Memoire Online - Etude de la chimie et de l'activité anti-mycosique des extraits de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)

II-1-3- Situation de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) dans le règne végétal 4

IV-2-4- Evaluation de l'activité antimycosique des fractions issues du partage liquide-liquide de l'extrait n-hexanique de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) 44

ANNEXES................................................................................................................53

PROBLEMATIQUE

La lutte pour la survie a été et demeure toujours la préoccupation première de tout être vivant. C'est ainsi que les plantes par exemple synthétisent certaines substances à un certain moment de leur cycle pour se protéger contre d'éventuels agresseurs pouvant porter atteinte à leur existence. Ces substances encore appelées métabolites secondaires permettent aux plantes de lutter contre les insectes, les parasites, les bactéries, les virus, les champignons, certains phénomènes naturels...

C'est dans cette optique que l'homme, ne pouvant pas synthétiser toutes les substances nécéssaires à sa protection a depuis les temps anciens jusqu'à nos jours recouru à ces mêmes plantes pour se protéger contre ces mêmes agresseurs ci-dessus cités.

Ces pratiques ancestrales demeurent toujours d'actualité malgré l'arsenal thérapeutique dont dispose aujourd'hui la médecine moderne.

En effet dans le cas de la lutte contre les mycoses causées par les micromycètes qui font l'objet de notre étude, la médecine moderne dispose d'une gamme variée de principes chimiques allant des polyènes aux dérivés imidazolés en passant par les acides organiques et autres. Malheureusement tout cet armada thérapeutique reste hors de portée de la grande majorité des populations du fait non seulement de leur coût relativement élevé, mais aussi et surtout de l'insuffisance d'infrastructures sanitaires auprès desquelles ces populations peuvent en disposer.

De plus, depuis ces dernières décennies, on constate une recrudescence de certaines maladies bénignes par le passé mais devenues morbides et mortelles avec l'apparition du S.I.D.A. (Syndrome d'Immuno-Déficience Acquise).

La déficience immunitaire affaiblissant l'organisme le fait envahir par des micro-organismes.

Les champignons sont de ceux-la qui deviennent très virulents: muguet et autres candidoses digestives, mycoses cutanées sont couramment rencontrés.

Suite à des enquêtes ethno-botaniques réalisées auprès des tradithérapeutes du plateau central du Burkina Faso, des plantes aux propriétés antimycosiques avérées ont été retenues pour des études plus poussées.

Parmi elles, Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) douée de propriétés sensorio-motrices.

Le présent travail consiste essentiellement à effectuer un criblage chimique afin de connaître les grandes familles chimiques auxquelles on peut rattacher les propriétés pharmacodynamiques attribuées à la plante, puis à réaliser quelques expériences "in vitro" en guise de tests biologiques pour confirmer ou infirmer le bien-fondé de telles utilisations.

I- OBJECTIFS

II-1- OBJECTIF GENERAL

Contribuer à la valorisation d'une plante médico-magique (Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)) douée de plusieurs propriétés pharmacodynamiques parmi lesquelles les propriétés antimycosiques.

II-2- OBJECTIFS SPECIFIQUES

- Effectuer une étude chimique de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) en vu d'établir une relation entre les principes chimiques trouvés dans la plante et certaines propriétés pharmacodynamiques qui lui sont attribuées.

- Etudier l'activité antimycosique sur un champignon levuriforme (Candida albicans) des extraits et fractions obtenus après les différents processus d'extractions et de partage.

II- GENERALITES

II-1- BIOPHYTUM PETERSIANUM KLOTZSCH (OXALIDACEAE) (3;4;5;29;33;36; 44)

II-1-1- Synonyme

II-1-2- Noms en langues nationales

II-1-3- Situation de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) dans le règne végétal

II-1-4- Caractères remarquables de la plante

II-1-4-1- Port

Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) est une plante annuelle à tige simple, mince atteignant 10 à 30 cm de haut, pubescente à pubérulente. Elle est sensitive et monocaule.

II-1-4-2- Feuilles

Elles ont une longueur de 2,5 à 4 cm et comportent 3 à 8 paires de folioles rassemblées au sommet de la tige en rosette, plus ou moins denses, sensitives. Les folioles sont subsessiles, asymétriques à la base, rectangulaires, ovales ou orbiculaires; arrondies au sommet, glabrescentes, rachis pubescent.

II-1-4-3- Fleurs

Les inflorescences sont ombelliformes, terminales; avec des pédoncules de 3 à 4 cm de longueur; ou nuls et portant alors des fleurs solitaires jaunes, oranges ou rouges.

II-1-4-4- Fruits

II-1-5- Habitat de la plante

C'est une plante paléotropicale se rencontrant dans toute l'Afrique intertropicale, dans les savanes soudano-zambéziennes. On la trouve aussi en Asie et en Nouvelle Guinée.

II-1-6- Utilisations thérapeutiques traditionnelles de la plante

* Les feuilles pilées, avec une tête de lapin, de l'oignon et du sel, servent à préparer un bouillon qui est consommé une seule fois en cas d'épilepsie.

- le macéré de la plante entière en bain soigne le "luila", maladie caractérisée par des convulsions survenant la nuit chez les enfants; et la croyance populaire attribue à un oiseau d'où le nom de la maladie (en mooré),

- la plante entière est utilisée dans le traitement d'une infection appelée "mobg-maa" ("serres-moi"; en mooré) qui en fait n'est autre que le zona thoracique.

* La plante entière est utilisée sous forme d'infusé à boire, additionné de miel contre les toux rebelles.

* La poudre des feuilles associées à celles de Piliostigma thonningii (Caesalpiniaceae) est utilisée per os dans le traitement des métrorragies et dans les dystocies.

* La plante (tige feuillée) est aussi utilisée dans le traitement des accès pernicieux, des fièvres infantiles, des candidoses digestives, du paludisme nerveux, du prolapsus du rectum, du hoquet et de l'hypogalactie.

En conclusion cette plante a des propriétés tonifiantes pour les nerfs, fébrifuges, dépuratives, cicatrisantes, anticonvulsivantes, fongicides, spasmolytiques, astringentes et galactogènes.

II-1-7- Chimie de la plante

La chimie de la plante est peu connue; cependant selon NACOULMA⁽³³⁾ la plante contient des saponosides, des tanins, des stéroïdes, des triterpènes et des amines.

Selon PARIS et MOYSE⁽³⁶⁾ les Oxalidaceae contiennent des oxalates de calcium sous forme de cristaux insolubles ou de l'oxalate de magnésium (ou potassium) sous forme soluble.

II-2- LES MYCOSES

II-2-1- Définitions (15; 19; 27; 35; 43)

II-2-1-1- Les mycoses

Ce sont des affections provoquées par des champignons microscopiques appelés micromycètes.

- les mycoses superficielles, localisées au niveau de la peau, des phanères et des muqueuses;

- les mycoses sous-cutanées, rares dans les régions tempérées, que l'on rencontre surtout dans les pays tropicaux (pathologie tropicale);

- les mycoses profondes ou systémiques au cours desquelles le champignon pénètre dans la profondeur des tissus et des humeurs, qui constituent de loin les formes les plus graves.

II-2-1-2- Les champignons (mycètes ou fungi)

Les champignons sont des organismes uni ou pluricellulaires dépourvus de chlorophylle, se nourrissant par absorption de substances très diverses, et se multipliant par des spores sexuées ou asexuées.

Les champignons sont parasites, saprophytes ou symbiotes. Généralement aérobies, ils se développent à des températures variables entre 0 et 50^oC avec une température optimale entre 20 et 27° C

Les champignons exercent à la fois chez leurs hôtes des actions favorables (fermentation, fertilisation, synthèse) et défavorables (maladies végétales, animales ou humaines).

Environ 100.000 espèces sont connues actuellement dont une centaine sont pathogènes pour l'homme.

D'un point de vue pratique on distingue les champignons levuriformes dont le thalle est réduit à un état unicellulaire, et les champignons filamenteux ou dermatophytes.

II-2-1-2-1- Les champignons levuriformes

Selon VANBREUSEGHEM, les levures sont des champignons unicellulaires ronds ou ovales qui se reproduisent asexuellement par bourgeonnement au moyen de blastospores, parfois sexuellement par des ascopores ou des spores proches ou identiques aux basidiospores et qui fréquemment fermentent un ou plusieurs sucres en produisant de l'anhydride carbonique (CO2). On distingue trois grands groupes:

- les levures vraies, ascosporées appartenant à l'ordre des Endomycétales, faisant partie des Ascosporées avec comme genre important Saccharomyces,

- les levures appartenant à la classe des Basidiomycètes et de l'ordre des Ustilaginales avec le genre Filobasidiella récemment créé (1975) par KWONG-Chung,

- les levures non ascosporées appartenant aux Deutéromycètes ou Fungi imperfecti où l'on reconnaît 6 genres d'intérêt médical qui sont: Candida, Cryptococcus, Pityrosporum, Rhodotorula, Trichosporon et Géotrichum.

II-2-1-2-2- Les champignons filamenteux ou dermatophytes

Selon BADILLET, les dermatophytes sont des champignons filamenteux à mycélium cloisonné, appartenant à la classe des ascomycètes et présentant les caractères communs suivants:

- ils poussent en général facilement sur des milieux artificiels peptonés et sucrés,

- ils sécrètent des produits antigéniques groupés sous les noms de trichophytine et épidermophytine et pouvant être responsables de lésions de type allergique,

II-2-2- Cas des candidoses (11; 19; 35; 37)

Les candidoses sont des mycoses cosmopolites, à développement localisé ou généralisé, dues à des espèces du genre Candida.

