|
N° d'enregistrement :
MEMOIRE BIBLIOGRAPHIQUE
Du MASTER des Grandes Ecoles du vivant d'île de
FRANCE
Présenté et soutenu publiquement à
l'Ecole Nationale Supérieure des Industries Agricole et alimentaires de
Massy
Par Ahmed MEKSEM Le
05-01-2006
MASTER en SCIENCES et TECHNOLOGIES du
VIVANT
Grandes Ecoles du Vivant d'Ile de France
INA P-G -ENGREF - ENSIA - ENVA - ENSP
Titre du mémoire
La famille des nucléosides monophosphate kinases :
importance
métabolique, structures et intérêts
thérapeutiques.
Laboratoire d'accueil
UMR INRA/INA P-G 206 Chimie Biologique
78850 Thiverval-Grignon
Responsable du stage
Dr P. Briozzo Maître de conférences en Biochimie
INA P-G
Jury de soutenance
Rapporteur :
Dr T. Chardot, Directeur de recherches INRA en Biochimie
(Centre
de recherches Versailles Grignon)
Examinateurs :
Pr. D. Tomé, Professeur en Nutrition Humaine INA P-G
Dr D. Fouques, Maître de conférences en Biochimie
INA P-G
Remerciements
Au terme de ce travail je tiens à présenter
mes
remerciements à :
Ma femme chère Farida AITEL-MEKSEM pour son soutien et
sa patience et je lui souhaite toute la réussite.
Monsieur Pierre BRIOZZO, Maître de Conférences en
Biochimie à INA P-G pour son aide, son orientation, sa
disponibilité à mon égard tout au long de la
réalisation de ce travail. Je tien aussi à remercier Pr Catherine
LAPIERRE, Professeur en Biochimie à l'INA P-G de m'avoir accueilli dans
ses laboratoires. Sans pour autant oublier Monsieur Amar HADJ KACI,
Maître Assistant Chargé de Cours de Biochimie à la
faculté des Sciences Biologiques et des Sciences Agronomiques,
Département
Biochimie-Microbiologie, Université Mouloud. MAMMERI de
Tizi-Ouzou (Algérie) pour son soutien moral, son orientation et son
aide.
Résumé
Les nucléosides monophosphate kinases (NMPK) sont des
enzymes clefs qui
catalysent le transfert réversible du groupement
phosphate terminal (d) d'un nucléoside
triphosphate (NTP) à un nucléoside monophosphate
(NMP). Elles contribuent ainsi au
maintien, avec les NDPK, des concentrations de NTP
nécessaires à la synthèse des acides
nucléiques et des phospholipides, et au recyclage des
seconds messagers. Les NMPK sont
nécessaires à l'activation pharmacologique des
analogues de nucléosides (promédicaments)
utilisés comme agents thérapeutiques dans le
traitement du cancer et de maladies virales. Du point de vue structural, les
différentes analyses cristallographiques des NMPK libres ou liées
aux substrats ou à des analogues des substrats, montrent qu'elles
présentent toutes trois domaines caractérisés par leurs
propriétés structurales et fonctionnelles : le core, le couvercle
et le domaine de liaison des NMP. L'existence de NMP kinases spécifiques
des bactéries et essentielles à leur croissance offre des cibles
possibles pour le développement de nouvelles drogues
antibactériennes.
Mots clefs : nucléoside monophosphate
kinases ; nucléotides ; analogues de nucléotides ;
médicaments anticancéreux, antiviraux et
antibactériens.
Summary
The nucleosides monophosphate kinases (NMPK) are key enzymes
which catalyse the
reversible transfer of the final phosphate group ( d) of a
nucleoside triphosphate (NTP) to a
nucleoside monophosphate (NMP). The NMPK maintain, with the
NDPK, the concentrations of NTP necessary to the synthesis of the nucleic
acids, phospholipids, and the recycling of the second messengers. Moreover, the
NMPK are required for pharmacological activation of the nucleoside analogues
used as therapeutic agents in the treatment of cancer and AIDS. From a
structural point of view, crystallographic analyses of the NMPK free or bound
to substrates or substrate analogues, show that they all possess three domains
which different structural and functional properties: the core, the LID and the
NMP binding domain. The occurrence of NMP kinases specific of bacteriae and
essential for their growth provides targets for new antibacterial drugs.
Key words: nucleoside monophosphate kinases;
nucleotides; analogues of
nucleotides, anticancer, antiviral and antibacterial drugs.
Abréviations
A : adénine
AK : adénylate Kinase
ADN : Acide Désoxyribonucléique
AMP : adénosine monophosphate
AMPc : adénosine monophosphate cyclique
ARN : acide ribonucléique
ATP : adénosine triphosphate
C : cytosine
CMP : cytidine monophosphate
G : guanine
GK : guanilate kinase
GMPc : guanosine monophosphate cyclique
NMP : nucléoside monophosphate
NDP : nucléoside diphosphate
NDPK : nucléoside diphosphate kinase
NMPK : nucléoside monophosphate kinase
NTP : nucléoside triphosphate
T : thymidine
TK : thymidylate Kinase
U : uracile
UMP : uridine monophosphate
UMP/CMPK : uridylate -cytidylate kinase
VIH : virus d'immunodéficience humaine
Introduction
Avec l'émergence des microorganismes pathogènes
de plus en plus résistants aux traitements antibiotiques conventionnels,
il devient plus qu'indispensable de concevoir de nouvelles molécules.
Les enzymes des voies métaboliques essentielles deviennent ainsi des
cibles thérapeutiques privilégiées et
constituent un axe de recherche incontournable et primordial.
