L'hémophilie

Introduction

Notre choix pour le thème de ce rapport de stage a été porté sur l'hémophilie, car cette maladie provoquait un déséquilibre dans l'espérance de vie des hémophiles qui n'atteignent pas alors 20ans, les handicapes fonctionnels qui se caractérisent par des hémorragies multiples étaient majeurs, empêchant toute insertion sociale ou professionnelle.

Le développement des thérapeutiques transfusionnelles à partir des années 1960-1970 en Europe bouleversait totalement cette situation et donnait la possibilité aux hémophiles d'atteindre des conditions de vie assez satisfaisantes.

Notre travail a été réalisé au sein du laboratoire d'hémobiologie de Ben Boulad (Blida) ainsi que l'hôpital de (Frantz-fanon) service d'hématologie.

Nos recherches ont pour but de faire des explorations d'hémostase : TCK, TQ, TP, TS et NP ainsi que le dosage des deux facteurs de coagulation facteur VIII et IX, à fin de détecter d'éventuelles anomalies sanguines chez les patients. Une étude statistique a été aussi élaborée et interprétée en fonction d'âge, sexe, le type de l'hémophilie et les signes cliniques.

1)-Définition de l'hémophilie :

Le mot hémophilie vient de deux mots grecs :

- HAIMA qui signifie le sang

- PHELIA qui signifie une affection

C'est une maladie hémorragique constitutionnelle à transmission récessive liée au sexe résultant d'un déficit qualitatif ou quantitatif du facteur VIII (hémophilie A) ou en facteur IX (hémophilie B), l'hémophilie A est quatre fois plus fréquente que l'hémophilie B. Il s'agit d'une maladie rare touchant un nouveau-né sur 5000 de sexe masculin, la maladie est ainsi transmise des femmes (conductrices) aux hommes.

( Dr .MERDOUM .F 2001)

2)-Historique :

Il y déjà prés de 2000 ans, le Talmud babylonien stipulait que si ces deux frères étaient décédés de complications hémorragiques après circoncision, le troisièmes enfants devait en être dispensé.

Cette observation généralement considérée comme se rapportant à l'hémophilie permet d'apprécier à la fois la gravité et l'ancienneté de la maladie.

Le terme même d'hémophilie est introduit en 1823 par Schonlein et son mode de transmission lié au sexe est établi en 1813 par Hay.

Depuis lors, d'énormes recherches ont était effectuées jusqu'à une bonne maîtrise du clonage des gènes du facteur VIII et du facteur IX respectivement en 1984 et 1982 permettant enfin la préparation de concentrés de ces deux facteurs par les techniques de génie génétique. ( Pr. JEAN FRANÇOIS SCHVED)

3)-Génétique et mode de transmission :

3.1)-Génétique :

La maladie résulte de mutations des gènes du facteur VIII (anti-hémophilie A) ou IX (anti-hémophilie B)

- Le gène du facteur VIII est localisé en position Xq28, c'est un gène de très grande taille(186 kilos bases ), très morcelé (24 exons), produisant un messager de 9 kilos bases, et une protéine de 2332 acides aminés. Les mutations identifiées comme responsables d'une hémophilie A (plus de 300 à ce jour) sont à type de mutations ponctuelles.

- Le gène du facteur IX est localisé en position Xq27, sa taille est de (33,5 kilos bases), il est morcelé en (8 exons), produisant un messager de 2,8 kilos bases et une protéine de 415 acides aminés. La majorité des mutations recensées à ce jour sont d'étendue limitée ; mutation du promoteur, des zones de transcription, décalant le cadre de lecture ou responsable de substitutions faux sens ou non-sens.

3.2)-Mode de transmission :

Trois situations peuvent se présenter :
Si on désigne par X le gène porteur de l'anomalie, et par X le gène sain, on aura :

A- Une femme porteuse de l'anomalie (XX) mariée à un homme sans anomalie (XY) :

- Leurs filles peuvent être :

Sans aucune anomalie (XX)

Ou porteuses de la maladie (XX)
- Les garçons peuvent également être:

Sains (XY)

Ou hémophiles (XY)

B- Une femme non porteuse (XX) mariée à un homme hémophile (XY) :

- Leurs filles seront toutes porteuses de la maladie (XX)
- Leurs fils seront tous sains (XY)

C- Une femme porteuse de l'anomalie (XX) mariée à un homme hémophile (XY) :  

- Le cas est extrêmement rare ( deux cas recensés en Algérie )

50 % de leurs filles seront hémophiles  (XX)
50 % seront porteuses de la maladie (XX)
50 % des garçons seront hémophiles (XY)
50 % des garçons seront sains (XY)

- Pourtant, la notion d'hérédité n'est pas retrouvée chez tous les hémophiles. Dans environ 1/3 des cas, il s'agit d'une mutation spontanée du gène au niveau d'un chromosome X. Dans ce cas, on ne retrouve aucune autre personne atteinte dans la famille du patient. Cependant, cette mutation, bien que spontanée, va se transmettre de façon héréditaire à la descendance du patient. ( Dr. AMAUD DUBANCHET )

4)-Etiologie :

4.1)-Type de déficit :

A- Déficit qualitatif : Dans ce cas, la protéine anti-hémophiliques est présente mais non fonctionnelle.

