Rapport de stage dans un secteur médical

L'hygiène est le point le plus important de la santé humaine.

En effet, un manque dans la qualité alimentaire (un produit toxique ou une eau mal traitée), ou un manque d'asepsie peuvent entraîner plusieurs maladies pour l'être humain : infections, intoxications...

On trouve dans la plupart des cas que la cause des maladies est microbiologique en particulier bactériologique. Avant de prescrire le remède généralement des antibiotiques, le médecin exige une série d'analyses qui permettent d'identifier les différentes bactéries.

Les effets énumérés ci-dessus m'ont intéressé á tel point que j'ai choisi le coté médical de la microbiologie.

Un stage de 15 jours (17/06-02/07/2008) m'a permis de voir de plus près quelques analyses microbiologiques et même biochimiques.

Mon stage a eu lieu dans la polyclinique BOUMEDIENE KHEIRA à SIG.

La polyclinique BOUMEDIENE KHEIRA SIG est l'annexe du centre hospitalier SIG, dont la mise en service remonte á Septembre 2006.

D'une façon générale, la polyclinique reçoit chaque jour plus de 100 patients environ, un service d'accueil enregistre leurs renseignements.

Les services disponibles dans la polyclinique sont :

* Médecine :

- médecine générale

- Spécialités :

Pédiatrie - ophtalmologie - gastrologie - dermatologie - ORL - hématologie - chirurgie dentaire.

* La radiologie

* Les analyses : on trouve

- une salle de prélèvements

- un laboratoire d'analyses biochimiques

- un laboratoire d'hygiène.

Laboratoire d'hygiène

Le personnel du laboratoire est au nombre de 2.

Le laboratoire d'hygiène est muni d'une paillasse avec un évier, dont le matériel disponible est :

Appareils :

Bec Benzun : pour assurer une stérilisation instantanée.

Centrifugeuse : pour séparer les composants des ech

Bain marie : pour la transfusion des milieux de culture

Four Pasteur : stérilisation de la verrerie du laboratoire á sec

Autoclave : stérilisation á la vapeur

Incubateur : pour la culture des bactéries

Réfrigérateur : conservation des souches et des réactifs

Microscope optique : permet l'observation (état frais, coloration de Gram).

Spectrophotomètre : pour les prises du D.O.

Verrerie :

Tout genre de pipettes (20cc, 10cc, 5cc, 2cc, 1cc) utilisées pour l'inoculation

Pipettes Pasteur pour l'inoculation et l'ensemencement

Micropipettes pour une prise très précise

Becher á différents volumes

Verre á pied (200cc, 60cc)

Lames et lamelles utilisées pour l'observation microscopique

Tubes à essai

Autres matériels :

Boites de Pétri pour les cultures bactériennes

Tubes à hémolyse

Anse de platine utilisée en ensemencement

Porteoirs

Poires pour aspirer les solutions

Milieux de culture :

a- Solides :

CPS : pour la culture et l'isolement des germes urinaires (ex : E.coli)

Sabouraud+chloramphénicol : isolement sélectif des levures et moisissures

Gélose Salmonella Shigella SS : isolement sélectif des Salmonelles et des Shigelles á partir des selles (mise en évidence des colonies lac et H2S -/+)

Hektoen : isolement des Entérobactéries pathogènes

Chapman : mise en évidence des colonies mannitol+ (jaunes), sélectif pour Staphylococcus aureus

Muller-Hinton : étude de la sensibilité aux ATB par la méthode de diffusion

BGA : isolement des Salmonelles

TGEA : dénombrement des germes totaux

GNAB : isolement sélectif des Vibrio

VF : mise en évidence des CSR

b- Liquides :

EPA : enrichissement des Vibrio

SFB : enrichissement des Salmonelles

BCPL : dénombrement des C.T

Schubert : mise en évidence des C.F (E.coli)

Rothe : présomption des Streptocoques fécaux

EVA Litsky : confirmation des S.F.

Milieux d'identification :

Kligler Hajna : recherche des caractères LDC, gaz, lac, glucose, H2S.

Urée indole : mise en évidence de l'enzyme uréase et l'indole

Urée tryptophane : recherche de tryptophane désaminase

Moeller : mise en évidence de la décarboxylase (LDC)

Citrate de Simmons : pour voir si la bactérie utilise le citrate comme seule source de carbone

Plasma du lapin : la recherche de la coagulase.

TSI : étude de fermentation des 3 sucre :saccharose, lactose, glucose

Réactifs utilisés :

Réactifs pour coloration de Gram (violet de gentiane, lugol, alcool,

fushine).