C'est une levure "opportuniste", c'est à dire normalement saprophyte et inoffensive mais qui peut devenir pathogène lorsque l'organisme hôte présente des conditions favorables.

II-2-2-1- Etiologie

II-2-2-1-1- Agent pathogène

Parmi les nombreuses espèces connues isolées, seules certaines peuvent présenter un pouvoir pathogène pour l'homme. Candida albicans est le plus fréquemment retrouvé à l'origine des manifestations pathologiques. Plus rarement on retrouve aussi Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis (Candida kefyr ou Kluyveromyces marxianus), Candida krusei (Lesatchenkia orientalis), Candida parapsilosis, Candida guilliermondii (Pichia guilliermondii), Candida zeylanoiides, Candida rugosa et Candida norvegensis.

II-2-2-1-2- Epidémiologie

Les Candida sont des parasites humains ou animaux. L'homme constitue le principal "réservoir" de Candida albicans. Le champignon y végète à l'état saprophyte dans la cavité buccale ou le tube digestif, plus rarement les voies génitales.

L'homme peut s'infecter par contact: contamination du nouveau-né lors de son passage dans le tractus génital dans une candidose génitale.

L'infection est d'origine endogène à partir de la flore saprophyte dont le pouvoir pathogène se trouve exacerbé:

- par des facteurs locaux: irritation toxique ou traumatique, macération, corps étrangers (cathéters), lésions pathologiques antérieures,

* dépression immunitaire congénitale ou acquise (hémopathie traitée, maladie de HODGKIN, déficit congénital de l'immunité, corticothérapie au long cours, chimiothérapie anticancéreuse et immunosupressive, dénutrition, radiothérapie, S.I.D.A.(Syndrome d'Immuno-Déficience Acquise) etc.),

* On peut aussi citer des circonstances physiologiques comme la grossesse et la contraception hormonale.

II-2-2-2- Clinique

En clinique les candidoses superficielles qui font l'objet de notre étude sont de loins les plus fréquemment rencontrées.

A celles-ci on joint les allergies dues à Candida. On y rencontre aussi les candidoses généralisées particulièrement graves qui ne s'observent que dans des circonstances très précises ainsi que des cas exceptionnels de granulomes à Candida.

II-2-2-2-1- Les candidoses digestives

- le muguet qui est la principale candidose buccale généralement rencontrée chez le nouveau-né, le nourrisson et certaines personnes âgées.

L'Infection H.I.V. (Human Immunodeficiency Virus) est devenue un des principaux facteurs favorisants.

- L'Entérite candidosique qui est une cause de diarrhée surtout chez le nourrisson.

II-2-2-2-2- Les candidoses cutanées et des phanères

- Les intertrigos sont les manifestations les plus fréquentes. Ce sont des lésions des grands plis (axillaires, sous-mammaires, abdominaux, inguinaux, cruraux et fessiers) et des petits plis (rétro-auriculaire, interdigitaux, interdigito-plantaires, sertissure unguéale et commissures labiales).

Ils sont fréquemment rencontrés chez les sujets obèses ou ayant une peau séborrhéique, ainsi que chez les diabétiques.

Ils sont généralement symétriques et leur évolution est centrifuge à partir du foyer initial (bouche, anus, vagin).

II-2-2-2-3- Les candidoses génito-urinaires

Elles sont surtout fréquentes chez la femme (vulvo-vaginite) en particulier lors de la grossesse ou lors d'utilisation d'anovulants.

Chez l'homme la mycose (balano-prosthite) est sexuellement transmise sauf chez les diabétiques chez lesquels elle est spontanée.

- des cystites chez les diabétiques et surtout les malades porteurs d'une sonde vésicale à demeure.

II-2-2-2-4- Manifestations allergiques des candidoses

Elles surviennent à distance d'un foyer mycosique initial et peuvent conduire à des situations diverses: dyshidrose, eczéma, urticaire, asthme, aggravation d'une colite.

II-2-2-3- Diagnostic mycologique

II-2-2-3-1- Prélèvement

C'est une étape essentielle qui conditionne par sa qualité la valeur des résultats. Il faut toujours avoir à l'esprit que les espèces du genre Candida sont très sensibles à la dessiccation.

II-2-2-3-2- Examen direct

Il doit être réalisé immédiatement après le prélèvement. Il permet d'affirmer précocement le caractère pathogène de la levure observée.

Les levures sont GRAM+. La coloration de May-Grunwald Giemsa (M.G.G.) permettant d'étudier la cytologie associée au champignon, aide au diagnostic. En effet, la présence de nombreux polynucléaires dans un liquide biologique à côté de levures et de filaments est un bon argument en faveur de pathogénicité.

II-2-2-3-3- La culture

L'Ensemencement est réalisé sur deux tubes (qu'il ne faut pas boucher à fond)

- Un milieu de SABOURAUD additionné d'un antibiotique bactérien (chloramphénicol ou gentamycine).

- Un milieu de SABOURAUD additionné d'un antibiotique bactérien et de cycloheximide qui inhibe les moisissures.

Les prélèvements d'origine superficielle sont placés à l'étuve à 26° C et ceux des muqueuses ou des organes profonds à 37° C.

Après 24 à 48 heures, on observe des colonies levuriformes; c'est-à dire crèmeuses, blanchâtres, luisantes, sauf pour Candida krusei dont les colonies sont mates.

* Identification de Candida albicans: le test de BLASTESE (test de TASCHDJIAN ou test de filamentation).

Microscopiquement il est impossible d'identifier les levures en bourgeonnement. Pour l'identification de Candida albicans on procède de la manière suivante:

Une suspension homogène d'une colonie de levures obtenues sur milieu de SABOURAUD est réalisée dans 0,5 ml de sérum humain ou animal. Après 3 heures d'incubation à 37° C, une goutte de cette suspension est examinée au microscope. Le test est positif si environ 50% des levures présentent un "tube de germination" (et non un bourgeonnement) flexueux dont la longueur atteint au moins trois fois celle du diamètre de la levure.

- On peut aussi rechercher des chlamydospores sur milieu pauvre RAT (riz, agar, Tween) ou milieu PCB (pomme de terre, carotte, bile) en 24 à 48 heures.

Dans ce cas on utilise des critères nutritionnels et biochimiques, en particulier l'assimilation des sucres (auxanogramme) et leur fermentation (zymogramme).

On utilise également la sensibilité de la souche à l'actidione et la réduction des sels de tétrazolium.

Ce test consiste à déposer à la surface de la gélose d'une boîte de pétri des disques de papier buvard imprégnés des différents antifongiques à évaluer. Chacun diffuse au sein de la gélose à partir du disque et y détermine des concentrations inversement proportionnelles à la distance du disque.

Pour chaque antifongique on mesure le diamètre de la zone d'inhibition avec un pied à coulisse, une règle graduée ou un compas.

La CMI permet de définir la sensibilité ou la résistance des souches de champignons vis à vis des différents antifongiques. C'est la plus faible concentration d'antifongique capable d'inhiber dans un milieu toute culture de la souche étudiée.

En fonction de la valeur brute de la CMI, ou de la valeur du diamètre de la zone d'inhibition, les souches peuvent être classées en:

Tableau 1: Interprétation des mesures

Antifongiques

Diamètre de la zone d'inhibition en mm

CMI

en ug/ml

Interprétation (a,b) pour les levures

5-Fluorocytosine *

(1ug)

20- 10

1,56

1, 56- 25

Sensible

Intermédiaire

Résistant

Amphotéricine B

Sensible

Intermédiaire ou

résistant

Nystatine

Sensible

Résistant

Imidazoles**

(Econazole, Clotrimazole, Miconazole, Kétoconazole)

20-10

1,56

1,56- 6,4

6,4

Sensible

Intermédiaire

Résistant

5-Fluorocytosine

1ug

Pour A. fumigatus

Sensible

Intermédiaire ou résistant

5-fluorocytosine

10ug

Sensible ou intermédiaire

Résistant

*: les colonies retrouvées dans la zone d'inhibition de la 5-Fluorocytosine appartiennent à des souches résistantes.

**: pour les dérivés d'imidazole, l'évaluation est parfois difficile. Certaines souches présentent deux zones d'inhibition:

- une zone plus réduite avec de petites colonies qui n'apparaissent pas résistantes lorsqu'on évalue à nouveau leur sensibilité; la croissance de ces petites colonies est observée également lors de la détermination des CMI.

b) Souches sensibles, intermédiaires ou résistantes par rapport aux taux sériques obtenus avec les posologies usuelles par voie orale ou intraveineuse.

II-2-2-4- Traitement

Il comporte si cela est possible, l'arrêt des antibiotiques à large spectre, de la corticothérapie et de la thérapeutique immunosuppressive, l'ablation des matériels tels que cathéters, etc.

Les candidoses cutanées relèvent de l'application d'antiseptiques (ammonium quaternaires, violet de gentiane), d'antifongiques topiques (nystatine, pimaricine, amphotéricine B, dérivés de l'imidazole).

Le muguet et les mycoses digestives sont à traiter par des badigeonnages antifongiques (suspension de nystatine ou d'amphotéricine B).

L'Antifongique doit rester au contact de la muqueuse atteinte. La durée du traitement est de 2 à 3 semaines. Dans les formes chroniques ou récidivantes les dérivés de l'imidazole sont le traitement de choix.