B- Déficit quantitatif : Dans ce cas, la protéine anti-hémophiliques est absente ou diminuée mais qualitativement normale.

4.2)-Type d'hémophilie :

A- Hémophilie A : Elle représente 80% des cas d'hémophilie, on distingue deux variétés : Hémophilie (A+) et Hémophilie (A-)

B- Hémophilie B : Elle représente 20% des cas d'hémophilie on distingue aussi deux variétés : Hémophilie (B+) et Hémophilie (B-)

(Rapport de stage hémophilie/ internat 2004)

5)-Signes cliniques :

Quel que soit le type d'hémophilie concerné, les manifestations sont identiques seules leur importance varie en fonction du taux sanguin du facteur de coagulation déficitaire. Il s'agit toujours d'accidents hémorragiques, on à 3 types d'hémophilie : 

-Hémophilie sévère : Les accidents sont fréquents, apparents et spontanés.

-Hémophilie modérée : Sont moins fréquents causée par un léger traumatisme.

-Hémophilie atténuée : Les accidents hémorragiques surviennent uniquement à la suite d'une blessure grave ou dans le cadre d'une intervention chirurgicale.

5.1) - manifestations cliniques :

A- Hémorragies externes :

Le sang est visible. L'enfant saigne souvent de la bouche (brossage des dents trop intense, morsure de la muqueuse des joues à l'occasion de la mastication...) Il peut aussi saigner du nez à l'occasion d'un rhume ou après une exposition prolongée au soleil (épistaxis), la présence de sang dans les urines (hématurie) et dans les selles peuvent aussi se rencontrer. (Figure N°4)

B- Hématomes :

Les hématomes peuvent survenir à n'importe quel endroit du corps. Ils se manifestent par un " bleu " qui entraîne une douleur et un gonflement de la zone concernée. Lorsqu'il est intra-musculaire, il peut provoquer une perte momentanée de la fonction assurée normalement par le muscle, Les hématomes les plus fréquents sont sous-cutanés (sous la peau) et sans gravité pour l'hémophile.

Certaines localisations intra musculaires sont particulièrement dangereuses et justifient une consultation immédiate et la mise en place d'un traitement substitutif : Cou, gorge, langue, abdomen, organes génitaux. (Figure N°5)

C- Hémarthroses :

Le sang s'écoule à l'intérieur d'une articulation (genou, cheville, coude, doigt) et finit, en l'absence de traitement substitutif, par la "bloquer". Cette hémorragie peut être provoquée par un traumatisme (coup, chute) ou faire suite à un effort prolongé (longue marche, pratique d'un sport, port d'une charge importante) Elle peut aussi être spontanée. (Figure N°6) (Dr. AMAUD DUBANCHET)

6)-Diagnostic :

6.1)- Diagnostic biologique : Il est porté sur l'intégrité de l'hémostase primaire qui est composé de temps de saignement (TS) et le taux de plaquettes normaux et aussi de la combinaison TCK allongé avec un temps de quick normal et pour finir, on fait des testes de correction employés jusqu'à tout récemment.

6.2)- Diagnostic positif : Fortement suspecté sur le sexe masculin, anamnèse personnelle, absence de purpura, antécédents familiaux du coté maternel, TQ normal et TCK allongé affirmé par le dosage des facteurs VIII et IX.

(Pr. BELHANI MERIEM / Manuel d'hématologie)

7)-Traitement :

7.1)- Traitement substitutif : Il à pour but d'apporter au malade le facteur dont il est dépourvu jusqu'à une concentration suffisante pour obtenir une hémostase correcte :

- Injection d'une unité de facteur VIII par Kg de poids augmente le taux circulant d'environ 2% (demi-vie 12 heures)

- Injection d'une unité de facteur IX par Kg de poids augmente le taux circulant d'environ 1,2 % (demi vie 24 heures)

Le nombre d'unités et d'injections dépend de la gravité de l'hémorragie, ces injections se font en perfusion intraveineuse.

7.2)- Traitement symptomatique : on fait appèle aux corticoïdes ainsi que les anti-fibrinolytiques, le traitement par le fer est indiqué dans le cas d'anémie ferré prive, des antalgiques sont aussi prescrits pour calmer la douleur.

7.3)- Traitement préventif : Interdire les efforts intramusculaires violents, prescrire une surveillance quotidienne contre tout traumatisme extérieur, proscrire les médicaments et les injections sans couverture transfusionnelle qui risque de faire saigner.

7.4)- Vaccination : Le BCG, les différentes hépatites, vaccination par les anatoxines diphtérique et tétanique sont parfois préconisés.