H202 : pour le test de catalase

Réactif de KOWACS

Autres :

Les bandelettes urinaires

Les disques d'oxydase

Les disques d'antibiotiques

* Pour les dilutions : eau physiologique, eau distillée.

ECBU (Examen CytoBacteriologique des Urines)

L'examen le plus fréquent demandé au laboratoire de bactériologie.

C'est la clé pour affirmer le diagnostic d'une infection urinaire

Cet examen repose essentiellement sur deux paramètres : la leucocyturie et la bactériurie. Il dure de 1 à 3 jours avec un test d'antibiogramme.

But d'examen :

· affirmer ou infirmer une infection urinaire.

· La recherche du germe et son étude afin de donner un traitement

· Recherche des éléments du sang (hématurie).

ECBU Déroulement :

1- Prélèvement des urines :

a- Chez l'adulte et le grand enfant : après une désinfection très soigneuse du méat urinaire, on recueille les urines du matin (de préférence), en éliminant la première partie de miction puis on met le milieu du jet dans un flacon stérile.

b- Chez le petit enfant : on applique une poche collectrice, qui ne doit pas être laissée en place au delà de 30 minutes.

c- Le porteur de sonde : on ponctionne la tubulure, après une désinfection.

2- Choix du récipient ou flacon :

Le flacon doit être en plastique ou en verre, à vis qui doit être hermétiquement fermé. Ce flacon est fournis par le laboratoire.

Il faut identifier ce flacon par une étiquette contenant le nom du Patient et par la date et l'heure du prélèvement.

3- Technique :

Premier jour :

Examen macroscopique :

- aspect: limpide, trouble.

- couleur: jaune, ambrée, hématique.

- présence de sédiment: blanchâtre (phosphates), rouge brique (acide urique)

Chimie des urines :

Nous avons utilisé la bandelette URS-5K (Urine Reagent Strips for urinalysis)

Les bandelettes urinaires permettent d'établir une étude chimique des urines c.-à-d. une analyse simple et rapide de différents paramètres urinaires. Généralement, on détermine 5 paramètres (hématurie, cétonurie, glucosurie, protéinurie et le pH).

Les bandelettes sont toujours conservées dans leur emballage bien bouché, dans un endroit sec et frais.

Utilisation de la bandelette :

· D'abord j'agite les urines (homogénéisation).

· Sortir la bandelette de son étui sans toucher les zones réactives.

· Plonger la bandelette dans le récipient d'urine et la retirer immédiatement

· J'élimine l'excès d'urine sur la bandelette.

· J'attends le temps préconisé sur l'emballage.

· Je note les paramètres en suivant l'échelle colorimétrique 

· Jeter la bandelette dans la poubelle.

Hématurie (blood) :60 secondes

Cétonurie (ketone) :40S

Glucosurie (glucose):30S

Proteinurie (protein):60S

pH : 60S

Examen microscopique : Cytologie

* Un état frais : une goutte d'urine non diluée entre une lame et lamelle, sur microscope et on note la présence de :

. Bactérie(s): morphologie, mobilité, nombre relatif

. Levures

. Les éléments du sang :

- les leucocytes : en notant leur nombre

- les cylindres : sont des modules protéiques des tubules rénaux

C.hématiques	C.leucocytaires	C.épitheliaux	C.graisseux

- les cristaux : les substances chimiques non solubles des urines forment les cristaux.

forme enveloppe	Forme arachide	Acide urique (formes : carrés. Losanges, cubiques)
Oxalate de calcium

· Concernant la numération des leucocytes, on utilise les cellules de Malassez ou de Kova.

Mais dans le laboratoire ou j'ai passé mon stage, on y procède à une numération semi quantitative

* Rare.......................................+/-

* Peu nombreux..........................++

* Nombreux.................................+++

* Très nombreux...........................+++++

* le frottis (coloration de Gram) : son réalisation nous indique á noter la présence des espèces morphologiquement différentes ainsi leur Gram.

Mise en culture :

A l'aide d'une pipette Pasteur stérile ou une anse de platine, on ensemence 10 ul d'urine pure non diluée sur une boite de gélose CPS ou CLED, puis on incube à 37°C pendant 24heures.

Deuxième jour :

Numération des bactéries :

On apprécie le nombre de colonies (UFC : Unité Formant Colonie) sur la boite et le comparer par rapport aux normes.

