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Evaluation des propriétés antihyperglycémiante et hypolipidémiante in vivo des fractions polysaccharidiques solubles de deux plantes médicinales camerounaises à savoir chromolaena odorata et harungana madagascariensis( Télécharger le fichier original )par Serge Simplice DJIALA DE MAFFO Université de Yaounde I - Diplôme d'Etudes Approfondies de Biochimie 2007 |
N = Normale + = Augmentation moyenne LDL = Low density lipoprotein ++ = augmentation modérée VLDL= Low density lipoprotein +++ = augmentation sévère La lipoprotéine HDL est produite au niveau du foie et de l'intestin pendant la lipolyse des chylomicrons. Son rôle principal est le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie pour être catabolisé. En l'absence du cholestérol alimentaire, les triglycérides et le cholestérol issus de la synthèse endogène sont transportés par les lipoprotéines de faibles densités (VLDL) qui sont produites par les cellules hépatiques et sécrétées dans le flux sanguin. Elles sont très riches en triglycérides et sont progressivement hydrolysés par la lipoprotéine lipase pour donner une lipoprotéine plus petite appelée une IDL (Intermediate density lipoproteins), qui donnera à son tour le LDL, qui contient une quantité élevée de cholestérol; il peut aussi être directement sécrété par les hépatocytes. Plus de la moitié des récepteurs du LDL localisés au niveau des hépatocytes des sujets souffrant d'une hypercholestérolémie héréditaire sont inactifs et limitent ainsi l'entrée du LDL dans les cellules avec comme conséquence l'augmentation du taux de cholestérol plasmatique (Shepherd et Packard, 1988). I.2.4.4. Diagnostic des dyslipidémies (NCEP Expert Panel, 1993)En clinique, les valeurs usuelles se présentent comme suit : · Cholestérol HDL : Males 40 - 50 mg/dl ou 1,04 - 1,29 mmol/L Femelles 50 - 60 mg/dl ou 1,29 - 1,55 mmol/L · Cholestérol LDL : Souhaitable <1,3 g/L ou <3,37 mmol/L Risque modéré 1,3 - 1,59g/L ou 3,37 - 4,12 mmol/L Risque élevé = 1,6 g/L ou = 4,14 mmol/L · Triglycérides : Souhaitable 0,4 - 1,6 g/L (Homme) et 0,35 - 1,35 g/L (Femme) Hypertriglycéridémie limite 2,5 - 5,0 g/L ou 2,8 - 5,6 mmol/L Hypertriglycéridémie franche = 5,0 g/L ou 5,6 mmol/L I.2.4.5. ComplicationsL'oxydation du cholestérol LDL dans les parois des artères par les radicaux libres oxygénés conduit à la production des LDL oxydés (OLDL) qui exercent une attraction sur les macrophages de Scavenger du système immunitaire. Ces macrophages s'accumulent dans la paroi des artères après avoir ingéré de nombreuses particules de OLDL formant ainsi des plaques d'athérome à l'origine de l'artériosclérose. L'augmentation du cholestérol total et du cholestérol LDL, la baisse du cholestérol HDL et à un moindre degré, l`augmentation des triglycérides sont des facteurs de risque d'athérosclérose, dont les principales complications sont les maladies coronariennes, l'accident vasculaire cérébral ischémique et l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs (Vidal Recos, 2008). I.2.4.6. Traitements médicamenteuxa) Phytothérapie pour les dyslipidémies Au Cameroun, comme dans plusieurs pays en voie de développement, l'utilisation des plantes dans le traitement des dyslipidémies est largement rencontrée. Un vaste nombre de ces plantes a été reconnu par les scientifiques comme doué d'activité hypolipidémique et/ou antihyperlipidémique. C'est le cas des fruits de Solanum lycocarpum (Solanaceae) (Dall'Agnol et Poser, 2000), des feuilles de Annona squamosa (Annonaceae) (Gupta et al., 2005) et de Laportea ovalifolia (Urticaceae) (Momo et al., 2006), des tiges de Canarium schweinfurthii (Burseraceae) (Kouambou et al., 2007) et de toutes les parties d'autres plantes tels que : Cymbopogon citratus Stapf. (Graminaceae) (Adeneye et Agbaje, 2007), Gacinia cambogia (Koshy et Vijayalakshmi, 2001), Zingiber officinale (Bhandari et al., 1998) et Emblica officinalis (Mathur et al.,1996). b) Traitement médicamenteux Face à une dyslipidémie, les médicaments suivants peuvent être utilisés : la cholestyramine, les dérivés des fibrates, les inhibiteurs de l'HMG-coA (Hydroxylméthylglutaryl coenzyme A) réductase ou statines, et les acides gras oméga-3 (Ferrières, 2002). Les médicaments sont prescrits en fonction de l'anomalie observée (augmentation de la concentration en cholestérol ou en triglycérides ou les deux) : i) Cas de l'hypercholestérolémie · Les résines fixatrices d'acides biliaires La cholestyramine et le colestipol sont des médicaments qui sont associés à la réduction des complications de l'hypercholestérolémie et sont destinés à un usage à long terme. Ils ne sont pas associés à de nombreux effets indésirables (Lipids Research Programme, 1984). Ces résines fixent les acides biliaires au niveau de l'intestin conduisant à une interruption du cycle entéro-hépatique et à une augmentation de l'excrétion fécale des acides biliaires. Il en résulte une stimulation de la synthèse hépatique des acides biliaires à partir du cholestérol endogène · Les statines ou inhibiteurs de l'HMG-coA réductase Le cholestérol endogène est principalement synthétisé par la voie de Novo dans le foie et