- chez l'homme, aux pommades à la nystatine, l'amphotericine B, ou à la pimaricine.

- Chez la femme, on utilise les dérivés de l'imidazole, ou les produits précédemment cités ci-haut pendant 3 à 10 jours de traitement.

III- MATERIEL ET METHODES

III-1- CADRES D'ETUDES

- L'étude chimique de la plante a été réalisée au Laboratoire de Biochimie et de Chimie Appliquées (La.Bio.C.A.) de la Faculté des Sciences et Techniques (Fa.S.T.) de l'Université de Ouagadougou.

- Les tests d'activité ont été réalisés au laboratoire d'analyses médicales "Sainte Elisabeth" à Ouagadougou.

III-2- MATERIEL

III-2-1- Matériel végétal

Il s'agit de la plante entière (racines, tige, feuilles) de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae). Elle a été récoltée courant période Août-Septembre 1999 dans la région de Banfora à l'Ouest du Burkina Faso.

La plante entière fraîche a été utilisée pour la réalisation des coupes histochimiques.

Après séchage à l'ombre à la température ambiante, les échantillons sont aussi pulvérisés et conservés dans un sachet en polyéthylène pour la suite des travaux.

III-2-2- La levure

Il s'agit de Candida albicans qui est l'espèce la plus fréquemment rencontrée lors des candidoses.

Elle a été isolée au laboratoire d'analyses médicales "Sainte Elisabeth" à Ouagadougou.

III-2-3- Matériel de laboratoire

III-3- SOLVANTS ET REACTIFS

III-3-1- solvants

n-hexane, méthanol, eau distillée, chloroforme, acétate d'éthyle, éthanol, éther éthylique, anhydride acétique, diméthylsulfoxyde (DMSO), eau physiologique stérile (solution de chlorure de sodium (NaCl) 0,9%).

III-3-2- réactifs

Carbonate de calcium (CaCO3), liqueur de FEHLING (A+B) (1/1), chlorure ferrique (FeCl3) (3%), réactif de STIASSNY (HCl + HCOH) (1/2), acide chlorhydrique (HCl) (30%), réactif de DRAGENDORFF, anhydride acétique, acide sulfurique (H2SO4) concentré, sulfate de sodium anhydre (Na2SO4), tournure de magnésium, ammoniaque (NH4OH) (10%), soude (NaOH) (10%), trichlorure d'antimoine (SbCl3), ninhydrine, chlorure d'étain (II) (SnCl2), acétate de sodium (CH3-COONa), acétate de nickel (II), réactif de MAYER, réactif de CARR-PRICE.

III-4- CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE

III-4-1- Coupes histochimiques (18, 36)

Elles ont pour but la mise en évidence de certains principes dont les oxalates dans la plante. Pour cela nous utilisons la plante entière fraîche.

Des coupes transversales très fines sont réalisées à travers les racines, la tige et les feuilles (nervure principale) avec la moelle de sorgho comme support.

Ces coupes sont ensuite observées au microscope optique entre lame et lamelle d'abord dans de l'eau distillée et ensuite dans une solution de carbonate de calcium (CaCO3) 4% au cas où on n'observerait pas de cristaux d'oxalate de calcium.

Dans tous les cas l'observation de cristaux d'oxalate de calcium indique que la partie concernée de la plante contient des oxalates soit sous forme d'acide oxalique libre (ce qui est rare car en général toxique pour la plante), soit sous forme d'oxalate de magnésium, de potassium ou de calcium.

III-4-2- Extractions (25, 30)

III-4-2-1- Extractions solide-liquide

Elles sont réalisées par épuisements successifs de la poudre végétale à l'aide de solvants de polarité croissante.

Dans cette partie nous définirons le rendement d'extraction qui est le rapport entre l'extrait séché et la prise d'essai (Masse de poudre végétale utilisée pour l'extraction) pour 100 unités de masse de poudre végétale.

III-4-2-1-1- Extractions à chaud

Dans les deux cas on utilisera l'extracteur de SOXHLET dont le principe de fonctionnement dans notre cas est le suivant:

L'appareillage comporte un chauffe-ballon, un ballon de 500 ml dans lequel le solvant est chauffé jusqu'à sa température d'ébulition et vaporisé, un réfrigérant qui condense les vapeurs et un extracteur de 250 ml à l'intérieur duquel est introduit dans une cartouche poreuse le produit à extraire (la poudre végétale) et où retombe le solvant condensé dans le réfrigérant. Un siphon permet de vider périodiquement l'extracteur de la solution obtenue. La solution retombe alors dans le ballon où se concentrent les extraits.

Par ce procédé, la poudre végétale est successivement épuisée à l'aide du n-hexane et du méthanol.

30 g de poudre végétale introduite dans la cartouche est introduite dans l'extracteur. Le ballon est rempli aux 2/3 du solvant d'extraction (n-hexane) puis chauffé à 68-69° C (température d'ébulition du n-hexane).

L'extraction terminée, la solution obtenue est concentrée à l'évaporateur rotatif, puis séchée à la température ambiante du laboratoire. Le résidu est pesé et gardé au congélateur jusqu'à la mise en marche des tests phytochimiques et pharmacologiques.

Le marc issu de l'extraction précédente est soumis au même processus d'extraction que précédemment mais cette fois-ci avec le méthanol comme solvant en chauffant à environ 64,9° C (température d'ébulition du méthanol).

La solution obtenue est concentrée à l'évaporateur rotatif; puis séchée à la température ambiante du laboratoire. Le résidu obtenu est aussi pesé et conservé au congélateur jusqu'à la mise en marche des tests phytochimiques et pharmacologiques.

Le marc issu de cette extraction est séché et conservé pour l'extraction à l'eau distillée.

Le marc issu de l'extraction par le méthanol est introduit dans une fiole jaugée de 500 ml contenant 300 ml d'eau distillée. Le mélange est laissé en macération pendant 24 heures sous agitation magnétique à la température ambiante du laboratoire (environ 25° C).

Le mélange est ensuite filtré et le filtrat est séché à l'étuve à 80° C. Le résidu est pesé et conservé au congélateur pour les tests phytochimiques et pharmacologiques.

III-4-2-2- Extraction liquide-liquide

Dans ce cas il s'agit d'extraire à froid l'extrait n-hexanique issu de l'extraction solide-liquide par un solvant non miscible au n-hexane.

Pour cela un extrait n-hexanique non concentré est introduit dans une ampoule à décanter contenant un volume égal d'éthanol. Après une agitation vigoureuse le mélange est laissé au repos jusqu'à la décantation complète. On obtient alors deux phases: une phase hexanique (fraction A) et une phase éthanolique (fraction B).

Chaque phase est recueillie, concentrée à l'évaporateur rotatif avant d'être séchée à la température ambiante du laboratoire. Les résidus obtenus sont conservés au congélateur pour la suite des travaux.

III-4-3- Réactions de caractérisation en milieu liquide

III-4-3-1- Caractérisation des saponosides (14)

Dans un tube à essai on dissout quelques mg d'extrait dans de l'eau distillée et on agite vigourement pendant au moins 5 mn.

L'apparition d'une colonne de mousse d'environ 1cm et persistant pendant au moins 15 mn indique la présence de saponosides.

III-4-3-2- Caractérisation des composés réducteurs (33)

On dissout quelques mg de l'extrait à étudier dans un tube à essai contenant de l'eau distillée. On ajoute à la solution obtenue 1 à 1,5 ml de liqueur FEHLING (A+B) (1/1) et l'ensemble est porté au bain marie bouillant pendant 30 mn.

L'apparition d'un précipité rouge-brique au fond du tube indique la présence de composés réducteurs.

III-4-3-3- Caractérisation des tanins et composés polyphénoliques (13, 33)

Dans un tube à essai on dissout quelques mg de l'extrait à étudier dans de l'eau distillée et on ajoute quelques gouttes d'une solution de chlorure ferrique (FeCl₃) 1%.

- L'apparition d'une coloration bleu-noir indique la présence de tanins galliques.

- L'apparition d'une coloration vert-noirâtre indique la présence de tanins catéchiques.

On ajoute à 10 ml de la solution obtenue après dissolution de quelques mg d'extrait dans de l'eau distillée une solution de formaldéhyde chlorhydrique, puis l'ensemble est porté au bain marie bouillant.

- les catéchols sont condensés en précipité rouge (tanins catéchiques) qui est filtré;

- le filtrat est neutralisé avec de l'acétate de sodium et quelques gouttes de la solution de chlorure ferrique 1% est ajouté. Si une coloration bleue se développe c'est qu'on est en présence de tanins galliques.

III-4-3-4- Caractérisation des alcaloïdes (40)

On dissout dans un tube à essai quelques mg de l'extrait à étudier dans 2 ml d'acide chlorhydrique (HCl) 10% puis on chauffe légèrement au bain marie. Après adjonction de quelques gouttes de réactif de DRAGENDORFF, la présence d'alcaloïdes se manifeste par le développement d'un trouble ou d'un précipité dans le tube.

Dans un ballon de 500 ml contenant 5 g de poudre végétale on verse 25 ml d'acide chlorhydrique 0,05N. Le mélange est laissé en macération sous agitation magnétique à la température ambiante du laboratoire (environ 25° C) pendant 24 heures; puis filtré et lavé à l'eau distillée. La solution obtenue est ensuite ajustée à 20 ml avec de l'eau distillée.

