Fractionnement des protéines sériques par électrophorèse sur gel polyacrylamide

République Algérienne Démocratique Et Populaire.
Ministère de l'enseignent supérieur et de la recherche scientifique.
Université Mentouri Constantine.
Faculté des sciences de la nature et de la vie.
Département De Biologie Animale.

Mémoire de fin d'étude

En vue de l'obtention du diplôme DES en Biologie.

Option: Biologie Et Physiologie Animale.

FRACTIONNEMENT DES PROTEINES SERIQUES PAR

THEME:

ELECTROPHORESE SUR GEL POLYACRYLAM IDE.

Présenté par: Encadré par:

Belaouar Hamza. Pr. Douadi Khelifi.
Lamri Adlène.

Promotion: 2008/2009.

Remerciement





A Dieu Le Tout Miséricordieux,

Ton amour, Ta miséricorde et Tes grâces à mon endroit m'ont fortifiée dans la persévérance et l'ardeur au travail.

A monsieur le professeur Douadi Khelifi qui nous a fait l'honneur de bien vouloir diriger ce mémoire, dont l'enthousiasme a fait

naître ce travail qu'il a continué à entourer de son attention, qui nous a non seulement permis d'accéder à le laboratoire de biochimie génétique mais qui nous y a guidé avec beaucoup de bienveillance, nous exprimons notre très respectueuse reconnaissance et nous tenons à adresser nos très sincères remerciements.

A mademoiselle Bellil Inès dont la consciencieuse et généreuse

participation afavorisé l'orientation de nos recherches, qui nous a guidées avec la plus grande bienveillance, qui nous a sans cesse

prodigué ses encouragements et ses judicieux conseils et qui nous a manifesté toute son attention et sa bienveillance, nous présentent nos vifs remerciements... nous disons un chaleureux merci.

Notre gratitude s'adresse aussi à tout l'équipe du laboratoire de biochimie génétique-Centre de biotechnologie-Université Mentouri Constantine, où nous réalisons notre partie expérimental.

Nombreux sont et celles qui, inlassablement pendant ces années d'étude, nous ont encouragée et aidée à atteint ce niveau...

Enseignants, enseignantes, amis et collègues nous exprimons notre gratitude.

...Belaouar Hamza/Lamri Adlène



IV

A ma mère.

A mon père.

A mes soeurs.

A mes proches.

Sans oublier...

Tous mes amis...

Mes collègues...

Tous ce qui est attend

Cet instant de moi...

« A ma soeur Mouna,

...ma cousine Kenza

...qui suivent mes pas »

A l'exception de Mouna et Kenza

Je ne mention pas des noms pour ne pas favorisé

certains a des autres...ils sont beaucoup.

...Belaouar Hamza.

Le plus beau sentiment c'est le m_ystère,

C'est l'ori_gine de l'art et de science.

Albert Einstein

Remerciement I

Dédicace II

Sommaire 1

Liste des tableaux 5

Liste des figures et des schémas 7

Liste des abréviations 10

Introduction 13

Partie théorique
Synthèse bibliographique 16

I. Généralité sur les protéines sériques 17

A. Hétérogénéité 18

1. Hétérogénéité structurale 18

2. Hétérogénéité fonctionnelle 18

3. Hétérogénéité dans l'échelle des concentrations 18

B. Valeur sémiologique de la protidémie 18

1. Valeur normale et variation physiologique 18

2. Variation pathologique 18

3. Répercussion de la variation de la protidémie sur d'autres paramètres biochimiques 19

II. Etude descriptive des principales protéines sériques 23



Le groupe des Albumines: 24

1. Pré albumine(PA) et Rétinol-binding protéine(RBP) 24

2. Albumine ou sérumalbumine 26



Le groupe des Globulines: 31

A. Le groupe des ALPHA-1-GLOBULINES 31

1. Alpha-1-antitrypsine (á 1-AT) 31

2. Orosomucoïde ou Alpha-1-glycoprotéine acide 33

3. Alpha-1-foetoprotéine 34

B. Le groupe des ALPHA-2-GLOBULINES 36

1. Haptoglobine (Hp) 36

2. Alpha-2-macroglobuline (á 2M) 38

3. Céruléoplasmine, céruloplasmine (CE R) 39

C. Le groupe des BETA GLOBULINES 42

1. Transferrine (Tf) ou Sidérophiline 42

2. C-réactive protéine (CRP) ou protéine C réactive 43

3. Fibrinogène (FIB) 44

D. Le groupe GAMMA GLOBULINES 47

1. Définition. 47

2. Propriétés 47

3. Structure générale des immunoglobulines. 48

4. Structure particulière des immunoglobulines 54

5. Les classes et sous-classes d'immunoglobulines. 54

6. Exploration des immunoglobulines sériques. 56

7. Fonctions des immunoglobulines 58

8. principales anomalies des immunoglobulines. 60

III. Etude de quelques syndromes: 67

A. Syndrome de dénutrition. 68

B. Syndrome inflammatoire. 69

C. Syndrome néphrotique. 70

D. Gammapathies. 72

y' Etude détaillé d'un syndrome; le syndrome inflammatoire. 73

Partie expérimental

Matériels et méthodes 98

Résultats et Discussion 106

Conclusion 112

Références bibliographiques 114

Annexes 118

Résumé 127

Liste des tableaux

Liste des tableaux

6

Liste des tableaux

Chapitre 1:

1. Classification des protéines sériques en fonction de leur concentration plasmatique (Tableau 1) P 17.

Chapitre 2:

2. Niveau du risque lié à la variation du CRP (tableau 2) P43.

3. Tableau comparatif de déficience congénital (tableau 3) P45.

4. Classes et sous classes des immunoglobulines (tableau 4) P54.

5. Dysglobulinémies monoclonales (tableau 5) P61.

Chapitre 3:

6. Répartition de la réponse inflammatoire (tableau6) P78.

7. Variation de la VS (vitesse de sédimentation) du Fibrinogène selon l'âge et

le sexe (tableau 7) P79.

8. Propriétés biologiques des protéines inflammatoires (tableau 8) P83.

9. Facteurs susceptibles de modifier le dosage sérique des protéines de l'inflammation (tableau 9) P85.

Matériels et méthodes:

10. Les échantillons utilisés pour l'électrophorèse sur gel polyacrylamide (tableau 10) P98.

Liste des fi_gures et des schémas

Liste des figures et des schémas	8

Les figures:
Chapitre2:

1. Structure biochimique d'une immunoglobuline (figure 1) P48.

2. Les différents types des immunoglobulines (figure2) P48.

3. Organisation en domaine (figure 3) P50.

4. Structure tridimensionnel d'une immunoglobuline (figure 4) P52.

5. Profil électrophoritique d'un patient atteint le myélome multiple classique (figure 5) P63.

6. Profil électrophoritique d'un patient atteint le syndrome MGUS (figure 6) P65.

Chapitre 3:

7. Comparaison entre des profiles nutritionnelles (figure 7) P68.

8. Electrophorèse des protéines sérique au cours du syndrome

inflammatoire (figure 8) P69.

9. Electrophorèse des protéines sériques au cours du syndrome néphrotique (figure 9) P70.

10. Electrophorèse des protéines sériques d'une personne atteint d'un

Gammapathie (figure10) P71.

11. Phase d'initiation du syndrome inflammatoire (figure 11) P74.

12. Phase d'amplification du syndrome inflammatoire (pré activation des cellules inflammatoires) (figure 12) P75.

13. Phase d'amplification du syndrome inflammatoire (activation des

cellules inflammatoires) (figure 13) P76.

14. Profil protéique des protéines sériques inflammatoires (figure 14) P91.

15. Profil protéique des protéines sériques inflammatoires (figure 15) P91.

Matériels et méthodes

1. comparaison entre le résultat de fractionnement sur gel d'acétate cellulose et sur gel de polyacrylamide (figure 16) P106.

2. Comparaison entre les résultats de fractionnement sur gel Acide PAGE,

SDS-PAGE, PAGE (figure 17) P106.

3. variation des bandes protéiques ; malade-malade (figure 18) P107.

4. variation des bandes protéiques ; malades-témoins (figure 19) P107.

5. comparaison entre deux profils ; malade-témoin (figure 20) P108.

6. comparaison entre les profils des malades (figure 21) P109.

7. comparaison entre les profils des témoins (figure 22) P109.

Liste des figures et des schémas	9

Les schémas: Chapitre 2:

1. Mouvement d'eau et des aliments contrôlé par la Ponc (schéma 1) P26.

Chapitre 3:

2. Mécanisme du système inflammatoire (schéma 2) P68.

3. La réponse inflammatoire (schéma 3) P77.

Liste des abréviations

11

Abréviations

Les protéines sériques: AFP: Alpha foetoprotéine. ALB: Albumine.

CER: Céruléoplasmine, céruloplasmine. CRP: protéine C réactive.

FIB : Fibrinogène.

Hp: Haptoglobine.

Ig : Immunoglobuline.

ORO: Orosomucoïde.

PA: Préalbumine.

RBP : Rétinol binding protein.

Tf: Transferrine.

á1-AT: Alpha-1-antitrypsine.

Á1-GA: Alpha-1-glycoprotéine acide. á2-M: Alpha-2-macroglobuline.

Les acides amines:

Asp: Asparagine.

Glu: Glutamine.

Leu: Leucine. Lys: Lysine. Val: Valine.

12

Liste des abréviations

Autre abréviation:

APS : Ammonium persulfate. BCG : bromocrésol.

CIVD: coagulation intravasculaire disséminée.

DICS: Déficits immunitaires combinés sévères.

Hb: Hémoglobine.

IDR: immunodiffusion radiale. IN: immuno-néphélométrie.

KDa: Kilo Dalton (1KDa=1000Dalton).

MGUS: Gammapathies monoclonales de signification indéterminée.

NFS: numération formulaire sanguine.

Ponc: Pression oncotique.

PRI- : protéine négative de la réaction inflammatoire.

PRI+: protéine positive de la réaction inflammatoire.

RI : Réaction inflammatoire.

SAM : syndrome hémophagocytaire.

SI : Syndrome inflammatoire. TBG: Tyroxine binding globuline.

TBPA: thyroxine binding pré albumine.

VS : Vitesse de sédimentation.

Introduction

14

Introduction

Les protéines sont des grosses molécules non dialysables de masse moléculaire supérieure à 100000 daltones constituées par un enchaînement d'acides aminés dans un ordre spécifique qui est différent d'une protéine à une autre. Ce sont les constituants les plus abondants du plasma et du sérum. Elles sont surtout des glycoprotéines sauf l'albumine, la â2 micro globuline, la protéine Creactive.

Les protéines sont les constituants les plus abondants du plasma et du sérum. Historiquement ont d'abord été étudiées les protéines totales, puis la sérumalbumine et la sérum-globuline qui en ont été séparées.

Les protéines sont en fait présentes dans toutes les cellules, où elles jouent des rôles très variés sous formes d'éléments de structures, de molécules contractiles, d'enzymes,... etc. Les protéines globulaires, parmi lesquelles figurent les protéines douées d'activités biologiques, le plus souvent solubles dans l'eau ou dans les solutions salines diluées, de structure générale sphérique ou ovoïde. C'est dans cette classe que nous retrouvons les protéines du sérum, milieu biologique très complexe provenant de la coagulation du sang extravasé qui renferme une forte quantité de protéines.

Nous examinerons ici les principales de ces protéines, classées d'après leur migration électrophorétique. Leurs rôles biologiques sont très variés et leur dosage dans le sérum revêt une grande importance en biochimie clinique où il contribue au diagnostic de nombreuses affections.

La diversité des constituants protéiques du sérum laisse supposer à juste titre que chacun de ses éléments joue un rôle spécifique. Cependant, les principales fonctions physiologiques, dont les protéines sériques sont responsables, sont assurées par toutes les protéines ensemble; Fonction de transport, Maintien de la stabilité du volume sanguin, Maintien du PH sanguin, Action sur la calcémie sanguine, Protection contre l'hémolyse.

Une protéinémie basse ou élevée ne permet donc pas de définir un type de pathologie, mais elle est souvent le point de départ d'investigations plus complètes. Inversement, une protéinémie dont la valeur reste dans les normes physiologiques peut masquer une pathologie dont le diagnostic ou le suivi évolutif ne sera effectué qu'après une exploration des protéines dites "spécifiques" par différent méthodes d'exploration.

Les méthodes électrophorétique ; ce sont les plus importantes actuellement. Elles se fondent sur la charge électrique des protéines en solution et sur leur mobilité. Le but de notre travail est basé sur le fractionnement des ces protéines par la méthode d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

Partie théorique

S_ynthèse bibliographique

Chapitre 1

Généralités sur les protéines sériques

Chapitre1: Généralité sur les protéines sériques	18

A. Hétérogénéité:

1. Hétérogénéité structurale:

Plus de 300 protéines plasmatiques différentes (isolables à l'électrophorèse en 2D).

2. Hétérogénéité fonctionnelle:

-Homéostasie corporelle: Pression oncotique, pH, balance ionique. -Fonctions de transport: hormones, lipides, métaux, médicament. -Fonctions anti-protéasiques.

-Fonctions hémostatiques.

-Fonctions immunitaires,...

3. Hétérogénéité dans l'échelle des concentrations:

Il existe de très grandes différences de concentration entre les protéines plasmatiques (par exemple : entre sérumalbumine et IgE, il y a une échelle 10⁷). On va ainsi classer les protéines en fonction de leur concentration plasmatique:

-protéines prédominantes 10-40g/l Albumine(ALB), immunoglobuline G (IgG).

-protéines majeures	1- 1O g/l	Fibrinogène (Fib), Transferrine (Tf), IgA, IgM.

-protéines mineures 0,1-1g/l CER, plasminogène.

-protéines traces

< 0,1g/l

CRP, IgE, rétinol binding protein (RBP).

Tableau 1: classification des protéines sériques en fonction de leur concentration plasmatique.

B. VALEUR SEMEIOLOGIQUE DE LA PROTIDEMIE:

1. Valeur normale et variations physiologiques:

· Valeur normale chez l'adulte : 70g/l (60-80 g/l).

· Variations avec l'âge: dans le sens de l'hypoprotidémie:

>Prématuré: 40 g/l.

>Nouveau-né: 60 g/l, avec chute à 45-50 g/l au bout de 4 jours. >Nourrisson (2 ans): 60 g/l.

> Après 70 ans: 65 g/l par diminution de l'albumine et/ou des Ig.

· grossesse: 60 g/l par hémodilution et diminution de l'albumine et/ou des Ig.

2. Variations pathologiques:



Les variations absolues :

a) Hyper-protidémies absolues : immunoglobulines et Fibrinogène:

Les hyper protéinémies sont dues essentiellement à deux phénomènes

a. L'hémoconcentration.

b. L'hémoconcentration hypergammaglobulinémies.

Chapitre1: Généralité sur les protéines sériques	19

V' par augmentation des Immunoglobulines: Les hypergammaglobulinémies:

+ hypergammaglobulinémies polyclonales: Augmentation d'un groupe hétérogène d'immunoglobulines. Soit en réponse à une stimulation antigénique.

Soit à la suite d'une multiplication incontrôlée de plusieurs clones de cellules productrices d'immunoglobulines.

N'est pas obligatoirement accompagnée d'une augmentation des protéines totales et se retrouve dans de nombreuses.

+ Les hypergammaglobulinémies monoclonales:

Dans ces maladies, une bande d'immunoglobuline étroite et intense, produite par un seul clone de lymphocytes se localise à l'électrophorèse entre les á-globulines et les â globulines.

On a appelé ces immunoglobulines anormales, protéines "M" (M venant de maligne) ou para protéines.

Les paras protéinémies s'accompagnent d'une augmentation des protéines totales avoisinant ou dépassant 90 g/I. L'identification de la para protéine en cause se fait par immunochimie Des examens biologiques complémentaires doivent être effectués, afin de mettre en évidence une éventuelle protéinurie (en particulier, protéines de BenceJones), une insuffisance rénale ou une Cryoglobulinémie.

Les principales para protéinémies sont la maladie de Kahler, la macroglobulinémie de Waldenström; *la maladie des chaînes lourdes- et la maladie des chaînes légères D'autres para protéinémies sont bénignes : on ne trouve dans ces cas jamais de protéine de Bence-Jones dans les urines et aucun symptôme clinique et radiologique n'apparaît : elle représente moins de 1 % des immunoglobulinopathies totales.

V' par augmentation du fibrinogène:

Hyperfibrinogènémie, notamment dans les syndromes inflammatoires.

b) Hypo-protidémies absolues : Albumine ou des immunoglobulines.

Les principales causes des hypo protéinémies sont - un défaut d'apport alimentaire (malnutrition, Kwashiorkor) (l'albuminémie est alors fortement diminuée) Un défaut de synthèse lors d'une insuffisance hépatique sévère (hépatite grave, cirrhose évoluée).

Une fuite anormale rte protéines: hémorragie massive plasmaphérèse, fuites urinaires (syndrome néphrotique), déperditions cutanées ou tissulaires (brûlures, entéropathies,). Les signes cliniques majeurs de l'hypoprotéinémie sont fonte du tissu musculaire, d'oedèmes, voire d'ascite, expliqués par une fuite d'eau dans le compartiment du liquide interstitiel par diminution de la pression oncotique intravasculaire.

V' par carence d'apport alimentaire en protéines:

· Malnutrition, déséquilibre en Acides aminés.

· Syndrome de dénutrition.

· Par malabsorption intestinale (insuffisance pancréatique):

- une hypo albuminémie.

- une sidéropenie avec élévation de la capacité totale de saturation de la sidérophiline.

V' par diminution de la synthèse : en cas d'insuffisance hépatique.

· Anomalies du bilan biologique:

- Diminution de l'albumine (tardive).

- Diminution d'autres protéines: haptoglobine, transferrine.... V' par catabolisme exagéré dans les dénutritions sévères.

V' par augmentation des pertes:

> d'origine rénale (syndrome néphrotique). > d'origine cutanée (brûlures).

> d'origine digestive (entéropathie exsudative).

Les variations relatives de la protidémie :

Elles sont liées à des modifications dans l'état d'hydratation du sujet.

a) Hyper-protidémie par hémoconcentration:

Se voit dans les DEC= déshydratation extracellulaire.

b) Hypoprotidémie par hémodilution:

Se voit dans les HEC= hyper hydratation extracellulaire.

3. Répercussion de la variation de la protidémie sur d'autres paramètres biochimiques:

a) Les relations avec la calcémie:

> Calcium plasmatique:

Le calcium plasmatique existe sous deux formes :

1- calcium non ultra filtrable (lié aux protéines), 45% : dont (30% lié à l'Albumine, 10% aux globulines) de la proportion totale du calcium lié aux protéines plasmatiques.

2- calcium ultra filtrable (non ionisé et ionisé) ou libre, dont 55% calcium ionisé, 5% calcium complexé (bicarbonates, citrates,...).

> Variation physiologique:

90 à 100 mg/l = 2,25 à 2,62 mmole/l

· fraction non diffusible liée aux protéines (albumine: 80%; globuline : 20%).