Remarque : Deux types de produits sont actuellement disponibles : les concentrés de facteurs de coagulation obtenus à partir du plasma sanguin (dons du sang) et des concentrés dits recombinants dont la production a été permise par les progrès du génie génétique. Le PFC et le cryoprécipité sont aussi utilisés.

(Pr. BELHANI MERIEM / Manuel d'hématologie)

8)-Notions de base :

8-1) Hémostase : L'hémostase est un ensemble des mécanismes physiologiques dont les fonctions sont de prévenir toute hémorragie spontanée et de permettre l'arrêt d'un saignement après rupture hémorragique, par un équilibre entre les facteurs de coagulation et les inhibiteurs plasmatiques, l'hémostase est classiquement subdivisée en 3 temps étroitement intriqués :

- L'hémostase primaire : c'est l'occlusion d'une brèche vasculaire par le thrombus plaquettaire appelé aussi thrombus blanc.

- La coagulation : c'est la formation d'un réseau de fibrine par les interventions des facteurs plasmatiques qui consolide le thrombus plaquettaires pour donner le thrombus rouge ou caillot.

- La fibrinolyse : assure la lyse du caillot et la reperméabilisation du vaisseau.

- Pour les explorations in vitro on a :

1-Temps de saignement (TS)

2- Numération des plaquettes (NP)

3- Temps de Quick (TQ)

4- Taux de prothrombines (TP)

5- Temps de Céphaline Kaolin (TCK)

6- Fibrinogène.

7-Autres tests ...............

Le temps est compté par secondes et le taux en pourcentage.

(Pr. MERIAN F 1993)

8.2)- Les Facteurs de coagulation :

Ce sont des glycoprotéines qui on pour but de solidifier le caillot qui colmate la brèche vasculaire et arrête le saignement, dont la plupart sont synthétisés aux niveaux du foie, ils sont classés selon une nomenclature internationale utilisant des chiffres romains allant de I à XIII.

8.3)- Les inhibiteurs plasmatiques :

Il est important que des mécanismes dits "régulateurs" interviennent afin que le caillot soit limité et qu'il n'empêche pas la circulation du sang dans les vaisseaux. De plus, des mécanismes de digestion du caillot appelés "mécanismes de la fibrinolyse" doivent intervenir rapidement pour faire disparaître le caillot et restaurer la lumière du vaisseau.

8.4)- La vitamine K :

C'est une vitamine qui est synthétisée au niveau de la flore intestinale, elle est également fournie par l'alimentation, elle à pour rôle de stimuler la synthèse des facteurs de coagulation appelés facteurs K-dépendant qui sont en nombre de 4 facteurs : FII, FVII, FIX, FX.

8.5)-Plaquettes :

Dits aussi thrombocytes, sont des fragments de cytoplasme de mégacaryocytes, elles sont les plus petits éléments figurés du sang, leur fonction primordiale est hémostatique et rentre dans le phénomène de coagulation.

(Pr. MERIAN F 1998)

MATERIELS ET METHODES

- Le bilan de l'hémostase est fonction du type de manifestation hémorragique du malade et aussi ces antécédents personnels et familiaux, l'orientation du bilan sera différent. S'il s'agit de saignement spontané : des saignements de nez, des gencives, des manifestations cutanées à type de purpura pétéchial ( petites taches cutanées de couleur pourpre ), le bilan sera orienté vers une exploration de l'hémostase primaire (TS, NP)

Et s'il s'agit d'hémorragies prenant la forme d'hématomes, d'hémarthroses ou d'hématuries, les explorations s'orienteront vers la coagulation avec la réalisation de  (TQ, TP, TCK), dosage du facteur VIII et IX.

Les différentes analyses entrant dans un bilan d'hémostase vont nous permettre d'explorer d'éventuelles anomalies qui rentrent dans l'hémophilie à chaque stade de la coagulation. C'est pourquoi les examens sont différents et parfois complémentaires.

1)-Matériels :

1.1)- Matériels utilisés :

- Tubes à essai en plastique stériles.

- Tubes à hémolyse.

- Portoir.

- Vccinostyle ou lame de bistouri pour le prélèvement du sang (TS)

- Seringues pour d'autres analyses d'hémostase.

- Papier buvard (filtre)

- Pipette mélangeuse de Potain (pour les globules blancs)

- Pipette de 0,1 à 2 ml.

- Embouts jetables.

- Cellules hématimétriques de malassez.

- Lamelles planées.

1.2)- Appareillages :

- Bain-marie à 37c°.

- Chronomètre.

- Incubateur.

- Microscope optique.

- Centrifugeuse.

- Congélateur.

- Agitateur.

- Conteneur de déchets contaminés.

1.3)- Les Réactifs :

- Réactifs pour les explorations de l'hémostase :

- Thromboplastine.

- Chlorure de calcium (CaCl2) à 0,025 M.

- Plasma pauvre en plaquettes (PPP)

- Céphaline mélangé au Kaolin (Céphaline Kaolin)

- Témoin dont la concentration de fibrinogène est connue.