Les nucléosides monophosphate kinases (NMPK), enzymes
clés dans la synthèse des nucléosides triphosphates,
appartiennent à cette catégorie. Il existe des AMP, des GMP et
des
TMP kinases. Le cas des autres NMPs est plus complexe : chez
les eucaryotes une unique UMP/CMP kinase phosphoryle avec la même
efficacité le CMP et l'UMP ; au contraire, les bactéries
possèdent une CMP kinase et une UMP kinase. Cette différence
permet d'envisager de nouveaux médicaments spécifiques des CMP ou
UMP kinases bactériennes. D'une manière générale,
les analogues de nucléosides sont largement utilisés depuis
longtemps contre les maladies virales et les cancers. L'objectif de ce rapport
bibliographique est de contribuer à l'étude de la famille des
nucléoside monophosphate kinases, de décrire leur importance
métabolique dans la production et la conversion des nucléotides,
leur structure tridimentionnelles et enfin leurs intérêts
thérapeutiques lors de l'utilisation d'analogues de
nucléotides.
I. Les nucléosides monophosphate kinases
(NMPK)
Les kinases constituent un groupe d'enzymes ubiquitaires qui
jouent un rôle crucial et
central dans de nombreuses réactions biochimiques
liées surtout au métabolisme des
nucléotides (Matte et al, 1998). Ces enzymes
appartiennent à la famille des
phosphotransférases, enzymes qui assurent le transfert
réversible d'un groupement
phosphoryle d'un nucléoside, généralement
triphosphate, à un autre, ou à une petite molécule,
ou bien encore à un autre substrat protéique.
Les molécules ainsi phosphorylées sont
essentielles pour de nombreux aspects métaboliques,
mais le sont aussi pour la régulation de
l'expression des gènes et pour la transduction du
signal.
1.1-Définition
Les nucléosides monophosphate kinases (NMPK) sont des
enzymes clefs qui
catalysent le transfert réversible du groupement
phosphate terminal (d) d'un nucléoside triphosphate (NTP),
généralement et préférentiellement l'ATP, à
un nucléoside monophosphate (NMP) qui sera, dès lors, converti en
sa forme correspondante de diphosphate (NDP) . Les NMPK sont notées ---
ATP : NMPPhosphotransférases (Bucurenci et al, 1996).
NMPK
1.2-Substrats des NMPK
Dans cette partie du rapport nous proposons (1)
de décrire du point de vue et de leur
structure et de leur activité biologique les substrats
des NMPK : les nucléosides, (2) de
présenter quelques nucléosides modifiés
connus pour leur activité thérapeutique. Les NMP
sont composés d'une base azotée, d'un ose et
d'un groupement phosphate.
1.2.1-Les bases azotées
1.2.1.1-Définition
Parmi les centaines de molécules organiques, d'origine
naturelle, à propriétés basiques
contenant de l'azote (un ou deux cycles où alternent
des atomes de carbone et d'azote) que l'on rencontre chez les êtres
vivants, cinq jouent un rôle déterminant dans la structure des
acides nucléiques, support du message héréditaire, et se
trouvent ainsi impliquées dans ses
altérations rencontrées au cours des cancers et
des autres pathologies. Elles sont aussi la cible de médicaments
anticancéreux et antiviraux qui agissent sur leur synthèse et
leur incorporation et bloquent la reproduction cellulaire : ce sont les
bases azotées.
1.2.1.2-Classification
Les bases puriques
Les bases puriques contenues dans l'ADN ou l'ARN sont
essentiellement la guanine
(G) et l'adénine (A), elles sont dérivées
de la purine
Les bases pyrimidiques
Les bases pyrimidiques sont des dérivés de la
pyrimidine ; celles contenues dans
l'ADN sont la cytosine (C) et la thymine (T) dans l'ARN on
trouve la cytosine (C), l'uracile
(U) et rarement la thymine (T).
1.2.2-Les nucléosides et les nucléotides
Les nucléosides : Un nucléoside
est une molécule formée d'un ribose (dans le cas de
l'ARN) ou d'un 2'-désoxyribose (dans le cas de l'ADN)
lié soit à une purine ou à une
pyrimidine ; une liaison covalente s'établie entre le
carbone C1' du pentose et l'azote N9 de la
purine ou N1 de la pyrimidine.
Le pentose est sous forme furanique et la liaison osidique est
sous la configuration
b (N-b-glycosidique). Le tableau 1 indique la nomenclature des
principaux nucléosides.
Les nucléotides : Un
nucléotide, ester phosphorique de nucléosides, contient un
nucléoside lié à un ou à plusieurs
groupements phosphoryles fixés sur le carbone C5' du
pentofuranose, Le tableau 2 indique la nomenclature des
principaux nucléotides.
L'enchaînement de plusieurs nucléotides,
reliés entre eux par des liaisons 3'-5'
phosphodiester, aboutit à la formation
d'oligonucléotides et de polynucléotides constitutifs de
l'ADN et de l'ARN.
Chez les mammifères, les besoins en nucléosides
sont assurés soit :
_ Par la synthèse de novo ; dans ce cas les
ribo et les désoxyribonucléosides
monophosphates sont convertis de la forme monophosphate
à la forme di- puis triphosphate.
_ Par recyclage des nucléosides provenant de la
nourriture ou de la dégradation cellulaire de
l'ADN (Pruvost, 2002 ; Sandrini et Piskur, 2005).
