique issue des critères morphologiques, nous avons amplifié l'ITS1 (internal transcribed spacer 1) de tous les échantillons qui ont été retenus pour cette étude. En effet, des amorces consensus ont été mises au point et permettent d'amplifier l'ITS1 de toutes les espèces et sous espèces de mouches tsétsé. Une fois que l'ITS1 est amplifié, l'identification des différentes espèces se fait à partir du polymorphisme de longueur qui s'observe entre les différentes espèces de glossines.

L'identification moléculaire de G. p. pallicera a été faite suivant la méthode décrite par Dyer et al. (2008) en utilisant le couple d'amorces Diag forward

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(5'TCATTATGCGCTATTAAGGTAAGC-3'). Les réactions d'amplification ont été faites dans un milieu réactionnel de 25ul contenant 2,5ul de tampon PCR 10X (10 mM Tris-HCl ; 50 mM KCl; 1,5 mM de MgCl2), 10 pmoles de chaque amorce, 200 uM de dNTPs; 5U de Taq ADN polymérase et 2,5 ul d'extrait d'ADN dilué au 10^eme. Les amplifications ont été réalisées dans un thermocycleur de marque TECHNE selon le programme suivant : une étape de dénaturation initiale à 95⁰C pendant 3 minutes, suivie de 30 cycles d'amplification comprenant chacun une étape de dénaturation à 95⁰C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation des amorces à 56⁰C pendant 30 secondes, et une étape d'élongation à 72⁰C pendant 1 minute. A la fin, une extension finale a été réalisée à 72⁰C pendant 5 minutes. Les produits d'amplification ont été séparés sur gel d'agarose à 2% en vue de distinguer différentes espèces de glossines.

II.4.2.1. Amplification des loci microsatellites des glossines

Pour cette étude, nous avons analysé neuf loci microsatellites ; B3, B104, C102, B110 et A10 de ROBINSON (FAO/IAEA), Gpg55.3 de Solano et al. (1997), Pgp13 et Pgp24 de Luna et al. (2001) et GpCAG133 de Baker et Krafsur (2001). Chaque locus microsatellite a été amplifié en utilisant les amorces dont les séquences sont contenues dans le tableau 1. Les réactions d'amplifications ont été faites dans un milieu réactionnel de 25ul contenant 2,5ul de tampon PCR 10X (10 mM Tris-HCl ; 50 mM KCl; 1,5 mM de MgCl2), 10 pmoles de chaque amorce, 200 uM de dNTPs, 5U de Taq ADN polymérase et 5 ul d'extrait d'ADN. Le programme d'amplification contenait une étape de dénaturation initiale à 95⁰C pendant 5 minutes et 40 cycles d'amplification comprenant chacun une étape de dénaturation à 95⁰C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation des amorces pendant 30 secondes à des températures variables (voir tableau 1) en fonction du couple d'amorces utilisées, une étape d'élongation à 72⁰C pendant 1minute. Une extension finale a été réalisée à 72⁰C pendant 10 minutes.

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Tableau 1: Séquences et températures d'hybridation des amorces utilisées pour le

II.4.2.2. Séparation des produits amplifiés par électrophorèse sur gel d'agarose

Principe de la technique : Elle est basée sur la séparation des acides nucléiques chargés négativement sous l'effet d'un champ électrique. Cette séparation s'effectue à travers une matrice (agarose dans ce cas): les molécules de petites tailles se déplaceront plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

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La séparation des produits amplifiés sur gel d'agarose a été faite dans le but de vérifier si les réactions d'amplifications étaient bonnes. Pour cela, nous avons préparé un gel d'agarose à 2% par un mélange de 2g d'agarose et 100 ml de tampon (Tris-Borate-EDTA) TBE 0,5X (annexe 1). Le mélange a été porté à ébullition dans un four à micro-ondes pendant 3 minutes. Après refroidissement, 3ìl de Bromure d'Ethidium (BET) ont été ajoutés et l'ensemble a été versé dans un moule. A refroidissement et solidification du gel, le peigne a été enlevé. Par la suite, 6ul des produits d'amplification ont été mélangés à 2ul de bleu de charge. Le mélange a été déposé dans les puits du gel et la séparation a été faite à 100 volts pendant 30 minutes dans le tampon TBE 0,5X (Tris-Borate-EDTA). La révélation a été faite par observation du gel sur un trans-illuminateur à UV. Les échantillons ayant présenté des bandes d'ADN ont été sélectionnés dans le but de déterminer le nombre et la taille des allèles sur un gel de polyacrylamide.

II.4.2.3. Séparation des allèles sur gel de polyacrylamide

Les amplicons ou produits de la PCR ont été séparés sur gel d'acrylamide afin d'observer le polymorphisme génétique qui se reflète par le polymorphisme de longueur des séquences microsatellites amplifiées. A cet effet, la résolution des produits d'amplification s'est faite sur gel de polyacrylamide à 10% (seuls les échantillons qui ont présenté une bande sur gel d'agarose ont été sélectionnés). Pour ce faire, le gel de polyacrylamide a été préparé en mélangeant : 18,33 ml d'acrylamide/bis acrylamide (19:1) à 30%, 5,5 ml de Tris Borate EDTA (TBE) 10X, 30,62 ml d'eau distillée, 481,25 ul d'APS (10%) et 68,75 ul de TEMED. Le mélange a été introduit dans le moule vertical d'électrophorèse avec un peigne pour former les puits. Après polymérisation du gel (environ 30 minutes), le peigne a été enlevé et les puits ont été lavés avec le tampon de migration Tris Borate EDTA (TBE) 1X. Par la suite, 19ul de chaque produit d'amplification ont été mélangés à 3ul de bleu de charge. Les mélanges ont été introduits dans les puits du gel préalablement nettoyés. A côté des échantillons, 7ul de marqueur de poids moléculaire ont été introduits dans un autre puits pour l'estimation de la taille des allèles. La migration s'est faite dans du tampon TBE 1X à 150 Volts pendant environ 17 heures. A la fin de la migration, le gel a été coloré dans un bain de bromure d'éthidium (30 ul de bromure d'éthidium pour environ 600 ml de tampon TBE 1X). L'ensemble a été incubé pendant 20 minutes à l'abri de la lumière. Par la suite, le gel a été lavé à l'eau afin d'éliminer l'excès de bromure d'éthidium. Le gel a été enfin visualisé sous UV, puis photographié.