- Tampon D'Owren- Koller à PH 7,4.

- Solution de Thrombine à 100 U/ml.

- Sérum physiologique à 9g / 100ml de NaCl.

- Solution de dilution ( solution de piette) :

*Chlorhydrate de procaine 3g.

*Chlorure de sodium 0,2g.

*Eau distillée100ml.

- Ether.

- Réactifs pour la préparation des différents plasmas :

- Eau distillée.

- Tubes non mouillables.

- Citrate de sodium à 3,8% à raison d'un volume pour 9 volumes de sang.

- Réactifs pour le dosage des facteurs VIII et IX :

- Céphaline Kaolin.

- Céphaline : substrat plaquettaire préparé selon Bell et Alton (lyophilisé)

- CaCl2 : Chlorure de calcium 0,025ml (firme : diagnostica stago )

- Unicalibrator : plasma standard citraté (firme diagnostica stago )

- Activateur : suspension tamponnée de Kaolin à 5 mg/l (firme diagnostica stago)

- Plasma exempt de facteur VIII ( firme Behring )

- Plasma exempt de facteur IX ( firme Behring )

- Eau distillée.

- Eau physiologique.

2)-Méthodes :

- Les tests de l'hémostase primaire ; TS et NP ne sont pas obligatoirement prescrits dans le cas d'une hémophilie car ils rentrent aussi dans d'autres coagulopathies, et peuvent être remplacés par d'autres techniques, ces deux tests font partie du diagnostic biologique, par contre les tests de coagulation  ; TQ, TP, TCK sont nécessairement pratiqués pour affirmer le trouble de la coagulation sur la voie intrinsèque qui rentre dans le diagnostic positif d'un hémophile. L'affirmation se fait par la combinaison « TCK allongé et TQ normal »

- L'allongement du TCK est proportionnel à la gravité de l'hémophilie.

- Le Temps de Howell (TH) et le temps de coagulation (TC) ne sont pas assez sensibles pour être utilisés.

- Le dosage des facteurs VIII et IX sont importants et obligatoires car ils affirmeront le type de l'hémophilie A ou B et la sévérité :

Type d'hémophilie	sévérité
Hémophilie A	- De 0 à 1% hémophilie sévère - De 1 à 5% hémophilie modérée - De 5 à 40% hémophilie atténuée
Hémophilie B	- De 0 à 1% hémophilie sévère - De 1 à 5% hémophilie modérée - De 5 à 25% hémophilie atténuée

Le taux de facteur VIII peut augmenter au cours de certaines affections : complication thromboembolique, athérosclérose coronarienne, insuffisance rénale....

2.1)-Tests d'exploration de l'hémostase :

« Exploration de la coagulation »

A -Temps de Quick (TQ) :

A.1- Principe :

Le temps de Quick est un test global qui explore la coagulation extrinsèque, il consiste à déterminer le temps de la coagulation d'un plasma à 37c° en présence d'un excès de thromboplastine tissulaire et de calcium.

La conversion du TQ en TP permet d'apprécier l'activité prothrombinique du plasma à tester comparativement à un plasma témoin servant de référence (100%)

Il explore les facteurs de coagulation : F II, F V, F VII, F X.

A.2- Matériels et réactifs :

Matériels	Réactifs
- Tubes en plastique stériles. - Pipette. - Bain-marie à 37c°. - Chronomètre.	- Plasma pauvre en plaquettes (PPP) -Thromboplastine. - Chlorure de calcium (Ca Cl2) à 0,025 M. - Plasma à tester.

- Mélanger à part égale la suspension de thromboplastine avec le chlorure de calcium et incuber à 37c° pendant une période qui va de 10 à 15 minutes pour la préparation du réactif ( thromboplastine calcique)

A.3- Echantillonnage :

- Prélever du sang sur citrate trisodique par ponction veineuse.

- Centrifuger et laisser sédimenter.

· Le test doit être réalisé dans les quatre heures qui suivent le prélèvement.

· Laisser le plasma à une température entre 20 à 27c° avant le test.

A.4- Mode opératoire :

La technique peut se faire soit avec un coagulomètre ou au bain-marie, on utilise ce dernier à une température constante 37c°.

 

- prendre un tube de 5 ml et verser une quantité de réactif thromboplastine calcique puis le mettre au bain-marie à 37c°.

- Mettre le plasma à tester dans un tube de 5 ml.

- Maintenir les deux tubes 2 minutes à 37c°.

- Prendre 0,1 ml de plasma à tester.

- Ajouter 0,2 ml de thromboplastine calcique pré incubé dans le tube de plasma à tester et déclencher le chronomètre en mélangent avec l'aide d'une anse, en observant bien la coagulation du plasma, et on note le temps de coagulation à partir de 10 secondes.

