Figure 3: Schéma de
synthèse du criblage phytochimique
III-5- ETUDE PHARMACOLOGIQUE: ANTIBIOGRAMME FONGIQUE
(11,25, 31)
III-5-1- Milieu de culture
Nous avons utilisé le milieu de SABOURAUD
additionné de chloramphénicol (antibiotique s'opposant à
la prolifération des bactéries contaminantes).
Composition:
- Peptone 10 g
- Glucose 20 g
- Agar 15 g
- Chloramphénicol 0,5 g
- Eau distillée stérile Q.S.P. 1000 ml
pH: 6,0 0,2
Le mélange est ensuite porté au bain-marie
bouillant pendant 15 mn pour être dissout. Après dissolution le
milieu est stérilisé à l'autoclave pendant 15 mn à
118° C (après contôle du pH). Le milieu est refroidi et
coulé dans des boîtes de pétri stériles de 90 mm de
diamètre. Après séchage à la température
ambiante du laboratoire (environ 25° C), les boîtes sont
gardées au réfrigérateur jusqu'aux tests biologiques.
III-5-2- Technique
employée
La technique de diffusion en milieu gélosé est
utilisée.
Des cupules d'environ 5 mm de diamètre sont
creusées dans la gélose à l'aide d'une pipette PASTEUR
stérile. Afin d'éviter la diffusion des extraits à tester
sous la gélose on referme le fond des cupules avec une goutte de
gélose préalablement fondue. L'ensemble est ensuite refroidi et
conservé au frais pour les tests antifongiques.
III-5-3- Inoculum
Il est préparé le jour même de son
utilisation. Il est obtenu à partir d'une culture sur gélose
inclinée de SABOURAUD.
Une colonie de levures prélevée d'une culture
à l'aide d'une anse stérile est homogénéisée
dans 10 ml d'eau physiologique (solution de NaCl 0,9%) stérile. Si la
suspension obtenue est très concentrée on procède à
une dilution au 1/10 (1ml de suspension pour 9 ml d'eau physiologique).
La suspension ainsi obtenue servira à ensemencer les
boîtes de pétri.
III-5-4- Ensemencement
La surface entière de la gélose est
inondée avec 5 ml d'inoculum. L'excès est aspiré à
l'aide d'une pipette stérile. Les boîtes sont ensuite
séchées à l'étuve à 37° C pendant 15
mn.
III-5-5- Solubilisation des
extraits
- L'extrait n-hexanique et la fraction B sont dissouts dans du
diméthylsulfoxyde (D.M.S.O.).
- La fraction A est dissoute dans de l'hexane.
- Les extraits méthanolique et aqueux ont
été dissouts dans de l'eau distillée stérile.
III-5-6- Dépôt des
extraits
100 ul de solution d'extrait (20 mg/ml, 40mg/ml, 80mg/ml
correspondant respectivement à 2; 4; et 8 mg d'extrait
séché) est déposé à l'aide d'une
micro-pipette dans les cupules (trois fois pour chaque extrait ou fraction).
Nous avons aussi testé la non-activité des
solvants utilisés pour la dissolution des extraits et fractions
(n-hexane, D.M.S.O., eau distillée stériles).
Le standard utilisé est le disque d'antibiogramme
imprégné de nystatine 100 unités.
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