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Etant donné que les mouches tsé-tsé sont des organismes diploïdes, on s'attend après résolution des produits d'amplification à deux bandes (2 allèles) pour un individu hétérozygote pour le locus analysé et une bande pour un individu homozygote. A la fin de chaque électrophorèse, la taille de chaque allèle a été estimée à partir des marqueurs de poids moléculaire (PM) en traçant la courbe du logarithme décimal du poids moléculaire en fonction de la distance de migration (D) (log PM =f (D)).

II.4.3. Analyse génétique des données

Après avoir déterminé la taille des allèles, une base de données contenant pour chaque individu son génotype multilocus (génotype à différents loci) a été confectionnée à partir du logiciel Excel^®. A partir de cette base de données, le logiciel CREATE version 1.0 a permis de créer des fichiers en formats appropriés pour les autres logiciels d'analyses FSTAT, GENETIX, GENEPOP, MSA et MICRO CHECKER.

L'hétérozygotie observée (Ho) et celle attendue (Hs) ont été calculées pour chaque locus sous l'hypothèse de l'équilibre de Hardy-Weinberg. Chez les mâles et pour les loci liés au chromosome X (55.3, PGP13), les tailles des allèles ont été codées en données manquantes par les chiffres zéro (000/000). Ceci est dû au fait que ces mâles sont tous des « faux » homozygotes et contribuent à un déficit en hétérozygotes.

La structure génétique des populations de glossines a été étudiée à l'aide des estimateurs non biaisés de Weir et Cockerham (1986) (f et O) des statistiques F (FIS et FST) de Wright (Wright, 1965). Le FIS ou coefficient de consanguinité mesure l'écart à la panmixie (croisements au hasard entre individus) dans une sous-population. Il exprime la variabilité génétique au sein des individus par rapport à la sous-population et permet d'expliquer l'excès ou le déficit d'hétérozygotes à l'intérieur de chaque sous-population. Ses valeurs varient de -1 (excès en hétérozygotes) à 1 (déficit en hétérozygotes). Le FST (ou indice de fixation) mesure la différenciation génétique entre deux ou plusieurs sous-populations. Il mesure, sur la base des différences de fréquences alléliques entre les sous-populations, le déficit en hétérozygotes issu de la structuration en sous-populations. Sa valeur est comprise entre 0 (pas de structuration) et 1 (toutes les sous-populations sont fixées pour un allèle au moins).

Les statistiques F de Wright ont été estimées à l'aide du logiciel FSTAT version 2.9.4 (Goudet, 2003). Etant donné que f mesure l'écart des fréquences génotypiques par rapport à celles attendues dans une sous-population sous équilibre de Hardy-Weinberg, la signification

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de cet écart a été testée en randomisant 10000 fois les allèles entre les individus au sein des différentes sous-populations et à chaque fois, f était calculé (procédure automatique dans le logiciel Fstat). La P-value de ce type de test est la proportion du nombre de fois que la valeur de f estimée dans les réplicas formés par randomisations est supérieure ou égale à la valeur réelle de f obtenue (ou inférieure ou égale lorsque la valeur réelle est négative). Une procédure analogue a été utilisée dans le logiciel Fstat pour tester la significativité de la valeur de O. Le polymorphisme au niveau de chaque marqueur a été obtenu en comptant le nombre d'allèles différents mis en évidence par le marqueur considéré, ceci grâce au logiciel FSTAT.

Les fréquences alléliques et l'hétérozygotie ont été respectivement déterminés par les logiciels FSTAT version 2.9.4 et GENETIX version 4.0.5 Une courbe de régression linéaire de FIS en fonction du nombre d'allèle nul a été construite afin de savoir si les allèles nuls étaient à l'origine du déficit en hétérozygote. Le logiciel Micro-checker version 2.2.3. (Van Oosterhout et al., 2004) a été utilisé dans le but de savoir si les allèles nuls expliquent la totalité du déficit en hétérozygote. Ceci a été évalué grâce au coefficient de corrélation (R) qui varie de -1 à 1. Si R est proche de -1 ou 1, il existe une forte corrélation et si R est éloigné de -1 ou 1, il existe une corrélation faible.

Pour apprécier le polymorphisme génétique, c'est-à-dire les distances génétiques entre les glossines analysées, le logiciel MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004) a été utilisé pour la construction d'un dendrogramme en utilisant des matrices de distances harmoniques de Cavalli-Sforza et Edwards (1967). Ces matrices ont été générées à l'aide du logiciel MSA (Dieringer et Schlotterer., 2003).

Le logiciel XLSTAT 2015 a permis de comparer le niveau de sensibilité entre les différents marqueurs microsatellites.

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III. RESULTATS

III.1. PCR diagnostic des espèces de glossines

Pour cette étude, 72 glossines ont été analysées dont 45 G. p. pallicera ,17 G. p. palpalis, 4 G. submorsitans, 3 G. caligenea, 2 G. nigrofusca et une G. fuscipes. La figure 10 montre un exemple de gel obtenu à la suite de la séparation des produits d'amplifications des ITS1 de différentes espèces de glossines. Cette figure montre une différence de taille entre les ITS1 de G. nigrofusca (254 Paires de bases) et G. caligenea (179 Pbs). Une différence a été aussi observée entre G. p. pallicera (266 Pbs) et G. p. palpalis (241 Pbs). Aucune différence n'a été observée entre la taille d'ITS1 de G. submorsitans et G. p. pallicera, ainsi qu'entre G. fuscipes et G. p. palpalis.

Figure 10: Photo d'un gel d'agarose montrant les produits d'amplification des ITS1 de différentes espèces de glossines.

* : pbs (Paires de bases) ; M = Marqueurs de poids moléculaires (100pbs) ; 1 et 2 = G. nigrofusca ; 3 et 4 = G. caligenea ; 5 = G. fuscipes ; 6= G. p. palpalis ; 7 et 8 = G. p. pallicera ; 9 et 10 = G. submorsitans

III.2. Sensibilité des différents marqueurs microsatellites

Lors de l'amplification des loci microsatellites sur les 45 échantillons de G. p. pallicera, les 9 marqueurs n'ont pas amplifié avec la même efficacité. Les marqueurs 55.3, GPCAG133, PGP13, PGP24 et C102 ont amplifié avec une sensibilité très variable. Le tableau 2 présente, en fonction des espèces, le nombre de glossines amplifiées à chaque locus microsatellite. Pour les marqueurs A10 et B110, aucune amplification n'a été observée pour les 72 glossines analysées ; raison pour laquelle ces deux marqueurs ne figurent pas dans le

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tableau 2. Les marqueurs B3 et B104 ont amplifié moins de 50% (34 glossines pour B3 et 31 pour B104) des 72 glossines analysées. Ces deux marqueurs n'ont pas été considérés dans les analyses de génétiques des populations. C102 est le marqueur ayant amplifié le plus grand nombre de glossines (70), suivi de PGP13 (69 glossines amplifiées), CPCAG, 55.3 et PGP24.