 

  Identification des bactéries :

Après incubation de la boite CPS ensemencée par les urines, il y aura des colonies suspectes, donc nous identifierons chacune de ces colonies en appliquant des tests biochimiques ou en utilisant les galeries Api, avec une incubation á 37°C/24h

Les colonies caractéristiques sur milieu CPS :

E. coli? colonies roses.

Staphylococcus saprophyticus? colonies blanches

Exemple de galerie Api20E, appliquée sur Escherichia coli

L'antibiogramme :

Permet de tester la sensibilité d'une souche bactérienne vis-à-vis d'un ou plusieurs antibiotiques

Le principe consiste à déterminer l'effet de ou des ATB sur le développement et la survie des souches. Il existe trois possibilités d'interprétation selon le diamètre du cercle qui entoure le disque d'antibiotique : bactérie sensible, intermédiaire ou résistante.

Réalisation :

- Préparer une suspension à partir d'une souche pure.

- couler le milieu Muller-Hinton sur la boite de Pétri.

- laisser sécher le milieu

- déposer 1ml de suspension sur la gélose

- étaler ce volume á l'aide d'un râteau stérile du centre vers les bords.

- Laisser sécher 2-3mn, puis poser les disques d'ATB.

- Incuber á 37°C pendant 24h.

Troisième jour :

Lecture des tests biochimiques et identification des germes.

Lecture des résultats de l'antibiogramme et interprétation.

Exemple d'un antibiogramme.

4- Résultats possibles:

Le dénombrement :

* résultats normaux :

Leucocytes : <10000/ml

Bactéries : < 1000 germes/ml

* pathologie :

Leucocyturie et bactériurie =10 /ml? infection urinaire confirmée

-En cas de présence de plusieurs germes, ainsi une discordance entre le nombre des leucocytes et celui des bactéries, il est préférable de refaire l'ECBU.

-Les germes les plus fréquemment rencontrés dans une infection urinaire sont : Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterococcus fecalis, Pseudomonas aerogenosa.

L'antibiogramme :

 

Mesurer les diamètres des zones d'inhibition de croissance de la souche microbienne.

- la bactérie est sensible à ATB quand la CMI est inférieure à la concentration critique inférieure (dose minimale d'ATB qu'un malade peut recevoir sans dangers et qui fait effet sur la souche bactérienne). ceci signifie qu'il suffit d'une faible concentration d'antibiotique pour tuer les bactéries .

- la bactérie est résistante à l'antibiotique quand la CMI est supérieure à la concentration critique supérieure (dose maximale d'antibiotique qu'un malade peut recevoir sans dangers et qui fait effet sur la souche bactérienne.).la dose nécessaire pour tuer les bactéries est bien trop élevée pour être supportée chez l'homme sans effets secondaires importants. Cet antibiotique ne peut pas être utilisé pour traiter une infection.

- la bactérie est intermédiaire à l'antibiotique quand la CMI est comprise entre les deux concentrations critiques. Il ne faut pas utiliser cet antibiotique.

 

 

 

Coproculture (Examen des selles)

Le tube digestif de l'être humain contient une importante flore microbienne commensale, bien que dans certains cas, il y ait la présence d'autres bactéries réputées par leur pouvoir pathogène.

Donc, la coproculture est la mise en culture des selles,

Cet examen est demandé en cas de diarrhée, il peut aussi être réalisé dans un bilan d'une intoxication alimentaire.

Le délai d'exécution est de 1 à 3 jours avec un test d'antibiogramme.

But d'examen :

· Rechercher et isoler les bactéries responsables de diarrhées.

· Identifier ces bactéries en donnant l'antibiogramme.

La démarche diagnostique:

1- Prélèvement des selles :

a- Chez l'adulte et l'enfant : un peu de selles suffit dans un flacon hermétique.

b- Chez le nourrisson : un écouvillonnage réctal suffit.

- Un échantillon muco-purulent ou sanglant est choisi lorsqu'il en existe.

- le choix du flacon idem que l'ECBU

2- Technique :

Premier jour :

Examen macroscopique :

Il est important de noter l'aspect macroscopique des selles, car il nous aidera à choisir les milieux de culture.

Les selles peuvent être liquides, molles ou solides.

Elles peuvent être aussi hémorragiques.

Examen microscopique :

Si les selles sont solides ou molles, nous devons préparer une suspension

L'état frais permet d'observer la morphologie des bactéries, leur mobilité ainsi de déceler la présence des leucocytes et d'hématies. Il est possible de révéler des parasites.

L'examen des selles après coloration permet d'étudier l'équilibre de la flore (concernant le Gram, la morphologie).

Si les selles sont liquides, l'examen microscopique est important pour orienter les cultures :

· la présence des leucocytes montre que la diarrhée est á germes invasifs (provoquent la lésion des tissus), les germes caractéristiques sont : Salmonella sp, Shigella sp, Campylobacter sp.

· En cas d'absence des leucocytes, la diarrhée est á germes enterotoxigéniques, les germes caractérisant ce cas sont : Vibrio cholerae, Aeromonas sp.