A.5- Résultats :

L'intervalle des valeurs normales de TQ est de 12 à 14 secondes, on peut considérer comme allongé s'il y a un écart à partir de 2 secondes par rapport au témoin qui est mis au début du test pour la comparaissent.

A.6- Etalonnage :

Les résultats sont exprimés en pourcentage, la conversion du (TQ) en (TP) se fait ainsi :

· Détermination de la courbe d'activité pro thrombinique à partire du plasma.

· Dilution de façon adéquate le témoin (PPP)

· Dilution du plasma au 1/1, 1/2, 1/3,1/4,1/8 dans le tampon de Michaélis :

Dilution (ml)	1/1	1/2	1/3	1/4	1/8
PPP (ml)	0,2	0,1	0,1	0,1	0,1
Tampon (ml)	---	0,1	0,2	0,3	0,4
Plasma à tester	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Thromboplastine calcique	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2

Déclencher le chronomètre et noter le temps de coagulation .

A.7- La courbe d'étalonnage :

La courbe d'étalonnage consiste a faire une triple détermination à partir de chaque dilution puis à tracer une droite d'étalonnage , pour cela porter sur le papier millimétré les temps en secondes en fonction de l'inverse des dilutions du plasma , on aura alors le pourcentage correspondant (voir graphe N°1)

Temps de la coagulation / (secondes)

Inverses des

Dilutions

  

A.8- Résultats et interprétations :

Le résultat est exprimé en pourcentage d'activité par rapport au témoin.

R : le rapport est définie comme :

R = Temps du malade / Temps du témoin

Les Valeurs normales locales sont supérieures ou égales à 82%.

Les valeurs signalées comme pathologiques sont inférieures à 82%.

Les taux supérieurs à 100% n'ont pas de signification pathologique.

- Un test anormal indique :

· Un déficit important en fibrinogène, si le taux est inférieur à 1g/l.

· Déficits associés en plusieurs facteurs FII, FVII, FX.

· Déficits isolés congénitaux en un des facteurs du complexe prothrombinique FII, FV, FVII, FX.

· Avitaminose K (malabsorption)

B- Temps de Céphaline Kaolin (TCK) :

B.1- Principe :

Le temps de Céphaline Kaolin est un test global qui explore la coagulation intrinsèque, il consiste à déterminer le temps de coagulation d'un plasma à 37c° en présence d'un substitut plaquettaire et un activateur.

Ce test explore l'ensemble des facteurs de la voie intrinsèque à l'exception des facteurs plaquettaires.

B.2- Matériels et réactifs :

Matériels	Réactifs
-Tubes en plastique stériles. - Pipette. - Bain-marie à 37c°. - Chronomètre.	- Plasma pauvre en plaquettes (PPP) - Céphaline Kaolin (commerciale). - Chlorure de Calcium (CaCl2) à 0,025 M. - Plasma à tester.

B.3- Mode opératoire :

- Mélanger 0,1ml du plasma à tester ou témoin (PPP) avec 0,1ml de Céphaline Kaolin préparé ou fournie par des firmes commerciales.

- Laisser 3 minutes au bain-marie à 37 °C .

- Ajouter 0,1ml de Chlorure de calcium (activateur) et à partir de 20 secondes on observe la coagulation en mélangent à l'aide d'une anse, le temps sera chronométrer et noter par secondes.

B.4- Résultats et interprétations :

Les valeurs normales sont comprises entre 40 et 50 secondes selon l'origine de la Céphaline utilisée.

Un allongement de TCK supérieur à 10 secondes par rapport au témoin est considéré comme pathologique.

- Le TCK est allongée dans les cas suivants :

· Déficit important en fibrinogène (inférieur à 1g/l)

· Déficit en facteurs anti-hémophiliques A et B et en facteur XII et XI.

· Déficit acquis des facteurs K-dépendant.

« Exploration de l'hémostase primaire »

C- Temps de saignement :

C.1- Principe :

Test global explorant l'hémostase primaire, il fait appel à deux méthodes mesurant le délai nécessaire à une hémostase effective après incision standard.

C.2- Matériels et réactifs :

- Vaccinostyle ou lame de bistouri.

- Papier buvard (filtre)

- Chronomètre.

- Tensiomètre.

- Ether.

C.3- Mode opératoire :

A- METHODE DE DUKE :

Pratiquer une incision à l'aide d'un vaccinostyle (5 mm de longueur sur 2 mm de profondeur) à la partie médiane du lobule de l'oreille déjà badigeonné à l'éther, et on recueille la goutte de sang sur papier filtre toute les 30 secondes en utilisant un chronomètre, jusqu'à l'arrêt du saignement, on note la durée de saignement.

B- METHODE D'IVY :

Pratiquer une incision avec un vaccinostyle (4 mm de longueur sur 2 mm de profondeur) à l'avant- bras, après avoir à l'aide d'un tensiomètre exercé une pression de 4 cm de mercure et aussi désinfecté à l'éther, et on recueille toutes les 30 secondes la goutte de sang sur papier filtre en utilisant un chronomètre jusqu'à l'arrêt du saignement, on note la durée de saignement.

