Etude de sensibilité de streptococcus mutans aux extraits totaux de khaya nyasica

IV.2.2.5. Tests bactériologiques

IV.2.2.5.1. Préparation des milieux de culture

ü Bouillon peptoné

a) Composition (en g/l)

Casein peptoné...................10,0

Sodium chloride..................9,0

pH..................................7,2

b) Préparation

Dissoudre 15g dans un litre d'eau distillée et répartir en récipients appropriés. Stériliser 15 minutes à 121°C à l'autoclave (7).

c) Importance

Le bouillon peptoné est d'une grande importance du fait qu'il peut servir à la culture de la plupart des germes qui ne présentent pas d'exigences particulières.

Le bouillon peptoné est un milieu d'usage courant, utilisé spécialement pour la recherche de la production de l'indole du fait de sa teneur élevée en tryptophane (7).

ü Gélose de Mueller Hinton

a) Composition

Infusion de viande de boeuf:............300,0 ml

Peptone de caséine:.......................17,5 g

Amidon de maïs:..........................1,5 g

Agar:........................................17,0 g

pH............................................7,4

b) Préparation

38 g par litre. Stérilisation à l'autoclave. Pour préparer ce milieu il faut peser 38g de poudre et la mélanger dans 1l d'eau. Il faut homogénéiser puis chauffer en agitant. Il faut porter à ébullition pendant environ une minute. Ensuite il faut stériliser la gélose à l'autoclave durant 15 minutes à 116°C (3).

c) Importance

La gélose Mueller-Hinton est une gélose riche pour la réalisation de l' antibiogramme standard.

Cette gélose standardisée est la gélose permettant de tester l'action des antibiotiques sur les bactéries. Elle peut être additionnée de sang (pour les Streptococcus), d'extrait globulaire (pour Haemophilus), Elle doit être coulée en boîte de façon à obtenir une épaisseur de 4 mm. Il existe un bouillon équivalent (3).

IV.2.2.5.2. Préparation de l'inoculum

Ajouter 1ml d'eau distillée dans une ampoule contenant une souche pure de S. mutans ATCC (Américain type culture collection) N°35668 et homogénéiser.

IV.2.2.5.3. Préparation des dilutions

Nous avons préparé la concentration des dilutions des extraits végétaux, au départ, nous avons pesé 100mg de notre extrait végétal que nous avons dilué d'abord dans 1ml de bouillon. Après la dissolution, nous avons porté le volume à 2ml avec le bouillon peptoné, que nous avons représenté à la figure 5.

IV.2.2.5.4. Repiquage des résultats en gélose Mueller Hinton

Le repiquage des dilutions ayant manifesté l'absence visible de croissance bactérienne est effectué sur gélose Mueller Hinton dans le but de voir s'il y'a des survivants et la détermination de la CMB qui est la concentration minimale bactéricide.

Procédé :

Ensemencer successivement les dilutions ne présentant pas trouble à l'aide d'une anse de platine sur gélose dans une boite pétri. Laisser incuber pendant 24 heures à une température de 37°C à l'étuve.

Figure 7 : Schéma de la préparation des dilutions des extraits végétaux.

IV.2.2.5.5. Préparation des dilutions des extraits végétaux

Pour préparer la concentration de 50mg/ml, nous avons commencé par peser 100mg d'extrait végétal que nous avons dilué d'abord dans 1ml de bouillon, puis nous avons homogénéisé. Après dissolution, nous avons porté le volume à 2ml avec le bouillon peptoné.

- Nous avons 8 tubes au départ, 1 contenant le bouillon peptoné, 1 autre contient 100mg de l'extrait et 2 ml de bouillon et 6 tubes à hémolyse pour la dilution placés dans un portoir que nous avons représenté par les lettres : a, b, c, d, e et f de la figure 7.

- Mettre 1ml de bouillon peptoné dans tous les 6 tubes à hémolyse

- Dans le premier tube (a), ajoutez l'extrait végétal, bien homogénéisez et porter à un volume de 2ml avec le bouillon peptoné

- Dans (a), prélever 1ml, mettre dans (b) et homogénéiser ;

- Dans (b), prendre 1ml, mettre dans (c), et homogénéiser ;

- Reprendre la même opération jusqu'au sixième tube (f) ;

- Du sixième tube (f), pour garder le même volume partout, prélever1ml du mélange et le jeter.

- On aussi réalisé une gamme de dilutions croissantes en progression géométrique de raison 2, soit respectivement 1,   ;   ; ; ;  ; ces dilutions correspondent respectivement aux concentrations en mg/ml de 50 ; 25 ; 12,5 ;6,25 ;3,125 et 1,5625.

- Ensemencer successivement toutes les dilutions à l'aide d'une anse de platine à partir de l'inoculum de Streptococcus mutans préalablement préparé et incuber toutes les dilutions à l'étuve pendant 24heures à une température de 37°C.

IV.2.2.5.6. Lecture des résultats en bouillon peptoné

Cette lecture des résultats se fait par une observation visuelle après nous ayons ensemencé notre galerie.

Et cela se fait soit par la présence ou l'absence de turbidité 

- Si nous remarquons de turbidité ou le bouillon devient trouble, cela veut tout simplement dire qu'il y a eu croissance bactérienne et notre espèce végétale n'a pas d'effet antibactérien face à ce germe.

- Si nous ne remarquons pas de turbidité, donc, le bouillon n'est pas trouble, il y'a eu inhibition de la poussée bactérienne, cela veut dire que notre plante possède des effets antibactériens face à notre germe.

IV.2.2.5.7. Lecture de résultats sur gélose de Mueller Hinton

La poussée bactérienne sur ce milieu se traduit par la présence de colonies et d'une hémolyse verdâtre autour de la colonie dans un résultat négatif et par l'absence de ces dernières dans un résultat positif.

Après 24 heures d'incubation, la poussé bactérienne sur gélose Mueller Hinton qui est un milieu solide se traduit par la présence de colonies et d'une hémolyse verdâtre autour de la colonie dans un résultat négatif et par l'absence de ces dernières dans un résultat positif.