Etude du polymorphisme génétique du virus de l'enroulement des feuilles (TYLCV) de tomate (Lycopersicum esculentum) dans la zone de Baguinéda au Mali

DISCUSSION

La maladie de l'enroulement des feuilles jaunes en cuillère de tomate est la plus dévastatrice des maladies de la tomate. Beaucoup de ces espèces virales appartiennent au genre begomovirus de la famille des geminiviridaes qui ont été associées à la tomate [14]. Deux espèces sont connues comme agent causal de la maladie au niveau de l'hémisphère ouest, TYLCV (type Israélite) et TYLCSV-ES [2] (type Sardingue).Ces deux espèces se retrouvent en Espagne et en Italie [5]. Ces virus sont transmis pour la mouche blanche de l'espèce Bemisia tabaci.

L'identification moléculaire est nécessaire pour évaluer la diversité génétique des souches qui circulent afin de développer des mesures de prévention contre les isolats qui s'avèrent néfastes pour la culture des tomates.

Au cours de cette étude nous avons testé 24 échantillons. Ils ont été prélevés à Baguinéda (Zone traditionnelle de production de tomate au Mali) et en périphérie de la ville de Bamako.

Cette étude serait une contribution à la connaissance des virus circulants dans la zone de Baguineda zone par excellence de maraîchage.

. La limite de l'utilisation de nos amorces est que la mise en évidence de la diversité est strictement fonction des souches israélite et Sardingue.

Parmi les vingt quatre échantillons de tomate traités, quinze ont pu être amplifiés soit un total de 62.5% et neuf non amplifiés soit un total de 37,5%. Cet échec serait dû probablement soit à des délétions ou ajouts de nucléotides qui changeraient les séquences sur lesquelles les amorces s'apparieront [5] ,ou probablement à l'existence des formes hybrides qui ont étés observés par d'autres auteurs ([16] ; [17]), que nos amorces ne pouvaient pas reconnaître afin d'initier les réactions d'amplification par PCR La négativité de l'amplification par PCR peut s'expliquer aussi par l'absence du génome viral dans les échantillons de feuilles collectées.

Selon la taille des produits de multiplex PCR observé chez ces échantillons, nous avons trouvé trois types de fragments. Le premier fragment correspondant au génotype TYLCVMld a été retrouvé au Sénégal et au Cape Vert [2]. Ce génotype est lié sur le plan génétique à la souche retrouvée au Moyen Orient [2]. Quant au second, il correspond au génotype TYLCSV-ES [2] (type Sardingue), il se retrouve en Espagne et en Italie ou il cause le changement de coloration des feuilles (qui deviennent aussi jaunes) et le rabougrissement des plants de tomate. Ce génotype a été retrouvé au Mali au cours de notre étude. Le troisième génotype TYLCV est une souche cosmopolite retrouvée sur tous les continents [5]. Cependant ce génotype serait lié à la souche TYLCV de type Israélite.

L'examen des fragments de PCR a montré que l'amplification par une même paire d'amorce montre la présence de plusieurs fragments dont les tailles varient sur le gel d'agarose.

Pour le cas de TYLCV (type israélite), les tailles ont varié de 638 à 618 paires de bases sur le même gel g'agarose. Nous pensons que chaque fragment représente un type de TYLCV (Israélite). Pour le TYLCSV-ES [2] (type Sardingue), la taille des fragments ont varié de 401 à 360 paires de bases sur le même gel. Et pour le TYLCVMld (type Méditerranéen), de 290 à 276 paires de bases sur le même gel d'agarose. Cette observation donne une autre dimension à notre analyse, c'est-à-dire la notion de polymorphisme de taille généré soit par addition ou délétion de base sur la région cible de l'amplification par les amorces (thèse de Koita).

Ainsi pour la souche TYLCV la taille moyenne était 629 Pb, ce qui diffère de 5 Pb de la taille attendue (figure2.) En utilisant les marqueurs pour le génotype TYLCSV-ES [2], la moyenne de la taille des fragments était 386 paires de bases ce qui diffère de 48 paires de bases par rapport à la taille du fragment de référence (figure 4). Quant au génotype TYLCVMld, il y a une différence de 32 paires de bases entre la moyenne des fragments obtenus au cours de notre étude et le fragment de référence (figure 3).

Le génotype TYLCV (type Israélite) et TYLCVMld (type Méditerranéen) sont associés au rabougrissement de la plante (p = 0,03). Mais nous n'avons pas retrouvé une relation statistiquement significative entre l'enroulement des feuilles et les deux génotypes, quoiqu'il y ait des plantes infectées avec ces deux génotypes présentaient des feuilles enroulées. Le fait que ces deux génotypes produisent les mêmes symptômes est compréhensible, ils appartiennent à la même espèce TYLCV (type Israélite)

Par contre l'enroulement des feuilles était associé d'une manière statistiquement significative avec la présence de TYLCSV-ES [2] (type Sardingue) p = 0,001.

