Memoire Online - Etude du polymorphisme génétique du virus de l'enroulement des feuilles (TYLCV) de tomate (Lycopersicum esculentum) dans la zone de Baguinéda au Mali

Etude du polymorphisme génétique du virus de l'enroulement des feuilles (TYLCV) de tomate (Lycopersicum esculentum) dans la zone de Baguinéda au Mali.

Introduction:

Le Mali est un pays à vocation agro-sylvo-pastorale, ou plus de 80% de la population vivent du secteur du développement rural où l'agriculture occupe la première place (72% avec un taux de croissance autour de 1,5%) [3]. L'agriculture est pratiquée aussi bien en saison pluvieuse qu'en contre saison. La culture de contre saison est dominée par le maraîchage et surtout la culture de la tomate qui constitue un élément très important dans la consommation alimentaire quotidienne.

D'après une étude récente [9] les petits exploitants utilisent en moyenne 0,2 hectares pour leur consommation personnelle et la vente locale.

Le rendement moyen de production est de 17,4 tonnes par hectare [9] contre 39,2 tonnes par hectare en Amérique, 19.4t/ha en Amérique Latine D'après le Comité Inter état de Lutte contre la Sécheresse au Sahel (CILSS), le rendement moyen est de 20t/ha [10].Cette différence peut être due à beaucoup de facteurs : nutrition minérale, les semences, les insectes, les agents pathogènes et autres. L'un des agents pathogènes est le virus de l'enroulement des feuilles jaunes en cuillère de la tomate (TYLCV), constituant un des problèmes majeurs pour les producteurs de tomates au Mali, et cités comme une des raisons de la fermeture de l'usine de transformation de tomate concentrée (SOCAMO) [9] Selon l'IER , cette virose est plus importante dans la zone traditionnelle de production (Baguinéda) que dans la zone plus récente de production (Office du Niger) [9]

Sur la base des symptômes, l'incidence de cette virose peut atteindre 80-100% de perte production au Burkina, Sénégal et au Mali [10]. La perte de production varie de 80-100% selon les zones et la précocité de l'infection.

Les méthodes de luttes classiques telles que les luttes chimique, biologique et les pratiques culturales sont insuffisantes contre le TYLCV.

La lutte chimique a pour corollaire la pollution de l'environnement et des intoxications néfastes pour la santé humaine.

Des recherches sont entreprises sur des méthodes de lutte biologique, mais pour trouver un ennemi naturel adéquat sera une tâche difficile [1].

La lutte par les pratiques culturales comprend le choix des dates de plantation de manière à éviter les populations élevées du vecteur, l'élimination des sources primaires et secondaires du virus, l'utilisation de protection pour exclure le vecteur et l'utilisation de transplants sains. Des recherches sont menées sur la résistance [11] et l'on a découvert des cultivars plus résistants. Des pieds de tomate contenant la protéine de capside de TYLCV sont résistants au virus [19].

La manipulation génétique est une piste à explorer pour le contrôle du TYLCV car le génome du virus peut être cartographié et des gènes qui seraient à la base de la résistance de la tomate au virus identifiés. Cette résistance de la tomate serait liée au gène de la capside du TYLCV.

La technique d'amplification de l'ADN par PCR et la détermination de la séquence nucléotidique par séquençage permettent d'examiner le polymorphisme du génome du virus. Ainsi, nous nous sommes proposés d'étudier la relation entre les génotypes de TYLCV et les symptômes de cette virose.

Généralités :

Etudier le polymorphisme génétique des virus de TYLCV sur la tomate par la technique PCR.

Déterminer les fréquences des différentes souches de TYLCV présentes dans la zone d'étude.

Echantillonnage : La collecte des feuilles sera faite dans toutes les zones d'étude et les feuilles sont stockée à -20°C avant l'extraction de l'ADN.

Extraction : l'ADN sera extrait à partir des feuilles infectées de tomate selon la méthode CTAB 3%).