· fraction diffusible ionisée (Ca ) formant des sels de phosphates, citrates et bicarbonates.

La forme physiologiquement active est le Ca (ionisé). L'importance de la partie du calcium lié aux protéines explique que la calcémie totale soit influencée par la concentration en protéines du plasma. Le degré de liaison aux protéines et d'ionisation dépend du Ph du milieu et des autres électrolytes (bicarbonate, phosphate et magnésium). Ce sont les déviations de la normale du calcium ionisé qui entraînent les manifestations cardiaques et neuromusculaires de l'hyper et de l'hypocalcémie.

La calcémie varie avec la protéinémie.

Plasma-Calcium (substc): 2, 20 - 2, 70 mmole/L. Plasma-Calcium ionisé (substc): 1, 06 - 1, 30 mmole/L.

Il existe un équilibre entre le calcium libre ionisé et le calcium ionisé fixé sur les protéines plasmatiques:

[Ca ][Albumine]

= ( [Ca lié à l^'Albumine]

> Variation pathologique:

· En cas d'hypoprotidémie:

· Le calcium total : diminue.

· Le calcium libre ionisé : normal.

· En cas d'hyper-albuminémie ; il y un transfert d'une partie du calcium ionisé vers l'albumine ce qui provoque une augmentation du calcium lié aux protéines plasmatiques, et par conséquent diminution du calcium ionisé.

· En cas d'hypo-albuminémie (insuffisance hépatocellulaire, syndrome néphrotique) ; il y a un effet inverse.

· La liaison du calcium aux protéines plasmatiques dépend du pH;

Si pH diminue 4diminution Ca-Protéines 4augmentation Ca .

Chapitre1: Généralité sur les protéines sériques	22

b) Les relations avec le sodium:

Le sodium plasmatique : Natrémie (Na):

1. Principal cation extracellulaire de l'organisme:

Représente 95% des cations du LEC, reflet du degré d'hydratation du LIC

Son abondance dans les liquides extracellulaires et la quasi- imperméabilité des membranes cellulaires à cet ion lui confèrent un fort pouvoir osmotique (principal cation contributeur de l'osmolalité plasmatique).

Rôle central dans l'équilibre hydro-électrolytique de l'organisme : l'état d'hydratation des secteurs hydriques, les mouvements d'eau intracellulaire et extracellulaire.

Ses perturbations (dysnatrémies) indiquent souvent une anomalie initiale du métabolisme hydrique.

2. Valeurs de référence : 135 à 145 mmole/l.

3. Principales perturbations lié aux protidémie:

a) Hyponatrémies : Na < 135 mmole/l:

> Il existe des pseudo-hyponatrémies (isotoniques) :

Présence de quantités anormalement élevées de substances entrainant une réduction du volume plasmatique (Hyper protéinémies, Hyperlipidémies)

> Hyponatrémies vraies (hypotoniques):

Avec volume extracellulaire augmenté (hypervolémique) Signes cliniques et biologiques d'hyperhydratation extracellulaire par rétention hydrosodée (hypoprotidémie, état confusionnel, puis coma; hypotonie des globes oculaires, signe du pli cutané, oedèmes périphériques, HTA, baisse hématocrite) - insuffisance hépatique avec cirrhose ascitique, - syndrome néphrotique - insuffisance cardiaque.

b) Hypernatrémies : Natrémie > 145 mmole/L:

Les hyper hydratations intra cellulaires sont dues à des chutes de l'osmolarité plasmatique soit par:

· Chute du taux de sodium du liquide extra cellulaire. En ce qui concerne les chutes du taux de sodium, il y a deux cas:

· Soit la perte de sodium: hyponatrémie de dépression.

· Soit la dilution du sodium: hyponatrémie de dilution.

· Chute du taux d'urée.

Fausses hyponatrémies = concentrations élevées de macromolécules (protides, lipides)

Chapitre1: Généralité sur les protéines sériques	23

Remarque:

1-Protidémie et non Protéinémie (plus rigoureux).

2- La protidémie est la concentration des protides du plasma (protéines+ AA...).

3- Protidémie plasmatique > Protidémie sérique.

4- Protidémie plasmatique = Protidémie sérique + fibrinogène (2 à 4g/1).

Chapitre 2

Etude descriptive des principales protéines sériques.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		25
	LE GROUPE DES ALBUMINES

1. Pré albumine (PA) et Rétinol-binding protein (RBP):

Ce complexe appartient aux fractions protéiques mineures (<1 % des protéines claires). Il est le plus anodique à l'électrophorèse (migre le plus vite), que la Pré albumine soit seule ou complexée à RBP (RBP seule se comporte comme une á-2 globuline).

a) Propriétés:

> Physico-chimiques:

Ce sont des holoprotéines, c'est-à-dire constituées uniquement d'acides aminées et sans copule glucidique (ce ne sont donc pas des glycoprotéines).

Elles sont très riches en tryptophane.

Ce sont des protéines de petite taille : Pré albumine= 55 kDa et RBP= 21 kDa.

> Métaboliques:

Leur synthèse est hépatique.

Le zinc est indispensable à la synthèse de rétinol-binding protein(RBP). Leur demi-vie biologique est très courte, moins à 12 h.

> Biologiques : fonctions de transport plasmatique:

· La pré-albumine(PA):

Fixation et transport des hormones thyroïdiennes (T3 >T4). On l'appelle alors TBPA (thyroxin binding prealbumin) ou transthyretine.

· La Rétinol-binding protein(RBP):

Fixe le rétinol (vitamine A).

Se combine au pré albumine dans un rapport stoechiométrique (1:1).

Le complexe assure la fixation et le transport plasmatique de la vitamine A.

Le complexe PA-RBP se dissocie en deux composantes quand le rétinol est capté par les cellules cibles.

b) Valeur sémiologique: > Méthodes de dosage:

Le dosage se fait par immuno-néphélométrie (IN) ou par immuno-diffusion radiale (IDR).Ce sont des marqueurs.

26

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques > Valeurs normales et variations physiologiques:

· Pré albumine(PA): 0.2 à 0.4 g/l

· Rétinol-binding protein(RBP) : 35 à 90 mg/l.

> Variations pathologiques:

>Valeurs 2 fois plus faibles chez l'enfant.

>Pré albumine et Rétinol-binding protein sont des marqueurs de dénutrition.

- diminution dans les états de malnutrition.

-plus sensibles que l'albumine (ALB) ou la transferrine (Tf).

· Variations de Pré albumine: - Diminution au cours des:

- états inflammatoires aigus : cette protéine est donc dite « RI» (protéine de la réaction inflammatoire).

- néoplasies (cancers).

- hépatopathies atteintes rénales et digestives.

- Augmentation dans :

- maladie de Hodgkin.

- les traitements hormonaux par corticostéroïdes, androgènes anabolisants, oestroprogestatifs.

· Variations de la Rétinol-binding protein: - Diminution au cours des:

- états de malnutrition protéique.

- insuffisances hépatiques (diminution de synthèse). - carences en zinc.

- carences en vitamine A = avitaminoses A.

- Augmentation dans :

-les néphropathies chroniques (surtout les protéinuries tubulaires).

27

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques 2. Albumine (Sérum-albumine) ;(ALB):

C'est la protéine majeure du plasma : 54-65 % (38 à 64 g/l) des protéines totales.

a) Propriétés:

> Physico-chimiques:

C'est une holoprotéine.

Sa taille est relativement faible: 564 acides aminés, pour une masse moléculaire de 66kDa.

Sa structure est uni peptidique et globulaire (17 ponts disulfure S-S).

Remarquable stabilité (10h à 60°C).

Richesse en certains acides aminés (Glu (10% des AA), Asp, Val, Leu, Lys).

Une fonction thiol (sur un résidu cystéine) libre : fixation possible de différents ligands comme les métaux, les halogènes, les acides gras, les stéroïdes, les colorants, les médicaments.

Son pH isométrique est bas: pHi=4,7 ce qui explique qu'elle migre rapidement à l'électrophorèse.

> Métaboliques:

Sa synthèse est active (10 à 12 g/l), principalement au niveau du foie.

Son espace de diffusion est le secteur vasculaire (40%) et le secteur extravasculaire (interstitiel) (60%).

Sa demi-vie biologique est de 15 à 20 jours. Son catabolisme est effectué dans tous les tissus par pinocytose et hydrolyse dans les lysosomes (par des enzymes protéolytiques).

Dans l'intestin, il existe un phénomène physiologique de transsudation : exsudation normale de plasma au niveau de l'épithélium digestif. Cette exsudation est exagérée dans l'entéropathie exsudative.

Elle est non filtrée par le rein. Se traduit en pathologie par une albuminurie. > Biologiques:


· Maintien de la pression oncotique (Ponc) du plasma.

Ponc : pression osmotique développée par les protéines,

Ponc=C/M, avec C : concentration et M : masse moléculaire.

La Ponc développée par la sérumalbumine est négligeable par rapport à la Ponc



EXOGENES

ENDOGENES

ENDOGENE

Transport de macro-
molécules

Élimination des déchets
Régulation thermique

Boissons: 600 à 1200 mL/24h

Aments

Aliments: 1000ml/24h

¹⁰⁰⁰ mL/²⁴h

Produit du métabolisme des substrats: 400

A 500ml/24h

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

28

développée par les électrolytes.

MAIS elle a un rôle essentiel dans les échanges d'eau au niveau des capillaires du réseau vasculaire. Cette Ponc va permettre le contrôle des échanges d'eau entre secteur vasculaire et secteur interstitiel.

Mouvements de l'eau:



Sorties

S ⁱ

Entrées

Rôles de l'eau

Urines : 1000 à 1500 ml(ajustables) Ui ^1000 à 1500 L ^bl

Perspiration : 600 ml Piti^600 L

Selles :100 ml ^ll 100 L

300 L Sueur : 300 ml

Schéma 1: Mouvement d'eau et des aliments contrôlé par la Ponc.

PH : pression hydrostatique (liée à la force de propulsion du sang développée par le coeur).

PO : pression oncotique du plasma.

Dans les hypo albuminémies, il va y avoir une baisse de la pression oncotique. Au pôle veineux des capillaires, la Ponc va être insuffisante par rapport à la Pression hydrostatique pour assurer le rappel d'eau dans le secteur vasculaire. Il y a donc stase de fluide interstitiel c'est-à-dire hyper hydratation du secteur interstitiel avec des oedèmes dans les tissus périphériques.


· Transport plasmatique de ligands variés:

L'albumine est un transporteur non spécifique de ligands. - D'origine endogène:

- ions organiques ou inorganiques.

- bilirubine (protecteur de la sérumalbumine). - acides gras non estérifiés (5% des acides gras). - hormones thyroïdiennes (T3 >T4) et stéroïdes. - glucose.

29

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

- D'origine exogène:

- médicaments.

- colorants (à l'origine d'une méthode de dosage cf. plus loin): bleu Evans, vert de bromocrésol : BCG.

- vitamine C, iode...

La fixation aux ligands est en général solide mais non covalente. Ceci permet à la fixation d'être réversible.

b) Valeurs sémiologiques:
> Méthodes de dosage:

· Méthode directe:

>Colorimétrique:

Affinité de l'albumine .Exemple: vert de bromocrésol (BCG).

>Immunochimique:

Utilisation d'anticorps mono spécifiques anti-albumine en immuno-néphélométrie et en immuno-diffusion radiale.

· Méthode indirecte par estimation:

Cette méthode est moins spécifique. Il faut pratiquer deux examens et les combiner pour avoir le résultat:

- électrophorèse des protéines sériques pour avoir le pourcentage d'albumine parmi celles-ci.

- dosage des protéines totales.

> Valeur normale et variations physiologiques:

· Valeur normale:

L'albumine représente 55 à 60% des protéines sériques soit 40-45 g/l. L'albuminémie chez l'homme est 5% supérieure à celle chez la femme.

Le rapport Albumine/Globuline est normalement de 1/3.

· Variations physiologiques:

- nouveau-né: 30 g/l.

- grossesse: augmentation légère au début, puis diminution d'environ 25% par hémodilution et stabilisation à la limite inférieure de la normale.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		30

- diminution sous oestroprogestatifs.

- sujet âgé après 60 ans: diminution à 30-35 g/l.

> Variations pathologiques:

· Anomalies acquises:

>Hyper-albuminémies :

Elles se font surtout par hémoconcentration.

> Hypo-albuminémies :

· carence d'apport protéique:

- Carence nutritionnelle: cachexie, cancer.

-Troubles de l'assimilation digestive, malabsorption intestinale.

· diminution de la synthèse :

-insuffisances hépatocellulaires (IHC). -Hépatite aiguë grave.

-Cirrhose hépatique décompensée.

· accroissement du catabolisme azoté:

- Lésions tissulaires ou traumatismes chirurgicaux.

- États inflammatoires (l'albumine est également 'PRI').

· augmentation des pertes :

- par voie rénale : glomérulonéphrites, syndrome néphrotique.

-par voie digestive : entéropathies exsudatives, mucoviscidose, syndrome coeliaque.

- par voie cutanée : brûlures, eczéma étendu et suintant.

>Bis-albuminémies transitoires :

-traitement antibiotique intense par les âlactamines (pénicilline) : c'est alors un de surdosage.

-faux kyste du pancréas fistulisé dans les espaces interstitiels: le suc pancréatique contenant de la trypsine (enzyme protéolytique) va digérer en partie l'albumine qui va migrer plus vite à l'électrophorèse.

? Anomalies génétiques: >An-albuminémie de Bennhold: rarissime.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	31

Ces individus sont incapables d'assurer la synthèse d'albumine. Cette affection est bien tolérée.

A l'électrophorèse pas de pic d'albumine.

> Bis-albuminémie héréditaire:

Il y a coexistence de 2 formes d'albumines différentes (2 gènes différents) dont un est variante pour un acide aminé. Cette anomalie est découverte à l'électrophorèse. Elle est sans traduction pathologique et bien supportée. L'expression des 2 gènes se fait pour 50 % chacun : expression Co-dominante.

La transmission de cette anomalie se fait sur le mode autosomique.

32

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

LE GROUPE DES GLOBULINES:

A. LE GROUPE DES ALPHA-1-GLOBULINES:

C'est un groupe hétérogène et on y trouve : á 1 antitrypsine, orosomucoïde, AF1 (á 1 foetoprotéine), anti-chymotrypsine, á 1 lipoprotéine, prothrombine, transcortine, TBG (thyroxin binding globulin).

Ils sont représentent 1.1 à 3.7 % (0.8 à 2.6 g/l) des protéines totaux.

1) Alpha-1-antitrypsine (á1-AT):

C'est une protéine positive de la réaction inflammatoire (elle est PRI+). Elle présente une action antiprotéasique : elle s'oppose à l'action des protéases qui sont des enzymes protéolytiques. Un déficit est associé à des pathologies pulmonaires chez l'adulte et hépatiques chez l'enfant.

a) propriétés:

> Physico-chimiques:

L' á 1 antitrypsine est le constituant principal des á 1 globulines : elle en représente 90%.

C'est une protéine de petite taille et sa masse moléculaire est de 55 kDa. Elle présente une structure uni-peptidique (une seule chaîne). Son pH isoélectrique (pHi) est de 4,8 ; elle migre donc vers l'anode à pH alcalin.

C'est une glycoprotéine qui présente 10 à 12 % de glucides. > Métaboliques:

Sa synthèse est hépatique et sa demi-vie biologique est de 5 jours.

Elle présente un grand polymorphisme génétique (c'est à dire qu'elle a plusieurs formes moléculaires). Plusieurs gènes sont impliqués dans sa biosynthèse : il existe 23 allèles différents soit 23 génotypes différents. Il existe des centaines de phénotypes différents.

En France, l'allèle le plus courant est l'allèle M qui à l'état homozygote donne le phénotype normal MM et il existe de nombreux phénotypes hétérozygotes.

L'allèle Z rare peut donner à l'état homozygote le phénotype ZZ qui est associé à un déficit en a 1 antitrypsine (10 à 15% de la valeur normale). La protéine ne peut exercer son action antiprotéasique.

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Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques > Biologiques:

* Protéine douée d'action antiprotéasique.

Elle fait partie du système Pi (protéase inhibitor) qui comporte aussi l'á 1 antichymotrypsine et l'á 2 macroglobuline.

Elle est capable de se lier aux enzymes protéolytiques pour les inactiver. S'il existe un déficit en á 1 antitrypsine, les enzymes protéolytiques peuvent dégrader les tissus : cela explique les pathologies pulmonaires lors du déficit de la protéine.

* protéine de la réaction inflammatoire.

Elle est PRI+ et participe à la réaction inflammatoire locale.

b) Valeurs sémiologiques: > Méthodes de dosage:

On peut faire une appréciation du dosage par l'examen du profil électrophorétique (si le profil électrophorétique est vide en á 1, on peut suspecter un déficit en á1 antitrypsine car elle est majoritaire).

*Le dosage:

> Par méthode indirecte : électrophorèse + protéines totales

>par méthode directe:

- mesure du pouvoir antiprotéasique du sérum.

- dosage par méthode immunochimique ((IDR) ou (IN)).

> Valeurs normales et variations physiologiques:

Les valeurs usuelles se situent entre 0,8 et 2,0 g/l. Cela augmente pendant la grossesse et lors de la prise d'oestroprogestatifs.

> Variations pathologiques:

- Diminution: le déficit en á1 antitrypsine.

En pathologie pulmonaire : chez un adulte jeune (30-40 ans).

Hétérozygote Z ? Prédisposé à la bronchite chronique et à l'emphysème pulmonaire.

Homozygote ZZ : emphysème pulmonaire avec destruction de la structure des alvéoles pulmonaires (l'attaque protéolytique n'est pas compensée par le taux d'á1 antitrypsine circulant).

La transmission est autosomique récessive et l'incidence est de : 1/5000.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	34

En pathologie hépatique : chez un enfant en bas âge.

Sujets homozygotes ZZ : cirrhose hépatique infantile (remaniement fibreux du tissu hépatique). Il y a des dépôts PAS+ dans les hépatocytes qui sont dus à

l'accumulation de matériel glucidique. En effet la glycoprotéine á1 antitrypsine s'accumule dans les hépatocytes mais ne peut aller dans le sérum et ne peut donc pas être dosée).

La transmission est autosomique récessive.

- Augmentation:

Lors de la phase aiguë de la réaction inflammatoire. - Marqueur de déperdition protéique digestive.

2) Orosomucoïde ou á 1 glycoprotéine acide (á-1GA):

a) Propriétés:

> Physico-chimique:

Protéine à caractère très acide : pHi=2,5. La migration est rapide vers l'anode mais moins que pour l'albumine, alors que le pHi de l'orosomucoïde est inférieur, cela veut dire que la migration électrophorétique ne dépend pas seulement du pHi mais d'autres facteurs interviennent.

Protéine de faible masse moléculaire : 41 kDa.

C'est une glycoprotéine avec 40% de glucides.