Le système de récupération constitue la
source de la plus importante de production de
nucléotides nécessaires pour la synthèse
de l'ADN et de l'ARN, ce système est ainsi ciblé en
pharmacologie pour activer les promédicaments
antiviraux par phosphorylation, seuls les
NTP sont utilisables pour la synthèse d'acides
nucléiques ; en revanche, la synthèse de novo
est ciblée en chimiothérapie pour inhiber
l'anabolisme des bases puriques et pyrimidiques
(Sandrini et Piskur, 2005).
Rô l e s p h y s i o l o g i q u e s e t p h a
rma c o l o g i q u e s d e s n u c l é o t i d e s
Le phosphate d'un nucléotide peut subir des
phosphorylations pour produire des
nucléotides diphosphates et triphosphates, par exemple
l'ADP et l'ATP. Pour chacun des
monophosphates de ribonucléoside et de
désoxyrironucléoside, les nucléotides sont
trouvés
principalement comme unités monomériques
constitutives des acides nucléiques de la cellule
(ADN et ARN).
Cependant, les nucléotides sont également
indispensables pour plusieurs autres
fonctions cellulaires importantes. Ces fonctions se
résument selon King (2005) :
_ Servir de réserve d'énergie (accepter, stocker
et transférer l'énergie chimique pour une
utilisation future) dans des réactions de transfert de
phosphate effectuées principalement
par l'ATP.
_ Entrer dans la constitution de plusieurs coenzymes
importants comme : le NAD + , le NADP+ et le coenzyme A.
_ Servir de médiateurs dans nombreux processus
cellulaires importants, tel le cas des
seconds messagers qui interviennent dans des
événements de transduction du signal, dont
le plus important est l'AMPc.
_ Intervenir dans nombreuses réactions enzymatiques de
contrôle via des effets
allostériques.
_ Servir d'intermédiaires activés dans de
nombreuses réactions biosynthétiques.
1.2.3-Les analogues des nucléosides et des
nucléotides thérapeutiquement
actifs
1.2.3.1-Définition
Les analogues structuraux des nucléosides et des
nucléotides sont des molécules
proches des molécules biologiques du point de vue
fonctionnel et structural, ils sont
chimiquement modifiés par substitution, addition ou
délétion de groupes ou d'éléments
spéciaux.
La modification peut porter sur :
_ La structure du sucre par inversion, remplacement ou
suppression de groupements
hydroxyles, le cycle peut être modifié par
ouverture ou par substitution d'atomes qui le
constituent.
_ La structure base azotée par ajout ou suppression de
groupements fonctionnels ; dans d'autres cas des hétérocycles de
synthèse peuvent être utilisés (Roy, 2004). Les analogues
des nucléosides et des nucléotides sont d'importants agents
anticancéreux (chimiothérapeutiques) et
antiviraux (réduction de la charge virale) qui
concurrencent les substrats naturels (effet
compétitif), ce qui perturbe la synthèse de
l'ADN et /ou de l'ARN et qui a pour conséquence le
déclenchement de l'apoptose (
Krishnan et al., 2002).
1.2.3.2-Mécanisme d'action
Les analogues structuraux des nucléotides et des
nucléosides sont suffisamment
proches des molécules biologiques pour s'incorporer
dans le métabolisme et suffisamment
différents pour le perturber. Leur action se traduit
par :
_ la formation d'ADN et/ou d'ARN non fonctionnels ;
_ l'inhibition de l'ADN polymérase responsable de la
réplication de l'ADN et donc de la
multiplication cellulaire ;
_ l'inhibition de la transcription de l'ADN en ARN et celle de
l'ARN en ADN sous l'effet
de la transcriptase inverse responsable de la
réplication des rétrovirus ;
_ le blocage de la traduction de la protéine
correspondante (thérapie antisens).
1.2.3.3-Administration
Les analogues de nucléotides et de nucléosides
(par exemple le ddI ou didanosine
(VIDEX®) analogue de l'adénosine, le 3TC ou
lamivudine (EPIVIR®) analogue de la
cytidine, le ténofovir (VIREAD®).....) sont
généralement administrés sous forme de (désoxy)
ribonucléosides. Ils sont administrés sous forme inactive, ils
sont qualifiés pour cela de promédicaments. L'entrée dans
la cellule des composés triphosphates métaboliquement actifs est
impossible [du fait de leur charge fortement négative ils ne peuvent
traverser la membrane cellulaire et donc ne peuvent entrer dans la cellule
où ils peuvent agir]. Ils deviennent actifs seulement après leur
transformation en dérivés triphosphates, grâce aux
Nucléosides Mono Phosphates Kinases (NMPK), et aux nucléosides
diphosphates kinases ou NDPK de la cellule hôte ou de celles du virus
présent dans la cellule.
1.2.3.4-Effets secondaires
Les analogues nucléosidiques ont été les
premiers traitements à être utilisés contre le
SIDA, seuls d'abord puis en association. Le recul permet de
voir le bénéfice évident de ces traitements. Mais des
effets indésirables sont connus et nombreux pour chaque classe.
Les analogues de nucléosides peuvent être
incorporés dans l'ADN de la cellule normale, menant à la
toxicité et à la mort cellulaires et à des effets
secondaires tels que : l'hypertension, la diarrhée, la fonte musculaire,
les hypertrophies du foie et du pancréas, la neuropathie
périphérique, l'anémie et les maux de tête. A
l'échelle cellulaire la mitochondrie est la composante la plus sensible
aux analogues nucléosidiques, car l'ADN mitochondrial ne possède
pas de système de réparation. La présence d'un grand
nombre de mitochondries endommagées donne lieu à une production
excessive d'acide lactique qui correspond à une augmentation du taux
d'acide lactique (sous forme de lactates) dans le plasma sanguin
accompagnée d'une baisse du pH, du CO2 total et des bicarbonates.