S'il apparaît un précipité c'est qu'on est en présence d'alcaloïdes et ammoniums

III-4-3-5- Caractérisation des stéroïdes et triterpènes (10, 13)

Ces composés ne sont recherchés que dans les extraits n-hexanique, méthanolique et sur les fractions A et B issues du partage liquide-liquide de l'extrait n-hexanique avec de l'éthanol.

Une fraction de l'extrait à étudier est dissoute dans un mélange d'anhydride acétique et de chloroforme (1/1). Une fraction de la solution obtenue (1 à 2 ml) est transférée dans un tube à essai; puis à l'aide d'une pipette on dépose délicatement sur la paroi du tube environ 2 ml d'acide sulfurique (H2SO4) concentré.

La réaction est positive lorsqu'il apparaît à l'interface des deux phases un anneau rouge-brun ou violet.

Ce protocole peut directement s'appliquer à l'extrait n-hexanique. Mais pour ce qui concerne l'extrait méthanolique il doit d'abord subir une hydrolyse acide.

Une fraction de l'extrait méthanolique est redissout dans environ 25 ml de méthanol. A la solution obtenue on ajoute 15 ml d'acide chlorhydrique (HCl) 10% et l'ensemble est porté à chauffer au reflux à environ 70° C pendant 30 mn.

Durant l'hydrolyse, la solution devient opalescente à cause de la précipitation des aglycones obtenus par la coupure des hétérosides.

Après refroidissement la solution est extraite trois fois avec du n-hexane dans une ampoule à décanter (10 à 12 ml) 3 fois soit au total 30 à 36 ml d'extrait n-hexanique (bis).

Une partie de cet extrait n-hexanique (bis), après évaporation à sec servira pour le test de LIBERMANN-BURCHARD.

Le reste de cet extrait n-hexanique (bis) servira aussi à caractériser les flavonoïdes, les coumarines et les anthracénosides.

III-4-3-6- Caractérisation des pigments anthocyaniques (10, 33)

Si la solution aqueuse acide obtenue après hydrolyse de l'extrait alcoolique est rouge et vire au violet à pH neutre, au vert à pH basique, c'est que les anthocyanes sont présents.

N.B.: Pour faire varier le pH nous avons utilisé une solution de soude caustique (NaOH) 10%, et à l'aide du papier pH nous avons suivi la variation du pH.

III-4-3-7- Caractérisation des flavonoïdes (23)

Quelques mg de l'extrait à étudier est dissout dans du méthanol 50°. On y ajoute un fragment de tournure de magnésium puis quelques gouttes d'acide chlorhydrique (HCl) concentré.

Il se produit une réaction exothermique mousseuse. A la fin d'une réaction positive il apparaît:

III-4-3-8- Caractérisation des coumarines (33)

Un fragment de l'extrait est dissout dans de l'eau chaude. Après refroidissement la solution est partagée dans deux tubes:

L'apparition d'une fluorescence bleu-verdâtre ou violette du tube 2 sous lumière UV254 montre la présence des coumarines et dérivés polyènes et/ou polyines.

III-4-3-9- Caractérisation des anthracénosides (33)

Dans un tube à essai on redissout une portion de l'extrait dans du n-hexane pour avoir à peu près 3 ml de solution. On ajoute environ 1 ml de soude (NaOH) 10%. Après agitation l'apparition d'une coloration rouge indique la présence d'anthracénosides.

III-4-3-10- Caractérisation des hétérosides (33)

dans un tube à essai on introduit 0,5 g de poudre végétale et 2 ml d'anhydride acétique. Après chauffage au bain marie bouillant sous agitation pendant 2 mn, la solution est filtrée.

On dépose délicatement sur le filtrat à l'aide d'une pipette 1 ml d'acide sulfurique (H2SO₄) concentré de manière à obtenir deux couches.

Le résultat est positif si une coloration rouge-brun se développe à l'interface.

III-4-3-11- Caractérisation des amines (8)

On laisse tomber sur du papier filtre une goutte de l'extrait préalablement redissout dans de l'eau distillée. Après séchage à 80° C à l'étuve, le papier est pulvérisé avec une solution de ninhydrine-chlorure d'étain (II) (SnCl₂) qui est un révélateur des amines. Le papier est reporté à l'étuve mais cette fois-ci à 110° C pendant 5 mn.

III-4-3-12- Caractérisation des polyuronides (pectines, mucilages, gommes) (33)

On dissout quelques mg de l'extrait aqueux dans un petit volume d'eau distillée.

2 ml de la solution obtenue sont ajoutés en filet mince dans un tube à essai où 10 ml d'acétone ont été préalablement introduits.

S'il y a formation d'un épais précipité, il pourrait être séparé par filtration ou centrifugation et lavé à l'alcool puis fixé avec du bleu de toluidine, bleu de méthylène ou hématoxyline.

5 g de poudre végétale est humectée avec quelques gouttes d'acide sulfurique (H₂SO₄) 10%, puis mise en macération dans 20 ml de chloroforme sous agitation magnétique pendant vingt quatre (24) heures à la température ambiante du laboratoire(environ 25° C).

Le filtrat recueilli est évaporé à sec puis repris avec quelques gouttes d'éthanol 95°.

A la solution obtenue on ajoute quelques ml d'une solution aqueuse d'acétate de nickel (II) 5%.

- ou violet indiquant la présence de naphtoquinones qui font en réalité l'objet de notre étude.

III-4-4- Chromatographies sur couche mince (CCM) (13, 45)

Les extraits sont déposés à l'aide de capillaires afin d'avoir des dépôts fins.

Dans cette partie nous définirons la notion de référence frontale (Rf) ou distance de rétention qui est exprimée par le rapport entre les longueurs parcourues depuis la ligne de départ par le centre de la tache d'une substance considérée dx et par le front de l'éluant de.

Seuls seront recherchés les composés chimiques que nous n'avions pas pu caractériser par les méthodes précédentes.

Cette étude nous permettra de choisir les meilleurs éluants susceptibles d'être utilisés lors des fractionnements sur colonne chromatographique qui feront l'objet de nos prochaines études.

Figure 3: Schéma de synthèse du criblage phytochimique

III-5- ETUDE PHARMACOLOGIQUE: ANTIBIOGRAMME FONGIQUE (11,25, 31)

III-5-1- Milieu de culture

Nous avons utilisé le milieu de SABOURAUD additionné de chloramphénicol (antibiotique s'opposant à la prolifération des bactéries contaminantes).

Le mélange est ensuite porté au bain-marie bouillant pendant 15 mn pour être dissout. Après dissolution le milieu est stérilisé à l'autoclave pendant 15 mn à 118° C (après contôle du pH). Le milieu est refroidi et coulé dans des boîtes de pétri stériles de 90 mm de diamètre. Après séchage à la température ambiante du laboratoire (environ 25° C), les boîtes sont gardées au réfrigérateur jusqu'aux tests biologiques.

III-5-2- Technique employée

Des cupules d'environ 5 mm de diamètre sont creusées dans la gélose à l'aide d'une pipette PASTEUR stérile. Afin d'éviter la diffusion des extraits à tester sous la gélose on referme le fond des cupules avec une goutte de gélose préalablement fondue. L'ensemble est ensuite refroidi et conservé au frais pour les tests antifongiques.

III-5-3- Inoculum

Il est préparé le jour même de son utilisation. Il est obtenu à partir d'une culture sur gélose inclinée de SABOURAUD.

Une colonie de levures prélevée d'une culture à l'aide d'une anse stérile est homogénéisée dans 10 ml d'eau physiologique (solution de NaCl 0,9%) stérile. Si la suspension obtenue est très concentrée on procède à une dilution au 1/10 (1ml de suspension pour 9 ml d'eau physiologique).

III-5-4- Ensemencement

La surface entière de la gélose est inondée avec 5 ml d'inoculum. L'excès est aspiré à l'aide d'une pipette stérile. Les boîtes sont ensuite séchées à l'étuve à 37° C pendant 15 mn.

III-5-5- Solubilisation des extraits

- L'extrait n-hexanique et la fraction B sont dissouts dans du diméthylsulfoxyde (D.M.S.O.).

- Les extraits méthanolique et aqueux ont été dissouts dans de l'eau distillée stérile.

III-5-6- Dépôt des extraits

100 ul de solution d'extrait (20 mg/ml, 40mg/ml, 80mg/ml correspondant respectivement à 2; 4; et 8 mg d'extrait séché) est déposé à l'aide d'une micro-pipette dans les cupules (trois fois pour chaque extrait ou fraction).

Nous avons aussi testé la non-activité des solvants utilisés pour la dissolution des extraits et fractions (n-hexane, D.M.S.O., eau distillée stériles).

Le standard utilisé est le disque d'antibiogramme imprégné de nystatine 100 unités.

III-5-7- Incubation

III-5-8- Lecture des résultats

La lecture est faite en mesurant le diamètre de la zone d'inhibition avec une règle graduée.

IV- RESULTATS ET DISCUSSIONS

IV-1-CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE

IV-1-1- Coupes histochimiques

Après observation au microscope optique des coupes d'abord dans de l'eau distillée et ensuite dans une solution de carbonate de calcium (CaCO3) 4% entre lame et lamelle nous obtenons les résultats suivants:

Tableau 3 : Résultats des observations des coupes au microscope optique
	Racines	Tige	Feuilles
Observation dans l'eau distillée	-	-	-
Observation dans du CaCO3 4%	-	+	+

L'Observation au microscope optique des coupes entre lame et lamelle dans de l'eau distillée ne montre aucun cristal d'oxalate de calcium dans les différents organes de la plante.

