Dosage radio-immunologique

1) Introduction 

2) Définition

3) Principe et Condition de la technique

4) Phénomène de compétition entre deux Ag, l'un marqué et l'autre non marqué

5) Exemple d'un dosage de mélatonine extraite chez le mouton.

6) Les inconvénients 

7) Conclusion

Introduction :

La présence et la concentration d'un Ag spécifique ou d'un Ac spécifique à un antigène dans la solution peuvent être déterminées par les radio-immuno- dosages (radio-immuno-assays : RIA), ou par le dosage ELISA. L'antigène attaché à une surface solide capture l'anticorps avec lequel il réagit, il est dosé en utilisant un second anticorps marqué réactif au premier. Ces dosages permettent de mesurer une grande variété d'antigènes ainsi que la concentration et l'isotype des Ac spécifiques à un Ag donné.

Définition

La méthode Radio-Immuno-Aissy (RIA) a été mise au point dans les années 1950 par les américains Solomon Aaron Berson et Rosalyn Sussman Yalow. C'est une technique très précise de dosage des substances biologiques telles que les enzymes, les hormones, les stéroïdes...,dans le sang, l'urine, la salive, ou tout autre liquide corporel dont lequel la formation du complexe antigène anticorps est détectée grâce à la désintégration d'un atome radioactif (iode 125). Ce dosage repose sur l'inhibition compétitive par la substance (froide).

Principe et condition :

Principe :

La RIA classique repose sur le principe d'une liaison compétitive ,mettons en présence une certaine quantité d'anticorps spécifique d'un antigène donnée et cette même antigène préalablement marqué par radio isotope .Un complexe anticorps antigène se forme selon l'équation suivante : Ac +Ag* [AcAg*]

La réaction Ag-Ac est due à l'interaction entre les épitopes de l'antigène et les paratopes de l'anticorps. Elle fait intervenir quatre type de liaison non covalentes (des liaison : hydrogène, électrostatique, hydrophobe, et les forces de van der waals). Les Ac constituent des sondes moléculaires spécifiques vis-à-vis de n'importe quelle substance antigénique. La réaction Ag-Ac a deux grands type d'applications : la détection et le dosage des antigènes (par méthodes dont il faut vérifier la spécificité, la reproductibilité et la sensibilité). Et la détection et le titrage des anticorps (vis-à-vis d'un Ag ou d'un mélange d'Ag). L'équation dépend de l'affinité de l'anticorps pour l'antigène et la constante K rend compte de cette affinité : K= [AcAg*] /[Ac].[ Ag]

Si la quantité d'Ag augmente, la concentration du complexe Ag-Ac augmente également de telle façon que le rapport [AcAg*]/[Ac] .[Ag*] reste constant. Si l'Ag non marqué est ajouté au milieu le phénomène est doublé : d'une part il y a augmentation de la concentration du complexe Ag-Ac, d'autre part il se produit un déplacement sur les sites de fixation de l'Ac, des molécules d'Ag marqué par des molécules d'Ag non marqué .lorsque, dans un tel système, on augmente la quantité d'Ag non marqué, on déplace l'Ag marqué. La radioactivité de l'Ag marqué lié à l'Ac diminue. La figure en dessous représente l'aspect typique d'un étalonnage en radio immunologie.

Condition :

· L'antigène marqué doit présenter une haute activité spécifique et une bonne stabilité.

· Les laboratoires doivent être équipés d'un spectromètre de détection et respecter en outre les contraintes de sécurité et de réglementation définies quand à l'emploi « in vitro » de substances radioactives.

· L'Ag est totalement pur après le marquage radio actif : actuellement, le marqueur radioactif le plus utilisé en immuno-analyse est l'iode 125.

Phénomène de compétition entre deux Ag, l'un marqué et l'autre froid :

La technique radio immunologie est basé sur un phénomène de compétition entre un antigène marqué par radio isotope et un antigène non marqué que l'on veut doser ; cette compétition s'exerce vis-à-vis d'un anticorps spécifique. L'Ag à doser est placé en même temps que l'Ag marqué sur une plaque recouverte de l'Ac spécifique. Plus il y a d'Ag dans l'échantillon, moins les Ag marqué peuvent lier l'Ac

Exemple  d'un dosage de mélatonine extraite chez le mouton :

Le principe est de créer une compétition entre de la mélatonine marquée radioactive (mélatonine chaude) et de la mélatonine non marquée (dite froide). Des anticorps anti mélatonine sont saturés de mélatonine radioactive. L'ajout de mélatonine non radioactive va générer une compétition. Plus il y aura de mélatonine froide dans le tube et plus la compétition est forte. L'anticorps va donc se décharger de sa mélatonine radioactive. Et ensuite on récupère l'anticorps et on compte la radioactivité qui lui est associée.

Réalisation d'une gamme étalon pour la RIA :

Au laboratoire, nous allons utiliser de la mélatonine non radioactive purifiée (achetée dans le commerce par exemple) de concentration connue et nous allons faire une gamme étalon comprise (par exemple) entre 0 et 1000pg/mL. Tous ces tubes sont passés en RIA. La gamme étalon peut être représentée de différentes manières.

1) inconvénients :

· Absence d'Ag froid grande quantité de traceur (nombreux complexes Ag*- Ac)

· L'immunisation est plus difficile à obtenir pour des substances de faibe poids moléculaire

· Plus il y a d'Ag dans l'échantillon, moins les Ag*peuvent lier l'Ac.

· La plage de mesure est restreinte

· la réalisation du blanc est parfois difficile

Conclusion

La radio-immuno-assay est devenu un outil de recherche précieux, que l'on utilise couramment dans les hôpitaux pour facilité le diagnostic du diabète des troubles de la thyroïde, de problème de stérilité et bien d'autre pathologie.

· Livre immunologie de Roitt.Brostoff.Male.

· Livre : Immunologie P.M Lydyard, A.Whelan

&M.W.Ffanger

· Microsoft ® Encarta ® 2006. (c) 1993-2005 Microsoft Corporation.

· www. wcentre.tours.inra.fr

Pelletier J. and al. Dosage radio-immunologique de l'hormone lutéinisante plasmatique chez le mouton. Mise au point de la technique de dosage. C. R. Acad. Sc. Paris, 1968, 266, 2291-2294.

· Livre immunologie de Jean-François `BACH'