Lorsque le taux d'acide lactique dans le sang s'élève
considérablement, une affection appelée acidose lactique
se produit, ces symptômes sont : la fatigue, des douleurs
abdominales, un essoufflement et des nausées.
Les analogues de nucléosides pourraient jouer un
rôle dans la survenue du syndrome
de lipodystrophie. Cette appellation recouvre plusieurs
syndromes différents, qui peuvent
s'associer, lesquels correspondent à des troubles du
métabolisme des graisses. D'une part, la perte de masse graisseuse ou
lipoatrophie, affectant particulièrement le visage, les membres
supérieurs et inférieurs, les fesses (elle ne doit pas être
confondue avec le syndrome de dénutrition ou wasting syndrome) et
d'autre part une obésité tronculaire avec graisse
périviscérale, une hypertophie mammaire et une masse graisseuse
au niveau de la nuque (bosse de bison). Enfin la dyslipémie (anomalies
des lipides sanguins) est parfois incluse, à tort, dans le terme de
lipodystrophie. Elle est mise en évidence par le bilan lipidique avec
dosage du cholestérol et des triglycérides dans le sang (Hosein,
2001).
Le même auteur rapporte dans sa publication, que des
chercheurs en France ont comparé l'effet de diverses combinaisons de
nucléosides sur la production de graisses et d'insuline dans
l'organisme, leurs résultats laissent penser que l'usage à long
terme d'analogues nucléosidiques donnerait lieu à des pertes de
graisses sous-cutanées. De plus, les
sujets recevant le d4T se sont avérés plus
susceptibles d'avoir un taux de triglycérides élevé dans
le sang.
1.3-Mécanisme catalytique
L'étude réalisée en 2004 par Segura-Penas
et al., sur les changements
conformationnels de l'UMP/CMP kinase humaine induits par la
liaison des substrats, a
montré clairement que le transfert de phosphate par les
NMPK s'effectue selon un mode dit
bi-bibi : c'est à dire que le mécanisme comporte
un complexe intérmédiaire constitué de
l'enzyme et des deux substrats.
1.4-Rôles physiologiques et pharmacologiques des
NMPK
Les NMPK maintiennent, avec les NDPK, les concentrations de
NTP nécessaires à la
synthèse des acides nucléiques et des
phospholipides et au recyclage des seconds messagers
(GMPc, AMPc..).
Ces rôles, si importants, font des NMPK des cibles
potentielles pour le développement
de nouvelles drogues antibactériennes et antivirales
(Hible et al, 2005).
Les études biochimiques montrent que les tissus humains
contiennent quatre NMPK :
une Thymidinylate Kinase (TK), une
Urydilate-Cytidilate Kinase (U/CK), plusieurs
isoformes de la Guanylates Kinases (GK) et
cinq isoformes de l'Adénylate Kinase (AK :
AK1-AK5 : Van Rompav et al, 2000).
Un sixième isoforme de l'AK a été mis en
évidence par Ren et al, en 2005 dans les
noyaux des cellules humaines.
A la différence des eucaryotes, les procaryotes
contiennent cinq NMPK, car l'UMP et
le CMP sont phosphorylés par deux enzymes distinctes
(UMPK et CMPK respectivement).
Les NMPK bactériennes interviennent dans la croissance
et la multiplication
cellulaire, elles présentent une grande
variabilité dans les propriétés structurales et
catalytiques par rapport à leurs homologues humains
(Tourneux et al, 1998 ; Munier-
Lehmann et al, 2003).
En plus, de leur rôle dans le turn over des
nucléotides, les NMPK bactériennes sont
exigées pour l'activation pharmacologique des analogues
de nucléotides et de nucléosides
utilisés comme agents thérapeutiques (Van Rompav
et al, 2000).
1.5-Structure tridimensionnelle des NMPK
Les différentes structures cristallographiques des NMPK
libres ou liées aux substrats ou à
des analogues des substrats, montrent qu'elles adoptent
généralement une forme monomérique (sauf pour certaines
telle l'UMPK bactérienne) et présentent toutes trois domaines qui
différent selon leurs propriétés structurales et
fonctionnelles:
_ Un domaine central (Core) : il contient
généralement un feuillet de cinq brins b
parallèles limités de chaque côté
par des hélices a généralement au nombre de huit ; ce
domaine rigide très conservé contient la
boucle-P (P-loop, p- pour phosphate) qui joue un
rôle important dans le transfert du phosphate ; la
boucle-P est caractérisée par une
séquence très conservée :
Gly-X-X-X-X-Gly-Lys. [Séquence consensus valable chez les
NMP kinases, mais il existe d'autres P-loops de
séquences consensus légèrement
différentes chez d'autres kinases] (Berg et
al, 2002 ; Pasti et al, 2003).
_ Un domaine de liaison des NMP (NMPbind) :
c'est un segment de 47 aa pour les GKs et
de 29 aa pour les autres NMPK, il est composé, pour les
GKs, de quatre feuillets b et
d'une petite hélice a et d'hélices pour les
autres NMPK. Le domaine de liaison avec les
NMP de la CMPK d'E. coli contient, par rapport aux
autres NMPK, une insertion
d'environ 40 aa (deux hélices a et trois brins b).
_ Un domaine LID (couvercle) qui recouvre le donneur
de phosphate dans le site actif : c'est un segment composé de
37 aa pour les AKs de type long et d'une petite boucle de 10
aa pour les autres NMPK (Yan, 1999).
Le nombre d'hélices et de brins de chaque domaine peut
varier d'une NMPK à une autre.