Tableau 2: Nombre de glossines amplifiées en fonction des espèces et des loci

Pour comparer les taux d'amplification obtenus à chaque locus, nous avons considéré uniquement les espèces G. p. pallicera et G. p. palpalis pour lesquelles plus de 10 glossines ont été analysées. La taille de l'échantillonnage des autres espèces étant très faible notamment une G. fuscipes, deux G. nigrofusca, trois G. caligenea et quatre G. submorsitans. En comparant les taux d'amplification des glossines à chaque locus, une différence significative (P= 0,024) a été observée entre G. p. palpalis et G. p. pallicera pour le locus B3.

Concernant le marqueur B104, une différence significative (P= 0,001) a été observée entre les nombres de G. p. palpalis et G. p. pallicera amplifiés. Par contre, pour les marqueurs PGP13, C102, 55.3, GPCAG et PGP24, aucune différence significative n'a été observée entre les nombres de G. p. palpalis et G. p. pallicera amplifiés (tableau 3). Pour ces comparaisons, le seuil de significativité était égal à 0,05.

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Tableau 3: Nombre et pourcentage de G. p. pallicera et G. p. palpalis amplifiés à chaque locus microsatellite

III. 3. Polymorphisme des marqueurs utilisés

Pour les analyses portant sur le polymorphisme génétique, nous avons considéré uniquement les marqueurs ayant amplifié au moins 80% des glossines analysées. Sur cette base, seulement 5 marqueurs ont été considérés : GPCAG, 55.3, C102, PGP13 et PGP24.

La figure 11 montre un exemple de photo illustrant la séparation, sur gel d'agarose, des produits d'amplifications obtenus au locus 55.3. Quel que soit le locus analysé, aucune différence de taille n'a été détectable à la suite de la séparation des produits d'amplifications sur gel d'agarose. Par ailleurs, une seule bande d'ADN illustrant l'amplification du locus microsatellite a été obtenue sur gel d'agarose pour chaque glossine analysée. Les allèles ayant des tailles très proches, ne peuvent être bien séparés sur gel d'agarose ; raison pour laquelle nous avons fait recours au gel de polyacrylamide.

Figure 11: Exemple de photo montrant les profils des bandes obtenues sur gel d'agarose et illustrant les amplicons issus de l'amplification du locus 55.3.

C- = Contrôle négatif ; 1= G. caligenea ; 2= G. fuscipes ; 3, 13-15= G. p. palpalis ; 4-12= G. p. pallicera

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La figure 12 présente un exemple de profils de bandes obtenues après résolution sur gel de polyacrylamide des produits d'amplification pour les loci C102 et PGP24.

Figure 12: Photo d'un gel de polyacrylamide montrant les profils des allèles obtenus pour chaque glossine et aux loci C102 et PGP24.

* : paire de base ; 1, 2 et 11 = G. p. palpalis ; 2-9 et 17 = G. p. pallicera ; 12-15 = G. submorsitans. C102 ; 16= G. caligenea ; 10 = marqueur de taille 25pbs. Le locus C102 (échantillon 1-15), le locus PGP24 (échantillon 16 et 17).

Le degré de polymorphisme des marqueurs microsatellites varie d'un locus à l'autre. La taille des allèles varie de 151 à 247 paires de bases pour le marqueur GPCAG133, de 165 à 193 pb pour 55.3, de 154 à 210 pour PGP13 et de 242 à 296 paires de bases pour C102.

Le tableau 4 donne, en fonction du sexe, du village, des espèces et des loci, la taille des allèles obtenus pour chaque glossine analysée.

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Tableau 4 : Génotypes multilocus obtenus pour chaque glossine analysée et pour les cinq

	loci considérés.
/	/	/	/	Génotypes à chaque locus
Ind	Espèce	Village	Sexe	55.3	GPCAG	PGP13	C102	PGP24
1	Gnigr	Akak	F	000/000	000/000	000/000	245/245	249/249
2	Gpal	Akak	F	167/167	217/217	180/166	254/242	241/227
3	Gpal	Akak	M	167/167	220/214	166/166	260/260	241/227
4	Gpal	Akak	F	167/167	214/214	180/166	251/251	241/227
5	Gpal	Akak	M	167/167	214/211	166/166	251/251	241/227
6	Gpal	Akak	F	167/167	220/220	180/166	254/245	241/227
7	Gpal	Akak	M	167/167	217/211	166/166	257/257	241/227
8	Gnigr	CampoBeach F		000/000	151/151	178/166	260/260	205/205
9	Gpal	Memel	M	000/000	220/214	166/166	251/251	207/201
10	Gcal	Campo	F	167/167	202/202	186/172	263/263	261/245
11	Gcal	Campo	F	167/167	205/220	188/174	260/260	263/247
12	Gcal	Akak	F	181/167	202/202	184/176	260/260	265/251
13	Gpal	Campo	M	167/167	202/199	166/166	260/251	265/251
14	Gfus	Memel	F	181/181	196/220	184/184	251/251	241/227
15	Gpp	Campo	F	000/000	000/000	000/000	260/260	000/000
16	Gpal	Memel	F	167/167	202/202	000/000	266/266	000/000
17	Gpal	Campo	M	167/167	214/214	166/166	269/269	241/227
18	Gpp	Campo	F	181/171	202/202	170/154	263/251	243/243
19	Gpp	Campo	M	177/177	211/211	192/192	263/257	209/205
20	Gpal	Campo	M	167/167	217/217	166/166	260/260	241/227
21	Gpal	Campo	F	181/167	214/214	204/190	260/260	241/227
22	Gpal	Campo	F	181/167	238/214	204/190	254/242	241/227
23	Gpal	Campo	M	167/167	217/217	166/166	254/242	241/227
24	Gpp	Campo	F	193/181	211/211	210/198	257/257	207/193
25	Gpal	Akak	F	000/000	220/220	180/166	000/000	000/000
26	Gpal	Akak	M	000/000	220/214	166/166	000/000	000/000
27	Gpal	Akak	M	167/167	214/214	166/166	260/260	241/227
28	Gpal	Akak	M	167/167	214/214	166/166	260/260	241/227
29	Gpal	Akak	F	181/167	214/205	180/166	260/260	241/227
30	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	260/260	241/227
31	Gpal	Akak	M	167/167	217/217	166/166	260/260	241/227
32	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	260/260	243/229
33	Gpal	Akak	M	000/000	217/217	166/166	257/257	241/227
34	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	260/260	241/227