> Métaboliques:

La synthèse et le catabolisme sont hépatiques, leur demi-vie est 2 à 3 jours. > Biologiques : (rôle mal connu).

C'est une protéine de la phase aiguë de la réaction inflammatoire (PRI+) et elle aide au transport plasmatique de la progestérone et de certains médicaments.

b) Valeurs sémiologiques: > Méthode de dosage:

Immunochimie (IN et IDR). > Valeur normale: 0,55 à 1,4 g/l.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	35

> Variations pathologiques:

s Diminution:

-états de malnutrition.

-insuffisances hépatiques sévères. -syndrome néphrotique.

-entéropathies exsudatives.

s Augmentation:

-réaction inflammatoire aiguë (rhumatisme articulaire aigu chez l'enfant). -lésions tissulaires (infarctus du myocarde).

- certaines néoplasies malins.

Comme l'orosomucoïde augmente lors de la réaction inflammatoire et lors de certains cancers, le suivi de cette protéine est intéressant pour juger de l'efficacité d'une antibiothérapie anti-inflammatoire ou d'une chimiothérapie anticancéreuse (si on observe une diminution du taux de la protéine, cela veut dire que le traitement est efficace).

3) Alpha-1-foetoprotéine:

a) Propriétés:

> Physico-chimique:

Cette glycoprotéine, présente dans le sérum foetal humain, a un poids moléculaire de l'ordre de 70KDa, et contient 4.3% de glucides.

> Métaboliques:

L'alpha-foeto-protéine (AFP) est synthétisée par les hépatocytes chez le nouveau- né, et par le corps jaune pendant la gestation, de même par certaines tumeurs hépatiques ou digestives ; il constitue donc un marqueur de cancer hépatocellulaire et digestive.

> Biologiques:

Elle est essentielle au développement normal de l'embryon. a) Valeurs sémiologiques:

> Dosage:

L'á FP est à un taux maximum de 3mg/ml dans le sérum du foetus de 13 semaines ; ce taux descend à quelques ug à la naissance, et à quelques ng chez l'adulte.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	36

> Valeurs normales et variations physiologiques: Son taux de référence chez l'adulte est 4,5 - 2,6 mg/l.

Chez la femme enceinte, le taux sérique normal entre la 15è et la 30è semaine est de plusieurs mg/l ; il s'élève en cas de grossesses multiples mais aussi dans 60% des cas d'atteinte du tube neural du foetus.

> Variations pathologiques:

La concentration d' á-FP s'élève dans diverses circonstances pathologiques : - Cancer primitif du foie : élévation non constante (2/3 des cas).

- Cancer de l'estomac.

- Tératocarcinome testiculaire : élévation presque constante.

- Hépatites, hépatectomie partielle : rarement.

-Chez le nouveau-né, qui a un ictère, et où le diagnostic hésite entre une hépatite néonatale et une atrésie des voies biliaires. Le dosage de l' á-FP permet de trancher entre une hépatite (á-FP élevée car cytolyse) et une atrésie (á- FP normale, pas de cytolyse).

La cause la plus importante est le cancer primitif du foie. Son dosage permet de surveiller les gens à risque par exemple les cirrhotiques qui développent souvent des cancers primitifs du foie.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	37

B. LE GROUPE DES ALPHA-2-GLOBULINES

On y trouve l'haptoglobine, l'á2 macroglobuline, la céruloplasmine. Ces protéines constituent 8.5 à 15 % (6 à 10 g/l) des protéines sériques. 1) Haptoglobine (HP):

C'est une protéine de la réaction inflammatoire, elle est PRI+. Son taux peut s'effondrer au cours des hémolyses intra-vasculaires.

a) Propriétés:

> Physico-chimiques:

L'haptoglobine (Hp) est une protéine du groupe des á2 globulines est une glycoprotéine qui comporte 19% de glucides. Son pHi est de 4,2, il est du à une richesse en acides aminés acides comme l'acide aspartique et l'acide gluconique et à une richesse en lysine.

Il existe deux formes possibles pour cette protéine:

1> Forme monomérique : 4 sous unités comprenant 2 chaînes á et 2 chaînes â (á2â2) selon le schéma á ââá. Il existe 2 variantes pour á : á1 et á2, d'où 3 phénotypes possibles :

Hp 1-1: á 1-â -â -á 1 masse moléculaire = 86 kDa. Hp 2-1 : á 2-â -â -á1 masse moléculaire = 120 kDa. Hp 2-2 : á 2-â -â -á2 masse moléculaire = 160 kDa.

2 >Forme oligomérique : constituée de monomères complets ou partiels (masse moléculaire allant de 200 à 400 kDa).

> Métaboliques:

La synthèse est surtout hépatique et la demi-vie biologique est de 3 à 5 jours. Le catabolisme se fait dans les hépatocytes et dans les macrophages.

> Biologiques: *Combinaison à l'hémoglobine:

Le complexe Hb/Hp (hémoglobine/haptoglobine) se fait dans les proportions stoechiométriques. En cas d'hémolyse l'hémoglobine libérée est captée par l'haptoglobine et la fixation est irréversible, le complexe Hb/Hp est donc épuré dans le

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	38

système réticulo-endothélial. La demi-vie biologique de ce complexe est très courte: moins de 20 minutes (complexe capté et dégradé dans le système réticulo-endothélial). Ce complexe a des propriétés peroxydasiques.

* Protéine la réaction inflammatoire : PRI+

La synthèse de l'haptoglobine est stimulée dans les états comportant des destructions tissulaires avec hémolyse et libération d'hémoglobine.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

Immunochimie (IN).

> Valeurs normales et variations physiologiques: >valeurs normales:

0,3 à 2,0 g/l chez les adultes (valeurs supérieures de 10% chez la femme par rapport à l'homme en général).

> Variations physiologiques:

Chez les nouveaux nés on trouve seulement des traces de cette protéine. Les valeurs adultes sont atteintes à 6 mois.

Le taux d'haptoglobine diminue lors de la pratique de certains sports (hémolyse lors de microtraumatismes observables chez les marathoniens par exemple).

> Variations pathologiques: - Diminution:

-insuffisances hépatiques (cirrhose)

-hémolyse intravasculaire (effondrement du taux d'haptoglobine)
-déficit congénital : anhaptoglobinémie (rare, chez 3% des noirs).

- Augmentation : de 2 à 10 g/l soit 4 à 6 fois la normale.

-syndromes inflammatoires aigus, subaigus, chroniques (protéine PRI+ : marqueur très sensible de l'inflammation mais non spécifique sans valeur diagnostique ni pronostique).

-maladies infectieuses : pneumonie-tuberculose.

-néoplasies.

-syndrome néphrotique.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	39

-Limites du dosage de l'haptoglobine:

Coexistence réaction inflammatoire aigue et hémolyse intravasculaire. 2) Alpha- 2 macroglobuline (á2-M):

C'est une protéine assez abondante dans le sérum, pouvant former des complexes avec diverses protéases. Elle augmente peu dans le syndrome inflammatoire mais beaucoup au cours du syndrome néphrotique.

a) Propriétés: > Physico-chimiques:

Masse moléculaire est 850 KDa, sa constante de sédimentation est de 19S (unités Sievert) à l'ultracentrifugation.

C'est une glycoprotéine qui comporte 8% de glucides.

PHi=5,4

Elle est composée de 4 sous-unités reliées par des ponts disulfures ce qui permet de pouvoir former des dimères.

> Métaboliques:

Sa synthèse se réalise dans le foie et dans le système réticulo-endothélial. La demi-vie biologique de la forme non complexée est de 5 jours, alors après complexation avec des protéases la demi-vie est de 10 minutes.

Il existe un polymorphisme génétique pour cette protéine.

> Biologiques:

L'á 2 macroglobulines peut se lier avec diverses molécules : ions, hormones (insuline).

Elle possède un rôle antiprotéasique avec des endopeptidases bactériennes et leucocytaires et avec d'autres protéases circulantes comme la plasmine, la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, la cathepsine.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

Immunochimie (IN et IDR).

> Valeurs normales et variations physiologiques: Adultes : 1,5 à 3,5 g/l (supérieur de 10% chez les femmes).

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	40

Nouveau-nés : 5g!l (valeurs plus élevées de 50% environ). Le maximum est atteint vers 1 à 3 ans, puis diminution progressive avec stabilisation à 25 ans. Jusqu' 15 ans les valeurs sont supérieures aux adultes.

Après 70 ans : augmentation légère.

> Variations pathologiques:

L'intérêt clinique est assez limité et on ne trouve que des augmentations.

Dans le syndrome néphrotique : (jusqu'20 à 30 g!l) il y a une atteinte glomérulaire qui entraîne une protéinurie sélective avec perte des protéines de faible masse moléculaire comme l'albumine et rétention des grosses protéines comme l'a 2 macroglobuline (à l'électrophorèse : pic à a 2 macroglobuline).

Dans l'inflammation aiguë (PRI+) : augmentation moins nette que CRP (C réactive protéine), orosomucoïde ou haptoglobine...

Augmentation lors de la grossesse et la prise de contraceptifs oraux. 3) Céruléoplasmine, céruloplasmine (CER):

C'est une glycoprotéine colorée en bleu qui fait partie des á 2-globulines et qui contient huit atomes de cuivre.

a) Propriétés:

> Physico-chimiques:

La céruloplasmine est une protéine à cuivre de 134 kDa, pHi=4.4, présente chez les vertébrés et complexant plus de 95 % du cuivre présent dans le plasma.

Elle fait partie de la famille des oxydases bleues à cuivre, et catalyse l'oxydation à 4 électrons de nombreux substrats (amines, phénols, Fe²⁺...) couplée à la réduction du dioxygène en eau.

> Métaboliques:

Le cuivre est incorporé dans la molécule de Céruléoplasmine lors de sa synthèse dans les hépatocytes.

Après sécrétion par le foie la Céruléoplasmine migre vers les tissus où le cuivre est utilisé ; elle y est catabolisée avec libération du cuivre. Outre sa fonction de protéine de transport du cuivre, la Céruléoplasmine possède une fonction catalytique lors de l'oxydation du fer (Fe²⁺ en Fe³⁺), de polyamines, de catécholamines et de polyphénols.

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Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

Du fait de ces différentes activités catalytiques, elle jouerait un rôle antioxydant, serait impliquée dans de nombreux processus métaboliques comme celui du cuivre, des amines biogéniques, et du l'oxyde nitrique.

Toutefois, il semble maintenant établi que la céruloplasmine joue un rôle physiologique important dans le métabolisme et l'homéostasie du fer.

En effet, la céruloplasmine oxyde le Fe²⁺ en Fe³⁺ (activité ferroxydase) et permet l'incorporation du Fe³⁺ dans la transferrine.

La demi-vie biologique du céruloplasmine est 4 à 5 jours. > Biologiques:

La Céruléoplasmine est une « protéine de la phase aiguë de l'inflammation » et une protéine de transport.

Fixation du cuivre plasmatique, Oxydation du fer.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

Le dosage de la Céruléoplasmine s'effectue par immunodiffusion, néphélométrie ou turbidimétrie.

> Valeurs normales et variations physiologiques: Valeur normal chez l'adulte est de 0.2 à 0.6 g/l.

> Variations pathologiques:

- Diminution:

La concentration en Céruléoplasmine est diminuée dans la maladie de Wilson (dégénérescence hépatolenticulaire à transmission autosomique récessive).

Dans cette maladie où la synthèse de la Céruléoplasmine est diminuée, l'incorporation du cuivre Cu2+ dans la molécule de Céruléoplasmine ne se fait pas, en raison d'une anomalie du métallo thionine.

Il en résulte une accumulation pathologique de cuivre dans le foie (avec développement d'une cirrhose), le cerveau (avec des manifestations neurologiques), la cornée (anneau de Kayser-Fleischer) et les reins (hématurie, protéinurie, aminoacidurie). Chez les porteurs homozygotes de ces signes le taux de Céruléoplasmine est fortement diminué.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	42

Les porteurs hétérozygotes présentent une diminution moindre ou pas de diminution du taux de Céruléoplasmine.

Dans le syndrome de Meknès, qui est une maladie rare, il y a une perturbation génétique de l'absorption du cuivre avec diminution du taux de Céruléoplasmine.

Les syndromes de pertes protidiques et les insuffisances des cellules hépatiques sont les principales causes des diminutions acquises du taux de Céruléoplasmine.

- Augmentation:

Le taux de Céruléoplasmine augmente dans les inflammations aiguës et chroniques. En cas d'augmentation importante, le sérum peut présenter une coloration bleu-vert.

Et aussi Nécrose tissulaire et traumatismes, obstruction des voies biliaires (cholestase).

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	43

C. LE GROUPE DES BETA-GLOBULINES

Cette groupe constitue 8.5 à 15 % (6 à 10 g/l) des protéines sériques. 1) Transferrine (Tf) ou Sidérophiline:

La transferrine est une protéine soluble qui assure le transport du fer dans le sang. Les cellules de l'organisme dont la teneur en fer est trop basse synthétisent et expriment à leur surface des récepteurs à la transferrine. Elles assurent ainsi leur

réapprovisionnement en fer, en internalisant la transferrine par endocytose.

a) Propriétés: > Physico-chimiques:

La transferrine sérique ou sidérophiline est une glycoprotéine, sa masse moléculaire 76 kDa, contenant 6% de glucides. Leur PHi varie entre 5.5 et 5.9.

> Métaboliques:

Synthétisée dans le foie et sa concentration sérique est influencée par le contenu du fer dans l'organisme, et présente une variabilité génétique : 03 phénotypes principaux B.C.D.Sa demi-vie est de 7 jours.

> Biologiques:

Transport du Fe³⁺, régule l'absorption du fer suivant sa saturation, mais possède des propriétés inhibitrices de la multiplication virale.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

On sépare la transferrine aisément par électrophorèse en gel d'amidon. > Valeurs normales et variations physiologiques: Valeurs normales généralement admises : 02 à 03,8 g/litre.

Variations physiologiques : chez la femme enceinte, en fin de grossesse, la concentration s'élève autour de 04,4g/l, en raison de l'anémie ferriprive, habituelle à cette période.

> Variations pathologiques:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	44

-Diminution : dans la néphrose, syndromes inflammatoires, infectieux et néoplasiques, fuites protéiques, états de dénutrition ou malnutrition, insuffisances hépatocellulaires sévères, surcharges en fer.

-Augmentation : dans la sidéropenie et en fin de la grossesse, anémies ferriprives, hémorragies aigues ou chroniques et occultes.

2) C-reactive protein (CRP) ou protéine C réactive:

La c reactive protein a été ainsi nommée pour ses capacités à précipiter le polysaccharide C de Streptococcus pneu moniae.

C'est une protéine de la phase aigue et un marqueur systémique sensible de l'inflammation et des lésions tissulaires.

a) Propriétés: > Physico-chimiques:

La CRP est une holoprotéine de 120 KDa, elle est constituée d'un pentamère cyclique de 5 protomères de206 aminoacides chacun.

> Métaboliques:

La CRP plasmatique est essentiellement produite par les hépatocytes.sa transcription est sous le contrôle de cytokines comme IL-6, TNF-alpha, et IL-1â. Sa demi-vie est de 6 à 8 heurs.

La sécrétion de CRP débute 4a6 heures après le stimulus, double ensuit toutes les 8eures et atteint son pic vers 36-50 heures .la demi-vie plasmatique de la CRP est de 19 heures, mais la demi-vie clinique des concentrations de CRP après un seul stimulus comme la chirurgie ou un traumatisme demande plusieurs jours avant de revenir a sa valeur de base.

> Biologiques:

La CRP est reconnue pour jouer un rôle dans l'élimination des bactéries .les souris transgéniques pour la CRP montrent une résistance accrue contre l'infection létale a Salmonella typhimurium (bactérie Gram-négative).

Elle a par ailleurs un rôle d'activation du complément, de facilitation de la phagocytose des bactéries et de modulation de la multiplication des lymphocytes T.

b) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	45

Pas visible sur électrophorèse, dosage spécifique.

> Valeurs normales et variations physiologiques:

chez l'adulte sain ,le taux de CRP est inferieur a 3 mg/l et croit en réponse a un stimulus inflammatoire .les taux plasmatiques de CRP sont déterminés par le taux de synthèse, un marqueur de l'intensité du processus pathologique stimulant la production de CRP. L'hémodialyse n'affecte pas le taux de CRP.

> Variations pathologiques:

CRP Ultra sensible au risque cardiovasculaire hors inflammation (tableau 2).

<1mg/l Pas de risque.

1 à 5 mg/l Risque modéré.

>5 mg/l Risque élevé.

Tableau 2: niveau de risque lié à la variation du CRP.

Toujours dans le sens d'une augmentation: Etats inflammatoires aigus, quelle que soit leur étiologie, états infectieux, lésions traumatiques, Néoplasies.

Grand intérêt en pratique médicale courante.

3) Fibrinogène (FIB):

Le Fibrinogène est une glycoprotéine circulante soluble. Lorsque sa molécule est scindée par la thrombine au cours d'une réaction enzymatique, le fibrinogène est transformé en une protéine plasmatique insoluble : la fibrine. La conversion du fibrinogène en fibrine est la dernière et plus importante étape dans la formation du caillot hémostatique primaire dont le rôle est d'empêcher les pertes liquidiennes consécutives à un traumatisme.

a) Propriétés:

> Physico-chimiques:

La structure moléculaire du fibrinogène se compose de trois chaînes polypeptidiques reliées entre elles par des ponts disulfures pour former un dimère, sa masse moléculaire 330 KDa.

Lors de la conversion du fibrinogène en fibrine, deux paires de peptides (fibrinopeptide A et fibrinopeptide B) se libèrent des segments N-terminaux des chaînes á et ß pour former un monomère, la fibrine, qui est la protéine structurale prédominante dans la formation du caillot.1-4 Comme presque toutes les autres protéines responsables de la coagulation.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	46

> Métaboliques:

Le fibrinogène est synthétisé par le foie, avec demi-vie de 3 à 5 jours. Les anomalies relatives à la production du fibrinogène peuvent être congénitales ou acquises et se traduisent généralement soit par une diminution de la production de fibrinogène (afibrinogénémie/hyperfibrinogènémie) ou par une production de molécules de fibrinogène anormales (dysfibrinogénémie).

> Biologiques:

Le fibrinogène est le précurseur protéique plasmatique de la fibrine, qui polymérisé, devient le principal composant du caillot de fibrine. Sous l'action de la thrombine, le fibrinogène est clivé et forme un monomère de fibrine. Les monomères de fibrine sont polymérisés en un réseau de fibrine insoluble.

c) Valeur sémiologique: > Méthode de dosage:

On peut doser le niveau de fibrinogène dans le sang par un prélèvement sanguin. > Valeurs normales et variations physiologiques:

Le taux normal du fibrinogène dans le sang est de 2 à 4 g/l.