l'intestin. L'étape de régulation de cette voie est la réaction catalysée par la HMG-coA réductase. Elle est exploitée dans le traitement des hypercholestérolémies par les statines. Elles inhibent la production cellulaire du cholestérol en perturbant le pouls intercellulaire du cholestérol ; ce qui entraîne une augmentation des récepteurs du LDL. Les cas d'hypercholestérolémie sévère, qui ne sont pas liés à l'absence des récepteurs de LDL sur leurs hépatocytes, peuvent être soignés par les statines (Shepherd et al., 1980). ii) Cas de l'hypertriglycéridémie · Le bezafibrate Son mécanisme d'action reste inconnu mais il semblerait qu'il augmente l'activité des récepteurs du LDL ainsi que l'activité de l'HMG-coA réductase entraînant une réduction de la concentration de LDL plasmatique. Il limiterait également la production du VLDL et augmenterait son catabolisme par activation de la lipoprotéine lipase. Il augmenterait également la concentration de HDL résultant de la stimulation de la production des Apo I et Apo II (Monk et Todd, 1983). Les effets indésirables se limiteraient aux troubles digestifs et à une légère augmentation des concentrations de créatinine et de l'activité de la phosphatase alcaline. · Le gemfibrozyl Sa structure est différente de celle des autres. Il réduit considérablement la concentration des triglycérides plasmatiques ainsi que la production de VLDL et de l'apoprotéine B au niveau du foie. Il stimule également l'activité de la lipoprotéine lipase. Il en résulte une augmentation de la clairance des particules riches en triglycérides (Kesanemi et Grundy, 1984). Il entraîne aussi une augmentation du HDL qui varie d'une personne à une autre (Frick et al., 1987). Il est également bien toléré et les effets indésirables qui lui sont associés sont les troubles gastro-intestinaux (colique, diarrhée, nausées). iii) Cas de l'hypercholestérolémie associée à l'hypertriglycéridémie · L'Acide fenofibrique C'est un analogue de l'acide fibrique, il réduit considérablement le taux de cholestérol plasmatique, de triglycérides et de LDL chez les patients souffrant d'hyperlipidémie du type IIa et moins de 6% pour le type IIb. Le taux de HDL est également augmenté de 10 à 15% (Brown et al., 1986 ; Knopp et al., 1987). · Les acides nicotiniques Ils sont prescrits dans des cas d'hypercholestérolémies du type IIa et d'hypertriglycéridémies du type IIb et IV (NCEP Expert Panel, 1993). C'est une vitamine B hydrosoluble qui réduit considérablement le taux de LDL et de VLDL plasmatique. Dans le cas de l'hypercholestérolémies familiales hétérozygotes leur utilisation en association avec les résines fixatrices d'acides biliaires permet de normaliser la cholestérolémie (Brensike et al., 1984). Les effets indésirables sont principalement l'augmentation des activités des enzymes hépatiques, l'hyperurécémie, l'intolérance au glucose, l'hyperpigmentation de la peau et des troubles de vision. II.1. MATERIELII.1.1. Animaux expérimentauxLes expériences ont été menées sur une seule espèce animale. Il s'agit des rats mâles de souche wistar albinos, âgés d'au moins 90 jours et pesant entre 200 et 220 grammes. Les rats ont été élevés dans les mêmes conditions au Laboratoire de Nutrition et de Biochimie Nutritionnelle (LNNB) de l'Université de Yaoundé I, en aération et en luminosité suffisante et à la température ambiante.
II.1.2. Alimentation expérimentaleLes animaux étaient régulièrement nourris à base d'une alimentation de composition standard constituée de provende composée des farines de maïs (45%), du blé (20%), de poisson (8,2%), de soja bouilli et séché (24,6%° ), d'un complexe vitaminique (0,1%), du sel de cuisine (0,8%)et de farine d'os (1,3%). Ils avaient un accès libre à la nourriture et de l'eau ad libitum.
II.1.3. Les plantesLes feuilles et les tiges de Chromolaena odorata et de Harungana madagascariensis ont été récoltés en Janvier 2006 dans la ville de Yaoundé au quartier Biyem-assi et identifiés à l'Herbier National de Yaoundé. II.1.4. Appareillage- Balance (Gibertini, Europe-C) - Broyeur (Philips HR 1721) - Centrifugeuse (Quest Diagnostics, Biohazard) - Papier filtre Watman n°4 - Spectrophotomètre (Spectronic 20, Genesys) - Etuve (Fraser way, Canada) - Evaporateur rotatif (Laboratoriums, Büchi) - Lyophilisateur II.2. METHODESII.2.1. Préparations des différentes fractions pectines et hydrosolubles à froid des plantes (Alarcon-Aguilar et al., 2003)Les plantes préalablement récoltées et séchées au soleil, ont été broyées en une poudre fine. 100g de poudre de chacune des deux plantes ont été introduits ensuite dans 600 ml d'eau distillée après avoir délipidé dans 400 ml d'hexane, pour un séjour de 48 heures à température ambiante puis filtré. Le filtrat (produit A) a été concentré à l'évaporateur rotatif. Le résidu a été bouilli à 80°C successivement dans l'éthanol à 95° pendant 1 heure; dans le mélange méthanol/chloroforme (V/V) pendant 24 heures; ensuite dans du méthanol pur pendant 4 heures et enfin dans l'acétone pendant 24 heures. L'ensemble a été centrifugé à 4000g pendant 30 minutes et le culot (produit B) a été récupéré dans un pilulier en verre vide et mis à l'étuve sous