1.6-Flexibilité des NMPK
Les NMPK sont flexibles, leur structure subit un changement
local et global après la
liaison avec les deux substrats (NMP, NTP) ou avec des
analogues des substrats, des
mouvements de fermeture et/ou d'ouverture de la structure ont
lieu. On appelle ce phénomène l'ajustement
induit.
La structure des NMPK est ouverte en absence de substrats,
elle est partiellement fermée après la liaison d'un substrat
(donneur de phosphate) et est entièrement fermée après
la
liaison des deux (Blaszczyk et al, 2003 ; Pista et
al, 2003 ; Segura-Pena et al, 2004).
Cette flexibilité joue un rôle important dans la
catalyse enzymatique ; de plus, il est
important d'étudier ce phénomène pour
développer de nouveaux anti-cancéreux et anti-viraux de plus en
plus adaptés.
Les parties concernées par cette flexibilité
sont le domaine de liaison des NMP et le couvercle, en revanche, le domaine
central reste inchangé (Fukami-Kobayashi et al, 1996).
1.7-Rôles du Mg2+
L'étude de la cinétique des NMPK, et de
nombreuses enzymes qui utilisent l'ATP ou
les autres NTP comme substrats, montre que ces enzymes ne
deviennent actives qu'en
présence d'un cation métallique divalent : en
général le magnésium ( Mg 2+ ), ou le
manganèse (Mn 2+ ).
Selon Berg et al (2002), ces ions ne font pas partie
du site actif de l'enzyme ;
néanmoins, les NTP (tel l'ATP) se lient avec l'ion pour
former un complexe ion-NTP qui est le vrai substrat de l'enzyme.
A l'échelle moléculaire le Mg 2+ assure :
_ La coordination entre les groupements phosphate b-
et d- ou a- et d-
des NTP, il en
diminue ainsi le répulsions électrostatiques
dues aux charges négatives des groupements
phosphate.
_ La neutralisation des charges négatives des
groupements phosphates, donc la réduction
des interactions ioniques, non spécifiques, entre
l'enzyme et les groupements phosphates
des nucléotides.
_ La définition de la conformation des NMP suite
à la liaison du Mg 2+ avec les atomes
d'oxygène du groupement phosphoryle.
_ La diminution de l'énergie d'activation des NMPK
(Matte et al, 1998).
II- Description des NMPK
Les NMPK sont essentielles pour le contrôle de la
régulation de l'expression des
gènes, pour la transduction du signal et pour les
réactions métaboliques. Cela en fait des
cibles privilégiées pour le développement
de médicaments (Fioravanti et al, 2003).
2.1-L'adenylate kinase (AK)
L'AK (EC : 2.7.4. 3 ; ATP : AMP phosphotransférase) est
la NMPK la plus étudiée,
elle est abondante dans les organites ayant un important
turn over de nucléotides
(mitochondries et chloroplastes). Le gène qui code pour
l'AK : adk, a été cloné et séquencé
à partir de différentes sources, les protéines
correspondantes ont été purifiées et plusieurs
variants de l'AK ont été ainsi obtenus
(Bucurenci et al, 1996 ; Vonrhein et al, 1998).
On distingue, généralement et selon le nombre
d'aa constitutifs du couvercle, deux
types d'AKs : le type long et le type court ; le type long a
en plus 27 aa, au niveau du
couvercle (LID), que le type court (Fukami-Kobayashi et
al, 1996 ; Yan, 1999).
Cinq isoformes de l'AK ont été identifiés
chez les vertébrés :
_ L'AK1 : appartient au type court, on la
trouve dans le cytosol.
_ L'AK2 : appartient au type long, on la
trouve dans l'espace inter membranaire des
mitochondries et dans le cytosol.
_ L'AK3 : appartient au type long, on la
trouve dans la matrice mitochondriale (Yan, 1999).
Selon Fukami-Kobayashi et al (1996), les AKs 1 et 2
utilisent l'ATP comme donneur
de phosphate, en revanche l'AK3 utilise le GTP.
_ L'AK4 : appartient au type long, on la
trouve, aussi, dans la matrice mitochondriale.
_ L'AK5 : appartient au type court, elle est
cytosolique (Van Rompay et al, 1999 ; Ren et
al, 2005). Une sixième isoforme de l'AK :
AK6 a été caractérisée chez
l'Homme par Ren
et al (2005), sa structure cristallographique et sa
localisation cellulaire ont été
déterminées.
L'AK6 diffère des autres isoformes par le fait qu'elle
:
_ Subit des changements structuraux plus marqués
pendant la catalyse.
_ Accepte plus de donneurs et d'accepteurs de phosphate que
les autres AKs.
Mais aussi par sa localisation dans le noyau, qui lui permet
de jouer un rôle important
dans la production de l'ADP et du CDP utilisés par les
NDPK lors du métabolisme des
nucléotides dans le noyau et pour l'échange des
molécules riches en énergie entre le noyau et les mitochondries
(Ren et al, 2005).
Les AKs des plantes et de nombreux microbes appartiennent au
type long.
2.2- La guanylate Kinase (GK)
La GK (EC : 2.7.4.8 ; ATP: GMP phosphotransférase)
catalyse le transfert réversible
du groupement phosphoryle d de l'ATP au GMP en présence
du Mg 2+. Les GKs présentent
un certain degré de similarité avec l'AK1, les
aa impliqués dans le transfert du groupement
phosphoryle d sont identiques pour les GKs et les AKs ;
néanmoins, les aa constitutifs du
domaine de liaison avec les NMP ne sont pas homologues pour
ces deux enzymes (Yan,
1999 ; Blaszczyk et al, 2003).