> Variations pathologiques:

-L'afibrinogénémie: (absence de fibrinogène):

Dans cette forme de déficit en fibrinogène on note une absence complète du fibrinogène. Le taux du fibrinogène est < 0,2 g/l de plasma. Environ cinq personnes sur dix millions en sont atteintes. Des trois types de déficit, c'est celui qui provoque les saignements les plus graves.

L'afibrinogénémie se traduit par des tendances hémorragiques modérées à graves. -Diminution : L'hypofibrinogénémie: (taux inférieur à la normale):

En présence de cette anomalie, le fibrinogène est présent, mais à un taux inférieur à la normale : il se situe entre 0,2 g/l et 0,8 g/l. Cette anomalie est moins fréquente que l'afibrinogénémie. Les problèmes de saignements peuvent être légers, modérés ou graves.

Les taux de fibrinogène sont nettement diminués dans l'afibrinogénémie héréditaire, la coagulation intravasculaire, la fibrinolyse primaire et secondaire ainsi que dans les maladies hépatiques.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	47

Un taux de fibrinogène bas est retrouvé dans l'afibrinogénémie congénitale, dans l'hypofibrinogénémie et dans certains cas de dysfibrinogénémie, mais aussi dans différentes pathologies comme la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), la fibrinolyse, la pancréatite et les insuffisances hépatiques sévères. Le fibrinogène est une protéine réactive de la phase aiguë dont la concentration augmente en réponse à différents stimuli physiologiques.

-Augmentation : (6 à 8 g/l) dans les processus inflammatoires:

Il peut être augmenté au cours d'une inflammation, d'une infection, au cours de la grossesse et après un traumatisme. Le fibrinogène est augmenté chez les fumeurs.

Un taux plasmatique élevé de fibrinogène a été associé à des états pré-thrombotiques. La concentration en fibrinogène est corrélée positivement au développement de l'athérosclérose, de l'infarctus du myocarde et des accidents vasculaires cérébraux.

- La dysfibrinogénémie: (mauvais fonctionnement)

En présence de dysfibrinogénémie, le taux de fibrinogène est normal, c'est-à-dire entre 2 et 4 g/l, mais le fibrinogène ne fonctionne pas adéquatement. Environ une personne sur un million en est affectée. En fait, on a répertorié plus de 100 types différents de dysfibrinogénémie.Les gens atteints souffrent rarement de problèmes hémorragiques. Ils peuvent même présenter la situation contraire : une thrombose (le sang coagule dans la circulation sanguine).

AF I B RI NOG É N ÉMIE HYPO FI B RI N OG É N ÉMIE DYSF I B RI NOG É N ÉMIE

TRANSMISSION Autosomal récessif Autosomal dominant Autosomal dominant et

(les deux parents et récessif un seul récessif un seul parent

sont porteurs). parent est porteur les est porteur les deux

deux parents le sont parents le sont

INCIDENCE 5 sur 10 millions moins que 1 sur 1 million

l'afibrinogénémie

TAUX DEFIBRINOGENE < 0,2 g/l plasma entre 0,2 -0,8 g/l entre 2 et 4 g/l plasma plasma
SYMPTOMS - saignement cordon ombilical - saignement cutanéo- muqueux -hémorragie gastro- intestinale - saignement intracrânien - saignement articulaire (chez 20 % des sujets)	- saignement cordon ombilical - saignement cutanéo muqueux - hémorragie gastro- intestinale - saignement intracrânien (peu fréquent) - saignement articulaire (chez 20 % des sujets)	-sans symptôme -hémorragie - thrombose
TRAITEMENT FIBRINOGÈNE FIBRINOGÈNE FIBRINOGÈNE OU ANTICOAGULANT

Tableau 3: tableau comparatif de déficience en fibrinogène congénital.

48

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques D. LE GROUPE DES GAMMA-GLOBULINES:

La réponse humorale se fait à travers un groupe de protéines ayant des propriétés semblables, mais des fonctions différentes = les Immunoglobulines.

Les gammaglobulines présentent 9.2 à 18 % (6.4 à 13 g/l).

1) Définition:

Ce sont des protéines animales glycosylée (glycoprotéines). Elles migrent à l'électrophorèse dans la zone ã.

Elles sont présentes dans le plasma, les autres liquides biologiques et les sécrétions. Ce sont les agents de l'immunité humorale, ce sont des protéines douées d'activité anticorps.

· Ac : globuline apparaissant dans le sérum d'un sujet, soumis à un Ag qu'il ne possède pas et capable de se lier spécifiquement à cet Ag.

2) Propriétés:

a. Physico-chimiques:

> Les Ig sont des molécules bipolaires : 2 pôles fonctionnels :

· Régions variables : impliquées dans les fonctions de reconnaissance de l'Ag.

· Région constante : responsable des fonctions effectrices.

>A côté de cette dualité fonctionnelle, on a :

· Dualité structurelle : constitution par 2 types de chaînes : légères et lourdes.

· Dualité génétique : 2 types de gènes codant chacun pour un type de chaînes.

> On en a 5 classes : IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, synthétisés par le lymphocyte B et surtout plasmocyte et peuvent être : intracellulaires - membranaires (=récepteurs d'Ag du lymphocyte) - sécrétées.

> Leur migration dans la zone ã de l'EPPS est à l'origine de l'appellation = gammaglobulines.

b. Métaboliques:

Elles sont synthétisées par des cellules spécifiques qui sont dans la moelle osseuse : les plasmocytes, dérivant des lymphocytes B activés. Cette synthèse est secondaire au contact de l'organisme avec une substance étrangère: antigène ou immunogène. Ces anticorps sont produits et sécrétés dans la circulation générale.

c. Biologiques:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	49

La réponse immunitaire est spécifique; une immunoglobuline (Ig) est spécifique de l'antigène (Ag) qui a déclenché sa synthèse. La spécificité est le plus souvent absolue.

3) Structure générale des immunoglobulines: On remarque l'extraordinaire hétérogénéité des Ig. a. chaînes polypeptidiques:

L'unité de base d'un Ac (monogène d'Ig) comprend 4 chaînes polypeptidiques: - 2 chaînes lourdes identiques (chaînes « H » pour Heavy).

- 2 chaînes légères identiques (chaînes « L » pour Light).

La structure générale est du type H2L2.

Cet édifice moléculaire a une masse moléculaire d'environ 150 KDa. Au microscope électronique, ces Ig se présentent sous la forme d'un Y avec un axe de symétrie entre les 2 chaînes lourdes (donc la molécule est symétrique).

> Les chaînes lourdes:

Leur nature varie selon la classe et la sous classe d'Ig. Chaque chaîne lourde est constituée de 450 acides aminés, ce qui correspond à une masse moléculaire de 50KDa.

Les deux chaînes lourdes sont reliées entre-elles:

- par des liaisons covalentes: un ou plusieurs ponts disulfures. Cette liaison est située dans la zone charnière.

- par de nombreuses interactions non covalentes qui stabilisent aussi l'ensemble (liaisons ioniques, hydrogène...).

> Les chaînes légères:

Comme pour les deux chaînes lourdes, les deux chaînes légères sont identiques entrent-elles. Elles sont du type ê ou ë, commun à toutes les classes d'Ig: Ig G, Ig M, Ig A, Ig D, Ig E. Leur masse moléculaire est d'environ 25 KDa chacune.

Chaque chaîne légère est reliée à une chaîne lourde:

- par un pont disulfure inter caténaire (entre l'extrémité carboxylique de la chaîne légère et la région charnière de la chaîne lourde).

- par de nombreuses liaisons non covalentes.



Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

>>On distingue deux caractéristiques principales à cette structure de base: - la grande stabilité de la molécule H2L2.

- la grande flexibilité des chaînes lourdes (au niveau de la zone charnière). En effet, l'Y a un angle d'ouverture très variable, de 0 à 180°. Cette flexibilité permet l'adaptation de l'Ac à l'Ag qui a suscité sa production.

Figure 1: Structure biochimique d'une immunoglobuline.

Figure2 : Les différents types des immunoglobulines.

Belaouar Hamza/Lamri Adlène

50

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	51

b. Autres composants:

· Les chaînes oligosaccharidiques

Les Ig sont des glycoprotéines.

Les chaînes lourdes contiennent sur leur partie carboxy terminale des chaînes oligosaccharidiques (glycanniques) en nombre variable (1 à 7) selon la classe.

· Les chaines de Jonction ou chaînes J.

On les trouve dans la classe des Ig A et M. Elles permettent la polymérisation de l'unité de base. On a donc le motif (H2L2) n. Le degré de polymérisation est: n=2 pour les Ig A et n=5 pour les Ig M.

· La pièce sécrétoire S

Elle se rencontre dans les Ig A sécrétoires qui sont dimériques.

c. Les domaines d'Ig:

Au sein de chaque chaîne lourde et chaque chaîne légère, il existe des ponts disulfures intra caténaires qui obligent la séquence d'acide aminé à se replier sur elle-même en des boucles peptidiques de 60 à 70 résidus d'acide aminé. Chaque boucle représente la partie centrale d'une région globulaire comprenant 110 acides aminés; cette région est appelée domaine.

Le nombre de domaines varie selon la classe et le type d'Ig: > sur chaque chaîne lourde: 4 à 5 domaines.

>sur chaque chaîne légère: 2 domaines.

Au cours de l'évolution, on a constaté la duplication d'un gène ancestral commun. Quand on compare la composition en acides aminés de deux domaines différents, on remarque l'existence d'un haut degré d'homologie des séquences.



Figure3 : Organisation en domaines.

Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	53

d. Variabilité des chaînes:

Quand on compare les chaînes lourdes entre-elles ou les chaînes légères entre-elles, les séquences en acide aminé sont partiellement différentes.

Les différences sont localisées dans la région N terminale de ces chaînes; ces régions sont en conséquence dénommées régions variables ou V.

Les régions C terminales ont une structure relativement conservée : elles sont de ce fait appelées régions constantes ou C.

- Cas des chaînes légères:

On constate deux domaines de longueur équivalente:

- 1 domaine variable N terminal appelé VL (pour Variable Light) -1 domaine constant C terminal appelé CL (pour Constant Light).

- Cas des chaînes lourdes:

On constate 4 à 5 domaines de longueur équivalente:

- 1 domaine variable N terminal appelé VH (pour Variable Heavy)

- 3 à 4 domaines constants C terminaux appelés CH (pour Constant Heavy).

Il existe des appariements des domaines entre les chaînes lourdes et légères ; dans tous les cas, un domaine V s'associe à un V et un domaine C avec un C.

Ainsi, bien qu'ayant une structure de base commune, les Ig ont un certain degré de variabilité.

e. Dualité structurale et fonctionnelle des Ig:

Les Ig peuvent faire l'objet d'un clivage sous l'action d'enzymes protéolytiques (comme la papaïne d'origine végétale et la pepsine d'origine animale).

Les principaux résultats sont obtenus avec la papaïne; on assiste à une scission de l'Ig en 3 fragments de 50 KDa environ:

- 2 fragments Fab identiques. -1 fragment Fc.

*Les fragments Fab (ab pour "Ag-Binding") correspondent à la moitié N terminale d'une chaîne lourde reliée par un pont disulfure à une chaîne légère.

Ils ont la propriété de se lier à l'Ag mais sont univalents c'est à dire ils ne possèdent qu'un seul site de fixation antigénique.

Le site de liaison à l'Ag Fab est constitué:

- du domaine variable d'une chaîne légère (VL)

- du domaine variable d'une chaîne lourde (VH).


· Le fragment Fc : cristallise facilement et correspond à deux moitiés C terminales de chaînes lourdes reliées entre-elles par au moins un pont disulfure.

Le fragment Fc (constitué des domaines constants des chaînes lourdes, principalement CH2 et CH3) ne s'associe pas a l'Ag mais est le support des autres propriétés biologiques des Ig (comme leur capacité à s'associer au complément...).

f. Structure tridimensionnelle des Ig:

A l'aide de méthodes résolutives physiques (diffraction, RMN, Microscope Electronique), on a confirmé l'organisation spatiale des Ig en domaines.

-Figure ci-dessous: exemple de la conformation d'une Ig. Ce schéma indique l'organisation des chaînes entre elles et notamment la forme en Y induite par les chaînes lourdes.



Figure 4: structure tridimensionnel d'une immunoglobuline

4) Structure particulière des immunoglobulines:

a. Les IgG : 75% des Ig sériques, concentration = 12g!l.

- Elle a une structure de base en Y, constituée de 2 chaînes légères K ou ë et 2 chaînes lourdes ã.

- 4 sous classes décrites : IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 (ã1 - ã2 + ã3 - ã4 = chaînes lourdes).

- Leur déploiement dans l'espace est variable d'une sous classe à une autre.

- L'IgG est bivalent car elle possède 2 sites Ac (2 paratopes).

b. Les IgA : 10 à 15%. 3.5g!l.

- 2 formes :

* Monomérique : IgA sérique : prédominante dans le sérum, structure semblable à l'IgG.

* Dimérique : IgA sécrétoire : très dominante au niveau des sécrétions : salive, larmes, sécrétions nasales, trachéobronchiques, intestinales, colostrum...etc.

Formée de 2 monomères d'IgA, réunis par une pièce J (de jonction) et une pièce S (sécrétoire) et opposés par leur fragment Fc.

- Chaque molécule comporte : 2 chaînes légères K ou ë et 2 chaînes lourdes á.

c. Les IgM : 1.5 g!l.

- Elle est pentamérique. Chaque unité a une structure semblable à celle de l'IgG.

- Les 5 unités sont réunies au niveau de l'extrémité COOH terminale, par les ponts disulfures d'une pièce J.

- Chaque unité comporte : 2 chaînes légères ë ou K et 2 chaînes lourdes ì (chaque chaine lourde comporte un domaine variable VH mais 4 domaines constants CH.

- La structure pentamérique explique la grande affinité de l'IgM pour les Ag et ses propriétés agglutinantes.

- 2 sous classes : IgM1 et IgM2.

d. Les IgE :

- Chaque molécule comprend 2 chaînes lourdes å et 2 chaînes légères K ou ë. - Les chaînes lourdes sont formées de 5 domaines chacune (idem IgM).

- Concentrations faibles dans le sérum, localisation essentiellement tissulaire.

e. Les IgD :

- 2 chaînes légères K ou ë et 2 chaînes lourdes ä.

- concentration sérique faible, joue un rôle en tant que récepteur de membrane des lymphocytes B.



IgA	IgM	IgD	IgE
á	u	ä	å
Ê ou ë	Ê ou ë	Ê ou ë	Ê ou ë
IgA 1 à 2
H2L2 ou (H2L2)2JS	(H2L2)5J	H2L2	H2L2
160KDa ou 400KDa	950KDa	185KDa	190KDa
6 J	5 J	4 J	2 à 3 J
2 à 4	0.5 à 2	0.05 à 0.4	0.1 à 1
10	0.4 ou 06	02	02

Fonction -Réponse

secondaire. -Anticorps; protection à long terme.

-Réponse primaire. -Anticorps des secrétions.

-Protection des muqueuses. -Protection à cours terme.

-Protection contre les parasites. -rôle plutôt mineur.

- Anticorps de la réaction allergique.

Structure en Y

Classes IgG

Chaine H ã

Chaine L Ê ou ë

Sous classe IgG 1 à 4

Structure H₂L₂

Masse Moléculaire 150KDa

Demi-vie moyenne 24 J

[g/l] 8 à 16

Valence 02

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques

	56

5) Classes et sous -classes:

C'est la nature de la chaîne lourde d'une immunoglobuline qui détermine sa classe et éventuellement sa sous classe.

L'Isotypie de classe ou de sous classe est la propriété liée à la présence chez tous les individus de la même espèce, des mêmes marqueurs antigéniques spécifiques.

Chez les mammifères par exemple existe 5 classes d'Ig (immunoglobulines) qui

correspondent à un type différent de chaîne lourde :

- Ig G: chaîne lourde de type ã (Gamma). - Ig A : chaîne lourde de type á (Alpha). - Ig M : chaîne lourde de type u (Mu).

- Ig D : chaîne lourde de type ä (Delta).

- Ig E : chaîne lourde de type î (Epsilon).

En ce qui concerne les Ig A et les Ig D la nature de la chaîne lourde peut faire l'objet d'une variabilité définissant une sous classe :

- Il existe 4 sous classes d'Ig G: Ig G1, Ig G2, Ig G3, Ig G4 car il existe 4 sortes différentes de chaînes lourdes gamma.

- Il existe 2 sous classes d'Ig A: Ig A1, Ig A2 car il existe 2 types de chaînes lourdes alpha.

Le tableau ci-dessus indique les principales propriétés physiques et biologiques des classes et des sous-classes.

Tableau 4: Classes et sous classes des immunoglobulines.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	57

Quelques précisions :

. Dans la catégorie « association moléculaires possibles », le symbole « J» signifie qu'il existe une chaîne de jonction, et le symbole « S» signifie qu'il existe une pièce sécrétoire.

. La valence de l'anticorps correspond au nombre de segments Fab (nombre de sites de liaison à l'antigène).

. Ig D est plus lourde Que Ig G ou Ig A car elle est plus glycosylée.

. Ig E est lourde car il existe un 5ème domaine et Ig M est encore plus lourde car c'est un pentamère. La masse d'Ig A est de 400 000 quand il existe une chaîne de

jonction et une pièce sécrétoire.

.Ig G et Ig A sont les plus synthétisées par jour par un individu.

.Ig M sédimente plus vite car c'est un pentamère. 6) Exploration des immunoglobulines sériques:

L'exploration des immunoglobulines est de règle quand:

- il existe des infections répétées, inexpliquées, surtout bactériennes,

- on évoque un déficit immunitaire compliqué de manifestations infectieuses, auto- immunes ou lymphoprolifératives,

- il existe des éléments en faveur d'une prolifération lymphoplasmocytaire susceptible de sécréter une IM (cf. exploration d'une gammapathie monoclonale),

- la VS est accélérée avec ou sans syndrome inflammatoire. > Méthodes d'exploration des Ig :

Elle comporte une électrophorèse des protéines sériques complétée par un dosage pondéral des Ig sériques : IgG, IgA et IgM, éventuellement des sous-classes d'IgG.

* Electrophorèse des protéines sériques;

La séparation électrophorétique du sérum humain donne 5 (ou 6) fractions. A l'état normal, un grand nombre de molécules d'Ig d'isotypes, d'allotypes et d'idiotypes différents provenant d'une multitude de clones lymphoplasmocytaires circulent dans le sang : ce sont les Ig polyclonales. Les Ig migrent essentiellement dans la zone des ãglobulines. La concentration en ã-globulines estimée à l'EP varie selon l'âge, physiologiquement elle est de 6 à 13 g/l chez l'adulte.

* Dosage pondéral des Ig (IgG, IgA, IgM):

Le dosage pondéral (quantitatif) des Ig (néphélémétrie) donne plus de précisions.

Les concentrations en Ig varient en fonction de l'âge. Chez l'adulte sain, les concentrations sériques sont les suivantes :

IgG : 7,20 -14,70 g/l, IgA : 1,10 - 3,60 g/l, IgM : 0,48 - 3,10 g/l. *Dosage des sous-classes d'IgG (IgG1, G2, G3, G4).