la nuit à 40°C. Les polysaccharides hydrosolubles à froid ont été obtenus à partir du produit A. Pour cela, l'addition de 4 volumes d'éthanol à 95°C au produit a permis de précipiter ces polysaccharides. Le mélange a été centrifugé à 4000g pendant 30 minutes. Le précipité récupéré a été successivement solubilisé dans de l'eau, purifié par dialyse puis lyophilisé. La fraction pectine a été obtenue à partir du produit B. Pour cela, ce dernier a été bouilli dans l'oxalate de sodium 0,5% puis centrifugé à 4000g pendant 30 minutes. Le surnageant a été récupéré puis neutralisé à l'acide acétique afin d'obtenir le précipité. Ce précipité a été purifié par dialyse puis lyophilisé. II.2.2. Préparations des solutions à administrerLes différentes poudres ont été pesées et dispersées dans de l'eau distillée chaude (pectines) et froide (hydrosolubles à froid). Connaissant la dose X en mg/kg de poids corporel P (Kg) pour un groupe d'animaux et le volume V à administrer (10 ml/kg de poids corporel), la concentration de la solution (mg/ml) est déterminée par : X (mg/kg) x P (kg) V (ml) Concentration (mg/ml) = II.2.3. Etude des propriétés antihyperglycémiantes des différentes fractions : Test d'hyperglycémie provoquée par voie orale (OGTT) (Bonner-weir, 1988)Cette épreuve a été réalisée pour évaluer la glucotolérance c'est-à-dire la capacité régulatrice de l'organisme vis-à-vis d'une surcharge glucidique en présence des fractions polysaccharidiques. Echantillonnage Pour cela, 30 rats mâles normoglycémiques de poids moyen 210 grammes ont été répartis en 6 groupes de 5 rats, mis à jeun 18 heures à la veille et traité comme suit : - 1 groupe reçoit par gavage uniquement de l'eau distillée (control négatif); - 1 groupe reçoit par gavage du glucose (2 g/kg) et de l'eau distillée (control positif); - 1 groupe reçoit par gavage du glucose (2 g/kg) et 100 mg/kg de la fraction pectine de Chromolaena odorata (Essai1) ; - 1 groupe reçoit par gavage du glucose (2 g/kg) et 100 mg/kg de la fraction pectine de Harungana madagascariensis (Essai 2) ; - 1 groupe reçoit par gavage du glucose (2 g/kg) et 75 mg/kg de la fraction hydrosoluble à froid de Chromolaena odorata (Essai 3) ; - 1 groupe reçoit par gavage du glucose (2 g/kg) et 75 mg/kg de la fraction hydrosoluble à froid de Harungana madagascariensis (Essai 4). Le gavage a été effectué à l'aide d'une sonde gastro-oesophagienne. Traitement La première glycémie (glycémie de base) a été faite avant administration des différents produits (fractions et glucose). Les fractions ont été administrées par gavage 1 heure avant l'administration du glucose. La glycémie a été successivement déterminée aux instants 0h, 1h, 1h30, 2h et 3h. Tous les animaux étaient maintenus à jeun durant toute l'expérience. La glycémie a été déterminée dans du sang capillaire. Une légère incision au bout distal de la queue des rats permettait d'obtenir une goutte de sang qui était immédiatement déposée sur la plage réactive d'une bandelette de type SD-Check et la lecture de la glycémie était automatiquement faite à l'aide d'un glucomètre de type SD-Check. Les fractions, qui ont eu la propriété d'abaisser significativement l'hyperglycémie provoquée chez les rats, ont été sélectionnées pour l'évaluation des propriétés hypolipidémiantes. II.2.4. Etude des propriétés hypolipidémiantes des fractions sélectionnéesDans cette expérience 20 rats normolipidémiques ont été utilisés. Les animaux ont été rendus hyperlipidémiants par injection intraveineuse de 300 ul de Triton WR-1339 (Tyloxapol - Sigma Aldrich) à la dose de 850 mg/kg, 2 à 3 jours avant le début du traitement (Wattiaux et Wattiaux, 1967). Les animaux ayant un taux sérique de triglycérides et de cholestérol total supérieur à 200 mg/dl ont été retenus pour évaluer l'activité hypolipidémiante des fractions. Les rats ont été divisés en 4 groupes de 5 animaux chacun après un dépistage et repartis comme suit : - 1 groupe control négatif non traité recevant par gavage uniquement le véhicule (NaCl) - 1 groupe control positif non traité recevant par gavage uniquement du triton dissout dans le NaCl - 2 groupes essais traités recevant par gavage la fraction pectine de Chromolaena odorata à la dose de 100 mg/kg et de 200mg/kg pendant 48 heures. A la fin du traitement, après au moins 12 heures de jeun, les animaux ont été sacrifiés sous légère anesthésie à la vapeur d'éther. Le sang collecté dans les tubes EDTA, a été centrifugé à 3000 trs/min pendant 10 min ; le surnageant (plasma) a servi pour le dosage enzymatique du cholestérol total, du cholestérol HDL et des triglycérides et du malondialdéhyde. Le taux de cholestérol LDL a été évalué par la formule de Friedewald et al. (1972); le culot sanguin a servi à la préparation des hémolysâts tandis que le foie prélevé a servi à la préparation des homogénats de foie pour le dosage de la catalase, des hydroperoxydes et des protéines. II.2.5. Estimation des paramètres biochimiques d'intérêtsII.2.5.1. Dosage du cholestérol total (Richmond, 1973)a) Principe La cholestérol estérase catalyse l'hydrolyse des esters de cholestérol en cholestérol libre et acides gras. Le cholestérol libre y compris celui