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35	Gpal	Akak	M	167/167	217/217	166/166	260/260	241/227
36	Gpal	Akak	M	167/167	220/220	166/166	257/257	000/000
37	Gpal	Akak	M	167/167	217/217	166/166	260/260	241/227
38	Gpal	Akak	F	177/177	160/160	180/166	260/254	000/000
39	Gpal	Akak	M	177/177	220/217	166/166	260/260	241/227
40	Gpal	Akak	M	189/189	000/000	172/172	260/260	000/000
41	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	260/260	241/227
42	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	260/260	241/227
43	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	254/254	241/227
44	Gpal	Akak	M	167/167	223/223	166/166	263/263	241/227
45	Gpal	Akak	F	167/167	217/217	180/166	260/260	241/227
46	Gpal	Akak	M	167/167	217/217	166/166	260/260	243/229
47	Gpal	Akak	M	167/167	220/217	166/166	254/254	241/227
48	Gpal	Akak	M	165/165	220/214	166/166	287/257	241/227
49	Gpal	Akak	F	181/171	217/202	180/166	254/254	241/227
50	Gpal	Akak	M	167/167	217/202	166/166	257/257	241/227
51	Gpal	Akak	M	167/167	217/217	172/172	257/257	000/000
52	Gpal	Akak	F	181/167	217/202	180/166	257/257	241/227
53	Gpal	Akak	F	181/167	217/202	180/166	257/257	241/227
54	Gpal	Akak	F	181/167	217/217	180/166	260/260	243/227
55	Gpal	Mabiog	F	167/167	217/217	180/166	257/257	225/225
56	Gpp	RioCampo	F	181/167	000/000	184/170	296/266	245/231
57	Gpp	RioCampo	F	181/167	190/181	194/180	260/260	000/000
58	Gpp	Edjabe	M	167/167	247/208	190/190	266/266	219/203
59	Gpp	Edjabe	M	179/179	221/202	178/178	266/251	219/203
60	Gpp	RioCampo	M	177/177	205/205	186/186	260/260	000/000
61	Gpp	RioCampo	F	165/165	202/202	200/194	260/260	000/000
62	Gpp	Fontem	F	183/175	211/202	186/172	266/266	225/211
63	Gpp	Fontem	F	187/177	211/211	198/186	260/260	225/211
64	Gpp	Fontem	F	193/183	208/208	186/174	263/251	225/213
65	Gpp	Fontem	F	193/183	208/202	188/172	263/251	225/211
66	Gpp	Fontem	F	183/171	208/208	186/174	257/245	227/213
67	Gpp	Fontem	F	183/171	205/205	190/178	251/243	227/213
68	Gpp	Fontem	F	181/167	208/190	188/176	269/269	215/199
69	Gmp	Adamaoua	M	167/167	208/199	202/202	263/263	223/209
70	Gmp	Adamaoua	M	000/000	220/220	208/208	263/263	223/209
71	Gmp	Adamaoua	M	167/167	217/217	194/194	263/263	000/000
72	Gmp	Adamaoua	M	193/193	214/214	220/220	290/263	221/207

Ind : Individu ; M : Mâle ; F : Femelle ; Gmp : G. submorsitans ; Geal : G. caligenea ; GPP : G. p. palpalis ; Gpal : G. p. pallicera ; Gnigr : G. nigrofusca ; Gfus : G. fuscipes.

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Il découle de ce tableau que 69 allèles (dont 36 allèles pour G. p. pallicera) ont été identifiés pour les cinq marqueurs microsatellites utilisés, illustrant ainsi une certaine diversité génétique au sein des différentes populations de glossines.

III.4.1. Polymorphisme des marqueurs utilisés

Les cinq marqueurs considérés se sont montrés polymorphes avec des nombres d'allèles variables. La figure 13 donne les fréquences alléliques par locus et pour chaque espèce de glossines. Nous n'insisterons pas sur les espèces pour lesquelles peu de glossines ont été analysées.

Chez G. p. pallicera, 6, 10, 5, 10 et 9 allèles ont été respectivement identifiés aux loci 55.3, GPCAG, PGP13, C102 et PGP24. Au sein des populations de G. p. pallicera, la comparaison des nombres d'allèles de différents loci n'a montré aucune différence significative (P= 0,47). Les loci GPCAG et C102 étaient les plus polymorphes avec environ dix allèles distincts pour chacun des loci.

Chez G. p. palpalis, 10, 8, 16, 9 et 15 allèles ont été identifiés respectivement pour les loci 55.3, GPCAG, PGP13, C102 et PGP24. Les loci PGP13 et PGP24 étaient les plus polymorphes avec respectivement 16 et 15 allèles. Aucune différence significative (P= 0,20) n'a été observée en comparant les nombres d'allèles de différents loci au sein des populations de G. p. palpalis.

Les valeurs de la richesse allélique entre G. p. pallicera (4,960) et G. p. palpalis (10,785) montrent que la variation du nombre d'allèle est non-significative entre ces deux espèces (P= 0,33). Ces valeurs ont été calculées parce qu'il était impossible de comparer le nombre d'allèle entre ces deux espèces à cause de la disproportion entre le nombre d'échantillons de G. p. pallicera et G. p. palpalis.

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Gnigr : G. nigrofusca ; Gpal : G. p. pallicera ; Gcal : G. caligenea ; Gfus : G. fuscipes; Gpp : G. p. palpalis ; Gmp : G. morsitans

La figure 14 donne le nombre total d'allèles par locus pour l'ensemble des espèces de glossines. Le locus PGP24 a été le plus polymorphe avec environ vingt-six allèles distincts

III.4.2. L'hétérozygotie et le coefficient de consanguinité

L'analyse du coefficient de consanguinité (FIS) révèle un déficit en hétérozygote non significatif (FIS = 0,04 ; P = 0,31) pour G. p. pallicera. Par contre, chez G. p. palpalis, le déficit en hétérozygote est significatif (FIS = 0,145 ; P = 0,0001).