C.4- Résultats et interprétations :

Le temps de saignement normal est compris entre 1 à 4 minutes pour la méthode de Duke et de 2 à 4 minutes pour la méthode d'IVY, cette dernière est beaucoup plus sensible que la précédente, mais sous anesthésie locale si les TS sont refaits.

Le temps de saignement est considéré comme allongé et pathologique s'il est supérieur à 5 minutes pour la première méthode et supérieur à 8 minutes dans la deuxième.

- Pour tout allongement du temps de saignement on à tendance à avoir des anomalies variées :

· Anomalie plaquettaire (thrombopénie ou thrombopathie)

· Anomalie de facteur Willebrand.

· Anomalie du collagène.

· Anomalie du facteur X, IX et XI.

D- Numération plaquettaire (NP) :

D.1- Principe :

La numération des plaquettes se fait au microscope optique, après la lyse des hématies par un liquide de dilution.

D.2- Matériels et réactifs :

- Pipette mélangeuse de Potain pour les globules blancs.

- Cellules hématimétriques de malassez.

- Lamelles planées.

- Microscope optique objectif 40.

- Chronomètre.

- Solution de dilution conservée au réfrigérateur et renouvelée chaque 15 jours.

D.3- Mode opératoire :

Le sang prélevé par ponction veineuse est recueilli dans un tube en plastique stérile sur une solution citraté à 3,8% a raison d'un volume pour 9 volumes de sang.

Aspirer successivement dans la pipette le sang préalablement agité jusqu'au trait 0,5 et la solution de dilution jusqu'au trait 11, réaliser ainsi une dilution du sang au 1/20, faire une homogénéisation du mélange manuellement ou avec un agitateur mécanique, éliminer les premières gouttes avant le remplissage de la cellule de Malassez recouverte d'une lamelle, laisser sédimenter 15 minutes dans un endroit humide puis faire la lecture.

La numération est faite au microscope à l'objectif 40, après la mise au point, les plaquettes apparaît comme de petits éléments arrondis, réfringent et isolés.

Les plaquettes sont comptées dans deux bandes soit 20 carrés.

D.4- Résultats et interprétations :

Les résultats sont exprimés par micro litre de sang et sont obtenus après division du nombre trouvé au comptage par deux (2 bandes) puis multiplié par dix (nombre de bandes totales) et par vingt (la dilution), soit N le nombre trouvé on a :

Nombre de plaquettes / micro litre = N X 10 X 20/2

Taux de plaquettes = N X 10 X 20/2 mm cube

Valeur normale = 150.000 à 450.000 plaquettes/mm cube

- Dans les thrombocytopénies, les valeurs sont inférieures ou égales à 100.000 plaquettes /mm cube.

- Dans les thrombocyténies, les valeurs dépassent 400.000 mm cube et plus.

2.2)- Dosage du facteur VIII et IX :

A- Dosage du facteur VIII :

A.1- Rappel sur le facteur VIII :

Le facteur VIII est une glycoprotéine d'un poids moléculaire de 280.000 daltons environ, il est présent dans le foie et également dans la rate, les reins et les lymphocytes. Le facteur VIII circule dans le plasma sous forme complexée avec le facteur Willebrand (F.VIII/WF) qui est lié par une liaison non covalente.

A.2- Principe :

Le principe du dosage consiste à mesurer, en présence de Céphaline et d'activateur le temps de coagulation d'un système ou tous les facteurs sont présents, constants et en excès (réactif commercial ou local) à l'exception du facteur VIII apporté par l'échantillon testé.

A.3- Matériels et réactifs :

Matériels	Réactifs
- Tubes à essai stériles. - Pipette. - Bain-marie. - Centrifugeuse. - Chronomètre.	- Plasma exempt de facteur VIII. - Plasma dilué pour l'étalonnage. - Céphaline Kaolin. - Chlorure de calcium (ClCl2) - Eau physiologique.

A.4- Mode opératoire :

-Etalonnage :

Pour la dilution on utilise un plasma standard citraté (Unicalibrator) ou un pool de plasmas citrates de donneurs sains, considéré à 100% en facteur VIII.

Faire des dilutions de ce plasma à l'eau physiologique :

Dilution	1/10	1/20	1/40	1/80
Activité	100%	50%	25%	12.5

- Technique :

On dépose dans un tube stérile, au bain-marie à 37c° :

· 0,1 ml de plasma dilué du malade ou dilution d'étalonnage.

· 0,1 ml de plasma exempt de facteur VIII commercial ou local.

· 0,1 ml de Céphaline Kaolin.

· Incuber à 37c° pendant 3 minutes.

· 0,1 ml de CaCl2 préchauffé à 37c° qui nous servent d'activateur.

· On déclenche en même temps le chronomètre et on note le temps de la coagulation.