A chaque tube, contenant 1 ou 2 centimètres de feuille de tomate infectée, 500ul du tampon de CTAB (100mM de Tris PH 8.0, 50mM d ; EDTA, 500mM de Na Cl) sera ajoutée puis incubée à 65 ° C pendant 10 minutes. Ajouté 400ul de chloroforme pour centrifuger à 10000rpm durant 10 mn. Après centrifugation récupérer le surnageant dans un autre tube contenant de l'isopropanol pour précipiter l'ADN. Apres lavage avec l'éthanol 70%, 200ul de TE est ajouté pour la PCR et sa conservation.

Amplification par PCR des feuilles collectées.

Les conditions du thermocycleur sont optimisées pour la détection des souches Israélite et Sardingue avec les amorces spécifiques aux trois isolats (TYLCV, X15656, TYLCSV-ES [2], L27708 etTYLCV-M1d, X76319). Les paramètres pour la réaction de PCR sont optimisés pour un volume de 25 ul. La concentration finale des composantes de réaction : 2ul dNTPs, 2.5ul Buffer 10X PCR, 0.25ul de Taq Polymerase, 1ul de l'amorce sens et 1ul de l'anti-sens et 1ul d'ADN. Les paramètres de cycle sont comme suit : un cycle à 94° C pendant 10 minutes; 30 cycles à 94°C pendant pour1 minute, 58°C pour 1minute, 72°C pour 1minute, 72°C pendant 10 minutes et enfin 4°C pour toujours .

Résultats Sur un total de quarante cinq échantillons, vingt quatre ont été traités par la technique de multiplex PCR. Chaque échantillon a été amplifié par les trois paires d'amorces, quinze se sont révélés positifs et neufs négatifs.

Tableau IV : distribution de la taille des bandes aux isolats et la répartition des virus

		TYLCV	TYLCSV-ES [2]	TYLCV Mld
N	Présence	6	15	6
	Absence	18	9	18
Moyenne de la taille des bandes		629.1667	386.4667	284.5000
Minimum de la taille des bandes		618.00	360.00	276.00
Maximum de la taille des bandes		638.00	401.00	290.00

Le tableau IV montre la répartition des échantillons et la taille des fragments observés aux trois isolats ainsi que les variations de la taille des bandes par les différentes PCR.

Figure 2: gel d'agarose présentant les bandes amplifiées par les marqueurs de TYLCV

La figure2 présente les bandes de TYLCV sur gel d'agarose dont la taille est estimée à 629 pb. Chacun des échantillons au niveau des puits 1, 2, 3 et 4 présentent une bande unique. Le premier puits contient le marqueur de poids moléculaire VI (Roche Diagnostics Corporation, Mannheim, RFA)

Figure 3: gel d'agarose montrant la bande de l'amplification attendue par les marqueurs de TYLCVM1d

La figure3 présente une bande de TYLCVMld sur gel d'agarose dont la taille est estimée à 284 pb. Le premier puits contient le marqueur de poids moléculaire VI (Roche Diagnostics Corporation, Mannheim, RFA)

Figure 4: gel d'agarose montrant l'amplification de trois échantillons avec les marqueurs TYLCSV-ES [2]

La figure4 présentes les bandes de TYLCSV-ES [2] sur gel d'agarose dont la taille moyenne est estimée à 386 pb. Les échantillons 1, 2, 4 et 5 ont produit des bandes qui correspondent au génotype TYLCSV-ES [2]. Le premier puits contient le marqueur de poids moléculaire VI (Roche Diagnostics Corporation, Mannheim, RFA)

souches	Isolats	Positivité des échantillons par PCR	Fréquences
Souche Israélite	TYLCV	9	37.5%
	TYLCVMld
Souche Sardinia virus	TYLCSV-ES [2]	15	62.5%

Le tableau V présente la fréquence des génotypes obtenus par amplification par PCR par les amorces TYLCV ; TYLCVMld (Souche israélite) et TYLCSV-ES [2] (souche Sardingue). Nous avons observé que la souche Sardingue était la plus fréquemment retrouvée (62,5) soit 15/24.