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	58

Il s'effectue essentiellement par néphélémétrie. Les concentrations varient en fonction de l'âge. L'interprétation des résultats est délicate lorsque les concentrations sont à la limite inférieure de la normale et chez l'enfant de moins de 18 mois.

a. Dosage: á) Prélèvement de sang du foetus dans les derniers mois de grossesse:

- La teneur en augmente jusqu'à la naissance où elle atteint son point culminant. Mais ce stock d'Ig G à la naissance provient essentiellement de la mère car les Ig G sont les seuls capables de passer la barrière placentaire.

- Les IgM qui sont moins nombreuses sont elles d'origine foetale.

- On ne trouve ni Ig A ni Ig D ni Ig E.

â) Prélèvement à la naissance:

- Il y a diminution des Ig C} d'origine maternelle (1/2 vie d'environ 3 semaines) mais la production d'Ig G démarre dès la naissance et compense cette chute.

- La production des Ig M se poursuit jusqu'à atteindre un plateau vers le sixième mois. - La production des autres Ig augmente progressivement.


· Réponses immunitaires primaires et secondaires.

Lors du premier contact entre l'organisme et l'antigène: pendant quelques jours rien ne se passe (temps de latence) puis au bout d'une semaine apparaissent dans le sang des anticorps spécifiques de l'antigène puis le taux d'anticorps se stabilise avant de diminuer.

Lors du second contact entre l'anticorps et l'antigène: la réaction immunitaire secondaire est très rapide (pas de latence) et beaucoup plus ample. Elle traduit l'existence chez un individu d'une mémoire antigénique portée par les lymphocytes B mémoires.

b. Typage par immunofixation d'une gammapathie monoclonale: + Le principe de l'immune fixation repose sur 2 propriétés:

-Mobilité électrophorétique dans un champ électrique.

-Caractère antigénique des protéines. C'est une propriété inhérente à toutes les protéines.

Ex: si on injecte une protéine purifie (ex albumine humaine) à un mouton, il ne reconnaît pas cette albumine et donc fabrique des anticorps anti-albumine. Le mouton est alors immunisé contre l'albumine humaine et il est possible d'isoler ses anticorps anti-albumine humaine. D.

+ Technique de l'immunofixation (lors de cette expérience):

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	59

- On dispose d'un support plastifié sur lequel on coule un gel hydraté et tamponné par un Ph de 8,6.

- A l'aide d'un applicateur on dépose sur ce support quelques microlitres de sérum sur les 6 pistes correspondantes.

- On applique alors un courant électrique entre les électrodes (200 V).

- Les protéines migrent alors en fonction de leur taille.

- Sur la piste de gauche on applique un colorant des protéines (électrophorèse normale).

- Sur les 3 pistes suivantes on dépose un anticorps spécifique d'une Ig (G, A, M). - Sur les 2 dernières pistes on dépose un anticorps anti-chaîne légère (K et L).

Anticorps et antigène forment un complexe et donnent une réaction colorée. + Analyse de cette immunofixation:

- Sur la première piste on repère une zone intense qui correspond à une production anormale d'une catégorie d'Ig.

- On détermine cette classe d'Ig en étudiant les complexes antigène/anticorps. - La chaîne lourde correspondante est de type G et la chaîne légère de type L.

- Il y a donc une synthèse trop importante d'Ig de type ë2ê2.

7) FONCTIONS DES IMMUNOGLOBULINES :

Ils assurent plusieurs fonctions dans le déroulement de la réaction immunitaire :

a) Reconnaissance de l'Ag :

- La principale fonction d'une Ig est de reconnaître et de se lier spécifiquement à un Ag.

- Cette fonction est assurée par une région appelée : site Ac ou paratope, située sur le fragment Fab, et constituée de 6-10 acides aminés, qui ne sont pas voisins, et qui appartient aux régions « hypervariable » de la chaine lourde et de la chaine légère.

- Ainsi, se forment des complexes Ag-Ac= complexe immuns (lorsque l'Ag est soluble).

- Lorsque les Ac se fixent aux cellules cibles, leur forme se modifie faisant apparaître des sites de 4 fixation du complément, sur le fragment Fc.

b) Fixation et activation du complément :

- En fonction de leurs classes et sous-classes les Ig peuvent activer le complément par les deux voies : Classique et alterne.

Ce qui déclenche la fixation de certains facteurs du complément sur la surface de la cellule antigénique et par conséquent sa lyse.

c) Propriétés cytophylitiques :

- Le fragment Fc présente également des sites de fixation de nombreuses cellules immunitaires : macrophage, PNN, lymphocytes et mastocytes...

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques	60

- Les Ig en reliant l'Ag ou la cellule aux PNN et macrophages ou monocytes jouent le rôle d'opsonines (facilitent la phagocytose).

d) La neutralisation :

- L'Ig peut bloquer des sites spécifiques sur les exotoxines bactériennes et les virus. Ce qui les empêche d'endommager les cellules normales de l'organisme = neutralisation.

e) Agglutination et précipitation :

- Agglutination : lorsque plusieurs cellules étrangères, en l'occurrence, sont réunies par des Ig, formant un amas.

- Précipitation : lorsqu'il s'agit de molécules solubles réunies, pour former de grands complexes immuns.

- Ce qui facilite la phagocytose de ces bactéries ou molécules d'Ag précipités.

Neutralisation, agglutination et précipitation découlent de la fonction de fixation et de connaissance des Ac et donc du fragment Fab.

f) Passage transplacentaire des IgG :

- Le site qui permet ce passage est situé sur le fragment Fc des IgG : les seules à pouvoir traverser le placenta.

g) Propriétés particulières :

· IgM :

- Les premières à apparaître au cours de l'ontogénie et de la réponse immune.

- Puissants agents agglutinants et dans la fixation du complément et son activation. - Récepteurs antigéniques à la surface des lymphocytes B.

· IgG : - Principal Ac des réactions primaires et secondaires.

· IgA :

- Interviennent dans les réponses immunitaires locales au niveau de la sécrétion des muqueuses :

* En empêchant l'adhérence des germes aux cellules épithéliales. * En neutralisant certaines toxines.

* En agglutinant les bactéries ou champignons.

· IgE :

- Se lient au mastocytes et basophiles, lorsque associés aux Ag, déclenchent la libération de médiateurs : histamine.... (Dégranulation) qui participe à des réactions allergiques et à la défense antiparasitaire.

· IgD : Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		61

- Leur rôle n'est pas bien connu : probablement = rôle de récepteur à la surface des lymphocytes B5 immunocompétents.

- Bipolarité fonctionnelle :

* Le fragment Fab reconnaît et se fixe à l'Ag.

* Le fragment Fc est responsable des propriétés biologiques. N.B= Niveaux d'hétérogénéité des immunoglobulines :

- Isotypie : les isotypies : déterminants antigéniques identiques chez les individus d'une même espèce. Ils sont portés par la partie constante des chaînes lourdes et légères.

L'Isotypie définit les classes et les sous classes d'Ig.

- Allotypie : les allotypies sont des déterminants antigéniques provenant des variations génétiques interindividuelles au sein d'une même espèce de structure des chaînes lourdes á, ã et des chaînes légères kappa K.

_ Ils sont portés par les parties constantes de ces chaînes.

_ Il existe 28 allotypes pour les chaînes lourdes gamma appelés Gm. _ Il existe 2 allotypes pour les chaînes lourdes alpha appelés Am.

- Idiotype :

* Sont des déterminants antigéniques (ou Epitopes) localisés sur le fragment Fv formé par l'association des domaines variables des chaînes lourdes et légères= VL et VH. La spécificité idiotypique = étroite individuelle, produit d'un clone cellule.

* La cascade d'auto-anticorps anti-idiotypes = le réseau idiotypique, a pour rôle de réguler la réponse humorale.

8) Principales anomalies des immunoglobulines: a. Les hypogammaglobulinémies:

> Hypogammaglobulinémies physiologiques:

Les déficits de l'immunité humorale se caractérisent par un trouble de la production globale des anticorps par les lymphocytes B responsable d'une hypogammaglobulinémie plus ou moins sévère selon l'étiologie. Quatre cas cliniques illustrent les principales causes hypogammaglobulinémies de l'enfant, la maladie de Bruton - dans sa forme typique et dans sa forme atypique -, l'hypogammaglobulinémie transitoire de l'enfance et de la déficience immunitaire commune variable.

Les manifestations cliniques que partagent ces diverses pathologies sont les infections bactériennes à répétition touchant principalement le tractus respiratoire.

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		62

Les infections opportunistes et les manifestations auto-immunes sont plus fréquentes dans la déficience immunitaire commune variable et dans l'hypogammaglobulinémie avec hyper IgM qui, en raison de sa rareté, n'est que brièvement abordée.

Les récents progrès de la génétique et de la biologie moléculaire ont partiellement révélé l'origine et la physiopathologie de ces affections. L'administration intraveineuse d'immunoglobulines améliore considérablement la qualité de vie des patients et le pronostic de leur affection.

> Hypogammaglobulinémies pathologiques:

Dites globales lorsque la concentration de toutes les classes d'Ig est diminuée, sélectives lorsqu'elle ne touche qu'une ou deux classes d'Ig, les hypogammaglobulinémies relèvent de différentes étiologies. On distingue :

>Les déficits immunitaires acquis (étiologie la plus fréquente) :

- maladies infectieuses, syndromes lymphoprolifératifs (LLC, myélome), - atteinte médullaire néoplasique, toxique, post-radique,

- médicaments : immunosuppresseurs, APS, ...

- pertes excessives : fuites rénales, cutanées, digestives.

-Hémopathies malignes.

-Causes iatrogènes.

-Pertes Protéiques.

-Certaines maladies virales.

> Les déficits immunitaires primitifs : Le dosage des différents isotypes des Ig permet de détecter les déficits en IgA, déficits immunitaires humoraux les plus fréquents (1/700 sujets), les déficits immunitaires communs variables, les déficits avec hyper-IgM. L'agammaglobulinémie ou maladie de Bruton (absence d'Ig et de lymphocytes B) est exceptionnelle.

Déficits congénital en IgA (<50mg/l).

Déficits immunitaires combinés sévères(DICS).

>>Les déficits en sous-classes d'Ig

Les déficits en IgG2 sont les mieux caractérisés (infections des voies aériennes supérieures à germes encapsulés). Parfois il existe des déficits combinés IgG2 et IgA, IgG2-IgG4. L'existence du déficit en IgG4 est controversée : 20 % des sujets sains ont des concentrations en IgG4 à la limite des possibilités de détection.

b. Les hypergammaglobulinémies polyclonales:

> Caractéristiques:

Une hypergammaglobulinémie (augmentation des gammaglobulines) inférieure à 30 g/l a rarement une valeur d'orientation diagnostique décisive car elle s'observe dans de nombreuses circonstances inflammatoires ou infectieuses chroniques mais également dans certaines MAI (S. de GougerotSjögren+++, lupus systémique [on le revoie dans la partie

expérimental], ...). Une hypergammaglobulinémie supérieure à 30 g/l oriente vers une infection VIH, une parasitose ou une hépatite auto- immune.

> Situation pathologique:

+ Maladies infectieuses:

· infections aiguës: Ig monoclonale transitoire.

· infections chroniques.

· virus: VIH, EBV, CMV, VHB, VHC.

· bactéries: salmonelles, leptospires, EI.

· parasites: paludisme, toxoplasmose.

+ Maladies auto-immunes:

· syndrome de Gougerot-Sjögren essentiellement

· autres maladies auto-immunes (PR, LED...): fréquence peu élevée
d 'Ig monoclonale posant la question d'une association fortuite.

+ Hépatopathies:

· capacité de synthèse hépatique diminuée: o Diminution de l'albumine et d'autres protéines.

· autres perturbations biochimiques: o Augmentation des enzymes hépatiques (transaminases, PAL, ...) (cytolyse).

o Augmentation de la bilirubine (ictère).

· hypergammaglobulinémie polyclonale (IgA): o compensation de synthèse par les plasmocytes. o bloc â / ã.

o diagnostic différentiel des autres hypergammapolyclonales.

c. Les dysglobulinémies monoclonales:

> Caractéristiques:

Anomalie des globulines qui constituent, avec l'albumine, les protéines du sang. En pratique on réserve ce mot à des modifications des gammaglobulines ou anticorps. On regroupe ainsi sous le nom de dysglobulinémies, ou gammapathies monoclonales, des maladies dans lesquelles existe, dans le sang ou dans les urines, une immunoglobuline monoclonale en excès. Elle peut être mise en évidence dans le sérum par des réactifs qui identifient la classe de chaînes lourdes et le type de chaînes légères.

Chez un sujet normal, les différentes classes d'immunoglobulines sont présentes à des taux stables, leur production étant soumise à une régulation. Les dysglobulinémies monoclonales sont caractérisées par une rupture de cette régulation et par la prolifération excessive et maligne d'un clone qui entraîne une synthèse importante d'une espèce moléculaire dite monoclonale.

La présence d'une immunoglobuline monoclonale anormale a été longtemps synonyme de myélome ou de macroglobulinémie de Waldenström. On sait maintenant qu'il existe d'autres gammapathies monoclonales, au cours d'autres cancers, d'états inflammatoires chroniques et de certaines maladies auto-immunes. Il

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		64

y a aussi des modifications modérées et bénignes qui régressent sans traitement (Tableau 5).

DYSGLOBULINÉMIES MONOCLONALES

Malignes :Myélome

Macroglobulinémie de Waldenström

Lymphomes malins (leucémie lymphoïde chronique, lymphomes) non-hodgkiniens

Maladies des chaînes lourdes

Non malignes : Associées à une autre affection

· Cancers

· Cirrhoses

· Inflammation chronique · Maladies auto-immunes Formes dites« essentielles bénignes »

· Formes sporadiques

· Formes familiales (prédisposition génétique).

Tableau 5: Dysglobulinémies monoclonales.

Le diagnostic est assez souvent évoqué par un examen biologique sanguin fait pour une autre raison, s'il révèle une ou plusieurs anomalies : une augmentation de la vitesse de sédimentation, une précipitation du sérum ou du plasma au froid, des «rouleaux» de globules rouges sur un frottis sanguin, une pseudo-agglutination lors de la détermination d'un groupe sanguin, une anémie isolée, une augmentation des lymphocytes dans le sang. Ces modifications amènent à analyser les protéines par électrophorèse du sang et des urines. L'immunoglobuline monoclonale recherchée peut exister sous forme de molécules entières d'anticorps ou de chaînes isolées. On identifie de façon précise l'anomalie et l'anticorps concerné et on constate que les autres immunoglobulines sont diminuées.

Les anomalies les plus fréquentes portent sur les immunoglobulines et en cas de myélome. L'augmentation des immunoglobulines monoclonales correspond à la maladie de Waldenström.

Remarque:

Dans les cas de gammapathie bénigne, sans signe clinique, les immunoglobulines normales ne sont pas abaissées. Il n'y a pas de cellules anormales dans le sang ni dans la moelle osseuse. Il faut cependant surveiller ces formes bénignes car elles peuvent évoluer vers un myélome.

> Situations pathologiques:

+ Maladie de Kahler: (myélome multiple classique):



· Prolifération maligne monoclonale des plasmocytes dans la moelle osseuse- Maladie de Kahler-

· 20 % des Ig monoclonales; IgG (53 %), IgA (25 %), chaînes légères isolées (20 %),

IgD (1 %), IgE exceptionnelle.

· Manifestations: - Signes osseux:

Douleurs lombaires, costales, des membres; fracture pathologique; tuméfaction osseuse.

- Signes radiologiques:

Lacunes à l'emporte-pièce des os du crâne, des côtes, du bassin; déminéralisation osseuse ; tassements vertébraux.

- Signes rénaux :

Tubulopathie chronique, insuffisance rénale. - Signes neurologiques:

Paraplégie par compression épidurale; neuropathie périphérique.

Amylose.

· Manifestations hémorragiques:

Infection bactérienne.

· Manifestations cutanées:

nodules de coloration rose-chamois.

· Critères diagnostiques du myélome multiple:

· Critères majeurs:

1- Tumeur plasmocytaire sur une biopsie.

2- Plasmocytose médullaire > 30 %.

3- Pic monoclonal sérique: IgG >30 g/l, IgA > 20 g/l, excrétion urinaire de chaînes légères Kappa ou Lambda > 1 g/24heures.

· Critères mineurs:

a- Plasmocytose médullaire comprise entre 10 et 30 %.

b- Composant monoclonal sérique ou urinaire à un taux inférieur à ceux cités dans 3.

c- Lésions osseuses lytiques.

d- Baisse des Ig résiduelles: IgM < 0,5 g/l, IgA< 1 g/l, IgG < 6 g/l.

Chez des malades symptomatiques: anémiques et/ou hypercalcémiques et/ou hyperazotémiques et/ou hypoalbuminémiques et/ou présentant une déminéralisation osseuse et des fractures compressives.

Le diagnostic de myélome multiple est retenu si: á) 1 + b ou c ou d;

â) 2+ b ou c ou d;

ã) 3;

ä) a + b + c ou a+ b + d.

· Variant du myélome multiple:

-3 % des Ig monoclonales. - Smoldering myeloma:

· 3 % des Ig monoclonales

· Critères de définition:

-Malade asymptomatique.

-Taux de l'Ig monoclonale sérique > 30 g/l. -Plasmocytose médullaire entre 10 et 30 %. -stabilité de l'Ig monoclonale au cours de l'évolution.

· Surveillance à vie en raison du risque d'évolution vers un myélome multiple.



Figure 5: Profile électrophoritique d'un patient atteint le myélome multiple classique.

+ Macroglobulinémie de Waldenström:

· Macroglobulinémie de Waldenström:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		67

2 % des Ig monoclonales.

· prolifération de cellules lymphoïdes B de maturation intermédiaire entre le petit lymphocyte et le plasmocyte, excrétant une IgM monoclonale dite

macroglobuline.

· manifestation cliniques: fièvre, sueurs nocturnes, adénopathies,

hépatosplénomégalie, neuropathie périphérique, syndrome d'hyperviscosité.

· diagnostic:

· Ig monoclonal IgM > 5 g/l.

· myélogramme et BOM: prolifération lymphoïde polymorphe comportant

lymphocytes, lymphoplasmocytes et plasmocytes.

+ Maladies des chaînes lourdes:

· syndromes immunoprolifératifs caractérisés par la production d 'Ig monoclonales incomplètes sous forme de chaînes lourdes délétées sans chaines légères.

· électrophorèse le plus souvent normale (Ig < 1g/l).

· diagnostic sur l'immunoélectrophorèse ou l'immunofixation.

· trois types:

-Maladie des chaînes lourdes alpha: la plus fréquente; sujets jeunes du pourtour méditerranéen; tableau de malabsorption intestinale sévère.

-Maladie des chaînes lourdes gamma: présentation de type lymphome. -Maladie des chaînes lourdes mues: très rares.