Par contre les mêmes coupes observées dans du carbonate de calcium (CaCO3) 4% montre dans les cellules des tiges et des feuilles des amas en forme de grains de sable. Ses amas sont des cristaux d'oxalate de calcium.

Nous pouvons dire que les oxalates sont présents dans la plante mais sous forme soluble, c'est-à dire soit sous forme libre (acide oxalique) (ce qui est rare car l'acide oxalique est en général toxique pour les plantes) soit sous forme d'oxalate de potassium ou de magnésium.

L'apport d'ions calcium (Ca²⁺) dans le milieu d'observation permet de déplacer les protons (H⁺), les ions potassium (K⁺) ou magnésium (Mg²⁺) d'où formation de nouveaux complexes d'oxalate de calcium insolubles.

Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) contient donc de l'acide oxalique sous forme soluble dans ses parties aériennes (tige et feuilles). Cette observation avait d'ailleurs été constatée par PARIS et MOYSE ⁽³⁶⁾ concernant la chimie des Oxalidaceae en général.

IV-1-2- Extractions

IV-1-2-1- Extractions solide-liquide

Les quantités et rendements des extraits issus des extractions solide-liquide sont consignés dans le tableau suivant:

N.B.: Les rendements sont exprimés par rapport à la prise d'essai de départ (30 g) en ne tenant pas compte de la teneur en eau de la poudre végétale.

Tableau 4 : Quantités et rendements des extraits de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)
	Extrait n-hexanique	Extrait méthanolique	Extrait aqueux
Résidu (g)	0,964	3,4333	1,2739
Rendement (%)	3,21	11,44	4,25

L'extrait méthanolique est quantitativement la plus importante. Cela voudrait dire que la plante contient beaucoup de composés solubles dans ce solvant. On a d'ailleurs pu le constater lors des extractions à chaud. En effet l'extraction au n-hexane a duré 4 heures tandis que celle au méthanol a duré 8 heures. Contrairement à ce qui était attendu la plus grande partie de la chlorophylle s'est retrouvée dans l'extrait méthanolique au lieu de celui au n-hexane; en témoignent les durées d'extraction et la coloration des extraits. L'extrait méthanolique est d'un vert très foncé légèrement gras tandis que celui au n-hexane est vert-jaunâtre et très gras.

Quant à l'extrait aqueux il présente une coloration brune et un aspect pulverulant. Son faible rendement s'explique probablement par le fait de l'épuisement de la matière végétale par les deux extractions à chaud.

IV-1-2-2- Extraction liquide-liquide

- Extraction par l'éthanol

- Une fraction A soluble dans le n-hexane et présentant une coloration légèrement jaunâtre et sans odeur caractéristique.

- Une fraction B soluble dans l'éthanol, d'un vert très foncé avec une odeur caractéristique d'huile essentielle aromatique.

IV-1-3- Réactions de caractérisation en milieu liquide

IV-1-3-1- Caractérisation des saponosides

Tableau 5: Résultats du test de caractérisation des saponosides
	Extrait n-hexanique	Extrait méthanolique	Extrait aqueux
Observations	Pas de mousse	Forte présence de mousse	Présence moyenne de mousse
Conclusion	-	++	+

L'absence de saponosides dans l'extrait n-hexanique peut s'expliquer par le fait qu'il s'agit d'hétérosides non solubles dans les solvants apolaires tel que le n-hexane.

La mousse est plus importante dans l'extrait méthanolique parce que ce solvant , ayant été utilisé avant l'eau distillée a certainement épuisé la poudre végétale.

IV-1-3-2- Caractérisation des composés réducteurs

Tableau 6: Résultats du test des composés réducteurs
	Extrait n-hexanique	Extrait méthanolique	Extrait aqueux
Observations	Pas de précipité rouge-brique	Faible précipité rouge-brique	Fort précipité rouge-brique
Conclusion	-	+	++

Cette absence de composés réducteurs dans cet extrait peut s'expliquer par leur non solubilité dans le n-hexane.

Ces composés sont généralement des oses, aldéhydes et cétones qui sont en général peu solubles dans les alcools et très solubles dans l'eau; d'où la différence de précipité observé.

IV-1-3-3- Caractérisation des tanins et polyphenols

Tableau 7: Résultats du test des tanins et polyphenols
	Extrait n-hexanique	Extrait méthanolique	Extrait aqueux
Observations	Pas de précipité	Précipité bleu-noir	Précipité sombre
Conclusion	-	+	+

Les tanins et les polyphenols sont insolubles dans les solvants apolaires comme le n-hexane. Par contre ils sont solubles dans les alcools et l'eau.

Dans l'extrait méthanolique on trouve essentiellement des tanins galliques tandis que l'extrait aqueux contient des tanins catéchiques. Ces derniers ont été aussi caractérisés et identifiés avec le réactif de STIASSNY en présence duquel nous obtenons un précipité rouge.

IV-1-3-4- Caractérisation des alcaloïdes

Tableau 8: Résultats du test des alcaloïdes
	Extrait n-hexanique	Extrait méthanolique	Extrait aqueux
Observations	Pas de précipité	Pas de précipité	Pas de précipité
Conclusion	-	-	-

Aucune trace d'alcaloïde n'est observée dans les extraits obtenus: la plante ne contient donc pas d'alcaloïdes

Ce résultat est confirmé par une recherche infructieuse par l'extraction directe des alcaloïdes en milieu acide et utilisant les réactifs de DRAGENDORFF et de MAYER pour leur caractérisation.

IV-1-3-5- Caractérisation des stéroïdes et/ou triterpènes

Tableau 9: Résultats du test des stéroïdes et triterpènes
	Extrait n-hexanique	Extrait n-hexanique (bis)	Fraction A	Fraction B
Observations	Anneau brun	Anneau brun	Anneau brun	Anneau brun
Conclusion	+	+	+	+

Tous les extraits et fractions étudiés contiennent des stéroïdes et/ou triterpènes.

Mais il faut noter que dans l'extrait méthanolique nous n'avions que des hétérosides stéroïdiques et/ou triterpéniques. L'hydrolyse acide a permis de libérer les génines stéroïdiques et/ou triterpéniques.

Le partage liquide-liquide de l'extrait n-hexanique a donné deux fractions A et B contenant chacune des stéroïdes et/ou triterpènes. Le partage n'aura pas permis de les isoler dans l'une des fractions; à moins qu'il ne s'agisse de deux types différents.

IV-1-3-6- Caractérisation des pigments anthocyaniques

Le tableau 10 indique la présence de pigments anthocyaniques dans Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae).

Cette observation pourrait permettre une exploitation des propriétés colorantes de cette plante.

Tableau 10: Résultats du test des pigments anthocyaniques
	Couleur en milieu acide	Couleur en milieu neutre	Couleur en milieu basique
Solution aqueuse acide obtenue après hydrolyse acide de l'extrait méthanolique	Rouge	Violette	Verte

IV-1-3-7- Caractérisation des flavonoïdes

Tableau 11: Résultats du test de caractérisation de flavonoïdes
	Extrait n-hexanique	Extrait n-hexanique (bis)
Observations	Pas de coloration rouge ou orange	Pas de coloration rouge ou orange
Conclusion	-	-

Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) ne contient pas de flavonoïdes stricto-sensu.

IV-1-3-8- Caractérisation des coumarines

Tableau 12: Résultats du test de caractérisation des coumarines
	Extrait n-hexanique	Extrait n-hexanique (bis)
Observations	Pas de fluorescence bleu ou verte	Pas de fluorescence bleue ou verte
Conclusion	-	-

IV-1-3-9- Caractérisation des anthracénosides

Tableau 13: Résultats du test de caractérisation des anthracénosides
	Extrait n-hexanique	Extrait n-hexanique (bis)
Observations	Pas de coloration rouge	Pas de coloration rouge
Conclusion	-	-

Les résultats précédents indiquent que la plante ne contient pas d'anthracénosides.

IV-1-3-10- Caractérisation des polyuronides (mucilage, pectine, gomme)

La réaction ne présente pas un épais précipité; d'où on constate l'absence de polyuronides dans la plante.

IV-1-3-11- Caractérisation des hétérosides

Après avoir déposé sur l'extrait obtenu une solution concentrée d'acide sulfurique (H2SO4) il se développe à l'interface des deux phases une coloration rouge-brun. Cette observation est la preuve que l'échantillon contient des hétérosides. Cela confirme d'ailleurs les résultats obtenus lors de l'hydrolyse acide de l'extrait méthanolique.

IV-1-3-12- Caractérisation des amines

Après pulvérisation et séchage du papier filtre il apparaît une tache violette caractéristique des amines. Ces amines avaient d'ailleurs été signalées par NACOULMA en 1996⁽³³⁾

Il pourrait s'agir d'une amine vaso-constrictrice comme les catécholamines à savoir l'adrénaline,la noradrénaline ou la dopamine qui, quand à elle est utilisée dans le traitement de la maladie de PARKINSON ou d'une amine biogène comme la GABA (Gamma ()-aminobutyrate) utilisée en médecine moderne dans le traitement de l'épilepsie.

Cette amine serait responsable du caractère sensorio-moteur de la plante lorsque celle-ci se trouve face à une "situation d'urgence".

En effet, lorsque la plante fait face à un danger (frôlement par exemple) ses feuilles se referment sur elles-mêmes à la manière d'un animal face à un danger. Une fois le danger passé les feuilles reprennent leur état initial après quelques instants.