Figure 5: Polymorphismes du TYLCV sur gel d'agarose. Cette photo présente les bandes des trois isolats sur gel d'agarose amplifiées simultanément avec les 3 paires d'amorce dans le même test tube. Il faut noter que bandes non spécifiques sont visibles sur le gel d'agarose. Le premier puits contient le marqueur de poids moléculaire VI (Roche Diagnostics Corporation, Mannheim).

Type d'infection	Fréquence	Pourcentage
Mono infection	9	37,5
PCR négative	9	37.5
Poly infection	6	25,00
Total	24	100,00

Dans le tableau VI, nous avons reparti les échantillons selon qu'une seule (mono - infection) ou plusieurs bandes (poly-infection) sont observées avec les trois amorce données.

Nous n'avons pas pu examiner des échantillons à cause de la négativité des PCR.

Un quart de l'infection est multiple avec la présence de plus d'un génotype alors que la mono infection était de 37,5%. Nous notons que neuf échantillons sont restés indéterminés parce que leur amplification a été négative.

Tableau VII : Distribution des mono et poly infections aux différentes souches.

souches	Isolâtes	Mono infection	Poly infection	fréquence	Pourcentage
Israélite	TYLCV	0	6	6	40%
	TYLCV Mld	0	6
Sardingue	TYLCSV-ES [2]	9	6	9	60%
Total		9	6	15	100%

Le tableau VII montre qu'avec l'amorce TYLCV, plusieurs génotypes ont été observés simultanément sur les pieds de tomate avec une fréquence de 40%, aucun cas d'infection mono spécifique n'est observer. Par contre, l'amorce TYLCV-ES [2] présente des infections monoclonales (60%) et poly clonales (40%).

Souches	Isolats	Symptômes
		Enroulement de la feuille	Rabougrissement	Variation de couleur des feuilles
Israélite	TYLCV	-	+	+
	TYLCVMld	-	+	+
Sardingue	TYLCSV-ES [2]	+	+	-

L'examen de la relation entre les symptômes et les génotype montre que les génotypes Sardingue ne présentent pas de variation de couleur mais des feuilles enroulées et rabougries et cela de façon statistiquement significative (X²= 13,333 et p = 0.001) tandis que les génotypes israélites ne présentent pas de feuilles enroulées mais des plants rabougris dont les couleurs varient. Cette relation n'était pas statistiquement significative (X²= 4,126 et p = 0,078).

DISCUSSION

La maladie de l'enroulement des feuilles jaunes en cuillère de tomate est la plus dévastatrice des maladies de la tomate. Beaucoup de ces espèces virales appartiennent au genre begomovirus de la famille des geminiviridaes qui ont été associées à la tomate [14]. Deux espèces sont connues comme agent causal de la maladie au niveau de l'hémisphère ouest, TYLCV (type Israélite) et TYLCSV-ES [2] (type Sardingue).Ces deux espèces se retrouvent en Espagne et en Italie [5]. Ces virus sont transmis pour la mouche blanche de l'espèce Bemisia tabaci.

L'identification moléculaire est nécessaire pour évaluer la diversité génétique des souches qui circulent afin de développer des mesures de prévention contre les isolats qui s'avèrent néfastes pour la culture des tomates.

Au cours de cette étude nous avons testé 24 échantillons. Ils ont été prélevés à Baguinéda (Zone traditionnelle de production de tomate au Mali) et en périphérie de la ville de Bamako.

Cette étude serait une contribution à la connaissance des virus circulants dans la zone de Baguineda zone par excellence de maraîchage.

. La limite de l'utilisation de nos amorces est que la mise en évidence de la diversité est strictement fonction des souches israélite et Sardingue.

