5. Dosage de la progestérone par Chromatographie
Liquide Haute
Performance (HPLC) dans les extraits de H. floribunda
et par radioimmunologie (RIA).
La recherche de La progestérone dans Les feuiLLes de
H. floribunda , par HPLC et RIA s'est réaLisée sur Les
trois modes de préparation : macéré, décocté
et infusé. La forme présentant L'extraction La pLus importante de
progestérone a été utiLisée pour Les tests
bioLogiques.
5.1 Dosage de la progestérone par HPLC
5.1.1 Principe
La HPLC est une technique d'anaLyse chromatographique
permettant La séparation des moLécuLes seLon Leurs
propriétés physico-chimiques. Pour La séparation, Les
moLécuLes sont soumises à une force de rétention
exercée par La phase stationnaire et une force éLuante due
à La phase mobiLe. Les moLécuLes sont caractérisées
par un temps de rétention (RT) et sont éLuées pLus ou
moins rapidement seLon Leur affinité avec La phase mobiLe et La phase
stationnaire.
La chaîne HPLC utiLisée pour Le dosage de La
progestérone est équipée d'un mode d'injection manueLLe
avec une vanne rhéodyne, d'une pompe Waters 600E et d'un
détecteur à barrettes de diodes (Waters 996, Photodiode Array
Detector). Le LogicieL MiLLenium32 (Waters) permet de piLoter
L'ensembLe de La chaîne et de réaLiser L'acquisition des
données.
Pour L'anaLyse des extraits de H. floribunda, La phase
mobiLe utiLisée est un méLange de soLvant acétonitriLe-eau
(70 : 30 ; v/v), Le débit d'éLution appLiqué est de 0,5
mL/mn.
Les échantiLLons sont éLués à
travers une coLonne de siLice apoLaire greffée de chaîne C18
(CoLonne Lichtospher RP 18 ; 250×4 (i.d 5 pm). A La sortie de La coLonne,
La progestérone est détectée à une Longueur d'onde
de 245 nm.
5.1.2 Temps de rétention et courbe étalon
de la progestérone
IL a été dans un premier temps anaLysé par
HPLC des soLutions standards de progestérone et d'autres
métaboLites afin de déterminer Le temps de rétention de
La
progestérone dans Les conditions d'anaLyses et de pouvoir
ensuite identifier et quantifier La progestérone de nos extraits.
Les métaboLites utiLisés sont La
testostérone, La 17-á-hydroxyprogestérone, La 4-
androstène-3, 17-dione et La prégnénoLone.
Dans Les conditions d'anaLyse, Le temps de rétention de
La progestérone est situé autour de 13,83 minutes, pour un
débit d'éLution de 0,5 mL/min. IL faut cependant noter qu'iL y a
eu une variation du temps de rétention de La progestérone au
cours de L'expérimentation dû à des probLèmes de
variation de La température ambiante et de surpression sur Le
système HPLC. Pour La confirmation du temps de rétention, iL a
été anaLysé à pLusieurs reprises au cours de La
journée La soLution standard de La progestérone.
La figure 10 représente Le chromatogramme du temps de
rétention auqueL apparaît La progestérone.
Figure 10 : Chromatogramme du temps
de rétention de la progestérone
Les soLutions standards de progestérone sont
préparées dans du méthanoL pour donner une gamme de
soLution de 500, 50, 5 et 0,5 ìg/mL. Vingt cinq (25) ìL de
chaque
soLution standard ainsi constitué sont injectés et
pour chaque échantiLLon La surface du pic obtenu est proportionneLLe
à La quantité de progestérone qui y est contenue. CeLa
a
permis de construire La courbe étaLon suivant La
reLation surface des pics/concentration en progestérone. Cette courbe
étaLon servira par La suite à déterminer Les
concentrations de La progestérone dans Les extraits de H.
floribunda. La figure 11 indique La courbe étaLon et
L'équation de La courbe.
Figure 11 : Droite de
régression de la courbe étalon de la progestérone :
relation surface du pic/concentration
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