* L'état frais montre que Campylobacter se présente comme une bactérie très mobile, mais dans le laboratoire, les laborantins n'identifient plus ce germe.

Mise en culture :

Les germes recherchés systématiquement :

Salmonelles et Shigelles:

Concernant les Salmonelles, un milieu d'enrichissement est indispensable tel que : bouillon au sélénite - milieu Leifson ou Muller Kauffmann avec 0.5ml de selle, puis incubation á 37°C.

Il n'existe pas un milieu d'enrichissement pour les Shigelles.

Il est important de repiquer le milieu d'enrichissement des Salmonelles sur gélose sélective après 3-6h maximum d'incubation afin d'éviter la multiplication des bactéries commensales mal inhibées au delà de ce temps.

Les milieux sélectifs les plus utilisés pour l'isolement de Salmonelles et de Shigelles sont : gélose SS, gélose Hektoen.

L'incubation se fait pendant 24h à 37°C.

E.coli :

Recherchée systématiquement chez l'enfant moins de trois ans.

Autres germes :

Nous réalisons cette recherche selon le contexte : demande, observation microscopique.

Levures :

Leur présence se révèle lors de l'observation microscopique à l'état frais.

Dans ce cas, on utilise le milieu Sabouraud + chloramphénicol.

Staphylococcus aureus :

Recherchée en cas de toxi-infection alimentaire, le milieu utilisé Chapman.

Vibrio cholerae :

Recherchée directement sur milieu sélectif(GNAB) et après enrichissement par EPA, puis repiquage après 3heures sur GNAB et sur EPA, puis repiquage de ce dernier dans GNAB. Incubation 37°C/24h.

Deuxième jour :

Repérage des colonies :

Caractérisation et identification biochimiques des colonies suspectes.

1- Les colonies suspectes de Salmonelles et de Shigelles sur gélose Hektoen sont transparentes, vertes, elles sont lac, H2S + ou -.

- On réalise un test d'oxydase instantané, afin d'éliminer les Pseudomonas qui sont oxy +

- Réaliser un test d'uréase

- Après incubation, ajouter le réactif de KOWACS

- Ensemencer sur milieu Kliger Hajna?incubation 24h/37°C.

- Pour les colonies saumons, on élimine les Proteus par le test d'uréase sur milieu urée indole, Proteus est uréase+ (le milieu devient rouge en 2heures)

a- Urease + :Proteus.

b- Urease : ajouter le réactif de Kowacs?indole +? possibilité

d'avoir E.coli.

2- Les tests effectués pour E.coli sont : lactose, acétoïne, citrate, H2S, gaz.

3- Les Staphylocoques pathogènes forment des colonies pigmentées, entourées d'une auréole jaune due à la fermentation du mannitol.

Les tests effectués sont : cat(+), coagulase(+).

4- Pour l'identification des Vibrio cholerae, qui se présentent en colonies transparentes bleutées, on effectue un test d'oxydase (oxy+), catalase (cat+), urée indole, TDA

L'antibiogramme :

L'antibiogramme est impératif pour Salmonella, Shigella, E. coli et pour V cholerae.

Troisième jour :

Lecture des résultats d'identification biochimique et de l'antibiogramme.

Salmonella, Shigella :

Tests	Lac	H2S	Uréase	Indole	Hajna Kligler
					glucose	gaz	LDC
Salmonella	-	+/-	-	-	+	+	+
Shigella	-	-	-	-	+	-	-

- Les Salmonelles sont sensibles à l'amoxicilline

- Les Shigelles sont sensibles à la céphalosporine.

E.coli : oxy, Lac+, indole+, acétoïne, citrate, H2S, gaz+, uréase.

Staphylococcus aureus: cat+, coagulase+, mannitol+.

Vibrio cholerae: oxy+, cat+, urée, indole+, TDA.

- Les Vibrio sont sensibles aux sulfamides et aux tétracyclines.

* Réalisation d'un sérotypage pour Salmonella, Shigella, Vibrio

Donc, un résultat normal se traduit par l'absence de bactéries entéropathogenes, il ya seulement la présence de la flore commensale dont on retrouve 10% d'Entérobactéries surtout les Colibacilles.

En cas de pathologie, il y ait la présence d'Entérobactéries pathogènes, ce qui confirme le contexte.

Parasitologie des selles

Un examen parasitologique est la mise en évidence directe des parasites dans un produit biologique tel que les selles, les urines, le sang, la peau, les crachats, les sécrétions vaginales.

Donc, la parasitologie des selles met en évidence les parasites qui colonisent le tube digestif de l'homme.