+ MGUS:

· Gammapathies monoclonales de signification indéterminée (MGUS):

· 60 % des Ig monoclonales; IgG (70 %), IgA (15 %), ou IgM (15 %).

· découverte d'une Ig monoclonale de manière fortuite.

· examens para cliniques:

Électrophorèse des protéines sériques.

Immunoélectrophorèse ou immunofixation des protéines sériques. NFP, calcémie, créatininémie.

Myélogramme.

Radiographies osseuses: crâne, bassin, colonne dorsale et lombaire, humérus, fémur, thorax; éventuellement.

IRM du squelette axial.

Électrophorèse et immunoélectrophorèse ou immunofixation des protéines urinaires.

· Critères de définition des MGUS:

Chapitre 2 : Etude descriptive des principales protéines sériques		68

Malade asymptomatique ne présentant pas de: lésion lytique osseuse, anémie, hypercalcémie, insuffisance rénale.

Taux de l'Ig monoclonale sérique < 30 g/l.

Pas d'excrétion urinaire de chaînes légères (ou taux très faible). Plasmocytose médullaire < 10 %.

Stabilité de l'Ig monoclonale au cours de l'évolution. ? Evolution des M GUS:

Évolution possible vers un myélome multiple (IgG et IgA) ou une lymphopathie maligne (IgM) après parfois de très nombreuses années: risque actuariel de transformation maligne de 15 % à 10 ans et 30 % à 20 ans.



Surveillance:

Après 3 mois puis tous les 6 mois.

Clinique et biologique: électrophorèse des protéines sériques, NFP, calcémie, créatininémie, excrétion urinaire de chaînes légères.

Figure 6 : Profile électrophoritique d'un patient atteint le syndrome MOUS.

d. Profils immunitaires oligoclonaux: > Immunodéficience sévère.

> Certains types de cancers.

> Maladies auto-immunes.

Chapitre 3

Etude de quelques syndromes

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes		68

Introduction:

Il y a plusieurs syndromes qui dues a cause des anomalies des protéines sériques parmi ses syndromes les plus important sont les suivants, en les résumé tous, mais en prend le syndrome inflammatoire comme exemple on l'étude plus détaillé.

A) SYNDROME DE DÉNUTRITION:

> Définition : Dénutrition = déficit d'apport nutritionnel principalement

quantitatif.
> Mécanismes :

· Dénutrition exogène :

· Carence d'apport (anorexie mentale, cancer, malabsorption).

· Dénutrition endogène :

· Maladies inflammatoires (Maladie infectieuses, auto-immunes,

Cancers...).

· Fuites (cutanées, rénales, intestinales).

· Défaut de synthèse (Insuffisance hépatocellulaire).

· Dénutrition mixte.

> Evaluation : Clinique, anthropométrique, biologique.

> Marqueurs biochimiques:

· Marqueur « idéal » :

· Dépendre essentiellement de l'état nutritionnel.

· Varier significativement de façon précoce.

· Profil de base :

· 2 marqueurs de dénutrition = ALB + PALB.

· 1 marqueur d'inflammation = ORO.

· plus éventuellement RBP ou TRF.

> Index biologique ou clinico-biologique:

· Index de Buzby ou N R I :

· 1,519 x ALB (g/l) + 0,417 x (poids actuel / poids idéal) x 100.

· N > 97,5 ; 83,5 < modérée < 97,5 ; sévère < 83,5.

· P I N I :

· [CRP (mg/l) x ORO (mg/l)] / [ALB (g/l) x PALB (mg/l)].

· Risque : faible 1-10 ; modéré 11-20 ; de complications 21-30 ; vital >30.

> Exemples de profils nutritionnels :(Figure7)

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	69



Figure 7: Comparaison entre des profils nutritionnels.

a) Dénutrition exogène débutante sans inflammation, PALB diminue ALB et ORO = N.

b) Dénutrition exogène chronique sans inflammation PALB et ALB diminue ORO = N.

c) Dénutrition endogène isolée avec inflammation PALB et ALB diminue ORO augmenté.

d) Dénutrition mixte, endogène avec inflammation et exogène PALB et ALB diminue, ORO augmenté.

B) SYNDROME INFLAMMATOIRE:

> Définition : Réaction inflammatoire = réponse de l'organisme à une agression tissulaire ;

· d'origine exogène (infection, traumatisme physique ou chimique....).

· d'origine endogène (immunologique, tumorale ).

> Mécanisme:

PRI-(ALB, PALB, RBP, TRF).

PRI+ (CRP, AAT, ORO, HPT, CER, FIB).

Foyer inflammatoire Cytokines Foie





Schéma 2 : mécanisme du syndrome inflammatoire.

> Marqueurs biochimiques:

· Marqueur « idéal » : Varier exclusivement avec une inflammation, sans liaison à la cause, Cinétique de variation rapide, amplitude de variation significative et proportionnelle au degré de l'inflammation.

· Profil de base : 1 marqueur cinétique rapide = CRP et 2 marqueurs cinétique intermédiaire = ORO + HPT.

· Recherche de pathologies associées :

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes						70
			mri Adlène

Hémolyse ? HPT, Carence martiale ? TRF.

Dénutrition ? ALB, TRF, Fuites protéiques Ur ? ALB, ORO. ? Electrophorèse des protéines sériques :



Figure 8: Electrophorèse des protéines sériques au cours du syndrome inflammatoire.

C) SYNDROME NEPHROTIQUE:

> Définition : purement biologique associant 3 signes: - protéinurie d'origine glomérulaire > 3 g/24h,

- hypoprotidémie < 60 g/l,

- hypoalbuminémie < 30 g/l.

> Electrophorèse des protéines sériques:

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	71

Protéinurie = 10,1 g/24H

Diminution d'Albumine.

Augmentation d'á2-globulines. Diminution de ã globulines.

Figure 9: Electrophorèse des protéines sérique au cours du syndrome néphrotique.

D) GAMMAPATHIES:

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	72

> Schéma d'investigation dans le sérum :(Schéma 3)



Figure 10: Electrophorèse des protéines sérique d'une
personne atteint de gammapathies.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	73

Etude détaillé d'un syndrome : Le syndrome inflammatoire.

1) INFLAMMATION:

PHLEGMASIE OU INFLAMMATION : classe de maladie très fréquente, consistant en une surexcitation qui appelle le sang dans les vaisseaux capillaires d'un organe, d'où résulte de la douleur, de la chaleur, du gonflement, etc., phénomènes caractéristiques de l'inflammation. Le mot phlegmasie, qui, selon Gallien, signifiait toute inflammation avec fièvre, est plus particulièrement consacré aujourd'hui à désigner l'état inflammatoire des organes intérieurs.

LITTRÉ E. et ROBIN Ch.
Dictionnaire de médecine, de chirur_gie et de pharmacie
Éditions J.B. Baillère et Fils, Paris, 1878

2) DEFINITION:

La réaction inflammatoire (RI) : est un processus non spécifique de défense de l'organisme contre une agression tissulaire visant; tout en empêchant la progression de l'inflammation, à cicatriser le tissu blessé.

C'est une Processus tissulaire dont la finalité est de rétablir l'homéostasie. L'agression peut être d'origine:

® Exogène: infectieuse (bactéries, virus, parasites, champignons), tumorale, chimique, physique (traumatique, thermique, microcristaux, radique).

® Endogène: immunologique, hypersensibilité, secondaire à une nécrose tissulaire (IDM).

La réaction inflammatoire comporte des phénomènes : ® Locaux : cellulaires, humoraux, vasculaires. ® Généraux : PRI, hormones, hématologiques.

3) SYNDROME INFLAMMATOIRE:

Modifications biologiques systémiques survenant au cours des RI, principalement : augmentation de la Vitesse Sédimentaire, modification du tracé de l'électrophorèse des protéines sériques, modification du taux des PRI.

Les conséquences cliniques peuvent être:

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	74

· Purement locales:

· Ou s'accompagner de signes généraux :

? Fièvre.

? Altération de l'état général : Amaigrissement ++.

4) INTERET:

® Prévalence: 25-30% des patients consultants ou hospitalisés. ® Témoigne d'une pathologie organique non spécifique.

® Marqueur évolutif de nombreuses maladies et permettra de confirmer

l'efficacité des traitements proposés.

® Valeur discriminative de certains marqueurs.

® Gravité : état de choc avec SDMV si RI généralisée.

5) PHYSIOPATHOLOGIE: Quatre séquences d'évènements complexes et intriqués composent la RI:

1. Phase d'initiation.

2. Phase d'amplification.

3. Phase de stabilisation.

4. Phase de résolution.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	75

1) INITIATION : fait suite à un signal de danger d'origine exogène ou endogène et qui met en jeu des effecteurs primaires.





Figure 11: Phase d'initiation du syndrome inflammatoire.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes 2) AMPLIFICATION : mobilisation et l'activation d'effecteurs secondaires.	76
Figure 12: Phase d'amplification du syndrome inflammatoire (pré activation des cellules inflammatoires).
Belaouar Hamza/Lamri Adlène
Chapitre 3: Etude de quelques syndromes AMPLIFICATION (suite):		77
Figure 13: Phase d'amplification du syndrome inflammatoire (activation des cellules inflammatoires).
Belaouar Hamza/Lamri Adlène



78

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes

Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes 3) STABILISATION : Par neutralisation des facteurs de l'inflammation. 4) REPARATION ou RESOLUTION : tend à restaurer l'intégrité du tissu agressé.	79
Tableau 6 : répartition de la réponse inflammatoire.
Belaouar Hamza/Lamri Adlène

6) MARQUEURS BIOLOGIQUES DU SYNDROME INFLAMMATOIRE: a. VITESSE DE SEDIMENTATION(VS):

VS : distance parcourue en une heure par des hématies sédimentant dans un tube sous l'action de la gravité.

C'est un marqueur classique du Syndrome inflammatoire. ® Méthode de Westergren (Fahreus, 1920);

· Simple, rapide, économique.

· Dépistage et suivi du SI.

Mesure VS à la 2^e heure: pas d'intérêt spécifique. > Le résultat de la lecture de la VS dépend :

® Des hématies ; nombre, forme et volume.

® Du plasma : facteurs qui favorisent la formation de rouleaux de sédimentation :

· Protéines asymétriques lourdes chargées négativement : le Fibrinogène ++, les L- et ã-globulines et #177; á2-globulines.

· chaleur et acidose.

® De l'hématocrite : influence la VS à la 2°heure. ® Non influencée par la température corporelle. > VS : DELAIS DE MODIFICATIONS:

® Fibrinogène ++ (80%) : s'élève en 3-4 jours et retour à la normale plusieurs semaines après une infection.

® VS = indicateur tardif du SI avec une cinétique très lente.

® VS = marqueur global et indirect du SI.

® VS non spécifique du SI.

VS : VARIATIONS PHYSIOLOGIQUES ET VALEURS NORMALES A LA 1^ère HEURE:

Age Hommes Femmes

< 50 ans 15 mm 20 mm

> 50 ans 20 mm 30 mm

Tableau 7 : Variation de la VS du Fibrinogène selon l'âge et le sexe.

> FACTEURS ABAISSANT LA VS :

· Anomalie des GR : microcytose, polyglobulie, hémoglobinopathie.

· Hémolyse: Haptoglobine diminue.

· Hypofibrinémie: fibrinolyse.

· Syndrome néphrotique et fuites urinaires de protéines.

· Hypogammaglobulinémie Hyperviscosité.

· Cryglobulinémie.

· Leucocytose > 50 000 /mm3.

· Corticoïdes.

· Cachexie.

· Mesure VS plus de 2H après le prélèvement.

> FACTEURS AUGMENTANT LA VS :

· Âge avancé.

· Sexe féminin.

· Grossesse.

· oestrogènes (via fibrinogène).

· Anémie si Ht < 30%.

· Macrocytose.

· Hypogammaglobulinémie.

· Hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie.

· Héparine.

· Insuffisance rénale.

· Insuffisance cardiaque.

· Tube non vertical.

· VS élevée : peut refléter un syndrome sédimentaire uniquement.

· VS normale : n'élimine pas un syndrome inflammatoire. b. MODIFICATIONS DE L'HEMOGRAMME :

® Anémie ;

· Normochrome, normocytaire puis microcytaire, arégénérative et modérée dès la 3^e semaine.

· Fer sérique bas, ferritinémie élevée, transferrine abaissée (CPT normale ou basse).

· Séquestration de fer par les macrophages.

® Thrombocytose.

® Hyperleucocytose à neutrophile > inconstante. ® Action des growth factors et IL-1 sur la moelle osseuse. c. MODIFICATIONS NON SPECIFIQUES :

o LECTROPHORESE DES PROTEINES SERIQUES :

> Signification :

® Hyper alpha globulinémie évoque un SI ;

· Migrent en a 1 : Orosomucoïde, Alpha chymotrypsine.

· Migrent en a 2 : Haptoglobine, Céruléoplasmine.

® Migrent en Bêta : Fibrinogène, Bêta globulines.

® Migrent en Gamma : CRP, y-globulines.

® Fibrinogène et CRP ne modifient pas le tracé.

® L'albumine = PRI négative.

® Explore aussi :

· La fonction hépatique.

· L'état nutritionnel.

® L'interprétation est difficile en cas ;

· Entéropathie exsudative.

· Syndrome néphrotique.

· Malnutrition protéique.

· Insuffisance hépatocellulaire.

® Délai de modifications : Très lent et peu spécifique.

® Examen peu sensible mais permet d'identifier "au coup d'oeil".

® Hyper alpha globulinémie et hypoalbuminémie en rapport avec un SI.

® Gammapathie poly- ou monoclonale =:). augmentation de la VS.

® un bloc h évocateur d'une cirrhose.

® EPP = marqueur global et indirect de l'inflammation. Quel marqueur idéal de la réaction inflammatoire ?

® Le marqueur idéal de la réaction inflammatoire doit avoir les qualités suivantes:

· Rapport exclusif avec la réaction inflammatoire.

· Non lié à la cause de l'inflammation.

· Cinétique rapide.

· Augmentation significative pour une RI modérée.

· Augmentation proportionnelle au degré de la RI.

· Dosage facile, reproductible, standardisable.

· Coût modéré du dosage.


· Excellentes VPP et VPN.

7) PROTEINE DE LA REPONSE INFLAMMATOIRE (PRI): > ACUTE PHASE PROTEINS:

Les PRI = protéines dont le taux varie au moins de 25% lors de la réaction inflammatoire. Aucune PRI parfaite.

> MODIFICATION DES TAUX DES PRI:

· AUGMENTATION - PRI ? : V' Protéine C-réactive (CRP).

V' Protéine sérique amyloïde A (SAA).

V' Orosomucoïde (á1-glycoprotéine acide). V' á2-macroglobuline.

V' Procalcitonine (PCT).

V' á2-macroglobuline.

V' Anti-protéases ; á1-antitrypsine; á1-antichymotrypsine.

V' Protéines de transport ; Céruléoplasmine; Haptoglobine.

V' Fractions du complément ; C3; C4; C1-INH (inhibiteur) ; Facteur B.

V' Protéines de la coagulation et fibrinolyse;

· Fibrinogène; Plasminogène; Protéine S.

· Activateur tissulaire du plasminogène.

· Inhibiteur de l'activateur du plasminogène.

· DIMINUTION - PRI È: V' Albumine.

V' Transferrine.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes		84

V' Apolipoprotéine A1.

V' Préalbumine.

V' á-foeto-protéine (fetuine).

V' Facteur XII.

V' Insulin-like growth factor I (IGF-I). > Propriétés des PRI:

® Production ++ FOIE.

® Influence principale de IL6 ++, IL1, TNFá. ® Rôle de défense;

· Opsonisation.

· activation du système du complément.

· élimination de substances toxiques.

· transport protéines.

· inhibition protéases.

> PROPRIETES BIOLOGIQUES DES PRI ? :							PROTEINE
GROUPE	MOBILITE ELECTROPHORETIQUE	DEMI-VIE (JOUR)	CONCENTRATION (g/l)	VARIATIONS PATHOLOGIQUE		OROSOMUCOIDE
II	a 1	2,3	0,5-1	1,5-2,5		á 1 ANTITRYPSINE
II	a 1	4,0	1,5-3			á 1 ANTICHYMOTRYPSINE
II	a 1	?	0,2-0,5			SERUM AMYLOID A
IIII	a1	1,0	10x10-^3			HAPTOGLOBINE
II	a 2	4,0	0,8-2	3-8		CERULOPLASMINE
I	a 2	2,5	0,3-0,6			FIBRINOGENE
II	13-y	4-6	2-4			CRP
III	y	1,0	<0,006	0,015-0,3

Tableau 8 : Propriétés biologiques des protéines inflammatoires.

> Problèmes rencontrés avec les PRI?

® L'amplitude de variation au cours de la RI est différente d'une PRI à l'autre.

· x 1,5 : fraction C3, Céruléoplasmine.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes		85

· x 2- 4 : Orosomucoïde, á1-antitrypsine, á1-antichymotrypsine, fibrinogène, haptoglobine.

· x 1000: CRP, SAA.

· Diminué : Albumine, Transferrine.

® La cinétique de variation des protéines non homogène.

· Rapide : CRP, SAA, Alpha-1-antichymotrypsine.

· Plus lente pour les autres PRI.

· L'Albumine a une demi-vie de 15-20 j et la pré-Albumine de 2 jours. ® La réponse aux ttt non identique.

· La CRP n'est pas modifiée par les corticoïdes.

® L'association de plusieurs situations pathologiques peut aboutir à des valeurs normales ou basses pour certaines protéines:

· TRF et carence martiale; dénutrition protéique.

· Haptoglobine et hémolyse.

· Orosomucoïde et fuite urinaire de protéines (moindre poids moléculaire).

· C3 et activation du complément par les CIC (baisse) et la RI (hausse).

· Albumine et fuite protéique; dénutrition.