Parmi les vingt quatre échantillons de tomate traités, quinze ont pu être amplifiés soit un total de 62.5% et neuf non amplifiés soit un total de 37,5%. Cet échec serait dû probablement soit à des délétions ou ajouts de nucléotides qui changeraient les séquences sur lesquelles les amorces s'apparieront [5] ,ou probablement à l'existence des formes hybrides qui ont étés observés par d'autres auteurs ([16] ; [17]), que nos amorces ne pouvaient pas reconnaître afin d'initier les réactions d'amplification par PCR La négativité de l'amplification par PCR peut s'expliquer aussi par l'absence du génome viral dans les échantillons de feuilles collectées.

Selon la taille des produits de multiplex PCR observé chez ces échantillons, nous avons trouvé trois types de fragments. Le premier fragment correspondant au génotype TYLCVMld a été retrouvé au Sénégal et au Cape Vert [2]. Ce génotype est lié sur le plan génétique à la souche retrouvée au Moyen Orient [2]. Quant au second, il correspond au génotype TYLCSV-ES [2] (type Sardingue), il se retrouve en Espagne et en Italie ou il cause le changement de coloration des feuilles (qui deviennent aussi jaunes) et le rabougrissement des plants de tomate. Ce génotype a été retrouvé au Mali au cours de notre étude. Le troisième génotype TYLCV est une souche cosmopolite retrouvée sur tous les continents [5]. Cependant ce génotype serait lié à la souche TYLCV de type Israélite.

L'examen des fragments de PCR a montré que l'amplification par une même paire d'amorce montre la présence de plusieurs fragments dont les tailles varient sur le gel d'agarose.

Pour le cas de TYLCV (type israélite), les tailles ont varié de 638 à 618 paires de bases sur le même gel g'agarose. Nous pensons que chaque fragment représente un type de TYLCV (Israélite). Pour le TYLCSV-ES [2] (type Sardingue), la taille des fragments ont varié de 401 à 360 paires de bases sur le même gel. Et pour le TYLCVMld (type Méditerranéen), de 290 à 276 paires de bases sur le même gel d'agarose. Cette observation donne une autre dimension à notre analyse, c'est-à-dire la notion de polymorphisme de taille généré soit par addition ou délétion de base sur la région cible de l'amplification par les amorces (thèse de Koita).

Ainsi pour la souche TYLCV la taille moyenne était 629 Pb, ce qui diffère de 5 Pb de la taille attendue (figure2.) En utilisant les marqueurs pour le génotype TYLCSV-ES [2], la moyenne de la taille des fragments était 386 paires de bases ce qui diffère de 48 paires de bases par rapport à la taille du fragment de référence (figure 4). Quant au génotype TYLCVMld, il y a une différence de 32 paires de bases entre la moyenne des fragments obtenus au cours de notre étude et le fragment de référence (figure 3).

Le génotype TYLCV (type Israélite) et TYLCVMld (type Méditerranéen) sont associés au rabougrissement de la plante (p = 0,03). Mais nous n'avons pas retrouvé une relation statistiquement significative entre l'enroulement des feuilles et les deux génotypes, quoiqu'il y ait des plantes infectées avec ces deux génotypes présentaient des feuilles enroulées. Le fait que ces deux génotypes produisent les mêmes symptômes est compréhensible, ils appartiennent à la même espèce TYLCV (type Israélite)

Par contre l'enroulement des feuilles était associé d'une manière statistiquement significative avec la présence de TYLCSV-ES [2] (type Sardingue) p = 0,001.

Ainsi, nous pouvons suggérer que la sévérité de la maladie dépend de la présence simultanée des trois génotypes qui appartiennent à deux espèces.

La conséquence de cette multiple infection par les trois génotypes est que la mouche blanche (B tabaci) peut être infectée par les trois génotypes. La présence de ces trois génotypes pourrait entraîner la formation des formes recombinantes à la suite de brassage génétique ([4] ; [13]).

Nous avons observé que le TYLCV et TYLCVMld sont associés et ils représentent la souche Israélite avec 37,5% de fréquence tandis que le TYLCSV-ES [2] révèle la présence de la souche Sardiniavirus avec 62,5% de fréquence. Cela était attendu car la même amorce aller permet à la fois d'amplifier TYLCV et TYLCVMld (tableau III).