Cet examen est prescrit pour toute personne présentant des douleurs abdominales, diarrhées, fièvres. Il est demandé également pour des personnes ayant des troubles digestifs.

But d'examen :

Il permet d'affirmer l'existence d'une parasitose intestinale.

Prélèvement :

Avant le prélèvement, éviter les aliments riches en fibres, et certains médicaments (suppositoires)

Les selles recueillies dans un pot stérile devront être rapidement transmises au laboratoire.

Déroulement d'examen :

1- Examen macroscopique :

Cet examen permet de noter la couleur, la consistance, la présence du sang, de mucus, ainsi la présence de parasites visibles á l'oeil nu.

2- Examen microscopique :

Met en évidence les kystes et les formes végétatives de protozoaires ainsi que les oeufs et les larves d'helminthes.

Il comprend deux étapes :

  a- Examen direct :

Se fait a l'état frais entre lame et lamelle et s'effectue sur des selles fraîches liquides ou en suspension (selle solide), il permet de rechercher le maximum de protozoaires et de kystes.

 b- Examen après concentration :

Permet la recherche des oeufs et des kystes qui sont en petites quantités invisibles par l'examen direct.

Cet examen dure de 1 à 3 jours.

Résultats :

Résultats normaux :
Absence de parasites dans les selles.

Résultats anormaux :
La présence de parasites.

Tab : Principaux parasites des selles chez l'homme

Protozoaires	Sporozoaires (coccidies) Infusoires (Balantidium coli) Flagellés(Giardia) Rhizopodes (amibes)
Helminthes=Nématodes (vers ronds)	Ascaris lombricoïdes Trichuris trichiura (trichocéphale) Enterobius vermicularis (oxyure) Strongyloides stercoralis (anguillule intestinale)
Plathelminthes (vers plats)	Distomatoses (douves) Schistosoma (bilharzies) Cestodes(Taenia)

Giardia intestinalis

Analyse bactériologique des eaux de consommation

Tout produit destiné á la consommation humaine doit être analysé, divers paramètres sont utiles (organoleptiques, physicochimiques, microbiologiques).

L'analyse microbiologique d'une eau représente la recherche des germes pathogènes (Salmonella) et met en évidence la présence d'une pollution fécale dans cette eau par la recherche de certains germes considérés comme indicateurs.

Objectif :

Evaluer la qualité hygiénique d'une eau de consommation

Prélèvement :

Pour ne pas fausser les résultats, le prélèvement se fait dans des conditions aseptiques dans un flacon stérile.

Il faut bien noter l'heure et le lieu du prélèvement.

La démarche :

1- Dénombrement des germes totaux :

=

Flore Totale Aérobie Mésophile(FMAT)

* But :

Son dénombrement nous renseigne sur la charge microbienne du produit et le risque de présence de germes pathogènes.

* Technique :

Nous avons préparé des dilutions d'eau à analyser, par l'eau physiologique.

Poser 1ml de chaque dilution et même la solution mère (eau) dans deux boites de Pétri, puis verser le milieu TGEA et mélanger, laisser solidifier, puis incuber.

* Lecture :

Comptage direct des colonies : le nombre de colonies est exprimé en UFC/ml

Le nombre des bactéries par ml est selon la formule suivante :

Ó n

n=

(N1+0.1N2) d

n : nombre de colonies dans chaque boite pour deux dilutions successives

N : nombre de boites pour une dilution

d : dilution

1ml 1ml 1ml 1ml

9ml d'eau physiologique

Eau á 1/10 1/100 1/1000 1/10000

Analyser

1ml de dilution

Gélose TGEA dilution

Incuber la 1^ere série de boites à 37°C pendant 48h

Incuber la 2^eme série de boite á 22°C pendant 72 heures

Lecture :

Prendre en considération les boites contenant entre 30 et 300 colonies

Fig : Schéma représentant la technique du dénombrement de FMAT

2- Colimétrie :

=

Recherche et dénombrement des coliformes dans l'eau

Les Coliformes sont des Entérobactéries (G+, oxy, glu, NR+, aero-anaerobies),

Se divisent en deux groupes :

- Coliformes totaux(C.T) : fermentent le lactose avec production de gaz á 37°C

- Coliformes fécaux(C.F) : fermentent le lactose avec production de gaz á 44°C

Le dénombrement se fait par la méthode NPP (Nombre le Plus Probable).

* But :

Mise en évidence d'une contamination fécale.