Les différentes valeurs de FIS reflètent la différence entre les valeurs de Ho et Hs de G. p. pallicera (tableau 5) et G. p. palpalis (tableau 6)

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Tableau 5: Hétérozygotie et les valeurs de FIS en fonction des loci chez G. p. pallicera

Tableau 6: Hétérozygotie et les valeurs de FIS en fonction des loci chez G. p. palpalis

Les valeurs des FIS sont variables entre loci et sont toutes différentes de zéro. Les figures 15 et 16 présentent les valeurs des FIS par locus, respectivement pour G. p. pallicera et G. p. palpalis. La valeur moyenne de FIS est proche de zéro pour G. p. pallicera et éloignée de zéro pour G. p. palpalis.

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Figure 15: Valeurs de la FIS en fonction des loci et pour les populations de G. p. pallicera

Figure 16: Les valeurs de la FIS en fonction des loci et pour les populations de G. p. palpalis

Effet des allèles nuls sur les déficits en hétérozygote ou les valeurs du FIS pour G. p. palpalis.

Compte tenu du fait que la présence des allèles nuls peut avoir un effet sur le déficit en hétérozygote, nous avons analysé la relation entre les allèles nuls et les FIS. La figure 17 illustre l'association entre le nombre d'allèles nuls et les FIS pour G. p. palpalis. Cette courbe de régression des allèles nuls (figure 17) donne la relation entre les valeurs de FIS et les allèles

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nuls. Le coefficient de corrélation (R² = 0,00627) montre qu'il existe une corrélation négative entre les allèles nuls et les valeurs de FIS.

Figure 17 : Courbe de régression des FIS en fonction des allèles nuls pour G. p. palpalis

Effet des allèles nuls sur les déficits en hétérozygote ou les valeurs du FIS pour G. p. pallicera.

La figure 18 montre la courbe de régression des FIS en fonction des allèles nuls. Le coefficient de corrélation (R² = 0,4681) montre qu'il existe une corrélation négative entre les allèles nuls et les valeurs de FIS.

Figure 18 : Courbe de régression des FIS en fonction des allèles nuls pour G. p. pallicera

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La fréquence des allèles nuls de la sous population G. p. palpalis a été estimée en utilisant la deuxième méthode de Broockfield. En comparant les allèles attendus, il ressort que les loci GPCAG et C102 ont présenté des allèles nuls qui auraient contribué à augmenter leurs valeurs de FIS. Tous les autres loci n'ont pas présenté d'allèles significativement nuls (tableau 7).

PB2² : Fréquence génotypique attendue des individus homozygotes nuls ; Méthode de Brookfield 2 : Nous donne la fréquence attendue des allèles nuls ; N : Nombre d'individus génotypés ; N' : Correspond à la somme de N et les blancs (homozygotes nuls) observés.

Pour voir s'il existait des associations entre les loci microsatellites analysés, nous avons évalué le déséquilibre de liaison. En effet, Le déséquilibre de liaison est évalué sous l'hypothèse de l'absence d'association statistique entre les loci. Globalement, les valeurs (tableau 8) du test de déséquilibre de liaison montrent globalement une absence d'association statistiquement significative aussi bien pour les populations de G. p. palpalis que celles de G. p. pallicera (tableau 8). Néanmoins, une association significative a été observée au sein des populations de G. p. pallicera pour les combinaisons de loci 55.3 et PGP13 (P = 0,002) au seuil de significativité P= 0,0025 (en fait, en combinant les P-values de plusieurs tests pour obtenir une P-value générale pour chaque paire de locus, le logiciel recalcule le nouveau seuil qui est en général 0,05/nombre de tests combinés). Ces loci sont donc en déséquilibre de liaison.

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Gpal : G. p. pallicera; Gpp : G. p. palpalis ; * : association statistiquement significative

III.4.3. Différenciation génétique entre les populations

Pour évaluer la similarité entre les espèces de glossines, un dendrogramme (contenant des bootsraps) a été construit. Ce dendrogramme regroupe les glossines en fonction des espèces (figue 19). Un total de 6 espèces a été analysé dans cette étude. Pour construire ce dendrogramme, nous avons regroupé les glossines en fonction des espèces. A la suite de ce regroupement, nous avons évalué les distances génétiques entre les espèces. Le dendrogramme résultant montre les distances génétiques entre les différentes espèces de glossines. Il ressort que les distances sont faibles entre G. p. palpalis et G. nigrofusca, G. fuscipes et G. p. pallicera. Par contre, ces distances génétiques sont élevées entre les autres espèces comme par exemple G. caligenea et toutes les autres espèces.

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Figure 19: Dendrogramme illustrant les différences et les similarités génétiques entre les espèces de glossines.

Gpp : G. p. palpalis ; Gnigr : G. nigrofusca ; Gfus : G. fuscipes ; Gpal : G. p. pallicera ; Gmp : G. submorsitans ; Gcal : G. caligenea

Pour évaluer le niveau de polymorphisme génétique entre les populations de glossines, nous avons utilisé les génotypes multilocus pour caractériser chaque espèce. Par la suite, un dendrogramme de similarité a été construit à partir des données obtenues. Un total de 69 génotypes multilocus distincts a été identifié à partir des 72 échantillons examinés. Le dendrogramme généré indique un nombre important de génotypes différents (figure 20). Ce dendrogramme peut être subdivisé en quatre clusters : le premier cluster contenant 41 glossines dont la majorité appartenant à l'espèce G. p. pallicera provenant de Campo, deux G. p. palpalis de Rio Campo et G. fuscipes provenant de Bipindi. Le deuxième cluster, (contenant 10 échantillons) contient trois G. p. palpalis dont deux provenant de Campo et une autre de Fontem, deux G. caligenea de Campo, une G. nigrofusca provenant de Campo Beach et quatre G. p. pallicera de Campo. Le cluster 3 contient majoritairement l'espèce G. p. palpalis dont cinq provenant de Fontem et trois autres de Campo, une espèce G. submorsitans de l'Adamaoua. Le cluster 4 contient trois G. submorsitans provenant de l'Adamaoua et une G. caligenea provenant de Campo. Le Cluster 5 contient deux G. p. palpalis d'Edjabé et une G. p. pallicera provenant de Bipindi. D'une manière générale, on constate que les espèces de glossines sont isolées les unes des autres.