· PRI et insuffisance hépatiques.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes				86
						Tableau 9: Facteurs susceptibles de modifier le dosage sérique des protéines de l'inflammation. + HAPTOGLOBINE: ® Alpha 2 glycoprotéine synthétisée par le foie et qui se combine à l'Hb libre pour le recyclage du fer. ® Délais de modifications; · Cinétique lente ? Redondance avec la VS. · Variant parallèlement à l'Orosomucoïde (x1, 3 en pourcentage). · Augmente après 3-4 jours et 1/2 vie 3 à 6 j. ® Variations physiologiques; · Hausse: ? Réaction inflammatoire chronique. · Baisse: ? Hémolyse; Traitement par la Dapsone (hémolyse).
Belaouar Hamza/Lamri Adlène
Chapitre 3 : Etude de quelques syndromes o Nouveau né. o Insuffisance hépatique très sévère (TP < 50%). ® Permet (avec la CRP) : · d'infirmer un SI à VS accéléré. · ou d'affirmer un SI à VS normale. · Diagnostic des syndromes hémolytiques (LED, anémie hémolytique auto immune...). TRANSFERRINE : PRI 0: ® Protéine de transport du fer, synthétisée par le foie. ® Délai de modification : · Lent. · Augmente après 3-4 jours et 1/2 vie de 8 jours. ® Diagnostic des carences martiales. ® Utile au dépistage des hémochromatoses. ® Variations physiologiques; · Varie peu avec l'âge, régulé par les niveaux de fer. · Augmentation de sa synthèse pendant la grossesse (oestrogènes). · Le taux varie chez l'adulte sain de 2 à 3 g/l. ® Baisse; · RI de façon parallèle à l'albumine. · Dénutrition, carence en vit C. · Insuffisance hépatocellulaire. · Fuite protéique (glomérulaire, intestinale, brûlures). ® Hausse; · Carence martiale. · Hépatite virale.		87
			Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 3 : Etude de quelques syndromes · Oestrogénothérapie. · Thiazidiques. · Hypoandrogénie. v FERRITINE: ® Famille des isoferritines, protéines de haut PM: · Intracellulaires, réserve échangeable du fer. · Ou sériques de contenu faible en fer. ® Délai de modification : Lent. ® Variations physiologiques; · Homme : 30-300 ug/l. · Femme : 20 à 200 ug/l. · Basse à la puberté son taux augmente avec l'âge. ® Diagnostic de la carence martiale et des surcharges en fer. ® N'est pas un marqueur de l'inflammation en première intention. ® Baisse: · Carence martiale. ® Hausse: · Syndromes inflammatoires. · Maladie de Still (très spécifique). · Anomalie de l'érythropoïèse. · Lyse cellulaire aiguë : infarctus, hépatite, rhabdomyolyse, hémolyse. · Cirrhose, hépatocarcinome. · Hémochromatose. v ALPHA -1 - ANTICHYMOTRYSINE: ® 6-6 Alpha-1-antichymotrypsine. ® Anti protéase dont la synthèse est hépatique.		88
			Belaouar Hamza/Lamri Adlène

89

Chapitre 3 : Etude de quelques syndromes

® La demi-vie courte= 2 jours.

® Taux habituel = 20,3-0,6 g/l.

® Augmentation précoce en de SI : 1 à 2 g /l.

® Marqueur le plus sensible et le plus spécifique de la RI (VPN 95%).

v FRACTION C3 DU COMPLEMENT:

® Activation en cascade des protéines du complément au cours de nombreux processus : lyse cellulaire, opsonisation, activité des neutrophiles et monocytes etc.

® Synthèse foie et macrophage.

® Trois voies d'activation:

· classique, initiées par le complexe Ag-Ac.

· alterne, initiée par des substances naturelles (paroi bactérienne, venin..).

· voie des lectines.

· Carrefour : fraction C3 dont le clivage aboutit à la voie terminale et à action biologique.

® La fraction C3 baisse lorsque le complément est activé (présence de complexes immuns circulants):

· LED en poussée, PR avancée.

· Certaines infections: endocardite, infection à méningocoque coli.

· Anémie hémolytique.

· Glomérulonéphrite.

· Insuffisance hépatocellulaire sévère.

® La fraction C3 augmente dans les autres SI et en cas de cirrhose biliaire primitive.

® Son taux est de 0,15 à 2 g/l et ne varie pas avec l'âge.

v SAA (serum amyloïde A protein):

® Apolipoprotéine de type HDL épurant le cholestérol lors de la RI.

® Synthèse : foie, poumon, rein, rate, intestin.

Chapitre 3 : Etude de quelques syndromes		90

® effet chimiotactique pour les leucocytes et favorise leur adhésion sur les parois vasculaires.

® Peut être dégradée en protéine A amyloïde.

® Taux habituel = 2,5 mg /l.

® 1/2 vie courte = un jour.

® Augmentation précoce en cas de SI: 50-1000 mg /l.

® Serait plus spécifique et meilleure VPN que la CRP. ® Marqueur d'une évolution possible vers l'amylose. C - REACTIVE PROTEINE (CRP) :

® Protéine pentamérique non glycosylée dont la synthèse est hépatique sous l'action des cytokines (IL6 surtout).

® Connue depuis 1930 : protéine qui précipite en présence du polysaccaride (protéine - C) du pneumocoque.

® Prépare la phagocytose (opsonisation) en se fixant sur les cellules altérées et aux substances étrangères facilitant leur reconnaissance et leur élimination.

® Induit la sécrétion des cytokines et active le complément.

® Délais de modifications :

· Cinétique très rapide :

· S'élève dès la 8°heure et sa 1/2 vie est de 12 H.

· Peut varier d'un facteur 10 à 400.

® Variations physiologiques :

· Pas de modification avec l'âge.

· Non modifiée par les corticoïdes et immunosuppresseurs.

® La CRP ne fait pas partie des PRI impliquées dans la VS.

® Sa sensibilité permet de détecter des inflammations modérées comme les manifestations athéromateuses.

® L'élévation de la CRP est corrélée au risque de fracture de la plaque d'athérome et à celui d'infarctus du myocarde chez les patients souffrant de syndrome coronaire aigu.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes ® Baisse: · IHC (très sévère uniquement). ® Hausse: · Réaction inflammatoire jusqu'à 300 mg. · Infections : bactériennes ++. ® Témoin (diagnostique et efficacité thérapeutique) de l'infection. ® Marqueur d'évolutivité des pathologies inflammatoires. ® Excellent rapport coût / rentabilité diagnostique. ® Marqueur sérique le plus utile au clinicien pour confirmer et suivre un SI. 8) PROFIL PROTEIQUE: y' Concept né en 1984. y' Dosage de 3 PRI ? (CRP, HPT, ORO) -3 PRI È (pré ALB, ALB, TRF) - Fraction C3, IgA, IgG, IgM. y' Orienter la recherche en cas de SI inexpliqué. y' La lecture simultanée des variations des différentes protéines permet en plus : ® De palier aux plus beaucoup de variations (âge, sexe, cinétique). ® D'apprécier les variations d'amplitudes des protéines. ® De mettre en évidence des mécanismes contradictoires. ® De retrouver une anomalie des immunoglobulines. ® D'envisager ensuite un profil plus ciblé : · Profil protéique inflammatoire : (ORO, HPT, CRP) (CRP, HPT) (CRP, ORO). · Profil protéique hémolytique: (ORO, HPT). · Profil protéique nutritionnel : (AlB, ORO, préALB, RBP). ® Expression des concentrations en % des valeurs normales pour le sexe et l'âge. ® Aucun bénéfice : le meilleur profil ne donnera jamais un diagnostic.		91
			Belaouar Hamza/Lamri Adlène



Chapitre 3: Etude de quelques syndromes

92

Figure 14,15: Profil protéique des protéines sériques inflammatoires. > Distinction infection - inflammation:

® PROCALCITONINE:

· Intéressante pour différencier les maladies inflammatoires non infectieuses des infections,

· Cinétique rapide (augmentation dès la 3^e heure).

· N'augmente pas au cours des poussées des principales affections inflammatoires, ni au cours des viroses.

· Augmente au cours des infections bactériennes, parasitaires ou fongiques sévères.

· Marqueur de gravité?

· Non pathognomonique d'infection bactérienne.

· Étude en association avec le tableau clinique et les autres anomalies biologiques.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes		93

9) DEMARCHE DIAGNOSTIQUE

> Circonstances de découverte:

® Le plus souvent, le syndrome inflammatoire est associé à une pathologie connue ou aisément identifiable;

® Parfois mis en évidence chez des sujets sans affection évolutive connue mais présentant une altération de l'état général, une fièvre;

® Parfois de découverte fortuite chez un sujet asymptomatique.

> DIAGNOSTIC POSITIF:

® Il est purement biologique.

® Un syndrome inflammatoire est défini par :

· l'élévation d'au moins 2 protéines de l'inflammation.

· ou de la vitesse de sédimentation et d'une protéine de l'inflammation. > DIAGNOSTIC ETIOLOGIQUE:

® Un syndrome inflammatoire témoigne le plus souvent d'un processus pathologique.

® La démarche diagnostique passe systématiquement par;

· l'interrogatoire.

· l'examen physique.

· et la réalisation d'un bilan paraclinique.

® En pratique, 2 situations peuvent s'observer :

· SI est associé à une pathologie connue ou aisément identifiable.

· Aucune maladie ne semble expliquer le SI.

® Deux situations sont possibles:

· soit le SI est associé à une fièvre.

· soit il est associé à une AEG.

· fièvre et AEG peuvent coexister.

Chapitre 3 : Etude de quelques syndromes	94

> Le syndrome inflammatoire est associé à une symptomatologie fébrile :

® Recherche d'une infection systématique.

® CRP.

· Supérieure à 100 mg + PPN : infection bactérienne dans 85% des cas dans les fièvres prolongées (réserve pour Horton).

· Marqueur d'efficacité des antis infectieux grâce à sa cinétique rapide.

® Affections parfois silencieuses sur le plan clinique.

® Endocardite subaiguë.

· Impose la réalisation d'hémocultures répétées.

· Échographie cardiaque (ETO ++).

> Maladies systémiques et connectivites.

® Etape difficile en raison de la richesse des étiologies possibles et de l'incertitude diagnostique liée aux formes de début ou aux formes atypiques.

® Maladies systémiques et connectivites ;

· Polyarthrite rhumatoïde (FR, Radio squelette) :

® CRP augmente > 40 mg plus sensible de l'activité que VS, haptoglobine et fibrinogène.

® CRP restant élevée : indice de progression rapide des lésions radiologiques.

® Dosage SAA ou á1-antichymotrypsine dépiste les PR en activité avec CRP normale (synovite).

· Syndrome Gougerot-Sjögren (biopsie salivaire) :

® Gammapathie polyclonale (hyper IgG) VS élevée.

® CRP normale ou basse.

® Les autres PRI varient peu.

· Maladie lupique (FAN, anti-DNA natifs) ;

® VS élevée (> 80mm/h dans 50%).

® VS négligeable => rechercher une Cryoglobulinémie. Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Chapitre 3 : Etude de quelques syndromes		95

® Gammapathie polyclonale : 75% des cas.

® Anémie inflammatoire ou hémolytique fréquente.

® Leucopénie avec lymphopénie < 1500 / ml et thrombopénie < 100 000 /ml.

® CRP normale ; si élevée rechercher une infection.

® SAA peut être élevée.

® La baisse du complément précède une poussée.

· Sclérodermie ;

® VS normale si élevée rechercher une hyper gamma globulinémie.

® CRP normale, SAA discrètement augmentée. ® Autres PRI négligeables.

· Dermatopolymyosites ;

® VS légèrement augmentée.

® CRP négligeable si élevée rechercher une infection.

® PRI négligeable et si élevées rechercher un cancer.

· Maladie de Horton et PPR ;

® VS peut dépasser 100 mais peut être normale < 20 mm dans 8,5 % des cas (le pronostic oculaire est le même).

® La CRP (et SAA) permet d'infirmer ou non la persistance d'activité de la maladie devant une VS négligeable.

· Autres Vascularités (Takayashu, PAN, Churg-Strauss) ;

® VS et PRI élevée + Gammapathie polyclonale.

® CRP corrélée à l'activité de la maladie.

® Pas de SI, si atteinte muqueuse localisée.

Chapitre 3: Etude de quelques syndromes	96

Conclusion:

® VS = marqueur classique du SI.

® CRP = meilleur marqueur /cinétique rapide.

® Recherche de la cause fonction des tableaux cliniques et biologiques. ® Principales causes : infections ++, maladies de système, cancers.

® Traitement du SI = celui de sa cause.

Partie expérimental

Matériels et Méthodes

Matériels et Méthodes

99

Il s'agit d'une étude qui concerne le fractionnement des protéines sériques de deux groupes des sujets ; malades et sains, basée sur la technique d'électrophorèse sur gel polyacrylamide.

Ce travail a été réalisé sur 04 échantillons présentant une maladie auto- immune ; Lupus (la Lupus est une maladie généralement cutanée). Et 2 témoins (des sujets sains).

Les échantillons présentant la maladie auto-immune appartiennent aux patients admis au service de médecine interne du CHU Constantine.

Ce coté expérimental du mémoire a été réalisé au laboratoire de Biochimie Génétique-Centre de biotechnologie-Université Mentouri Constantine.

Les protéines sériques extraites de ces échantillons ont été fractionnées par 3 méthodes d'électrophorèse ; PAGE, SDS-PAGE, Acide-PAGE.

1. Matériel biologique:

Après la collecte des échantillons (sang veineux) ces derniers sont
soumis à une centrifugation pendant 10 min à 10000 rotations par

minutes (rpm). Le sérum récupéré est conservé à - 20 °C.

N^° d'échantillon 1 2 3 4 5 6

Symbole marqué sur l'eppendorf 16 26 H 25 AS A

Statut Malade Malade Témoin Malade Malade témoin

Tableau 10: Les échantillons utilisés pour l'électrophorèse sur gel polyacrylamide.

2. Méthode d'étude:

2-1 L'électrophorèse:

C'est un procédé biochimique qui permet le fractionnement des molécules biologiques (protéines, acides nucléiques) par le passage du courant électrique sur support poreux en fonction de leur charge nette ou de leur poids moléculaire.

La vitesse de migration dépend non seulement de la charge des protéines, de leur taille et de leur forme mais aussi des conditions expérimentales de tels que le pH, la composition des solutions et le support électrophorétique.

La révélation se fait après coloration des protéines avec du bleu d'Aniline ou du bleu de Coomassie en présence d'un fixateur acide le TCA (acide trichloracétique) ou par la coloration d'un composé chimique associé à la protéine comme dans

Matériels et Méthodes

100

le cas des glycoprotéines (réaction de SHIFF) et des lipoprotéines (réaction au noir de sodium) ou, dans le cas des enzymes, avec leur substrat en présence du coenzyme.

Le dispositif d'électrophorèse est constitué d'un gel dans lequel sont déposés des échantillons et dont deux extrémités opposées sont en contacte avec une solution tampon dans laquelle baignent les électrodes. On distingue différents types d'électrophorèse ; en milieu acide (Acide-PAGE), l'électrophorèse en présence du Sodium-Dodecyl-Sulfate (SDS-PAGE), l'isoélectrofocalisation...

4La technique SDS-PAGE:

Cette technique a été mise au point par LAEMMLI (1970) où la séparation des molécules se fait en milieu basique à pH=8.8 en présence d'un détergent, le Sodium-Dodecyl-Sulfate qui masque la charge des protéines par sa propre charge négative et permet donc de faire migrer les protéines selon leurs poids moléculaires et leurs conformations uniquement.

2-2 Caractérisation des protéines sériques:

2-2-1 Extraction des protéines sériques:

Elle a été réalisée à partir du sérum des patients malades (lupus) obtenu après centrifugation et recueilli dans des eppendorfs de 1.5 ml.

En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de la solution stock à base de SDS à 10% (voir annexe) et d'un réducteur de Dithiothréitol (DTT) à 1% pour extraire et réduire nos protéines.

En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé puis incubé à 60°C pendant 30min.

2-2-2 Réalisation de l'électrophorèse:

Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle en présence du SodiumDodécyl-Sulfate sur gel polyacrylamide (SDS-PAGE) selon la méthode de LAEMMLI (1970) modifiée par SINH et al. (1991) et par AMIOUR et al. (2002).

a. Préparation des gels:

Dans la méthode de séparation par SDS-PAGE nous devons préparer deux types de gels : Un gel de séparation qui permet de fractionner les différentes protéines et les sous-unités protéiques selon leurs poids moléculaires et un gel de concentration permettant de retenir les impuretés et de tasser les protéines.

Matériels et Méthodes

101

Avant de préparer les gels on doit procéder au montage des plaques, après les avoir nettoyées à l'éthanol. On les place l'une contre l'autre en les séparant avec deux éspaceurs dont la largeur est choisie, (voire annexe 2).

? Le gel de séparation (running gel):

Le gel est à T=12.8% et C=0.97%.Ces dimensions sont de 180x160x1.5 mm. Il est constitué d'acrylamide à 35% (p/v), de N-N'-Méthylen-Bisacrylamide à 2% (p/v), de Tris HCL à pH=8.8, de SDS à 10% (p/v) et d'eau distillée. La réaction de polyacrylamide est catalysée par l'ammonium persulfate (APS) à 1% (p/v) et le TEMED. Une fois tous les constituants mélangés (les catalyseurs sont ajoutés en dernier lieu), il est coulé entre les plaques (montées auparavant) doucement pour ne pas faire de bulles jusqu'à un niveau délimité sur la plaque pour laisser la place au gel de concentration (à 4 cm de l'encoche). Ensuite, on coule une fine couche de butanol pour égaliser la surface du gel et pour éviter son contact avec l'air (pour faciliter la polymérisation). Au bout de 30 à 45 minutes le gel prend, on se débarrasse du butanol et on rince à l'eau distillée.

? Le gel de concentration (stacking gel):

Le gel est à T=2.8% et C=1.4%. Il a les dimensions de 180x40x1.5 mm.

Il est constitué de la même façon que le gel de séparation avec une seule différence au niveau du Tris HCL qui a un pH de 6.8.Le gel est coulé sur le gel de séparation, les peignes sont posés bien centrés entre les plaques et sans faire de bulles. Le gel prend après 45 à 60 minutes, les peignes sont retirés soigneusement pour ne pas casser les puits. Enfin, on verse du tampon dans les puits est on fait les dépôts.

b. Le tampon d'électrophorèse:

Le tampon de migration est constitué de glycine à 1.41% (p/v), de Tris à 0.3% (p/v) et de SDS à 0.1% (p/v), (voir annexe 1).

c. La migration:

Après le dépôt des différents échantillons ; la cuve d'électrophorèse (bac inférieur) est remplie à un niveau suffisant avec le tampon d'électrophorèse.

Ensuite, le bac supérieur situé entre les deux plaques (bien serré contre les joints pour éviter les fuites) est rempli lui aussi avec le même tampon jusqu'à ce que les faces supérieures des gels soient immergées. Ensuite, ce dernier est placé dans la cuve d'électrophorèse pour que les faces inférieures des gels plongent dans le tampon. Enfin, la cuve est fermée et est reliée à un générateur

102

Matériels et Méthodes

qui va assurer le passage du courant électrique. La migration est menée à une intensité constante de 40mA/gel.

d. Fixation et coloration:

Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau.

4La technique PAGE:

Dans cette technique, la séparation des molécules se fait en milieu basique à pH=8.8 en absence d'un détergent, le Sodium-Dodecyl-Sulfate. Donc la migration des protéines se fait selon leurs poids moléculaires, leurs conformations et leur charge électriques.

2-3 Caractérisation des protéines sériques:

2-3-1 Extraction des protéines sériques:

Elle a été réalisée à partir des mêmes échantillons utilisés dans la technique SDS-PAGE.

En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de l'urée, le glycérol, triton x100 et d'un réducteur de Dithiothréitol (DTT) à 1% pour extraire et réduire nos protéines.

En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé puis incubé à 60°C pendant 30min.