Ce comportement serait dû à la sécrétion par la plante de cette amine qui agirait en créant une vaso-constriction; d'où le reploiement des feuilles de la plante sur elles-mêmes (Nastie).

C'est la présence de cette amine qui expliquerait l'utilisation de la plante dans le traitement de l'épilepsie et autres maladies convulsivantes en milieu traditionnel.

La réaction donne un précipité vert indiquant du même coup que la plante ne contient pas de quinones.

IV-1-4- Chromatographies sur couche mince (CCM)

IV-1-4-1- CCM de l'extrait n-hexanique

Après essai de plusieurs systèmes d'éluants, c'est finalement le système n-hexane-chloroforme (1,5-1) qui a donné la meilleure séparation.

Cette séparation nous a donné quatorze (14) taches représentées sur la figure 3.

Quant aux références frontales (Rf) de ces 14 taches elles sont consignées dans le tableau 14.

Les taches 1 et 14 (colorées en jaune) donnent une coloration bleue qui devient rouge plus tard lorsqu'elles sont pulvérisées avec une solution saturée de trichlorure d'antimoine (SbCl3) dans du chloroforme (CHCl3) (réaction de CARR-PRICE). En plus de cela ces taches apparaissent fluorescentes sous lumière UV254 prouvant du même coup qu'il s'agit de composés ayant plusieurs doubles liaisons conjuguées. En plus de toutes ces observations il faut noter que ces deux taches perdent leur coloration lorsqu'elles sont exposées à l'air libre.

Cette perte de coloration est due aux réactions d'oxydation intervenant au niveau des doubles liaisons conjuguées de la molécule.

Ces taches colorées seraient donc des caroténoïdes qui seraient probablement parmi les précurseurs de l'acide oxalique trouvé dans les organes aériens de la plante.

*Tableau 14: Références frontales (Rf) des composés de l'extrait n-hexanique de Biophytum* petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae).**
Taches(n°)	Références frontales (Rf)
1	0,05
2	0,06
3	0,08
4	0,10
5	0,14
6	0,17
7	0,20
8	0,23
9	0,25
10	0,29
11	0,35
12	0,37
13	0,41
14	0,96

IV-1-4-2- CCM de l'extrait méthanolique

Pour cette séparation le meilleur éluant est le système: acétate d'éthyl-méthanol-eau: 10-1,35-1.

Les références frontales (Rf) des huit composés sont consignées dans le tableau 15.

N.B.: Ici aussi les numéros des taches sont lus sur la figure 4 du bas vers le haut.

La tache n° 1 présente une réaction positive avec le réactif de caractérisation des amines (ninhydrine-chlorure d'étain (II)).

Figure 5: Chromatogramme de l'extrait méthanolique de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae).

*Tableau 15: Références frontales (Rf) des composés de l'extrait méthanolique de Biophytum petersianum* KLOTZSCH (Oxalidaceae).**
Taches (n°)	Références frontales (Rf)
1	0,04
2	0,17
3	0,39
4	0,50
5	0,63
6	089
7	0,92
8	0,96

IV-1-4-3- CCM comparative des fractions A et B de l'extrait n-hexanique de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)

Les taches 9 (du bas vers le haut) (de la fraction A), 2 et 12 (du bas vers le haut) (de la fraction B) sont jaunes, fluorescentes sous lumière UV254 et donnent une réaction positive avec le réactif de CARR-PRICE. En plus de toutes ces caractéristiques il faut noter que ces taches perdent leur coloration lorsqu'elles sont exposées à l'air libre. Cela est du aux réactions d'oxydation qui se produisent au niveau des doubles liaisons conjuguées des molécules qui sont sans doute des caroténoïdes.

Un autre fait à remarquer sur ces chromatogrammes c'est la présence d'autres taches jaunes (8 de la fraction A, et 11 de la fraction B) qui ne donnent pas de réaction positive avec le réactif de CARR-PRICE.

Ces taches pourraient être des xanthones dans la mesure où elles ne donnent pas de réactions positives avec les réactifs de caractérisation des flavonoïdes (test de SHIBATA) et des naphtoquinones (réaction de BRISSEMORET et COMBES).

Le tableau suivant indique les références frontales (Rf) des différentes taches des fractions A et B

Tableau 15: Références frontales des composés des fractions A et B
	Références frontales (Rf)
Taches (n^o)	Fraction A	Fraction B
1	0,27	0,03
2	0,34	0,13
3	0,44	0,21
4	0,52	0,30
5	0,56	0,35
6	0,61	0,44
7	0,70	0,52
8	0,80	0,58
9	0,92	0,64
10		0,70
11		0,80
12		0,96

Les CCM des deux fractions donnent des composés de références frontales identiques ou proches les unes des autres; exception faite des composées 1; 2 et 3 de la fraction B qui n'ont pas leur équivalent dans la fraction A. Cela démontre que les deux fractions ne sont pas identiques; d'ailleurs la fraction B est parfumée et beaucoup plus sombre que la fraction A.

Pour cette étude un extrait n-hexanique de carotte est utilisé comme témoin (T).

Après avoir fait migrer en même temps l'extrait n-hexanique brut, les fractions A et B, ainsi que l'extrait n-hexanique de la carotte avec le système n-hexane-acétate d'éthyle: 3-1 comme éluant nous obtenons la configuration ci-après: (voir figure 7 ).

Figure 7: CCM comparative de l'extrait n-hexanique brut, des fractions A et B, et de l'extrait n-hexanique de carotte

L'extrait n-hexanique de la carotte (T) donne deux taches jaunes qui présentent une réaction positive avec le réactif de CARR-PRICE, qui sont fluorescentes sous lumière UV254 et qui perdent leur coloration après une exposition prolongée à l'air libre.

La tache 2 de T migre pratiquement avec le front de l'éluant tandis que la tache 1 migre très légèrement.

En comparant cette configuration avec celles présentées par l'extrait n-hexanique brut et les fractions A et B nous pouvons constater que la tache 1 du témoin et les taches 2 de l'extrait n-hexanique brut et de la fraction B migrent ensemble.

Il en est de même des taches 2 de l'extrait de carotte, 12 de la fraction B, 9 de la fraction A et 13 de l'extrait n-hexanique brut.

La tache 2 de l'extrait n-hexanique brut étant totalement passé dans l'éthanol (solvant d'extraction de la fraction B) peut être considérée comme une xanthophylle.

En effet les xanthophylles, à cause des groupements hydroxyles (-OH) qu'elles renferment dans leur structure sont solubles aussi bien dans les solvants apolaires que polaires comme les alcools. C'est l'existence de ces groupements hydroxyles qui explique le comportement de ce composé dans la phase mobile.

Quant à la tache 13 de l'extrait n-hexanique brut elle est partagée entre les fractions A (tache 9), et la fraction B (tache 12). Il peut être un carotène car les carotènes en général, étant des hydrocarbures sont solubles aussi bien dans les solvants apolaires que dans certains solvants polaires comme les alcools.

IV-1-4-4- Récapitulatif sur la chimie de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)

Afin d'étudier la chimie de la plante nous avons été amenés à utiliser plusieurs techniques à savoir:

- l'observation des coupes histochimiques de différentes parties de la plante (racines, tige, feuilles) au microscope optique entre lame et lamelle d'abord dans de l'eau distillée et ensuite dans une solution de carbonate de calcium (CaCO3) 4%,

- les réactions de caractérisation en milieu liquide effectuées sur les extraits et fractions de la plante.

- et enfin les chromatographies sur couche mince (CCM) de certains extraits et fractions.

- l'espèce étudiée contient de l'acide oxalique sous forme libre ou sous forme d'oxalate de potassium ou de magnésium soluble; ce qui confirme les travaux de PARIS et de MOYSE concernant la chimie des Oxalidaceae ⁽³⁶⁾.

- La plante contient beaucoup d'autres principes chimiques tels que des saponosides, des tanins, des stéroïdes, des triterpènes, des amines qui avaient déjà été identifiés par NACOULMA ⁽³³⁾, des composés réducteurs, des pigments anthocyaniques, des hétérosides, des carotènes et des xanthophylles.

En plus de ces familles nous pouvons aussi ajouter celle des xanthones que nous nous proposons de vérifier dans la suite de nos travaux.

IV-2- ETUDE PHARMACOLOGIQUE

Le screening de l'activité antimycosique des extraits de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) a donné les résultats consignés dans les tableaux suivants:

IV-2-1- Extrait au n-hexane

Tableau 16: Résultats du screening de l'activité antimycosique de l'extrait au n-hexane
			Concentrations de l'extrait
	DMSO	Nystatine 100 UI	20 mg/ml (2mg)	40 mg/ml (4mg)	80 mg/ml (8mg)
Observations	-	++++	+	++	+++
Diamètres d'inhibition (mm)	0	25	8 1	11 2	15 2

IV-2-2- Extrait au méthanol

Tableau 17: Résultats du screening de l'activité antimycosique de l'extrait au méthanol
			Concentrations de l'extrait
	Eau distillée stérile	Nystatine 100 UI	20mg/ml (2mg)	40mg/ml (4mg)	80mg/ml (8mg)
Observations	-	++++	-	+	++
Diamètres d'inhibition (mm)	0	25	0	8 1	11 2

IV-2-3- Extrait à l'eau distillée

Tableau 18: résultats du screening de l'activité antimycosique de l'extrait à l'eau distillée
			Concentrations de l'extrait
	Eau distillée stérile	Nystatine 100 UI	20mg/ml (2mg)	40mg/ml (4mg)	80mg/ml (8mg)
Observations	-	++++	-	-	+
Diamètres d'inhibition (mm)	0	25	0	0	8 1

Des résultats obtenus il ressort que l'extrait n-hexanique présente l'activité antimycosique la plus forte.