présent à l'origine est alors oxydé par la cholestérol oxydase (CHOD) en 4-cholestèn-3-one et en peroxyde d'hydrogène. En présence de la peroxydase (POD), le phénol et le 4-aminoantipyrine se combinent avec le peroxyde d'hydrogène pour former un chromophore rouge (la quinonéimine) qui absorbe entre 500 et 550 nm. L'intensité de la coloration est directement proportionnelle à la concentration de cholestérol total présent dans l'échantillon. Cholestérol estérase Cholestérol oxydase Peroxydase Esters de cholestérol + H2O cholestérol + acides gras libres Cholestérol + O2 4-cholestèn-3-one + H2O2 2H2O2 + phénol + 4-aminoantipyrine quinonéimine + 4H2O b) Réactifs R1 : Tampon Tampon PIPES pH 6,9.......................................................90mmol/l Phénol...........................................................................26mmol/l R2 : Réactif enzyme Cholestérol estérase.............................................................300U/L Cholestérol oxydase.............................................................300U/L Peroxydase............ .........................................................1250U/L 4-aminoantipyrine......................................................... ....0.4mmol/l R3 : Solution étalon cholestérol standard..........................................................200 mg/dl R1 + R2 : Solution de travail La solution de travail est stable pendant quatre mois entre 2°C à 8°C ou pendant 40 jours entre 15 à 25°C. c) Mode opératoire Dans des tubes étiquetés blancs, étalon et essai ont été introduits respectivement 10 ul d'eau désionisée, d'étalon ou d'échantillon à analyser et 1000ul de réactif. Mélanger et incuber pendant 5 minutes à 37°C ou 10 minutes à température ambiante. Lire l'absorbance de l'échantillon contre le blanc réactif à 505 nm à l`aide d`un spectrophotomètre. d) Expression des résultats La concentration en cholestérol total dans le sérum est donnée par la relation : DO échantillon DO étalon x 200 (mg/dl) = [cholestérol total] (mg/dl) [Cholestérol total] (mmol/l) = 0,0259 × [cholesterol total] (mg/dl) Valeurs de référence : Sérum - Plasma < 200 mg/dl II.2.5.2. Dosage du cholestérol HDL (Young, 2001)a) Principe Les lipoprotéines (chylomicrons, VLDL et LDL) sont précipitées par l'ajout de l'acide phosphotungstique et du chlorure de magnésium. Après centrifugation, le surnageant clair contenant la fraction de HDL qui est testée avec le réactif du kit Chronolab pour la détermination du taux de HDL cholestérol. b) Réactifs (kit Chronolab) R1 : Réactif précipitant (le réactif précipitant est prêt pour l'utilisation) acide phosphotungstique...................................................14 mmol/l chlorure de magnésium......................................................2 mmol/l R2: Solution étalon cholestérol standard...........................................................200 mg/dl c) Mode opératoire Pipeter dans un tube, 200ul de l'échantillon et 20ul du précipitant. Laisser reposer pendant 10 minutes à température ambiante. Centrifuger à 4000 tours/min pendant 10minutes. Collecter le surnageant. Pipeter respectivement dans les tubes à essai et étalon 10ul du surnageant, 10ul de standard y ajouter 1000ul de tampon cholestérol, mélanger et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Lire l'absorbance de l'échantillon contre le blanc réactif à 505 nm à l`aide d`un spectrophotomètre. d) Expression des résultats La concentration en HDL cholestérol dans le sérum est donnée par la relation : DO échantillon DO étalon
X 200 (mg/dl) = [HDL cholestérol] (mg/dl) II.2.5.3. Estimation du cholestérol LDL (Friedewald et al., 1972)La concentration en LDL sérique a été déterminée par la méthode de différence selon l'équation de Friedewald et al., 1972 : Cholestérol LDL = cholestérol total - cholestérol HDL - triglycérides / n n = 2, lorsque les valeurs sont exprimées en mmol/l n = 5, lorsque les valeurs sont exprimées en mg/dl II.2.5.4. Dosage des triglycérides (Fossati et Principe, 1982)a) Principe Sous l'action de la lipoprotéine lipase (LPL), le glycérol, produit par hydrolyse enzymatique des triglycérides, est phosphorylé par l'ATP pour produire la glycérol-3- phosphate et l'ADP à travers une réaction catalysée par la glycérol kinase (GK). La glycérol-3-phosphate oxydase (GPO) catalyse ensuite l'oxydation du glycérol -3-phosphate pour produire le dihydroxyacétone-3-phosphate et H2O2. Ce dernier se combine au 4-aminoantipyrine et au 4-chlorophénol pour former la quinonéimine sous l'influence catalytique de la peroxydase (POD). L'intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des triglycérides présente dans l'échantillon. LPL GK GPO POD Triglycérides + H2O glycérol + acides gras Glycérol + ATP glycérol-3-phosphate + ADP Glycérol-3-phosphate + O2 dihydroxyacétone phosphate + H2O2 2H2O2 + 4- aminoantipyrine + 4- chlorophénol quinonéimine + 4H2O b) Réactifs R1: Tampon Tampon GOOD pH 7,5................................................................50mmol/l p-chlorophénol............................................................................2mmol/l R2 : Réactif enzyme Lipoprotéine lipase (LPL)..........................................................150000U/L Glycérol kinase (GK).....................................................................500U/L Glycérol-3-phosphate oxydase (GPO................................................2500U/L Peroxydase (POD) .......................................................................440U/L 4-aminophénazone................................................................ ....0,1mmol/L ATP.....................................................................................0,1mmol/L R3 : Solution étalon Triglycérides standard................................................................250 mg/dl R1 + R2 : Solution de travail La solution de travail est stable pendant six semaines entre 2°C à 8°C ou pendant 7 jours entre 15 à 25°C. c) Mode opératoire Introduire dans une cuve, 10 ul d'échantillon sérique ou de standard et 1000ul de réactif, mélanger et incuber pendant 10 minutes à 25°C. Lire l'absorbance de l'échantillon contre le blanc réactif à 505 nm à l`aide d`un spectrophotomètre. d) Expression des résultats La concentration des triglycérides dans le sérum est donnée par la relation : DO échantillon DO étalon X 250 (mg/dl) = [triglycérides] (mg/dl) [Triglycérides] (mmol/l) = 0,0113 × [triglycérides] (mg/dl) II.2.5.5. Dosage de quelques marqueurs du stress oxydatifII. 2.5.5.1. Malondialdéhyde (MDA) (Yagi, 1976)a) Principe Les composés carbonylés à l'instar du malondialdéhyde réagissent avec l'acide thiobarbiturique (TBA) pour donner des chromophores de couleur rose absorbant à 532 nm. b) Réactif : Pour 100 ml de réactif Acide trichloroacétique (TCA) 20% P/V; Acide thiobarbiturique (TBA) 0,375% P/V; Butylhydroxytoluène (BHT) 0,01% P/V ; Chlorure d'hydrogène (HCl) 1 N. 375 mg de TBA, 20g de TCA, 0,01g de BHT, 25 ml de HCl 1 N et 50 ml d'eau distillée ont été introduit dans un bécher. La solution obtenue a été chauffée à 40°C dans un bain Marie jusqu'à dissolution complète du TBA, puis transférée dans une fiole de 100 ml et le volume complété à l'eau distillée jusqu'au trait de jauge. c) Mode opératoire Pipeter dans les tubes à essai en verre et à vis, 100ul d'échantillon, 400ul de réactif TBA et fermer hermétiquement. Chauffer le mélange au bain Marie à 100 °C pendant 15 minutes. Puis refroidir dans un bain d'eau froide pendant 30 minutes en laissant les tubes ouverts pour permettre l'évacuation des gaz formés lors de la réaction. Centrifuger à 3000 tours/minutes pendant 5 minutes et lire l'absorbance du surnageant à 532 nm à l`aide d`un spectrophotomètre. d) Expression des résultats La concentration de TBARS a été déterminée en utilisant le coefficient d'extinction moléculaire du MDA (å = 1,53 105 M-1 cm-1). Les résultats ont été exprimés en umol/l. II. 2.5.5.2. Protéines totales (Lowry et al., 1951)a) Principe Les protéines en milieu alcalin forment avec les ions Cu2+ un complexe hexacoordonné dont la couleur varie du rose violet au bleu violet suivant la quantité de protéines présente dans le milieu. Le complexe dont la longueur d'onde d'absorption maximale est 540 nm est proportionnel à la quantité de protéine présente. · Réactif A: 2% NaCO3 mélangé avec un volume égal de 0.4% NaOH · Réactif B: 1% CuSO4 mélangé avec un volume égal de 1% Na K tartrate. · Réactif 1: 1 volume du réactif B est mélangé avec 100 volumes de réactif A. · Réactif 2: 50% réactif de Folin - Ciocalteu 100ul d'échantillon, d'eau distillée (blanc) ou de BSA (Bovine Sérum Albumin: 5 mg dans 5 mL d'eau) est introduit dans un tube à essai avec 1 ml du réactif 1. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 10 minutes ensuite100ul du réactif 2 est ajouté. Le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 minutes. La densité optique est lue 750nm contre le blanc. L'albumine a été utilisée comme étalon. x [étalon] = DO échantillon DO étalon [Protéines] (en g/L) Concentration de l'étalon albumine = 50g/L II. 2.5.5.3. Hydroperoxydes (ROOH) (Jiang et al., 1992)a) Principe En milieu acide, l'ion peroxyde entraîne l'oxydation de l'ion ferreux (Fe2+) en ion ferrique (Fe3+). Le xylénol orange présent forme avec le Fe3+ un complexe Fe3+-xylénol orange dont la densité optique peut être lue à 560 nm. Le calibrage de la réaction se fait avec des standards hydroperoxydes à l'exemple du peroxyde d'hydrogène, de l'hydroperoxyde linoléique, du tert - butylhydroperoxyde ou encore des cumènes peroxydes (å = 4,52. 104 M-1 cm-1). b) Réactifs · BHT (butylated hydroxytoluène) 88mg · Xylénol orange 7,6mg · Sulfate d'ammonium 9,8mg · Méthanol 90ml · Acide sulufurique (250mM) 10ml c) Mode opératoire Préparation du réactif de FOX Le réactif de FOX est préparé en mélangeant 88 mg de BHT, 7,6mg de xylénol orange et 9,8mg de sulfate d'ammonium. On y ajoute ensuite 90ml de méthanol et 10ml d'acide sulfurique 250mM. Le mélange obtenu est homogénéisé et conservé. Procédure 100ul d' hémolysât et d'homogénat sont additionnés à 900 ul du réactif de FOX. Après homogénéisation, les différents tubes sont incubés au bain marie à 37°C pendant 30 min. La densité optique du complexe coloré formé est lue à 560 nm contre le blanc réactif à l`aide d`un spectrophotomètre. d) Expression des résultats La