* Technique :

Eau a analyser

50ml

1ml

10ml

50ml BCPL D/C 10ml BCPL D/C 10ml BCPL S/C

+ + +

Cloche de Durham cloche cloche

Agitation des tubes et Incubation à 37°C pendant 24heures

Résultat + :

Virage du milieu au jaune translucide+gaz dans la cloche 1/10? présence de C.T

Résultat - :

Aucun changement

Pas de gaz

6gouttes de surface

Mélanger

Incubation 44°C/24h

Anneau rouge?

Indole +

Confirmation E.coli

Trouble + gaz dans la cloche? présence de C.F

Milieu Schubert pour détection de C.F et E.coli

R +

+R.Kowacs

R

Fig : Schéma représentant la recherche des C.T, C.F et E.coli

* Lecture :

Nous prenons en considération les tubes positifs seulement

Pour obtenir le nombre de C.T et C.F dans 100ml d'eau analysée, on se reporte à la table de MAC GRADY pour calculer l'indice du nombre le plus probable(NPP).

3- Recherche et dénombrement des Streptocoques fécaux :

=

Groupe des Entérocoques

Ces germes ne sont pas pathogènes pour l'homme mais leur présence en grand nombre peut indiquer qu'il y a des bactéries pathogènes.

Sont des Streptocoques du groupe D (généralement non hémolytique).

* But :

Confirmer ou infirmer une contamination fécale (témoins supplémentaires en plus des Coliformes).

* Technique :

Dans un 1^er temps en utilisant le milieu de ROTHE (bouillon glucosé á l'azide de sodium).

Après incubation á 37°C/24h, les tubes positifs sont présumés á contenir des Streptocoques.

Ainsi devient le test confirmatif qui est réalisé par l'utilisation du milieu EVA LITSKY.

* Lecture :

Après l'incubation, les tubes contenant des Streptocoques présentent un trouble avec la formation d'une pastille violette au fond du tube.

On se réfère à la table de MAC GRADY, pour avoir le nombre des Streptocoques dans 100ml d'eau.

Tab : Origine de pollution fécale selon le rapport C.F/S.F

Rapport C.F/S.F	Source de contamination
R< 0.7	Principalement ou entièrement d'origine animale
0.7<R<1	Mixte à prédominance animale
1<R<2	Origine incertaine
2<R<4	Mixte à predominance humaine
R>4	Exclusivement humaine

Test présomptif

Eau a analyser

1ml

50ml

10ml

50ml

50ml bouillon de 10ml bouillon de 10ml bouillon de

Rothe D/C Rothe D/C Rothe S/C

Agitation des tubes et Incubation à 37°C pendant 24 - 48h

Résultat - :

Aucun changement

Résultat + :

Troubles (cultures positives)

Test confirmatif

6 gouttes de surface

Mélanger

Incubation 37°C/24h

Virage au jaune translucide+ une pastille violette au fond du tube? présence de S.fecaux

R +

Aucun changement? absence de S.fecaux D

R

Milieu EVA Litsky pour confirmation de S.fecaux

Fig : Schéma représentant la technique du dénombrement des S.fecaux

4- Recherche des Vibrio cholerae :

=

Absence ou présence

Ce germe est pathogène pour l'homme, c'est l'agent du cholera.

Il ne se multiplie qu'en présence du Nacl

A l'état naturel, ce genre ne se trouve pas dans une eau de consommation.

* But :

Confirmer l'absence du germe dans une eau de consommation.

* Technique :

Eau a analyser

450ml eau

50ml EPA

Enrichissement des Vibrio cholerae

Mélanger le flacon

Incuber 37°C/6h

Refaire l'enrichissement 3 fois

A partir d'EPA précédent

Apres 24 heures

Isolement

des V.cholerae sur GNAB

Repérage des colonies suspectes de V.cholerae (colonies en gouttes d'eau)

Avec la pipette Pasteur, sur la surface d'EPA (5cm)

Trouble :

Eau suspecte

Aucun changement :

Absence de V.cholerae

Fig : Schema representant la technique de recherche des V.cholerae.

Pour la recherche de V.cholerae, il faut un enrichissement par EPA (Eau Peptonée Alcaline).

Ce germe se développe chaque 6 heures pendant 24 heures, donc :

- Soit, on effectue la lecture chaque 6 heures, dans ce cas on refait l'enrichissement á partir du tube précédent (3 fois pendant 24heures).

- Ou soit, une lecture après 24 heures d'incubation.

* Lecture :

Une eau suspecte se traduit par un trouble dans le flacon d'EPA, on applique un isolement sur milieu GNAB.

Une eau potable (prête à consommation humaine) ne doit pas contenir des V.cholerae.

5- Recherche des Salmonelles :

=

Absence ou présence

Ces bactéries sont susceptibles de contaminer les aliments et provoquer des toxi infections alimentaires.