Les produits amplifiés par multiplex PCR ont montré des fragments de taille differentes.Trois types de fragments ont été obtenus.

Le fragment de 629 paires de bases se rapprocherait du génotype TYLCV qui présente 634 paires de bases selon l'étude Anfoka et al [6] (figure2). Le second fragment a une taille de 386 paires de bases cette taille serait proche de la taille du génotype TYLCSV-ES [2] avec 434 paires de bases que Anfoka et al auront observés à leur étude (figure4).

Enfin le troisième fragment observé au cours de notre étude aurait 284 paires de bases qui se rapprocheraient du génotype TYLCVMld de type Méditerranéen qui a une taille de 316 paires de bases (figure3). Il faudra noter que cette différence entre les tailles de nos génotypes avec ceux obtenus par Anfoka et al peuvent avoir pour cause ; 1] les conditions de migration electrophoretique de notre laboratoire (notre temps de migration était différent de celui de Anfoka et al ;2] aux réarrangement, insertion ou délétion qui pourraient joués sur la longueur des segment d'ADN venant des souches locales, indiquerait des virus différents.

La technique de séquençage serait l'outil idéal pour confirmer cette observation.

Donc notre étude montre que les trois génotypes trouvés ailleurs [11] se retrouve au Mali Mais la fréquence des trois génotypes est différentes ainsi TYLCSV-ES [2] était le plus présent avec 62.5%(15/24) suivi des deux autres qui se trouvent dans un système de co-infection (infection simultanée de la tomate par les deux génotypes), de l'ordre de 37,5%.

Cependant à l'intérieur des génotypes TYLCSV-ES [2], nous avons un polymorphisme de taille. Nous avons une variation de taille de 401 à 360 paires de bases, suggérant l'existence des sous types de cette souche. Ce phénomène est observé dans d'autres systèmes viraux tels que le VIH. Il en est de même chez les deux génotypes (TYLCV et TYLCVMld).

L'enroulement des feuilles et le changement des couleurs sont des paramètres qui n'ont pas données une relation statistiquement significative chez le TYLCV et le TYLCVM1d (X²= 4.126 et p = 0.078), par contre, le rabougrissement a donné une relation statistiquement significative chez ces deux isolats (X²= 9.455 et p= 0.003).

Chez le TYLCSV-ES [2], l'enroulement des feuilles (X²= 13.333 et p = 0.001) et le rabougrissement (X²= 12.185 et p = 0.001) ont donnés une relation statistiquement significative. Le changement de couleur n'a pas présenté une relation statistiquement significative (X²= 3.789 et p = 0.118).

L'analyse par le test de Fisher montre qu'il existe une relation statistiquement significative entre les symptômes et génotype. Cette variabilité de ce génome viral peut conduire à la formation de formes hybrides [8,12] (résultats des recombinaisons entre deux génotypes) comme constaté par Sánchez-Campos, S [15]. La conséquence de cette réarrangement génétique est d'accroître le répertoire antigénique des ces virus empêchant le développement normal de la plante. Plusieurs symptômes sont associées à la présence des Begomovirus chez la tomate (enroulement des feuilles, coloration des feuilles et le rabougrissement générale de la plante. Ces observation ont été aussi faites par Konaté [10].

Il y a plusieurs méthodes de typer le génome, nous avons utilisé la technique de multiplex PCR [9] qui permet de détecter simultanément différents fragments d'ADN d'un microorganisme donné. Elle a l'avantage d'être économique (moins de réactifs), avec un temps assez court pour l'amplification. Par contre, elle requiert que les amorces aient la même température d'appariement. Aussi il était possible d'utiliser la RFLP, cette technique demande une grande quantité d'ADN et ce qui n'est pas le cas lorsqu'on à faire des souches sauvages collectées sur le terrain.

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