concentration des hydroperoxydes est exprimée en uM d'hydroperoxydes (plasma) et en uM d'hydroperoxydes /100 g de tissue (homogénat). II. 2.5.5.4. Catalase (CAT) (Sinha, 1972)a) Principe La méthode est basée sur le fait que la catalase présent dans l'échantillon réduit l'H2O2 en H2O et O2. b) Réactifs · 0,2 M de peroxyde d'hydrogène (H2O2). · Tampon phosphate 0,01 M pH 7.0 · Dichromate de potassium 5% · Dichromate acide acétique (mélanger 100 ml de dichromate de potassium avec 300 ml d'acide acétique concentré). c) Mode opératoire A 0,1ml d'échantillon ou d'eau distillée (blanc), on ajoute 250uL de tampon phosphate et 200 ul de peroxyde d'hydrogène et la réaction est arrêtée après 30s et 60s par addition de 1 ml du mélange dichromate - acide acétique. Tous les tubes sont incubés au bain marie bouillant (100°C) pendant exactement 10 minutes, refroidis et l'absorbance est lue à 620 nm contre le blanc à l`aide d`un spectrophotomètre. d) Expression des résultats L'activité de la catalase est exprimée en mmoles de l'H2O2 consommés/min/g protéine II. 2.6. Analyse Statistique des DonnéesLes valeurs moyennes des données obtenues de plusieurs observations selon les tests étaient calculées et représentées avec les écart-types au moyen du logiciel Excel de Windows. Ces données ont été analysées statistiquement au moyen du logiciel SPSS version 10.1 de Windows à l'aide de l'analyse de la variance (ANOVA) suivie du Post-hoc LSD applicable aux comparaisons des données. Les probabilités de risque ont été évaluées au seuil á = 0,05 et les résultats ont été considérés comme significatifs pour p < 0,05. III.1. RESULTATSIII.1.1. Etude des propriétés antihyperglycémiantes des fractions de Chromolaena odorata et de Harungana madagascariensisLes fractions polysaccharidiques ont été
obtenues suivant les rendements :
Figure III: Effet des fractions de Chromolaena odorata et de Harungana madagascariensis sur la glycémie des rats après administration orale du glucose *p<0,05 différence significative par rapport au témoin ; Moyennes (mg/dl) #177; ó, (n=5). Les rats ayant reçu uniquement de l'eau distillée ne présentent pas de variation significative de la glycémie par rapport à l'instant initial mais plutôt par rapport au témoin (ayant reçu uniquement le glucose) dès 1 heure 30. Par ailleurs, on observe une réduction significative (p<0,05) de la glycémie comparativement au groupe témoin à 1 heure 30 chez les rats ayant reçu la fraction pectine de Chromolaena odorata et à 3 heures chez les rats ayant reçu la fraction hydrosoluble de Chromolaena odorata après une élévation marquée de la glycémie à 1 heure 30 (Tableau II de l'annexe I). Par conséquent, seules les pectines de C. odorata ont été sélectionnées pour l'évaluation des propriétés hypolipidémiantes à la dose 100 et 200 mg/kg de poids corporel. III.1.2. Etude des propriétés hypolipidémiantes des fractions pectines de Chromolaena odorataOn observe une différence significative entre les groupes traités et le groupe non traité ou groupe témoin pour ce qui est des paramètres lipidiques (cholestérol total, cholestérol HDL, triglycérides) (Tableau III de l'annexe I). On note une différence significative du taux plasmatique de triglycérides chez les rats hyperlipidémiques traités par les fractions pectines de C. odorata à la dose de 100 mg/kg (39,45 #177; 6,72 mg/dl ; p<0,01) et de 200 mg/kg (56,87 #177; 23,03 mg/dl ; p<0,01) par rapport à celui des rats témoins hyperlipidémiques non traités (1613,75 #177; 292,37mg/dl) qui est également différent de celui des rats ayant reçu le véhicule NaCl (46,25 #177; 41,49 mg/dl ; p<0,001) (Figure IV). Légende : Groupe 1: Control normal (NaCl) Groupe 2: Témoin hyperlipidémique non traité Groupe 3: Essai hyperlipidémique traité par les pectines de C. odorata (100mg/kg) Groupe 4: Essai hyperlipidémique traité par les pectines de C. odorata (200mg/kg) *** ** **
Figure IV : Effet du traitement des pectines de Chromolaena odorata sur la triglycéridémie des rats. **p<0,01 ; ***p<0,001 : différences significatives par rapport au groupe 2 Ces mêmes fractions entraînent une baisse significative de la cholestérolémie (p<0,001) respectivement de 39,57 #177; 10,81 mg/dl et de 61,02 #177;12,59 mg/dl pour les doses 100 et 200 mg/kg contre 365,50 #177; 92,86 mg/dl observée chez les rats témoins hyperlipidémiques (Figure V). *** *** ***
Figure V : Effet du traitement des pectines de Chromolaena odorata sur la cholestérolémie des rats ***p<0,001 : différence significative par rapport au groupe 2 De même, le taux de cholestérol HDL des rats traités est également significativement (p<0,05) différents de celui des rats témoins hyperlipidémiques (Figure VI). * * *
Figure VI : Effet du traitement des pectines de Chromolaena odorata sur le cholestérol HDL plasmatique des rats *p<0,05 : différence significative par rapport au groupe 2 L'estimation du taux plasmatique de cholestérol LDL par la formule de Friedewald et al. (1972) n'est possible que si la triglycéridémie est inférieure à 400 mg/dl. Par conséquent, l'analyse comparative du taux de cholestérol LDL entre les groupes traités et le groupe témoin ne peut être effectuée (figure VII).