Les GKs sont ubiquitaires chez les procaryotes et chez les
eucaryotes, elles se trouvent
essentiellement dans le cytosol des cellules ( Hible et
al, 2005)
La GK humaine est très importante dans l'activation des
drogues anti-virus herpes
(gancyclovir) et anti-VIH (Blaszczyk et al, 2003).
2.3-La thymidylate Kinase (TK)
La TK (EC 2.7.4.9, ATP: dTMP phosphotransférase)
catalyse le transfert réversible du
groupement phosphoryle d de l'ATP au dTMP. La TK est
essentielle pour la réplication de
l'ADN, pour la croissance et la survie des cellules, elle
constitue une cible attractive (thérapie génique) pour les
analogues de nucléosides (Fiavanta et al, 2003).
La TK est présente aussi bien chez les virus que chez
les eucaryotes supérieurs, mais
les TK représentent la fraction la plus faible des
kinases bactériennes solubles.
L'activité de cette enzyme est presque nulle dans les
tissus qui prolifèrent lentement
ou pas, mais maximale dans les tissus à renouvellement
rapide, c'est pour cette raison que les inhibiteurs des TK sont des
médicaments pour le traitement du cancer et contre les virus. Selon
Prevost (2002), les cellules humaines contiennent deux types de TK : la TK1
et
la TK2. La TK1 phosphoryle la désoxythymidine et la
désoxyuridine.
La TK2 phosphoryle la désoxyuridine, la
désoxythymidine et la désoxycytidine.
Selon Fioravanti et al (2003), une autre
classification des TK est possible en fonction
de l'addition de résidus basiques au niveau de la
boucle-P pour le type I (chez les eucaryotes) et au niveau du couvercle (LID)
pour le type II (chez les procaryotes).
Les TK interviennent dans l'activation cellulaire, par
tri-phosphorylation, de deux
analogues utilisés comme agents anti-HIV
(promédicaments) : le d4T (didéhydrodésoxythymidine)
et l'AZT (3'-azido-3'-désoxythymidine) ; les TMPK
d'E.coli
phosphorylent mieux l'AZT que leurs homologues humains (Lavie
et al, 1999).
L'AZT est un mauvais substrat pour les TK humaines, il en
résulte une accumulation
de l'AZT-MP dans les cellules humaines ce qui cause plusieurs
effets secondaires chez les
patients lors du traitement par l'AZT (Van Rompay et
al, 2002).
2.4-L'UMP/CMP kinase des eucaryotes (UMP/CMPK)
Chez les eucaryotes les UKs catalysent, efficacement, la
phosphorylation de l'UMP et
du CMP : on parle ainsi d'UMP/CMP kinases. Chez les
procaryotes, ce sont deux enzymes
distinctes qui catalysent la phosphorylation de l'UMP ou du
CMP (dCMP).
L'UMP/CMPK des eucaryotes contrôle les niveaux de
synthèse des pyrimidines
diphosphate, elle catalyse le transfert d'un groupement
phosphoryle de l'ATP au CMP, à
l'UMP avec la même efficacité, il en
résulte la formation de l'ADP et des NDP
correspondants ; le dCMP est un mauvais substrat pour
l'UMP/CMPK (Liou et al, 2002).
Les UMP/CMP kinases interviennent dans la phosphorylation de
plusieurs
médicaments anticancéreux et antiviraux, elles
sont utilisées dans le traitement des personnes qui souffrent du sida et
de l'hépatite B (Pista et al, 2003).
Des analogues de la cytidine et de la désoxycytidine :
1-b-D-arabinofuranosylcytosine,
5-azacytidine et 2',2'-difluorodésoxycytidine
(Gemcitabine), sont utilisés dans le traitement
de la leucémie ou des tumeurs massives
(chimiothérapie) ; d'autres tels la b-D-2',3'-
didésoxycytidine et le L-(-)-SddC ( Lamivudine)
montrent une activité anti-VIH et antihépatite B.
Le L-(-)-SddC est le premier analogue de nucléosides
sous forme L qui montre une
activité thérapeutique et qui définit une
nouvelle catégorie d'analogues de nucléosides.
Ces analogues nécessitent une phosphorylation par les
kinases humaines pour pouvoir
exercer leurs activités pharmacologiques. La
première phosphorylation est assurée par une
désoxycytidine kinase et une uridylate kinase, la
deuxième par l'UMP/CMPK et la troisième par la NDPK ou par
d'autres kinases (Liou et al., 2002).
La désoxycitidine kinase (dCK) humaine phosphoryle la
plupart des analogues de
nucléosides utilisés comme des agents antiviraux
ou anticancéreux : le 1-b-D-
arabinofuranosylcytidine et la
2-chloro-2'-désoxyadénosine sont utilisés dans le
traitement
des tumeurs malignes ; la 2'-3'-didésoxycitidine et la
2'-désoxy-3'-thiacytidine sont utilisés
comme des agents anti-VIH. L'expression de la dCK est
importante dans les tissus et les
cellules lymphoïdes particulièrement dans les
lymphoblastes-T immatures qui sont, de ce fait, très sensibles aux
analogues de nucléosides antileucémiques.
La résistance aux analogues des nucléosides est
liée à une baisse de l'expression de la
dCK ou à une mutation dans une ou plusieurs
régions du gène qui code pour la dCK
(Johansson et al, 2000).