Ainsi, nous pouvons suggérer que la sévérité de la maladie dépend de la présence simultanée des trois génotypes qui appartiennent à deux espèces.

La conséquence de cette multiple infection par les trois génotypes est que la mouche blanche (B tabaci) peut être infectée par les trois génotypes. La présence de ces trois génotypes pourrait entraîner la formation des formes recombinantes à la suite de brassage génétique ([4] ; [13]).

Nous avons observé que le TYLCV et TYLCVMld sont associés et ils représentent la souche Israélite avec 37,5% de fréquence tandis que le TYLCSV-ES [2] révèle la présence de la souche Sardiniavirus avec 62,5% de fréquence. Cela était attendu car la même amorce aller permet à la fois d'amplifier TYLCV et TYLCVMld (tableau III).

Les produits amplifiés par multiplex PCR ont montré des fragments de taille differentes.Trois types de fragments ont été obtenus.

Le fragment de 629 paires de bases se rapprocherait du génotype TYLCV qui présente 634 paires de bases selon l'étude Anfoka et al [6] (figure2). Le second fragment a une taille de 386 paires de bases cette taille serait proche de la taille du génotype TYLCSV-ES [2] avec 434 paires de bases que  Anfoka et al auront observés à leur étude (figure4).

Enfin le troisième fragment observé au cours de notre étude aurait 284 paires de bases qui se rapprocheraient du génotype TYLCVMld de type Méditerranéen qui a une taille de 316 paires de bases (figure3). Il faudra noter que cette différence entre les tailles de nos génotypes avec ceux obtenus par Anfoka et al peuvent avoir pour cause ; 1] les conditions de migration electrophoretique de notre laboratoire (notre temps de migration était différent de celui de Anfoka et al ;2] aux réarrangement, insertion ou délétion qui pourraient joués sur la longueur des segment d'ADN venant des souches locales, indiquerait des virus différents.

La technique de séquençage serait l'outil idéal pour confirmer cette observation.

Donc notre étude montre que les trois génotypes trouvés ailleurs [11] se retrouve au Mali Mais la fréquence des trois génotypes est différentes ainsi TYLCSV-ES [2] était le plus présent avec 62.5%(15/24) suivi des deux autres qui se trouvent dans un système de co-infection (infection simultanée de la tomate par les deux génotypes), de l'ordre de 37,5%.

Cependant à l'intérieur des génotypes TYLCSV-ES [2], nous avons un polymorphisme de taille. Nous avons une variation de taille de 401 à 360 paires de bases, suggérant l'existence des sous types de cette souche. Ce phénomène est observé dans d'autres systèmes viraux tels que le VIH. Il en est de même chez les deux génotypes (TYLCV et TYLCVMld).

L'enroulement des feuilles et le changement des couleurs sont des paramètres qui n'ont pas données une relation statistiquement significative chez le TYLCV et le TYLCVM1d (X² = 4.126 et p = 0.078), par contre, le rabougrissement a donné une relation statistiquement significative chez ces deux isolats (X² = 9.455 et p= 0.003).

Chez le TYLCSV-ES [2], l'enroulement des feuilles (X² = 13.333 et p = 0.001) et le rabougrissement (X² = 12.185 et p = 0.001) ont donnés une relation statistiquement significative. Le changement de couleur n'a pas présenté une relation statistiquement significative (X² = 3.789 et p = 0.118).

L'analyse par le test de Fisher montre qu'il existe une relation statistiquement significative entre les symptômes et génotype. Cette variabilité de ce génome viral peut conduire à la formation de formes hybrides [8,12] (résultats des recombinaisons entre deux génotypes) comme constaté par Sánchez-Campos, S [15]. La conséquence de cette réarrangement génétique est d'accroître le répertoire antigénique des ces virus empêchant le développement normal de la plante. Plusieurs symptômes sont associées à la présence des Begomovirus chez la tomate (enroulement des feuilles, coloration des feuilles et le rabougrissement générale de la plante. Ces observation ont été aussi faites par Konaté [10].

Il y a plusieurs méthodes de typer le génome, nous avons utilisé la technique de multiplex PCR [9] qui permet de détecter simultanément différents fragments d'ADN d'un microorganisme donné. Elle a l'avantage d'être économique (moins de réactifs), avec un temps assez court pour l'amplification. Par contre, elle requiert que les amorces aient la même température d'appariement. Aussi il était possible d'utiliser la RFLP, cette technique demande une grande quantité d'ADN et ce qui n'est pas le cas lorsqu'on à faire des souches sauvages collectées sur le terrain.