· A.5- Résultats et interprétations :

Sur du papier bi logarithmique, porter en abscisse les taux en pourcentage (%) de facteur VIII des différents points de la gamme d'étalonnage et en ordonne les temps de coagulation correspondant par secondes.

Tracer la droite d'étalonnage et en déduire le taux de facteur VIII des échantillons testés, lorsque le taux de facteur VIII trouvé chez un malade est particulièrement bas (inférieur à 5%), il est recommandé de vérifier ce résultat sur une dilution au 1/5, le taux lu sur la droite sera alors divisé par 2. (Voir graphe N° 2)

Le taux plasmatique du facteur VIII est généralement compris chez l'adulte entre 60 et 150%

De nombreux facteurs sont susceptibles de provoquer une augmentation du taux de facteur VIII :

· Oestroprogestatifs, grossesse.

· Anti-vitamine K (AVK)

· Effort physique, stress.....

Temps de coagulation / secondes

Taux de facteur

VIII (%)

B- Dosage du facteur IX :

Le dosage du facteur IX est identique que celui du facteur VIII sur tous les plans sauf pour le réactif, on utilise un plasma déficient en facteur IX, ainsi le principe, les matériels, le mode opératoire, les résultats et la courbe d'étalonnage sont similaires.

B.1- Rappel sur le facteur IX :

Le facteur IX est une glycoprotéine de poids moléculaire 55.000 environ, synthétisée par le foie. Sa concentration plasmatique est de l'ordre de 3 à 5mg/l, la synthèse du facteur IX biologiquement actif est vitamine K dépendante.

Cette vitamine est nécessaire à la carboxylation des résidus glutamiques indispensables à la fixation, en présence de Ca++, du facteur IX sur les phospholipides plaquettaires ou tissulaires.

(Selon Pr. MERIANE et Pr. BERNARD.J)

2.3)- Préparation des plasmas utilisés pour les tests biologiques de l'hémostase et du dosage :

A- Préparation du plasma déficient en facteur VIII et IX :

Le sang provenant d'un déficit congénital total en facteur VIII et IX prélevé par ponction veineuse en tubes non mouillables sur citrate de sodium, centrifuger à 3000 tours /minutes pendant 10 ou 15 minutes. Le plasma réactif est donc congelé et peut être conservé à 20c° pendant une période de 3 mois minimum.

B- Préparation du plasma à tester :

Le plasma à tester est obtenu à partir du sang recueilli sur citrate de sodium à 3,8% à raison d'un volume pour 9 volumes de sang par centrifugation à 2700 tours/minutes pendant 5 minutes dans les mêmes conditions que le plasma témoin.

(selon Pr. MERIANE et Pr. BERNARD.J )

Résultats et discussion

Nos résultats ont été portés sous forme de statistiques, qui nous ont été fournis par l'hôpital Frantz-fanon (Blida) service d'hématologie.

Vu que l'hémophilie est considérée comme une maladie rare, on n'a pas pu suivre plus de sept cas d'hémophiles dans cet hôpital.

N°du malade	Age	Sexe	Type d'hémophilie	Type d'hémorragies	Hématomes	Hémarthroses
1	7' ans	Masculin	A : (1%) Sévère TCK:Allongé TQ : Normal	Hémorragie de grande abondance Epistaxis	RAS	RAS
2	5' ans	Masculin	A : (5%) Modérée TCK:Allongé TQ : Normal	Hémorragie muqueuse Epistaxis modérée	RAS	RAS
3	4'mois	Masculin	A : (1%) Sévère TCK:Allongé TQ : Normal	RAS	Hématome léger Ecchymoses	Hémarthrose de l'épaule droite
4	18'ans	Masculin	A : (1%) Sévère TCK : Allongé TQ : Normal	RAS	Oedèmes touchants une partie des membres supérieurs	Tuméfication articulaire de l'hanche gauche
5	62'ans	Masculin	A : (1%) Sévère TCK : Allongé TQ : Normal	Hémorragie spontanée	RAS	RAS
6	43'ans	Masculin	A : (1%) Sévère TCK : Allongé TQ : Normal	Epistaxis prolongée causant des céphalées et des palpitations	Ecchymoses post traumatique à la main droite	RAS
7	22'ans	Masculin	A : (1%) Sévère TCK : Allongé TQ : Normal	RAS	Hématome du cou (coté gauche)	Hémarthrose du genou droit

RAS : Rien à signaler.

Interprétation des résultats

L'âge :

On peut interpréter de ces résultats que trois hémophiles parmi les sept, sont des enfants et les quatre restants sont majeurs, car on réalité les quatre hémophiles qui on plus de 18 ans ont été suivis depuis leur plus jeune âge dans d'autres hôpitaux, on peut conclure par ceci que les signes cliniques d'une hémophilie apparaissent dés les premiers mois après la naissance et les cas sont très variables, le traitement et le suivie médical attribués aux malades sont nécessaire pour leur survie, ainsi les hémophiles atteignent des piques dans la sévérité de la maladie puis à l'aide d'un traitement substitutif et un traitement d'urgence ils arrivent à se stabilisés pour y revenir quand le cas s'aggrave, donc l'hémophilie est une maladie chronique à vie qui jusqu'à ce jour reste inguérissable car l'anomalie se trouve dans un gène défectueux, la maladie est alors juste apaisée sous des recommandations du médecin traitant.