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Gmp : G. submorsitans Gpp : G. p. palpalis Gca : G. caligenea Gpa : G. p. pallicera Gni : G. nigrofusca Gfu : G. fuscipes Admw: Adamaoua Cmpo: Campo

Figure 20: Dendrogramme illustrant les différences et les similarités entre les populations de glossines

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Pour évaluer la structuration entre les différentes espèces de glossines étudiées, les valeurs de FST ont été déterminées entre elles (tableau 9). Ces valeurs de FST permettent d'estimer les différences génétiques entre les différentes populations de glossines. Lorsque les valeurs de FST sont proches ou égales à zéro, on conclut à une absence totale de structuration ; lorsqu'elles sont différentes de zéro, on conclut à une structuration de la population en sous populations. A la lumière de ces considérations, nous observons que toutes les valeurs de FST sont significatives entre G. p. pallicera et G. caligenea (0,1894), G. p. pallicera et G. p. palpalis (0,2006) ; G. p. pallicera et G. morsitans, G. p. palpalis et G. morsitans (0,2396).

Gpal : G. p. pallicera ; Gcal : G. caligenea ; Gpp : G. p. palpalis ; Gmp : G. submorsitans.

Pour évaluer la structuration entre les sous populations (ensemble des glossines du même village) de G. p. pallicera et de G. p. palpalis en fonction des villages (Campo, Edjabe, Fontem, Rio Campo), les valeurs de FST ont été calculées (tableaux 10 et 11). Ces valeurs sont faibles et non significatives entre les sous populations aussi bien pour G. p. pallicera que G. p. palpalis (tableaux 9 et 10).

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IV. DISCUSSION

Au cours de cette étude, neuf marqueurs microsatellites ont été testés pour la caractérisation génétique de G. p. pallicera du Sud forestier camerounais. Les marqueurs microsatellites utilisés dans la présente étude avaient déjà été utilisés dans de nombreux travaux notamment sur G. p. palpalis des foyers de la THA du Cameroun et de la République Démocratique du Congo (RDC) (Melachio et al., 2011, 2015), et même sur G. p. gambiensis d'Afrique occidentale (Solano et al., 2009).

De ces marqueurs, deux (A10 et B110) n'ont amplifié aucune des 72 glossines analysées dans cette étude. Or, les travaux menés avec ces marqueurs sur G. p. gambiensis (Solano et al., 2009) et G. p. palpalis (Melachio et al., 2011, 2015) avaient révélé un taux d'amplification important pour ces espèces de glossines. Cette absence d'amplification pourrait s'expliquer par le fait que ces glossines n'appartiennent pas aux mêmes espèces. De plus, la plupart des marqueurs microsatellites utilisés dans cette étude ont été synthétisés à partir du génome de G. p. gambiensis. Ces deux marqueurs ne semblent donc pas appropriés pour la caractérisation génétique de G. p. pallicera du sud forestier Camerounais. A côté de ces deux marqueurs, deux autres (B3 et B104) ont amplifié moins de 50% de glossines analysées. Ces résultats pourraient s'expliquer par un polymorphisme au niveau du site de fixation de ces amorces. Le nombre faible d'échantillons de G. p. pallicera amplifiés avec B3 et B104 suggère aussi que ces deux marqueurs ne sont pas appropriés pour la caractérisation génétique de G. p. pallicera du sud forestier Camerounais. Des neuf marqueurs utilisés dans cette étude, seulement cinq (55.3, GPCAG, C102, PGP24 et PGP13) d'entre eux ont donné des résultats d'amplification permettant de faire des analyses de génétique des populations. Les marqueurs C102, PGP13, PGP24, 55.3 et GPCAG se sont montrés polymorphes pour G. p. pallicera et toutes les espèces de glossines ; corroborant ainsi les résultats obtenus chez G. p. palpalis (Melachio et al., 2011, 2015), G. p. gambiensis (Solano et al., 2009, 2010), G. tachinoïdes (Adam et al., 2014) . La variabilité observée au niveau de la sensibilité de ces cinq marqueurs microsatellites corrobore avec les résultats antérieurs (Melachio et al., 2011 ; Solano et al., 2009). Des cinq espèces de glossines analysées dans cette étude, les marqueurs GPCAG et C102 se sont montrés plus polymorphes (10 allèles chacun) chez G. p. pallicera et les marqueurs 55.3, PGP24 et PGP13 (9, 15, 16 allèles respectivement) chez G. p. palpalis. Ces résultats montrent que le taux d'amplification obtenu pour chaque marqueur dépendrait de l'espèce de glossine et du lieu d'échantillonnage.

Les niveaux de polymorphisme obtenus pour G. p. palpalis ont été supérieurs à ceux de G. p. pallicera dans cette étude. L'hétérozygotie moyenne attendue a été de 0,906 pour G.

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p. palpalis alors qu'elle a été de 0,571 pour G. p. pallicera. De même, l'hétérozygotie moyenne observée était de 0,761 alors qu'elle a été de 0,363 pour G. p. pallicera. Cette supériorité s'explique par le fait que les marqueurs microsatellites utilisés ont été désignés pour G. p. palpalis et sont donc plus adaptés chez ces derniers.

Les cinq marqueurs microsatellites retenus pour les analyses génétiques ont montré un polymorphisme génétique aussi bien au sein des populations de G. p. pallicera que celles de G. p. palpalis. La combinaison des résultats obtenus au niveau de chaque locus a permis d'établir des génotypes multilocus pour chaque glossine analysée. C'est ainsi que le dendrogramme de la figure 18 illustre les similarités génétiques obtenues à partir de 5 loci. Ce dendrogramme confirme le polymorphisme allélique observé au niveau de chaque locus. Il montre un grand polymorphisme génétique non seulement au sein des populations de G. p. pallicera du même village, mais aussi des villages distincts. Ce dendrogramme ne montre aucun regroupement des échantillons de G. p. pallicera en fonction des villages ; confirmant ainsi les résultats des FST qui ont montré une absence de structuration entre les populations de G. p. pallicera. Le dendrogramme montre que presque tous les échantillons de G. p. pallicera se concentrent sur une partie du dendrogramme. Ces résultats indiquent que les populations de G. p. pallicera sont génétiquement différentes des autres espèces de glossines. Ces différences s'illustrent par les distances génétiques entres les populations de G. p. pallicera et celles d'autres espèces, mais aussi par les valeurs de FST statistiquement significatives entre G. p. pallicera et les autres espèces de glossines analysées dans cette étude. Pour les populations de G. p. palpalis, le dendrogramme montre un grand polymorphisme génétique non seulement au sein des populations de G. p. palplis du même village, mais aussi des villages distincts. Il ne montre aucun regroupement des échantillons en fonction des villages; confirmant ainsi les résultats des FST qui ont montré une absence de structuration entre les populations de G. p. palpalis.