22
2.5-La CMP kinase et l'UMP kinase
bactériennes
Chez les procaryotes l'UMPK est localisée
essentiellement dans le cytoplasme et à un
degré moindre dans la membrane cytoplasmique, elle est
codée par le gène pyrH (propre aux procaryotes et sans
homologue chez l'Homme), elle est essentielle pour la croissance et la division
cellulaire ; le produit du gène pyrH constitue une nouvelle
cible attractive pour les drogues antibactériennes (Bucurenci et
al, 1998).
L'UMPK d'E. coli (UMPKeco) diffère des autres
NMPK, sa séquence ne ressemble
pas à celle des autres NMPK ; elle est plutôt
similaire à celle des aspartokinases. L'UMPK
est un hexamère (les autres NMPK sont
monomériques) sujet de régulations complexes : le
GTP est un acivateur allostérique, et l'UTP semble
être un inhibiteur compétitif ( Briozzo et al, 2005).
L'ATP et le dATP sont les seuls substrats donneurs de
phosphate pour cette enzyme.
Selon Yu et al (2003), la CMPK de Streptococcus
pneumoniae, bactérie souvent résistante
aux antibiotiques, constitue une cible thérapeutique
attractive pour le développement de
nouveaux antibiotiques et palier ainsi au problème de
la résistance croissante aux
antibiotiques.
Cependant, en l'absence de CMP kinase les bactéries
peuvent synthétiser du CTP à
partir d'UTP grâce à la CMP synthétase. La
CMP kinase n'est sans doute pas indispensable
aux bactéries sauf dans quelques cas particuliers. Par
contre, l'UMP kinase est indispensable à la croissance
bactérienne et constitue de ce fait une cible intéressante pour
la conception des antibiotiques.
Conclusion
Les thérapeutiques antivirale et anticancéreuse
progressent avec lenteur, car elles
s'attaquent à des micro-organismes ne se multipliant
qu'à l'intérieur des cellules vivantes dont ils détournent
le métabolisme à leur profit, ou directement à des
cellules anormales du
malade.
D'ou l'intérêt de connaître :
_ la structure tridimensionnelle des enzymes notamment les
NMPK des microorganismes
pathogènes impliqués dans ces pathologies, et
celles des cellules humaines ciblées par les
médicaments pour le développement [par
génie biochimique et biotechnologie] de
médicaments inhibiteurs spécifiques avec des
effets secondaires moindres ;
_ la spécificité des médicaments
inhibiteurs enzymatiques à l'égard des enzymes virales ou
cellulaires, afin de limiter leur toxicité vis à
vis des cellules de l'organisme et moduler la
balance : toxicité / efficacité.
Chose possible en utilisant la mutagenèse
dirigée associée à la
cristallographie.
24
Références bibliographiques
1. Berg M., Tymoczko J.L. & Stryer L. (2002).
Nucléosides monophosphates kinases :
catalyzing phosphoryl group exchang between nucleosides
without promoting hydrolysis.
Sur le net :
http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/ book/ bv.fcgi? rid
=stryer.section.1236.
2. Berry M.B. & Phillips G.N. (1998). Crystal
Structures of Bacillus stearothermophilus
Adenylate Kinase With Bound Ap5A, Mg
2+
Ap5A, and Mn
2+
Ap5A Reveal an
Intermediate Lid Positionand Six Coordinate Octahedral
Geometry for Bound Mg
2+
and
Mn
2+
. Proteins : Structure, Function, and Genetics 32 :
276-288.
3. Bertrand T., Briozzo P., Assairi L., Ofiteru A., Bucurenci
N., Munier-Lehmann H.,
Golinelli-Pimpaneau B., Bârzu O. & Gilles A.-M.
(2002). Sugar Specificity of bacterial
CMP Kinases as Revealed by Crystal Structures and Mutagenesis
of Escherichia coli
enzymes. J. Mol. Biol., 315, 1099-1110.
4. Blaszczyk J., Li Y., Yan H. and Ji X. (2001). Crystal
structure of unligated guanylate
kinase from yeast reveals GMP-inducedconformational changes.
J. Mol. Biol. ; 307(1) :
247-57.
5. Blaszczyk J., Li Y., Yan H. and Ji X. (2003). Crystal
Structure of Unligated Guanylate
Kinase from Yeast Reveals GMP-induced Conformational Changes.
J. Mol. Biol. 307,
247-257.
6. Briozzo P., Evrin C., Meyer P., Assairi L., Joly N.,
Bârzu O. & Gilles A.-M. (2005).
Structure of Escherichia coli UMP Kinases Differs
from That Other Nucleoside
Monophosphate Kinases and Sheds New Light on Enzyme
Regulation. The JOURNAL of
Biol. Chem. Vol . 280, no. 27, 25533-25540.
7. Bucurenci N., Serina L., Zahara C., Landais S., Dauchin A.
and Bârzu O. (1998).
Mutational Analysis of UMP Kinase from E. coli. J.
Bacteriol. Vol. 180, no. 3. 473-477.
8. Bucurenci N., Sakamoto H., Briozzo P., Palibroda N., Serina
L., Sarfati R. S., Lebesse G.,
Briand G., Danchin A., Bârzu O. and Gilles A.-M. (2005).
CMP kinase from Escherichia
coli Is Structurally Related to Other Nucleoside
Monophosphate Kinases. The Journal of
Biological Chemistry. Vol. 27 No. 5,. 2856-2862.
9. Chenal-Francisque V., Tourneux L., Carniel E., Christova
P., Li de la Sierra I.., Bârzu O.
and. Gilles A.-M. (1999). The highly similar TMP kinases of
Yersinia pestis and
25
Escherichia coli differ markedly in their AZTMP
phosphorylating activity. Eur. J.