2-3-2 Réalisation de l'électrophorèse:

Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle, cette méthode de séparation, par rapport à la méthode SDS-PAGE est une méthode non dénaturante en raison de l'absence de Sodium-Dodécyl-Sulfate (SDS).

a. Préparation des gels:

Dans la méthode de séparation par PAGE nous devons aussi préparer deux types de gels : Un gel de séparation et un gel de concentration ressemblant à celle la méthode SDS-PAGE, mais dans cette méthode on élimine le SDS dans les deux gels (voir annexe 3).

Matériels et Méthodes

103

Avant de préparer les gels on doit procéder au montage des plaques, après les avoir nettoyées à l'éthanol. On les place l'une contre l'autre en les séparant avec deux éspaceurs dont la largeur est choisie.

b. Le tampon d'électrophorèse:

Le tampon de migration est constitué de glycine à 1.41% (p/v), de Tris à 0.3% (p/v).

c. La migration:

Après le dépôt des différents échantillons ; la cuve d'électrophorèse (bac inférieur) est remplie à un niveau suffisant avec le tampon d'électrophorèse.

Ensuite, le bac supérieur situé entre les deux plaques (bien serré contre les joints pour éviter les fuites) est rempli lui aussi avec le même tampon jusqu'à ce que les faces supérieures des gels soient immergées. Ensuite, ce dernier est placé dans la cuve d'électrophorèse pour que les faces inférieures des gels plongent dans le tampon. Enfin, la cuve est fermée et est reliée à un générateur qui va assurer le passage du courant électrique. La migration est menée à une intensité constante de 80mA/gel.

d. Fixation et coloration:

Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau.

4La technique Acide-PAGE:

La séparation des molécules se fait en milieu acide à pH=3.2 en présence de l'acide ascorbique, ce dernier accélère la réaction entre l'acrylamide et bis acrylamide, donc une polymérisation rapide.

2-4 Caractérisation des protéines sériques: 2-4-1 Extraction des protéines sériques:

Toujours réalisée à partir du même sérum des patients malades (lupus) obtenu après centrifugation et recueilli dans des eppendorfs de 1.5 ml.

En premier lieu, on rajoute aux sérums 100ul de la solution d'extraction composée de la N N' méthyle Formamid, saccharose (voir annexe 4).

Matériels et Méthodes

104

En second lieu, le contenu de chaque tube est vortexé. 2-4-2 Réalisation de l'électrophorèse:

Il s'agit d'une électrophorèse monodimensionnelle, en présence de l'acide ascorbique.

a. Préparation des gels:

Dans la méthode de séparation par Acide-PAGE nous devons préparer un seul type de gel:

Avant de préparer les gels on doit procéder au montage des plaques, après les avoir nettoyées à l'éthanol. On les place l'une contre l'autre en les séparant avec deux éspaceurs dont la largeur est choisie.

Le gel est constitué d'acrylamide à 35% (p/v), de N-N'-Méthylen-Bisacrylamide à 2% (p/v), d'acide ascorbique à pH=3.2, de Lactate d'Aluminium et d'eau distillée. La réaction de polyacrylamide est catalysée par le sulfate ferreux et l'eau oxygénée (H₂O₂). Une fois tous les constituants mélangés (les catalyseurs sont ajoutés en dernier lieu), il est coulé entre les plaques (montées auparavant) doucement pour ne pas faire de bulles. Ensuite, les peignes sont posés bien centrés entre les plaques et sans faire de bulles. Le gel prend après 45 à 60 minutes, les peignes sont retirés soigneusement pour ne pas casser les puits. Enfin, on verse du tampon dans les puits est on fait les dépôts.

b. Le tampon d'électrophorèse:

Le tampon de migration est constitué de glycine à 1.41% (p/v), de Tris à 0.3% (p/v).

c. La migration:

Après le dépôt des différents échantillons ; la cuve d'électrophorèse (bac inférieur) est remplie à un niveau suffisant avec le tampon d'électrophorèse.

Ensuite, le bac supérieur situé entre les deux plaques (bien serré contre les joints pour éviter les fuites) est rempli lui aussi avec le même tampon jusqu'à ce que les faces supérieures des gels soient immergées. Ensuite, ce dernier est placé dans la cuve d'électrophorèse pour que les faces inférieures des gels plongent dans le tampon. Enfin, la cuve est fermée et est reliée à un générateur qui va assurer le passage du courant électrique. La migration est menée à une intensité de 400mA/gel et d'un voltage de 505v/gel.

La migration est achevée en 1heur 45 minutes.

Matériels et Méthodes

105

d. Fixation et coloration:

Après la sortie du front de migration (coloré en bleu), la migration est arrêtée. Les gels sont démoulés et récupérés dans des bacs en plastique puis recouverts avec une solution de coloration est constituée d'un fixateur des protéines, le TCA (acide trichloracétique) à 60% et d'un colorant, le bleu de Coomassie R250. Les gels doivent être maintenus en agitation pendant 24 heures pour éviter le dépôt du colorant. Après ils sont décolorés dans de l'eau.

Résultats et Discussion



«PAGE» « SDS-PAGE» «Acide PAGE»

Résultats et Discussion

107

Après la réalisation de différentes techniques électrophorétique (Acide PAGE, PAGE 8.8, SDS-PAGE) pour le fractionnement des protéines sériques de 6 échantillons dont 4 ayant une maladie auto-immune (LUPUS) et 2 témoins ; les résultats obtenus montrent que la séparation au gel de polyacrylamide est satisfaisante par rapport au gel Acétate cellulose.



«Gel de polyacrylamide» «Gel d'Acétate cellulose»

Figure 16 : comparaison entre le résultat de fractionnement sur gel d'acétate cellulose et sur gel de
polyacrylamide.

D'après les figures ci-dessus on peut facilement constate une différence dans la séparation entre les deux gels qui réside dans le nombre des bandes protéiques et la qualité de celles-ci.

En plus une nette différence a été observée dans la séparation protéique sur gel de polyacrylamide lui-même en allant d'Acide PAGE, PAGE 8.8, SDS-PAGE qui est présent dans la localisation, l'intensité et la qualité des bandes. (Voir figures ci-dessous).

Figure 17: Comparaison entre les résultats de fractionnement sur gel Acide PAGE, SDS-PAGE, PAGE.



Bande claire : taux de protéine réduit.

Bande foncé : taux de protéine élevé.

Les deux bandes identiques : même

taux de protéine.

Figure 18: variation des bandes protéiques; malade-malade.

Taux élevé de cette protéine chez le malade.

Taux réduit de la même protéine chez le témoin.

Même taux de cette protéine chez le malade et le témoin.

Résultats et Discussion

108

Quant aux profils protéiques, on peut dire qu'il existe une variation entre les bandes protéiques des patients malades entre eux d'une part et entre les patients malades et les témoins d'autre part (voir figures ci-dessous).

Figure 19: variation des bandes protéiques; malades-témoins.

Résultats et Discussion

109

Cette variation est due à l'élevation du taux des protéines sériques qui caractérisent la maladie du lupus plus particulièrement les protéines du fractionnement ã par rapport aux témoins (gens non malades) et qui sont traduit par l'intensité et/ou l'absence de la bande protéique ã (voir figure ci- dessous).



26 H 25 A

Figure 20: comparaison entre deux profils; malade-témoin.

Aussi une différence a été observée entre les malades eux même et qui peut être probablement due à la différence de ; l'âge, le stade de la maladie et/ou la pathologie elle-même (voir figure ci-dessous).



Figure 21: comparaison entre les profils des malades.

De même les profils protéiques des témoins présent aussi des faibles variations qui sont probablement en relation avec ; l'âge et l'état physiologique de la

personne (voir figure).

Figure 22: comparaison entre les profils des témoins.

Belaouar Hamza/Lamri Adlène

25 AS

16 26

Résultats et Discussion

110

H A

Résultats et Discussion

111

Cela implique que l'électrophorèse est un bon moyen qui permet la séparation des protéines sériques et de détecté les différences entre celle-ci

qualitativement et quantitativement.

Conclusion

113

Notre travail a été divisé en deux parties;

Une partie bibliographique portant d'une part sur des généralités sur les protéines sériques voir l'hétérogénéité structurale, fonctionnelle et sur l'échelle de concentration ; aussi sur les valeurs sémiologiques de ces protéines dans le sang qui varient selon l'état physiologique et pathologique.

D'autre part, sur l'étude descriptive des principales protéines sériques et de quelques syndromes.

La partie expérimentale nous a permis de conclure que la séparation des protéines sur gel de polyacrylamide donne une meilleure résolution par rapport au gel acétate de cellulose quantitativement et qualitativement.

Aussi, elle permet de visualiser le profil général des protéines et ainsi elle permet d'orienter le diagnostic et de déceler les maladies liées à ces protéines qu'il conviendra d'explorer par la suite.

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Annexes		119
Annexe 1: Solutions utilisées pour la SDS-PAGE Solution mère d'acrylamide à 35% (à prépare avec gants et masque): Acrylamide 35 g Eau distillée 100 ml Solution mère de bis acrylamide à 2% (à préparer avec gants et masque): Bis acrylamide 2 g Eau distillé 100 ml Solution stock de SDS à 10%: Sodium Dodécyl Sulfate 10 g Eau distillée 100 ml Solution d'APS (Ammonium Persulfate) à 1%: A préparer ex temporairement APS 0.1 g Eau distillée 10 ml Tampon Tris HCL pH 8.8 (à préparer sous la hotte, avec gants et masque): Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 60.57 g Eau distillée QSP 400 ml Ajuster à pH 8.8 avec du HCL fumant 8 à 10 ml Eau distillée QSP 500 ml Tampon Tris HCL pH 6.8 (à préparer sous la hotte, avec gants et masque): Tris (hydroxyméthyl aminomethan 30.285 g Eau distillée QSP 200 ml Ajuster à pH 8.8 avec du HCL fumant 19.5 ml Eau distillée QSP 250 ml
Belaouar Hamza/Lamri Adlène
Annexes	120

Tampon d'électrophorèse:

Glycine 70.55 g

Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 15 g

SDS 5 g

Eau distillée QSP 5000 ml
Solution de coloration (pour deux gels):

Acide trichloracétique (TCA) 60 % 100 ml

Solution mère de Bleu de Coomassie R250 25 ml

Eau distillée QSP 500 ml

Solution mère de Bleu de Coomassie R250:

Bleu de Coomassie R250 10 g

Ethanol 95° QSP 1000 ml

L'éthanol doit être mis en agitation dans l'éprouvette, avec un barreau aimanté.

Le bleu de Coomassie est ensuite ajouté (sinon le bleu prend en masse au fond du contenant).Laisser en agitation au moins deux heurs, puis filtrer la solution.

Annexes

121

Annexe 2:

Préparation des gels
(Quantités pour une cuve de deux gels)

Gel de séparation (running gel):

Acrylamide à 35% 35 ml

Bis acrylamide à 2 % 6 ml

Eau distillée 16.6 ml

Tris-HCL pH 8.8 37.6 ml

SDS à 10 % 1 ml

APS à 1% 2.5 ml

TEMED 50 ul

Gel de concentration (stacking-gel):

Acrylamide à 35 % 3.42 ml

Bis acrylamide à 2 % 0.86 ml

Eau distillée 30.4 ml

Tris-HCL pH 6.8 5 ml

SDS à 10 % 0.4 ml

APS à 1 % 2 ml

TEMED 40 ul

Annexes	122
Annexe 3: Solutions utilisées pour la PAGE Solution mère d'acrylamide à 35% (à prépare avec gants et masque): Acrylamide 35 g Eau distillée 100 ml Solution mère de bis acrylamide à 2% (à préparer avec gants et masque): Bis acrylamide 2 g Eau distillé 100 ml Solution d'APS (Ammonium Persulfate) à 1%: A préparer ex temporairement APS 0.1 g Eau distillée 10 ml Tampon Tris HCL pH 8.8 (à préparer sous la hotte, avec gants et masque): Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 60.57 g Eau distillée QSP 400 ml Ajuster à pH 8.8 avec du HCL fumant 8 à 10 ml Eau distillée QSP 500 ml Tampon Tris HCL pH 6.8 (à préparer sous la hotte, avec gants et masque): Tris (hydroxyméthyl aminomethan 30.285 g Eau distillée QSP 200 ml Ajuster à pH 8.8 avec du HCL fumant 19.5 ml Eau distillée QSP 250 ml Tampon d'électrophorèse: Glycine 70.55 g Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 15 g Eau distillée QSP 5000 ml
Belaouar Hamza/Lamri Adlène

Annexe 4:

Solutions utilisées pour l'Acide-PAGE

Préparation du gel (à prépare avec gants et masque):

Acrylamide 12 ml

Bis acrylamide 12 ml

Tampon lactate d'aluminium 1.6 ml

Eau distillé 57.5 ml

Accélérateur:

Acide Ascorbique 80 ul

Sulfate ferreux 08 ul

Catalyseur:

Eau oxygénée 0.73 ml

Tampon d'électrophorèse:

Glycine 70.55 g

Tris (hydroxyméthyl aminomethan) 15 g

Eau distillée QSP 5000 ml
Solution de coloration:

Acide trichloracétique (TCA) 60 % 30 g

Solution mère de Bleu de Coomassie R250 12.5 ml

Eau distillée QSP 250 ml

Solution mère de Bleu de Coomassie R250:

Bleu de Coomassie R250 10 g

Ethanol 95° QSP 1000 ml

Annexes

124

L'éthanol doit être mis en agitation dans l'éprouvette, avec un barreau aimanté. Le bleu de Coomassie est ensuite ajouté (sinon le bleu prend en masse au fond du contenant).Laisser en agitation au moins deux heurs, puis filtrer la solution.

Les solutions d'extraction pour les 3 méthodes:

Méthode d'électrophorèse Solution d'extraction

PAGE -2.4g urée.

-0.100256g de DTT. -2ml Glycérol.

-0.005% Triton x100

SDS-PAGE -2.125 ml solution Stock*

-0.05g de DTT.

-QSP (5ml) H₂O pure.

Acide-PAGE -1.96 ml NN'de méthyle Formamid.

-2g Saccharose.

-QSP (10ml) eau distillé.

Annexe 5:

La maladie LUPUS

Qu'est-ce que le lupus systémique (LS) ?

Le lupus systémique (LS) ou lupus érythémateux aigu disséminé (LEAD) est une maladie inflammatoire au long cours (chronique) pouvant affecter de nombreux organes et notamment la peau, les reins, les articulations, les poumons et le système nerveux. Les manifestations de cette maladie sont extrêmement variées.

Le terme « systémique » signifie que la maladie atteint plusieurs organes. Le mot « lupus » (loup en latin) fait référence à l'aspect caractéristique, en forme de masque, de l'atteinte du visage. Enfin, « érythémateux » (rouge en grec) traduit la couleur rouge de l'éruption cutanée.

Lorsque le lupus ne se manifeste qu'au niveau de la peau, on parle de lupus érythémateux cutané.

Qui peut en être atteint ?

Le lupus se rencontre surtout chez les femmes en âge d'avoir des enfants, c'està-dire entre 15 et 45 ans. Il peut aussi toucher l'homme (10 fois moins souvent que la femme) et les enfants.

Est-il présent partout dans le monde ?

Le lupus est présent partout dans le monde, mais il apparaît que certaines ethnies sont plus touchées, comme les populations noires (et notamment les Antillais et Afro-américains et asiatiques.

A quoi est-il dû ?

Le LS est une maladie auto-immune, ce qui signifie que les défenses immunitaires, qui normalement ne s'attaquent qu'aux éléments « extérieurs » (bactéries, virus...), se retournent contre les cellules mêmes de l'organisme et l'attaquent. L'organisme produit des anticorps (molécules de défense) nocifs, appelés auto-anticorps, qui entraînent l'autodestruction de certains tissus (articulations, peau, reins, etc.) et occasionnent d'importantes réactions inflammatoires. On ne sait pas encore pour quelle raison les défenses immunitaires se dérèglent, mais plusieurs facteurs (environnementaux, hormonaux et génétiques) sont probablement en cause.

Comme le lupus touche souvent les femmes en âge de procréer, il pourrait y avoir un lien entre le lupus et les hormones féminines. En outre, les chercheurs pensent que des facteurs génétiques entrent en jeu. Certaines personnes ont probablement une prédisposition génétique, c'est-à-dire qu'elles ont des gènes qui les rendent plus susceptibles de déclencher la maladie.

Dans certains cas, une infection virale, le stress, une exposition au soleil ou encore une grossesse (à cause des changements hormonaux qu'elle provoque)

Annexes

126

peuvent déclencher le lupus, ou plutôt le « réveiller » par un mécanisme qu'on ignore encore.

Enfin, certains médicaments utilisés pour traiter d'autres maladies (Dpénicillamine, chlorpromazine, certains anticonvulsivants, â-bloqueurs, minocycline) peuvent déclencher les symptômes du lupus : on parle alors de lupus « induit ». Ce lupus peut disparaître à l'arrêt du traitement.

Est-il contagieux ?

Non, le LS n'est pas contagieux.

Belaouar Hamza. Lamri Adlène.	Date d'exposition: 21 / 06 / 2009
Titre : Fractionnement des protéines sériques par électrophorèse sur gel polyacrylamide. Diplôme: DES en biologie.
Résumé: Les protéines sériques présentent une hétérogénéité structurale, fonctionnelle, sur l'échelle de concentration et sur les valeurs sémiologiques dont les variations pathologiques peuvent êtres détectables par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Le fractionnement des protéines sériques par électrophorèse sur gel acétate cellulose donne 5 groupes présentant les principales fractions et qui sont ; d'abord le Sérum albumine ; elle représente 60% des protéines du sérum, le Sérum globulines ; dans ce groupe hétérogène, on rencontre des protéines d'activité biologique très variée : Transporteur de métaux, hormones, anticorps et enzymes. Il y a la globuline a ; l'électrophorèse permet la distinction entre globuline a-1 qui représente 4% des protéines sériques et globuline a-2 qui représente 7% des protéines sériques, la globuline l; groupe hétérogène représentant 12% des protéines sériques et la globulines y ou immunoglobulines : ce groupe le moins mobile à l'électrophorèse, représentent environ 17% des protéines sériques, revêt une homogénéité structurale remarquable, une diversité exceptionnelle par le nombre quasi infini d'individualités protéiques qu'on peut y rencontrer., quant a la séparation sur gel de polyacrylamide les bandes protéiques sont beaucoup plus nombreuses avec meilleur qualité. Les anomalies de la protéinémie (taux des protéines dans le sang) peuvent illustrer l'existence des syndromes suspects indiqués par la différence qui existe entre les diagrammes protéiques des patients malades et des sains. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide est une bonne technique pour le fractionnement des protéines par rapport d'autres techniques comme la séparation sur gel d'Acétate cellulose. Mots clés : protéines sériques, électrophorèse, protéinémie, polyacrylamide, acétate cellulose.
Laboratoire de biochimie génétique-centre de biotechnologie-Département de biologie Animale. Faculté des sciences de la nature et de la vie. Université Mentouri Constantine.
Encadreur: Mr. Douadi Khelifi Professeur. Université Mentouri Constantine.