Le sexe :

Les résultats montrent aussi que tous les hémophiles sont de sexe masculin car c'est une maladie génétique transmise par la femme à sont garçon et les filles ne peuvent être que des porteuses saines de l'anomalie sauf si le père est atteint et la mère porteuse saine, qui est généralement un cas extrêmement rare.

Type de l'hémophilie :

Pour ce qui concerne le type de l'hémophilie on constate que l'hémophilie A est la seule diagnostiquée chez ces patients car statistiquement elle est 4 fois plus fréquente que l'hémophilie B.

La sévérité de la maladie est généralement de (1%) sauf pour le malade N° 2 qui est atteint d'une hémophilie modérée comprise entre 1 et 5%.

Les manifestations cliniques :

Les complications sont sous forme d'hémorragies, hématomes ou hémarthroses :

· Des hémorragies abondantes, Epistaxis pour les malades N° (1, 2, 5,6)

· Des hématomes, ecchymoses, et oedèmes pour les malades N° (3, 4, 6,7)

· Des hémarthroses situées dans les articulations pour les malades N° (3, 4,7)

« Tableaux biologiques de l'hémophilie »

Type de l'hémophilie	TS	Taux de plaquettes	TQ	TCK	Temps de thrombine	Facteur VIII (%)
Sévère	Allongé	150.000	Normal	180 s	Normal	1%
Modérée	Normal	150.000	Normal	180 s	Normal	1 à 5%
Atténuée	Normal	150.000	Normal	180 s	Normal	5 à 40%

Type de l'hémophilie	TS	Taux de plaquettes	TQ	TCK	Temps de thrombine	Facteur IX (%)
Sévère	Allongé	Normal	Normal	180 s	Normal	1%
Modérée	Normal	Normal	Normal	180 s	Normal	1 à 5%
Atténuée	Normal	Normal	Normal	180 s	Normal	5 à 25%

Questions non résolues

Le nombre d'hémophiles va s'accroître dans les pays développés où ces patients vivent une vie familiale normale. Les mutations sur les gènes des facteurs VIII et IX sont constantes et de nouvelles mutations apparaissent régulièrement.

L'hémophilie est universellement répartie sur la surface du globe ; cependant, 80% des hémophiles dans le monde n'ont pas accès au traitement. Le problème d'instituer un traitement dont le coût puisse être accessible à tous doit devenir une de nos préoccupations prioritaires.

Tant que le traitement restera dépendant du don du sang, le coût de sa sécurisation et de son fractionnement en produits purifiés, exclut une grande partie de la planète. Le coût de la préparation par génie génétique est également très élevé, la thérapie génique se heurte encore à beaucoup d'obstacles.

Le problème le plus grave, pour lequel nous n'avons aucune solution, est celui de l'apparition d'inhibiteurs au cours du traitement.

La recherche peut s'orienter pour répondre à deux questions :

· Quels sont les facteurs qui sont responsables ou du moins accompagnent l'immunisation ? La race, le caractère de la mutation, le type de produit utilisé pour le traitement sont ils déterminants ?

· Quels sont les particularités des 75% de patients qui ne développent pas d'anticorps anti-facteur de coagulation ? Des caractéristiques particulières de leur système immunitaire, l'âge du patient lors du premier contact avec le produit de substitution jouent-ils un rôle ?

Il résulte de ces conclusions que nous devons envisager comme une tache incontournable d'équiper des centres de prise en charge globale de l'hémophilie distribués de façon équitable sur le territoire, tenant compte de la répartition uniforme de la maladie et de sa multiplication inéluctable dans les années à venir. Ces centres doivent travailler en étroite collaboration avec les laboratoires de génétique, les laboratoires d'immunologie et les centres de fractionnement.

CONCLUSION

L'hémophilie est une maladie à transmission récessive liée au sexe secondaire à un déficit en facteur de coagulation F VIII et F IX, l'hémophilie se traduit par des hémorragies incoercibles post traumatiques (hémarthrose, hématome, hémorragie des cavités naturelles)

L'espérance de vie c'est progressivement accru avec le développement des thérapeutiques transfusionnelles, actuellement le traitement est basé sur le traitement substitutif, l'espoir d'un guéris est lié à la thérapie génique.

L'hémophilie reste donc une pathologie grave de la coagulation dont la prise en charge thérapeutique nécessite la participation de multiples intervenants.

Le stage que nous avons effectué aux seins des deux laboratoires de CHU Ben Boulad et Frantz-fanon nous a permis de bien connaître cette maladie et aussi de bien maîtriser tous les tests qui rentrent dans notre objectif autans que futures biologistes.