Figure VII : Effet du traitement des pectines de Chromolaena odorata sur le cholestérol LDL plasmatique des rats III.1.3. Influence des fractions pectines de Chromolaena odorata sur les marqueurs du stress oxydatifOn observe une différence significative entre les groupes traités et le groupe non traité appelé groupe témoin en ce qui concerne les marqueurs du stress oxydatif (Tableau IV de l'annexe I). L'analyse de l'activité de la catalase dans les homogénats de foie (groupe 4 : 0,17 #177; 0,06) et dans les hémolysâts (groupe 3 : 0,11 #177; 0,04 et groupe 4 : 0,12 #177; 0,07) montre une diminution significative (p<0,05) de celle-ci comparativement au groupe 2 (figure VIII). * * *** *
Figure VIII : Effet du traitement des fractions de C. odorata sur l'activité de la catalase *p<0,05 ; ***p<0,001 : différences significatives par rapport au groupe 2 Au contraire, on note une baisse significative (p<0,01) du taux d'hydroperoxydes dans les homogénats de foie des rats traités à la dose de 100 mg/kg (0,93 #177; 0,08) et de 200 mg/kg (0,90 #177; 0,25) comparativement à celui des rats hyperlipidémiques (1,37 #177; 0,09) (figure IX). ** ** **
Figure IX : Effet du traitement des fractions de Chromolaena odorata sur la concentration des hydroperoxydes **p<0,01 : différence significative par rapport au groupe 2 Par ailleurs, on note une baisse significative (p<0,001) du taux plasmatique de malondialdehyde chez les rats traités par la fraction pectine à 100 mg/kg (12,33 #177; 0,92) et à 200 mg/kg (8,10 #177; 3,12) par rapport au groupe témoin (20,96 #177; 1,50). *** *** ***
Figure X : Effet du traitement des fractions de Chromolaena odorata sur la concentration en malondialdehyde ***p<0,001 : différence significative par rapport au groupe 2 III.2. DISCUSSIONL'effet métabolique des polysaccharides complexes requiert actuellement une attention considérable. Dans la première étude, l'effet des fractions pectines et hydrosolubles de C. odorata a entraîné chez les rats rendus temporairement hyperglycémiques une baisse significative de la glycémie respectivement à l'instant 1h30 et 3h comparativement aux rats hyperglycémiques non traités. Tandis que les fractions de H. madagascariensis n'ont pas entraîné une réduction de la glycémie chez ces rats. Ce résultat présente en général une réduction significative de la glycémie de 29,85 % et de 19,31 % respectivement pour les fractions pectine et hydrosoluble à froid de C. odorata. Ce résultat est en conformité avec les travaux de Dall'Agnol et Poser qui ont montré en 2000 que certains polysaccharides complexes ralentissent la digestion et l'absorption des hydrates de carbone au niveau des vaisseaux sanguins et réduisent ainsi l'augmentation de la glycémie post prandiale. Cependant, la fraction hydrosoluble de C. odorata entraîne, chez les rats rendus hyperglycémiques, une élévation de la glycémie à l'instant 1h30 comparativement au groupe témoin (hyperglycémiques non traités). Ceci pourrait s'expliquer par le fait que soit cette fraction est en présence des contaminants d'hydrates de carbones, soit il y aurait eu libération de ces hydrates de carbones au cours du processus de fractionnement de l'extrait aqueux ou mieux par une éventuelle coexistence des propriétés hyperglycémiantes et des propriétés hypoglycémiantes (Stanley et al., 1999; Kameswara et al., 2003). C'est pourquoi cette fraction, bien qu'elle présente une activité antihyperglycémiante à la troisième heure, n'a pas été sélectionnée pour l'évaluation des propriétés hypolipidémiantes. L'absence de diminution significative de la glycémie des animaux traités par les fractions pectine et hydrosoluble de H. madagascariensis comparativement aux animaux non traités montre que ces deux fractions ne possèdent pas de propriétés antihyperglycémiantes aux instants 1h, 1h30, 2h et 3h. Par conséquent, seules les pectines de C. odorata ont été sélectionnées comme étant les plus actives au test d'hyperglycémie provoquée par voie orale et les doses 100 et 200 mg/kg ont servi à l'évaluation des propriétés hypolipidémiantes. Dans la deuxième partie de l'étude, les rats ont
été rendus hyperlipidémiques Le triton WR-1339 est un détergent non ionique qui induit une élévation du taux de cholestérol et de triglycérides sériques en augmentant la biosynthèse du cholestérol hépatique par inhibition de la lipoprotéine lipase. De plus, il a été démontré que le triton WR-1339 accroît l'activité de l'HMG-coA réductase dans le foie. Par conséquent, le triton est utilisé non pas seulement comme une méthode de screening pour les agents hypolipidémiants mais aussi comme un moyen pour élucider le métabolisme des lipides (Takahashi et al., 2003 ; Oh et al., 2006). Les résultats nous montrent que l'administration du triton aux animaux a entraîné une augmentation significative de la cholestérolémie (365,5 #177; 92,86 mg/dl) et de la triglycéridémie (1613,75 #177; 292,37 mg/dl) comparativement au groupe control (67,00 #177; 25,44 mg/dl et 46,25 #177; 41,49 mg/dl). Dans cette étude, les pectines de C. odorata à la dose de 100 et de 200mg/kg ont entraîné respectivement, chez les rats rendus hyperlipidémiques, une baisse significative des taux de cholestérol total (39,57 #177; 10,81 mg/dl et 61,02 #177; 12,59 mg/dl) et de triglycérides plasmatiques (39,45 #177; 6,72 mg/dl et 56,87 #177; 23,03 mg/dl) comparativement au groupe témoin non traité indépendamment de la dose. Plusieurs mécanismes ont été proposés afin d'expliquer l'activité hypolipidémique de ces fractions. Elles augmenteraient l'excrétion fécale des acides biliaires et des stérols neutres avec comme conséquence la réduction du cholestérol hépatique à cause de son utilisation pour la biosynthèse de ces acides biliaires. Ces fractions ralentiraient également la vitesse de diffusion à travers la muqueuse intestinale réduisant ainsi l'absorption du cholestérol et de triglycérides. Ces polysaccharides pourraient enfin constituer un excellent substrat