En considérant uniquement l'espèce G. p. pallicera, il ressort que la valeur globale de FIS est significativement proche de zéro (FIS = 0,04). Cette valeur serait due à la grande variation des FIS entre les différents loci (FIS = -0,199; -0,681; -0,534; 0,519; 0,778 respectivement pour 55.3; PGP13 ; PGP24 ; GPCAG et C102). Ces variations ont été aussi observées au sein des populations de G. p. palpalis. Les variations observées entre les valeurs des FIS ne permettent pas à présent de tirer une conclusion fiable sur la reproduction de G. p. pallicera c'est-à-dire si la reproduction se fait de manière panmictique ou pas. Malgré la grande variation observée entre les valeurs des FIS entre les loci, les résultats de cette étude

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montrent néanmoins et de manière générale des déficits en hétérozygotes aussi bien chez G. p. palpalis (FIS = 0,145) que chez G. p. pallicera. Ces déficits observés au sein des populations de G. p. pallicera et G. p. palpalis corroborent les résultats obtenus pour la plupart des populations de glossines. Comme dans la plupart des études, ce déficit en hétérozygote aurait pour origine la présence d'allèles nuls, l'effet Wahlund dû au mélange des populations génétiquement différentes et le stuttering qui se produit lorsque les amorces ne s'hybrident pas très bien provoquant un bégaiement de la Taq polymérase qui amplifie deux fois un allèle de même taille pour un individu hétérozygote. (Solano et al., 2010 ; Melachio et al., 2011). Pour voir si le déficit en hétérozygote observé dans cette étude était dû aux allèles nuls, nous avons estimé le coefficient de corrélation entre les allèles nuls et les valeurs du FIS. Le coefficient de corrélation (R² = 0,0627) montre une corrélation négative entre les allèles nuls et les valeurs de FIS pour l'espèce G. p. palpalis. Pour G. p. pallicera, le coefficient de corrélation (R² = 0,4681) montre aussi une corrélation négative entre les allèles nuls et les valeurs de FIS. Ces deux analyses suggèrent que les allèles nuls ne seraient pas à l'origine du déficit en hétérozygote observé. Ce déficit résulterait très probablement de l'effet Wahlund.

Le test de déséquilibre de liaison a montré globalement une absence d'association statistiquement significative aussi bien pour les populations de G. p. palpalis que celles de G. p. pallicera. Néanmoins, une association significative a été observée au sein des populations de G. p. pallicera pour la paire de 55.3 et PGP13 (P = 0,002). Cette association s'expliquerait par le fait que ces deux loci (55.3 et PGP13) sont situés sur le chromosome X et contribueraient à une déviation des proportions génotypiques.

Pour déterminer si les populations de glossines peuvent être structurées, des valeurs de FST ont été évaluées. Nos résultats ont montré une structuration entre les différentes espèces de glossines (P= 0,0003). La valeur de FST entre G. p. pallicera et G. caligenea est statistiquement très significative (P= 0,0002), suggérant ainsi que ces deux espèces sont génétiquement différentes. Entre les autres espèces de glossines notamment G. p. pallicera et G. p. palpalis, G. p. pallicera et G. morsitans, les valeurs de FST sont également significatives et suggèrent également des différences génétiques entre ces espèces. Ces résultats des FST sont en accord avec les distances génétiques observées sur le dendrogramme illustrant les différences et les similarités génétiques entre les espèces de glossines. Ces résultats confirment donc les différences taxonomiques entre ces espèces. Par contre, les valeurs des FST entre les sous populations de G. p. pallicera et G. p. palpalis sont faibles et non significatives entre les villages où ces glossines ont été échantillonnées ; indiquant ainsi une

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absence de structuration au sein des populations de G. p. pallicera et G. p. palpalis des villages du foyer de la THA de Campo. Ces résultats indiquent aussi une absence de populations de glossines génétiquement isolées et suggèrent des échanges entre les populations des différents villages. Les résultats générés dans cette étude suggèrent une approche de lutte visant la suppression et non l'éradication des populations de glossines du foyer de la THA de Campo.

Caractérisation génétique de Glossina pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris

CONCLUSION

Cette étude sur la caractérisation génétique de G. p. pallicera a fourni des données sur la structure génétique de ces populations de vecteurs. Les marqueurs microsatellites utilisés nous ont permis d'identifier plusieurs génotypes circulant au sein des populations de G. p. pallicera, illustrant un polymorphisme génétique au sein des populations du même village et des villages distincts. Cette étude a montré que les populations de G. p. palpalis des villages du foyer de la THA de Campo sont plus polymorphes que les populations de G. p. pallicera. Elle a montré des valeurs de FST non significatives entre les sous populations de G. p. pallicera ainsi que celles de G. p. palpalis. Il n'existe pas de sous structuration entre les sous populations de G. p. pallicera. Les populations de G. p. pallicera des villages du foyer de la THA de Campo ne sont pas génétiquement isolées. Par contre, les valeurs des FST sont significatives entre les différentes espèces de glossines ; confirmant ainsi la classification taxonomique de ces différentes espèces de glossines. Les résultats générés dans cette étude suggèrent une approche de lutte par suppression.

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Pour mieux comprendre la génétique des populations de glossines, nous comptons dans l'avenir :

? tester les marqueurs disponibles sur d'autres populations de G. p. pallicera d'autres

régions afin d'évaluer le niveau de polymorphisme réel au sein de ces vecteurs ;

? mettre au point d'autres marqueurs microsatellites adaptés à G. p. pallicera afin de générer des données qui permettront de mieux appréhender la génétique des populations de G. p. pallicera qui sont des vecteurs très peu étudiés.

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Caractérisation génétique de Glossina pallicera pallicera circulant dans le foyer de la maladie du sommeil de Campo du Sud forestier Camerounais rédigé par GOMSEU DJOUMSIE Emmanuel Boris

ANNEXES

Annexe 1 : Préparation de quelques solutions

Ajouter progressivement de l'eau distillée tout en agitant (agitateur magnétique)

Prélever 100 mL de TBE 10X et ajouter 900 mL d'eau distillée. Homogénéiser et

Prélever 50 mL de TBE 10X et ajouter 950 mL d'eau distillée. Homogénéiser et

Homogénéiser jusqu'à obtenir un liquide blanc laiteux. Chauffer jusqu'à clarification et ajouter 3 ul de BET. Maintenir à température ambiante dans une cuve à fabrication des puits jusqu'à solidification.