Biochem. 265, 112-119.
10. Floravanti 1. E., Haouz A., Ursby T., Munier-Lehmann H.,
Delarue M. and Bourgeois D.
(2003). Mycobacterium tuberculosis Thymidylate Kinase:
Structural Studies of
Intermediates along the Reaction Pathway. J. Mol. Biol. 327,
1077-1092.
11. Fukami-Kobayashi K., Nosaka M., Nakazawa A. & Go M.
(1996). Ancient divergence of
long and short isoforms of adenylate kinase" molecular
evolution of the nucleoside
monophosphate kinase family. FEBS Letters 385, 214-220.
12. Germanaud D. dossier sur Les trithérapies
antirétrovirales, sur le site :
http://www.snv.jussieu.fr/vie/dossiers/tritherapie/index.htm
13. Haouz A., Vanheusden V., Munier-Lehmann H., Froeyen M.,
Herdewijn P., Calenbergh
S. V., and Delarue M. (2003). Enzy matic and Structural
Analysis of Inhibitors Designed
against Mycobacterium tuberculosis Thymidylate
Kinase. The journal of biological
chemistry. Vol. 278, No. 7, pp. 4963-4971.
14. Hosein SR (2001). Analogues nucléosidiques et la
fonte de graisses. TraitementSida : 114.
Numéro de volume : 12, Nombre de numéro : 10.
15. Hible G., Renault L., Schaeffer F. , Christova P., Zoe
Radulescu A., Evrin C.
Gilles A. M. & Cherfils J. (2005). Calorimetric and
Crystallographic Analysis of the
Oligomeric Structure of Escherichia coli GMP Kinase. J. Mol.
Biol. 352, 1044-1059.
16. Johansson M., Norda A. & Karlsson A. (2000). Conserved
gene structure and
transcription factor sites in the human and mouse
deoxycytidine kinase genes. FEBS
Letters 487, 209-212.
17. Lavie A., Ostermann N., Brundierts R., Goody R.S.,
Reinstein J., Konradt M., and
Schlichting I. (1999). Structure of E. coli
thymidylate kinase. Project Number : PX -98-
99.
18. Liou J. Y., Dutschman G.E., Lam W., Jiang Z. & Cheng
Y.C. (2002). Characterization of
Human UMP/CMP Kinase and its phosphorylation of D- and L- form
Deoxycytidine
Analogue Monophosphates. Cancer Res 62, 1624-1631.
19. Matte A., Tari W.L. & Delbaere L.T.J. ( 1998). How do
kinases transfer phosphoryl
groups? Current biology ldt, Minireview, 6, 413-419.
20. Munier-Lehmann H. , Chenal-Francisque V. , Ionescu M. ,
Christova P., Foulon J. ,
Carniel E. and Bârzu O. (2003). Relationship between
bacterial virulence and nucleotide
metabolism: a mutation in the adenylate kinase gene renders
Yersinia pestis avirulent.
Biochem. J. , 373 ; 515-522.
26
21. Pruvost J.-L. (2002). Investigation of Thymidine kinase 2
(TK2) mutations and
truncations. Thèse de Magistère de
Biotechnologies - Université Paris sud - ENS Cachan.
18 p.
22. Rapport d'activité de l'unité Chimie
structurale des Macromolécules pour l'année 1999.
CNRS, URA 2185 .
23. Ren H., Wang L., Bennett M., Liang Y., Zheng X., Lu F., Li
L., Nan J., Luo M.,
Eriksson S., Zhang C. and Su X. D. (2005). The crystal
structure of human adenylate
kinase 6: An adenylate kinase localized to the cell nucleus.
PNAS, vol. 102 ; No. 2 ; 303-
308.
24. Roy V. (2004). Synthèse et caractérisation
de nouvelles structures mono et
dinucléosidiques à visée
thérapeutiques. Thèse pour obtenir le titre de doctorat de
l'université de limoges . Mention Chimie
Appliquée-chimie des substances naturelles, 246
p.
25. Sandrini M.P.B. and Piskur J. (2005). Deoxyribonucleoside
kinases : two enzyme families
catalyse the same reaction . trend in Biochemical Science vol.
30 No. 5 , 225-228.
26. Segura-Pena D., Sekulic N., Ort S., Konrad M., & Lavie
A. (2004). Substrate-Induced
Conformational Changes in Human UMP/CMP Kinases. J. Boil.
Chem.., vol. 279, issue
32, 33882-33889.
27. Tourneux L., Bucurenci N., Lascu I., Sakamoto H., Briand
G., and Gilles A.M. (1998).
Substitution of an Alanine Residue for Glycine 146 in TMP
Kinase from Escherichia coli
Is Responsible for Bacterial Hypersensitivity to
Bromodeoxyuridine. Journal of
Bacteriology, Vol. 180, No. 16, 4291-4293.
28. Van Rompay A.R., johansson M. & Karlson A. (2000).
Phosphorylation of nucleosides
and nucleotides analogs by mammalian nucleoside monophosphate
kinases. Pharmacol
Ther, (2-3): 189-98.
29. Van Rompay A.R., johansson M. & Karlson A. (1999).
Identification of a novel human
adenylate kinase cDNA cloning, expression analysis, chromosome
localization and
characterization of recombinant protein. Eur. J. Biocchem.
261, 509-517.
30. Yu L., Mack J., Hajduk P.J., Kakavas S. J., Saiki a. Y.
C., Lerner C.G. And Olejniczak E.
T. (2003). Solution structure and function of an essential CMP
kinase of Streptococcus
pneumoniae. Protein science, 12 : 2613-2621.
27
| 