pour les bactéries du gros intestin. Leur fermentation dans le colon aboutirait à la formation des acides gras volatiles dont l'entrée dans le courant sanguin par la veine portale entraînerait une suppression de la synthèse du cholestérol (Dall'Agnol et Poser, 2000). Cependant, contrairement à de nombreuses études portant sur l'amélioration des paramètres lipidiques des sujets hyperlipidémiques, les pectines de C. odorata n'ont pas entraîné une augmentation significative du taux de cholestérol HDL. Or, ce taux est généralement inversement corrélé avec les risques de maladies cardiovasculaires aussi bien chez les humains que chez les animaux d'expérimentation, et l'augmentation de ce taux réduit le développement de l'artériosclérose (Oh et al., 2006). Par conséquent, notre fraction ne possède pas d'effet anti-artériosclérotique pour les doses considérées. D'autres résultats nous présentent l'effet des fractions sur les marqueurs du stress dans chaque groupe de rats. L'analyse de ces résultats montre que les pectines de C. odorata possèdent la propriété d'abaisser significativement le taux d'hydroperoxydes dans les homogénats, le taux de malondialdehyde dans le plasma et l'activité de la catalase dans les homogénats et les hémolysâts. En effet, l'évaluation de la peroxydation lipidique dans les tissus passe par le dosage de certains marqueurs du stress tels que le malondialdéhyde, les hydroperoxydes qui sont les produits secondaires issues de la peroxydation lipidique et de certains enzymes tels que la catalase, la superoxyde dismutase, la glutathion peroxydase qui protègent les tissues contre les radicaux libres oxygénés qui endommagent les membranes et les structures biologiques. Plus spécifiquement, la catalase est responsable de la détoxification des quantités significatives de peroxydes d'hydrogènes (H2O2) (Gupta et al., 2008). Puisque le traitement des animaux par les fractions entraîne une diminution de l'activité de la catalase et une réduction des taux d'hydroperoxydes et de malondialdehyde, cela pourrait signifier que ces fractions possèdent la faculté de bloquer la peroxydation lipidique et par conséquent de renforcer le système de défense in vivo. Car, l'hyperlipidémie induite conduit à l'augmentation de la production des radicaux libres oxygénés, causant ainsi la peroxydation lipidique (Oh et al., 2005). CONCLUSIONAu terme de ce travail qui avait pour but d'évaluer les propriétés antihyperglycémiante et hypolipidémiante in vivo des fractions polysaccharidiques solubles de deux plantes médicinales camerounaises à savoir Chromolaena odorata et Harungana madagascariensis, il ressort que : ? Les fractions pectine et hydrosolubles à froid de C. odorata possèdent des propriétés antihyperglycémiantes tandis que celles de H. madagascariensis n'ont aucun effet sur la glycémie aux instants considérés. Les pectines de C. odorata se sont révélées les plus actives au test d'hyperglycémie; ? La fraction pectine de C. odorata à la dose de 100 et 200 mg/kg possède des propriétés hypolipidémiantes indépendamment de la dose ; ? Cette fraction possèderait également la faculté de bloquer la peroxydation lipidique et par conséquent de renforcer le système de défense in vivo. ? La fraction pectine de C. odorata serait impliquée dans l'activité antidiabétique de cette plante.
PERSPECTIVESCe travail, qui s'inscrit dans le cadre d'un programme visant à réduire l'apparition des maladies métaboliques et des maladies cardiovasculaires à l'aide des substances naturelles, nous permet d'envisager : ? De tester ces fractions sur les rats diabétiques et obèses avec un temps de traitement plus long afin de préciser le mécanisme d'action à l'échelle moléculaire et cellulaire ; ? D'effectuer une étude toxicologique sur ces fractions afin d'en déterminer la marge de sécurité d'utilisation et ? De standardiser la (les) fraction (s) active (s) afin d'en proposer aux populations locales. BIBLIOGRAPHIEAbo K.A., Adeyemi A.A., Dosunmu A, (2007). Ethnobotanical survey of plants used in the treatment of infertility and sexually transmitted in Southwest Nigeria. African Journal of Medicine and Medical Sciences. 29: 325-327. ADA (American Diabetes Association). (1997). The expert committee on the diagnostic and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 20: 1183-1197. 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*p<0,05 comparativement au groupe 2 (groupe témoin) Les valeurs sont les moyennes (mg/dl) #177; écart-type ; (n = 5) Groupe 1: Control normal (H2O) Groupe 2: Témoin (glucose 2g/kg) Groupe 3 : Essai Pectine C. odorata (100mg/kg) Groupe 4 : Essai Pectine H. madagascariensis (100mg/kg) Groupe 5 : Essai Hydrosoluble C. odorata (75mg/kg) Groupe 6 : Essai Hydrosoluble H. madagascariensis (75mg/kg) Tableau III : Variation du profil lipidique dans chaque groupe d'animaux
*p<0,05 ; **p<0,01 ***p<0,001 comparativement au groupe II (groupe témoin) Les valeurs sont les moyennes (mg/dl) #177; écart-type ; (n = 5) Groupe I: Control normal (NaCl) Groupe II: Témoin hyperlipidémique non traité Groupe III : Essai hyperlipidémique traité par les pectines de C. odorata (100mg/kg) Groupe IV : Essai hyperlipidémique traité par les pectines de C. odorata (200mg/kg) Tableau IV: Effet des fractions sur les marqueurs du stress dans chaque groupe d'animaux
*p<0,05 ; **p<0,01 ***p<0,001 comparativement au groupe témoin ou groupe II Les valeurs sont les moyennes #177; écart-type ; (n = 5) Groupe I: Control normal (NaCl) Groupe II: Témoin hyperlipidémique non traité Groupe III : Essai hyperlipidémique traité par les pectines de C. odorata (100mg/kg) Groupe IV : Essai hyperlipidémique traité par les pectines de C. odorata (200mg/kg) Annexe II: Courbe d'étalonnage de la catalase
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"Nous devons apprendre à vivre ensemble comme des frères sinon nous allons mourir tous ensemble comme des idiots" | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