Cela n'est pas étonnant car même en milieu traditionnel la poudre de la plante est utilisée mélangée à du beurre de karité préalablement fondu dans le traitement de certaines mycoses (candidoses digestives et pytiriasis versicolore), ainsi que dans certaines affections cutanées (zona thoracique). La pommade préparée est utilisée en application locale sur la zone atteinte. Ces faits sont une preuve que le principe actif majoritaire responsable de l'activité antimycosique est liposoluble et par conséquent soluble dans le n-hexane.

Ces résultats corroborent ceux de KAMBOU ⁽²⁵⁾, de MOBIE & al.⁽³¹⁾, de SANOGO & al. ⁽³⁹⁾ et de BONGA & al. ⁽¹⁰⁾ qui ont tous montré une activité antimycosique d'extraits lipidiques de Mitracarpus scaber ZUCC. (Rubiaceae); quant bien même nous savons que dans notre cas toute l'activité ne se retrouve pas que dans l'extrait n-hexanique.

Quant à l'extrait au méthanol il présente une activité inférieure à celle au n-hexane.

En observant les résultats des deux extraits on s'aperçoit que l'activité ne se manifeste qu'à partir de 4mg alors que celle de l'extrait au n-hexane se manifeste déjà à 2mg.

Cette activité de l'extrait au méthanol pourrait peut-être s'expliquer non seulement par le fait de l'épuisement de la poudre végétale par le n-hexane mais aussi et surtout par la présence très marquée des saponosides dans cet extrait et donc d'hétérosides. Pour ce qui concerne effectivement les saponosides un certain nombre (parmi lesquels ceux isolés de la luzerne) sont reconnus actifs sur des Candida et certains dermatophytes par BRUNETON ⁽¹²⁾.

Pour ce qui concerne enfin l'extrait aqueux, il manifeste une très faible activité antimycosique qui ne se manifeste qu'à partir de 8mg. Cette activité serait aussi certainement due aux saponosides et autres hétérosides présents mais en faible quantité dans cet extrait.

IV-2-4- Evaluation de l'activité antimycosique des fractions issues du partage liquide-liquide de l'extrait n-hexanique de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)

IV-2-4-1- Fraction A

Tableau 19: résultats du screening de l'activité antimycosique de la fraction A
			Concentrations de la fraction A
	n-hexane stérile	Nystatine 100 UI	20mg/ml (2mg)	40mg/ml (4mg)	80mg/ml (8mg)
Observations	-	++++	+	++	+++
Diamètres d'inhibition (mm)	0	25	9 1	12 2	17 2

IV-2-4-2- Fraction B

Tableau 20: résultats du screening de l'activité antimycosique de la fraction B
			Concentrations de la fraction B
	DMSO stérile	Nystatine 100 UI	20mg/ml (2mg)	40mg/ml (4mg)	80mg/ml (8mg)
Observations	-	++++	+	++	+++
Diamètres d'inhibition (mm)	0	25	8 1	11 2	16 2

L'étude des deux fractions (A et B) montre qu'elles ont à peu près la même activité vis-à-vis de Candida albicans. Ces résultats ne sont pas surprenants car ces deux fractions contiennent pratiquement les mêmes composés habituellement reconnus comme ayant une activité antimycosique à savoir les stéroïdes et/ou triterpènes.

En effet, en 1995 BONGA & al. ont isolé un phytostérol responsable d'une activité antimycosique sur Cryptococcus neoformans ⁽¹⁰⁾.

Dans cette même lignée, en 1986 BEP a montré que les triterpènes isolés de Hygrophyla auriculata (SCHUMACH.) HEINE (Acanthaceae) étaient actifs sur Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes et Candida albicans ⁽⁷⁾.

Par ailleurs l'utilisation de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) dans le traitement du zona thoracique en pharmacopée traditionnelle pourrait amener à attribuer une activité anti-inflammatoire à ces stéroïdes et triterpènes trouvés dans la plante car en 1997 NIKIEMA dans ses travaux avait montré des propriétés anti-inflammatoires de stéroïdes et de triterpènes⁽³⁴⁾.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

L'étude phytochimique de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) nous permet de dire que outre les principes notifiés par les études antérieures de NACOULMA en 1996 ⁽³³⁾ et de PARIS et MOYSE en 1965 ⁽³⁶⁾ (saponosides, tanins, stéroïdes, triterpènes, amines et oxalates), on pouvait aussi retrouver d'autres principes chimiques comme des pigments anthocyaniques, des hétérosides, des composés réducteurs, et surtout des caroténoïdes (carotènes et xanthophylles) et des xanthones (dont la présence sera vérifiée) qui pourraient être parmi les précurseurs des oxalates de la plante.

Au plan pharmacologique, en plus des données de la pharmacopée traditionnelle, l'étude nous indique que Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) possède une action inhibitrice sur Candida albicans. C'est la confirmation de l'utilisation faite en milieu traditionnel où la plante est recommandée et recherchée dans le traitement des candidoses digestives (muguet, mycoses bucco-anales etc...).

Cette activité antimycosique est retrouvée en majorité dans l'extrait n-hexanique. Afin de parvenir à une légère purification de cet extrait nous avons procédé à un partage liquide-liquide avec de l'éthanol.

Si au plan pharmacologique cette opération ne nous a pas permis d'avancer, au plan chimique elle nous aura permis de savoir que les caroténoïdes trouvés dans l'extrait n-hexanique sont constitués de carotènes et de xanthophylles.

Elle nous aura permis de rencontrer une deuxième groupe de composés jaunes qui seraient probablement des xanthones qui seront étudiées dans nos prochaines études.

L'objectif de nos prochains travaux sera d'approfondir cette étude qui était une étape indispensable pour permettre de se faire une idée d'ensemble sur la chimie et la pharmacologie de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae).

En d'autres termes nous étudierons la nature de certains principes responsables de la production d'oxalates dans la plante et de là ceux responsables de l'activité pharmacologique étudiée.

Dans cette lignée nous pourrions aussi étudier la nature de l'amine responsable des propriétés anticonvulsivantes et sensorio-motrices attribuées à la plante.

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Contribution à l'étude des mycoses cutanéo-phanériennes et leurs agents étiologiques dans les consultations dermatologiques à Ouagadougou.

A) 1 - Dissoudre 34,66 g de sulfate cuivrique (CuSO₄) dans 200 ml d'eau distillée et diluer à 500 ml.

B) 2- Dissoudre 173 g de tartrate double de potassium (K) et de sodium (Na) et 100 g de soude caustique (NaOH) dans 300 ml d'eau distillée et diluer à 500 ml après refroidissement.

Dissoudre 0,85 g de nitrate basique de bismuth dans un mélange eau distillée (40 ml)-acide aceptique (10 ml).

N.B.: Pour les révélations des taches chromatographiques, on prépare extemporanement un mélange de la solution mère (1 ml) + 10 ml d'un mélange : acide acétique-eau distillée 1/5 (v/v).

Dissoudre 10 g de perles de NaOH dans 80 ml d'eau distillée et diluer à 100 ml .

8- Réactif de révélation des amines: solution de ninhydrine-chlorure d'étain (II) (SnCl₂)

Dissoudre en chauffant 2 g de ninhydrine dans 40 ml d'eau distillée. Y ajouter une solution de (0,08 g de SnCl₂ dans 50 ml d'eau distillée) et laisser reposer.

Après avoir séparé le précipité par filtration, le filtrat est conservé au réfrigérateur.

A 25 ml de la solution de reserve, ajouter 50 ml d'eau distillée et 450 ml d'isopropanol.

Dissoudre 5 g d'acétate de nickel (II) dans 80 ml d'eau distillée et diluer à 100 ml.

Dissoudre 25 g de trichlorure d'antimoine (III) (SbCl₃) dans 75 ml de chloroforme (CHCl₃) ou de tétrachlorure de carbone (CCl₄).

Parmi plus de 60 antibiotiques polyènes isolés de Streptomyces du sol caractérisés par un nombre variable de doubles liaisons conjuguées (-CH=CH-)_n et un grand cycle lactone, 2 produits sont utilisés maintenant depuis plus de 20 ans: la nystatine et l'amphotéricine B.

Leur spectre antifongique est très large allant des levures aux champignons filamenteux pathogènes ou saprophytes, mais ils sont sans action sur les bactéries, les actinomycètes ou les virus; par contre, ils ont une activité sur quelques protozoaires (Trichomonas, Leishmania) et quelques algues (Prototheca zopfii, P. Filamenta). Leur action fongistatique et fongicide est expliquée d'une part par la formation de complexes insolubles avec les stérols aboutissant à l'altération de la perméabilité cellulaire et d'autre part par la stimulation de la consommation d'oxygène, transformation de l'ATP (Adénosine Tri-Phosphate) en ADP (Adénosine Di-Phosphate) diminuant la synthèse des composés azotés, glucidiques avec fuite des métabolites essentiels.

Non toxiques par voie orale, assez toxiques par voie parentérale, provoquant en particulier hyperthermie avec phénomène de choc; peu solubles dans l'eau, légèrement solubles dans l'alcool, solubles dans le diméthylsulfoxyde et le méthylformamide; ils ont un spectre d'absorption dans l'ultra-violet (UV) caractéristique des chromophores polyènes.