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	Annexe 2 : Fiche de donnée brute
ind Espèce Village			Codage	Sexe	553		GPCAG PGP13				C102		PGP24
1	Gnigr	Akak	Gni_Akak	F	0	0	0	0	0	0	245	245	249	249
2	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	167	167	217	217	180	166	254	242	241	227
3	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	220	214	166	166	260	260	241	227
4	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	167	167	214	214	180	166	251	251	241	227
5	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	214	211	166	166	251	251	241	227
6	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	167	167	220	220	180	166	254	245	241	227
7	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	217	211	166	166	257	257	241	227
8	Gnigr	CmpoB Gni_CmpB		F	0	0	151	151	178	166	260	260	205	205
9	Gpal	Memel	Gpa_Mmel	M	0	0	220	214	166	166	251	251	207	201
10	Gcal	Campo	Gca_Cmpo	F	167	167	202	202	186	172	263	263	261	245
11	Gcal	Campo	Gca_Cmpo	F	167	167	205	220	188	174	260	260	263	247
12	Gcal	Akak	Gca_Akak	F	181	167	202	202	184	176	260	260	265	251
13	Gpal	Campo	Gpa_Cmpo	M	167	167	202	199	166	166	260	251	265	251
14	Gfus	Memel	Gfu_Mmel	F	181	167	196	220	184	184	251	251	241	227
15	Gpp	Campo	Gpp_Cmpo	F	0	0	0	0	0	0	260	260	0	0
16	Gpal	Memel	Gpa_Mmel	F	167	167	202	202	0	0	266	266	0	0
17	Gpal	Campo	Gpa_Cmpo	M	167	167	214	214	166	166	269	269	241	227
18	Gpp	Campo	Gpp_Cmpo	F	181	171	202	202	170	154	263	251	243	243
19	Gpp	Campo	Gpp_Cmpo	M	177	177	211	211	192	192	263	257	209	205
20	Gpal	Campo	Gpa_Cmpo	M	167	167	217	217	166	166	260	260	241	227
21	Gpal	Campo	Gpa_Cmpo	F	181	167	214	214	204	190	260	260	241	227
22	Gpal	Campo	Gpa_Cmpo	F	181	167	238	214	204	190	254	242	241	227
23	Gpal	Campo	Gpa_Cmpo	M	167	167	217	217	166	166	254	242	241	227
24	Gpp	Campo	Gpp_Cmpo	F	193	181	211	211	210	198	257	257	207	193
25	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	0	0	220	220	180	166	0	0	0	0
26	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	0	0	220	214	166	166	0	0	0	0
27	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	214	214	166	166	260	260	241	227
28	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	214	214	166	166	260	260	241	227
29	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	181	167	214	205	180	166	260	260	241	227
30	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	181	167	217	217	180	166	260	260	241	227
31	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	217	217	166	166	260	260	241	227
32	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	181	167	217	217	180	166	260	260	243	229
33	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	0	0	217	217	166	166	257	257	241	227
34	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	181	167	217	217	180	166	260	260	241	227
35	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	217	217	166	166	260	260	241	227
36	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	220	220	166	166	257	257	0	0
37	Gpal	Akak	Gpa_Akak	M	167	167	217	217	166	166	260	260	241	227
38	Gpal	Akak	Gpa_Akak	F	177	177	160	160	180	166	260	254	0	0

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39	Gpal	Akak Gpa_Akak M	177	177	220	217	166	166	260	260	241	227
40	Gpal	Akak Gpa_Akak M	189	189	0	0	172	172	260	260	0	0
41	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	167	217	217	180	166	260	260	241	227
42	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	167	217	217	180	166	260	260	241	227
43	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	167	217	217	180	166	254	254	241	227
44	Gpal	Akak Gpa_Akak M	167	167	223	223	166	166	263	263	241	227
45	Gpal	Akak Gpa_Akak F	167	167	217	217	180	166	260	260	241	227
46	Gpal	Akak Gpa_Akak M	167	167	217	217	166	166	260	260	243	229
47	Gpal	Akak Gpa_Akak M	167	167	220	217	166	166	254	254	241	227
48	Gpal	Akak Gpa_Akak M	165	165	220	214	166	166	287	257	241	227
49	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	171	217	202	180	166	254	254	241	227
50	Gpal	Akak Gpa_Akak M	167	167	217	202	166	166	257	257	241	227
51	Gpal	Akak Gpa_Akak M	167	167	217	217	172	172	257	257	0	0
52	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	167	217	202	180	166	257	257	241	227
53	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	167	217	202	180	166	257	257	241	227
54	Gpal	Akak Gpa_Akak F	181	167	217	217	180	166	260	260	243	227
55	Gpal	Mabiog Gpa_Mbgo F	167	167	217	217	180	166	257	257	225	225
56	Gpp	RioCpo Gpp_Rcpo F	181	167	0	0	184	170	296	266	245	231
57	Gpp	RioCpo Gpp_Rcpo F	181	167	190	181	194	180	260	260	0	0
58	Gpp	Edjabe Gpp_Edjb M	167	167	247	208	190	190	266	266	219	203
59	Gpp	Edjabe Gpp_Edjb M	179	179	221	202	178	178	266	251	219	203
60	Gpp	RioCpo Gpp_Rcpo M	177	177	205	205	186	186	260	260	0	0
61	Gpp	RioCpo Gpp_Rcpo F	165	165	202	202	200	194	260	260	0	0
62	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	183	175	211	202	186	172	266	266	225	211
63	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	187	177	211	211	198	186	260	260	225	211
64	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	193	183	208	208	186	174	263	251	225	213
65	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	193	183	208	202	188	172	263	251	225	211
66	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	183	171	208	205	186	174	257	245	227	213
67	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	181	171	205	205	190	178	251	242	227	213
68	Gpp	Fontem Gpp_Fntm F	181	167	208	190	188	176	269	269	215	199
69	Gmp	Adama Gmp_Admw M	167	167	208	199	202	202	263	257	223	209
70	Gmp	Adama Gmp_Admw M	0	0	220	220	208	208	263	263	223	209
71	Gmp	Adama Gmp_Admw M	167	167	217	217	194	194	263	263	0	0
72	Gmp	Adama Gmp_Admw M	193	193	214	214	220	220	290	263	221	207

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