* But :

Evaluer la salubrité de cette eau

* Technique :

200ml d'eau sont ajoutés à 50 ml de SFB (bouillon au sélénite acide de sodium) pour l'enrichissement de Salmonella

Après incubation de 6 à 18 h. (le sélénite inhibe la croissance des Coliformes et des Entérocoques principalement dans 6h d'incubation) un ensemencement en masse sur BGA ou SS, et incubation á 37°C/24h

* Lecture :

Absence ou présence des colonies suspectes.

Normalement ce germe est absent dans un produit de consommation humaine et durant mon stage nous ne l'avons jamais trouvé.

Eau á analyser

Enrichissement

De Salmonella

200ml eau

50ml SFB

Mélanger

Colonies suspectes sur BGA (colonies plates lac-)

Incuber 37°C/6 a 18h

Isolement

De S

1ml du tube enrichi sur boite, puis ajouter BGA ou gélose SS

Colonies suspectes sur SS (colonies incolores avec ou sans centre noir)

Absence de colonies suspectes ? absence de Salmonella

Fig: Schéma représentant la recherche de Salmonella dans l'eau

5- Recherche et dénombrement des Clostridium

sulfito-réducteurs :

Ce sont des germes qui ont l'aptitude à se sporuler en conditions défavorables.

* But :

Mise en évidence d'une contamination fécale ancienne liée à leur aptitude à sporuler.

* Technique :

Une réalisation des dilutions d'eau á analyser

Afin de détruire les formes végétatives des CSR, nous réalisons un traitement thermique à 80°C pendant 10 minutes des tubes.

Laisser refroidir les tubes, puis ajouter le milieu Viande Foie en surfusion additionné de 0.4ml de sulfite de soude et 4 gouttes d'alun de fer.

* Lecture :

La présence des CSR sporulés se traduit par l'apparition des colonies noires, du fait de la réduction de sulfite en sulfure.

1ml 1ml 1ml 1ml

9ml d'eau physiologique

Eau a 1/10 1/100 1/1000 1/10000

Analyser

Chauffage a 80°C pendant 10 mn au bain marie de chaque tube

Les colonies de CSR sont entourées d'un halo noir

Incubation 37°C/48h

L'inoculum

10 ml de VF additionne de 0.4ml de sulfite de soude et 4 gouttes d'alun de fer

Fig : Schema representant la technique de recherche des CSR

Prélèvement sanguin

Après préparation de la salle et du matériel de prélèvement :

1- choix de la veine :

Poser un garrot légèrement serré au dessus du pli du coude

Recherche de la meilleure veine.

2- Antisepsie :

Passer sur la zone choisie un antiseptique le plus souvent de l'alcool sans repasser sur la zone déjà traitée

3- Introduction de l'aiguille :

Positionner l'aiguille  

Piquer, en tirant vers le bas, la peau sous le point de piqûre, puis aspirer

4- Retrait de l'aiguille :

Positionner au niveau du point de piqûre un coton propre et enlever l'aiguille

5- Remplissage des tubes :

Remplir le tube jusqu'au trait indique sur celui-ci et l'agiter.

Eliminer les aiguilles

Il faut identifier les tubes pour ne pas confondre les résultats.

Les tests effectués

1- Glycémie :

Cet examen est demandé pour la surveillance de l'évolution du taux de glucose.

Il est basé sur une méthode enzymatique colorimétrique.

Pour la mise en évidence du taux de glucose, on a besoin de 3 tubes :

Le 1^er du blanc contenant 1 cc du réactif de travail

Le 2^eme d'étalon contient 1ml du R de travail +0.1 ml R3

Celui d'ech, contient 1ml de R de travail +0.1ml du sérum

Il faut agiter les tubes et attendre 30mn pour mesurer la D.O á505nm.

D.O

Calculer le taux du glucose (G = g/l).

D.O standard

Valeurs normales : 0.70 -1.05 g/l

2- Créatinine :

Le dosage de la créatinine est prescrit pour le diagnostic d'une altération de la fonction rénale et pour la surveillance des sujets insuffisants rénaux.

C'est une méthode colorimétrique cinétique.

Pour le dosage, on a besoin de 2 tubes un du standard et l'autre pour l'ech, le zéro du spectrophotomètre est ajusté par l'air.

Ici, nous devons prendre 2 valeurs de D.O (la 1^ere après 30S et la 2^eme après 1mn á une longueur d'onde de 492nm.

Ä D.O ech

Calcul: Créa = 20 mg/l.

Ä D.O etalon

Valeurs usuelles : 7 -14 mg/l

3- Acide urique :

Ce test est prescrit pour la surveillance des insuffisants rénaux.