- Tétraènes: nystatine, antimycoine, rimocidine, chromine, amphotéricine A, pimaricine (tennécetine).

- Heptaènes: trichomycine, ascosine, candicidine, candidine, amphotéricine B, hamycine, etc.

La nystatine, la pimaricine et l'amphotéricine B ont un sucre aminé (mycosamine) lié à un grand cycle lactone contenant des doubles liaisons conjuguées. Cette structure rappelle l'architecture des antibiotiques du groupe de l'érythromycine (macrolides); pour cette raison, les antibiotiques polyènes sont appelés également macrolides polyèniques; certains polyènes n'ont pas d'azote (lagosine, filipine).

Ce antibiotique est un tétraène, inhibant in vivo à des concentrations variant de 1 à 12,5 ug/ml (les préparations actuelles contiennent entre 3500 et 5000 U/mg de produit) un très grand nombre de champignons, en particulier Candida, Torulopsis, Geotrichum sans donner de souches résistantes.

Activité fongistatique et fongicide. Absorption par les levures plus rapidement et en plus grande quantité à pH acide qu'à pH neutre ou alcalin.

L' Un des effets primaires des polyènes sur les champignons sensibles est la stimulation de la consommation d'oxygène, l'inhibition de la respiration étant le résultat final conduisant à la mort des cellules; analogie avec l'action des agents découplant la phosphorylation de la respiration, comme le 2-4 dinitrophénol; perturbation du métabolisme du phsphore inorganique. Altération de la perméabilité cellulaire par formation de complexes avec les stérols de la membrane cellulaire.

Ce polyène est un heptaène, inhibant à des concentrations inférieures à 1ug/ml tous les champignons levuriformes (Candida, Cryptococcus, Torulopsis) et les formes levures des champignons dimorphiques (Histoplasma capsulatum et H. duboisii, Blastomyces dermatitidis et P. brasiliensis, Coccidioïdes immitis). Les champignons filamenteux (Aspergillus, Cephalosporium, Mucor) sont sensibles à dess CMI plus élevées (1-5 ug/ml). In vivo on n'observe pas de résistance mais les CMI peuvent s'élever légèrement au cours des traitements prolongés.

L'Antibiotique est actif sur certains protozoaires: Leishmanies, Trichomonas, Naegleria et Hartmanella et sur des algues pathogènes comme Prototheca, agents de méningites.

Le mode d'action commun à celui des autres polyènes relève de divers mécanismes: stimulation de la consommation d'oxygène, transformation de l'ATP en ADP diminuant la synthèse des composés azotés et des reserves glucidiques, formation de complexes insolubles avec les stérols membranaires du champignon entraînant des troubles de la perméabilité cellulaire avec fuite des métabolites essentiels et de potassium. La fuite potassique semble concerner également les cellules de l'organisme et l'hypokaliémie, quasi constante au cours des traitements prolongés, doit être compensée ou prévenue.

Le mode d'action au niveau des stérols membranaires pourrait expliquer l'antagonisme observé in vitro avec les imidazolés. In vivo, aux doses thérapeutiques, l'antifongique est fongistatique et non fongicide justifiant la prolongation des traitements afin que les processus cellulaires de défense de l'organisme éliminent les agents pathogènes.

Il s'agit d'une pyrimidine fluorée de faible poids moléculaire. Elle est très peu liée aux protéines sériques dans l'organisme et elle est dialysable.

Son mode d'action est parfaitement connu. La 5-FC est un antimétabolite de la cytosine. En compétition avec cette dernière, la 5-FC traverse la paroi fongique grâce à une perméase. Puis une cytosine désaminase transforme la 5-FC en 5-fluoro-uracile qui est métabolisée en 5-fluoro-uridine puis phosphorylée. La 5-fluoro-uridine triphosphate est incorporée à l'ARN à la place de l'uridine ; la synthèse des protéines indispensables à la vie cellulaire fongique est ainsi bloquée.

Un tel mode d'action pourrait laisser craindre une forte toxicité lors de l'utilisation chez l'homme, par le biais du 5-fluoro-uracile.

Heureusement, contrairement aux cellules fongiques, les cellules humaines et celles de la plupart des mammifères ne possèdent pas la cytosine désaminase et c'est à titre exceptionnel que certains auteurs ont signalé une toxicité hématologique ou hépatique.

In vitro, l'action est du type fongistatique et fongicide, in vivo aux doses thérapeutiques l'action est fongistatique. Les champignons sensibles sont essentiellement des champignons levuriformes: Candida, Torulopsis, Cryptococcus; certains filamenteux: Aspergillus (inconstamment et à un moindre degré), Cladosporium trichoïdes, agent de mycoses cérébrales et des agents de chromoblastomycoses (Phialophora pedrosoï, P. verrucosa, Cladosporium carionii).

L'Etude de la sensibilité du genre Candida montre que in vitro la 5-FC a une action essentiellement fongistatique, l'action fongicide n'est obtenue qu'à des concentrations très élevées 100 ug/ml, non atteintes in vivo.

Il s'agit de : l'éconazole, du clotrimazole, du miconazole et du kétoconazole.

Ils agissent tous selon le même mécanisme par blocage de la chaîne de biosynthèse de l'ergostérol membranaire (accumulation des stérols précurseurs comme le lanostérol) et perturbation des fonctions membranaires fongiques.

Ils sont actifs sur certains champignons filamenteux (dermatophytes) et levuriformes (Candida).

Etude de la chimie et de l'activité anti-mycosique des extraits de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae)

SOMMAIRE

ANNEXES................................................................................................................53

PROBLEMATIQUE

I- OBJECTIFS

II-1- OBJECTIF GENERAL

II-2- OBJECTIFS SPECIFIQUES

II- GENERALITES

II-1- BIOPHYTUM PETERSIANUM KLOTZSCH (OXALIDACEAE) (3;4;5;29;33;36; 44)

II-1-1- Synonyme

II-1-2- Noms en langues nationales

II-1-3- Situation de Biophytum petersianum KLOTZSCH (Oxalidaceae) dans le règne végétal

II-1-4- Caractères remarquables de la plante

II-1-4-1- Port

II-1-4-2- Feuilles

II-1-4-3- Fleurs

II-1-4-4- Fruits

II-1-5- Habitat de la plante

II-1-6- Utilisations thérapeutiques traditionnelles de la plante

II-1-7- Chimie de la plante

II-2- LES MYCOSES

II-2-1- Définitions (15; 19; 27; 35; 43)

II-2-1-1- Les mycoses

II-2-1-2- Les champignons (mycètes ou fungi)

II-2-1-2-1- Les champignons levuriformes

II-2-1-2-2- Les champignons filamenteux ou dermatophytes

II-2-2- Cas des candidoses (11; 19; 35; 37)

II-2-2-1- Etiologie

II-2-2-1-1- Agent pathogène

II-2-2-1-2- Epidémiologie

II-2-2-2- Clinique

II-2-2-2-1- Les candidoses digestives

II-2-2-2-2- Les candidoses cutanées et des phanères

II-2-2-2-3- Les candidoses génito-urinaires

II-2-2-2-4- Manifestations allergiques des candidoses

II-2-2-3- Diagnostic mycologique

II-2-2-3-1- Prélèvement

II-2-2-3-2- Examen direct

II-2-2-3-3- La culture

II-2-2-4- Traitement

III- MATERIEL ET METHODES

III-1- CADRES D'ETUDES

III-2- MATERIEL

III-2-1- Matériel végétal

III-2-2- La levure

III-2-3- Matériel de laboratoire

III-3- SOLVANTS ET REACTIFS

III-3-1- solvants

III-3-2- réactifs

III-4- CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE

III-4-1- Coupes histochimiques (18, 36)

III-4-2- Extractions (25, 30)

III-4-2-1- Extractions solide-liquide

III-4-2-1-1- Extractions à chaud

III-4-2-2- Extraction liquide-liquide

III-4-3- Réactions de caractérisation en milieu liquide

III-4-3-1- Caractérisation des saponosides (14)

III-4-3-2- Caractérisation des composés réducteurs (33)

III-4-3-3- Caractérisation des tanins et composés polyphénoliques (13, 33)

III-4-3-4- Caractérisation des alcaloïdes (40)

III-4-3-5- Caractérisation des stéroïdes et triterpènes (10, 13)

III-4-3-6- Caractérisation des pigments anthocyaniques (10, 33)

III-4-3-7- Caractérisation des flavonoïdes (23)

III-4-3-8- Caractérisation des coumarines (33)

III-4-3-9- Caractérisation des anthracénosides (33)

III-4-3-10- Caractérisation des hétérosides (33)

III-4-3-11- Caractérisation des amines (8)

III-4-3-12- Caractérisation des polyuronides (pectines, mucilages, gommes) (33)

III-4-4- Chromatographies sur couche mince (CCM) (13, 45)

Figure 3: Schéma de synthèse du criblage phytochimique

III-5- ETUDE PHARMACOLOGIQUE: ANTIBIOGRAMME FONGIQUE (11,25, 31)

III-5-1- Milieu de culture

III-5-2- Technique employée

III-5-3- Inoculum

III-5-4- Ensemencement

III-5-5- Solubilisation des extraits

III-5-6- Dépôt des extraits

III-5-7- Incubation

III-5-8- Lecture des résultats

IV- RESULTATS ET DISCUSSIONS