Le dosage de l'A.U est basé sur des réactions enzymatiques (colorimétriques)

La valeur de D.O est prise pour l'ech et l'étalon après le réglage par le blanc à une longueur d'onde de 510nm.

D.O ech

Calcul: A.U = 60 mg/l.

D.O étalon

Valeurs usuelles :

Hommes : 34 - 70 mg/l

Femmes : 25 - 60 mg/l

4- Cholestérol total :

Puisqu'il fait partie des lipides, il est prescrit dans un bilan lipidique.

Concernant la technique, semblable à celle de la glycémie.

La D.O est prise à 500nm

D.O ech

Calcul : CHO = 2 g/l.

D.O étalon

Valeurs usuelles : < 2.2 g/l

5- Triglycérides :

Cet examen est prescrit pour le diagnostic des hyperlipidémies, ainsi dans un bilan lipidique.

Le principe du dosage est colorimétrique.

Un taux très élevé en T.G est remarqué sur le sérum (celui-ci est trouble même après la centrifugation).

Les D.O de l'étalon et d'ech sont notées, après le réglage du zéro par le blanc.

D.O ech

Calcul: T.G = 2 g/l.

D.O étalon

Valeurs usuelles : 0.35 - 1.35 g/l

Note :

Pour les tests ci-dessus, il nous faut un tube hépariné ou sec.

6- Vitesse de sédimentation (VS) :

La VS est la mesure de la chute des hématies en mm/h sur un ech de sang.

Pour la prise de VS, on utilise un tube au citrate (anticoagulant).

Cet examen est prescrit pour le dépistage des maladies infectieuses.

Pour la mesure, on utilise des pipettes Westergreen et on note 2 valeurs (la 1^ere après 1h et la 2^eme après 1h de la 1^ere prise).

Valeurs normales :

Hommes : 3 - 15 mm

Femmes : 7 - 20 mm

7- Groupe sanguin (groupage) :

Les 4 groupes sanguins (A, B, AB, O) sont déterminés par la présence ou l'absence de 2 protéines  agglutinogènes se trouvent à la surface des hématies et jouant le rôle des Ag : protéine A et protéine B.

La méthode consiste à poser 3 gouttes de sang sur une lame, on ajoute une goutte de chaque sérum (anti A, anti B, anti Rh), sans toucher le sang.

Avec un bâtonnet en plastique, on mélange la goutte du sang et celle du sérum.

Après 30S environ, bouger la lame d'un mouvement circulaire et noter le résultat.

Tab : résultats possibles du groupe sanguin

	A	A +	B	B +	AB	AB +	O	O +
antiA
antiB
antiRh

Agglutination aucun changement

- Durant mon stage, j'ai remarqué que le personnel du laboratoire néglige les conditions d'asepsie tels que les gants, le masque..., alors qu'ils nous les conseillent

- Du coté bactériologique (ECBU, Coproculture), ces laborantins se basent sur l'étude cytologique et délaissent la culture et l'identification bactérienne dans son aspect particulier c.-à-d le suivi des étapes.

- Concernant le dénombrement des leucocytes, ils utilisent une méthode semi quantitative c.-à-d. non précise (- / + / ++).

- La recherche des parasites est limitée á l'examen microscopique direct.

- Pour les analyses d'eau plus précisément la colimétrie, normalement il nous faut un test de confirmation pour les C.T en utilisant le milieu VBL car le milieu BCPL n'est pas sélectif (test présomptif).

Cette méthode n'est pas appliquée dans le laboratoire de la polyclinique.

- Quelques tests ont été présentés théoriquement du fait d'absence du matériel notant les exemples : prélèvements génitaux, prélèvements d'oreilles, de gorge. ECB des crachats et du LCR.

D'une façon générale, le stage m'a été bénéfique puisque j'ai pu voir de prés le déroulement des tests et manipuler librement.

Le contact avec les laborantins a été facile, une relation très bonne, avec des informations importantes.

Un stage plus long serait meilleur pour nous afin d'en savoir d'avantages.

Références :

D'une façon générale, ma synthèse était basée sur mon expérience de stage et des informations données par les laborantins.

Pour certaines informations utiles et importantes, je me suis référée á :

- Livres : Bactériologie médicale

Techniques usuelles

François Denis/Marie-Cécile Roly/ Christian Martin

Edouard Binger/ Roland Quentin

Guide des examens biologiques 4^e édition

N.Kubab / I.Hakawati / S.Alajati-Kubab

- Documents fournis par les laborantins : Kits de Biomaghreb

pour les analyses biochimiques

- Recherche internet : www.google.fr

www.yahoo.fr