Memoire Online - Activité antifalcémiante et screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique de BEAT-SS

Notre travail a porté sur BEAT-SS®, un médicament traditionnel breveté par le Centre de Phytothérapie Moderne NIECA, utilisé dans le traitement de la drépanocytose et préparé à partir d'écorces de tronc et de branches d'un grand arbre de la famille des Bombacacées présent dans nos forêts tropicales.

Des études récentes avaient déjà démontré que cette recette était capable de reverser la falciformation des globules rouges à une concentration optimale de 200 ìg/mL^1(*). Notre contribution fut de déterminer les groupes phytochimiques présents dans la fraction éthéro-méthanolique qui a montré un certain effet antifalcémiant après un fractionnement bio-guidé.

Le fractionnement bio-guidé fut réalisé sur 25 g de poudre lyophilisée de BEAT-SS® et le résultat sur le résidu sec de la solution éthéro-méthanolique a représenté 14,16% du matériel végétal utilisé.

L'évaluation in vitro de l'activité antifalcémiante fut effectuée par le test d'Emmel sur quatre principales fractions, parmi lesquelles la fraction insoluble dans le méthanol et la fraction éthéro-méthanolique. Cette dernière a donné un taux de réhabilitation des globules rouges de 42,96% à la concentration optimale de 200 ìg/mL.

Le screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique a mis en évidence la présence de polyphénols, de coumarines, de tanins catéchiques, de stérols et triterpènes.

Our work has focused on BEAT-SS®, a congolese traditional medicine patented by the Centre NIECA, used in the management of sickle cell disease and prepared from the bark of the trunk and branches of a big tree of the rainforests belonging to the family of Bombacaceae.

Previous investigations had shown that this recipe was able to reverse the sickling of red blood cells at an optimal concentration of 200 ìg/mL. Our contribution was to determine the phytochemical groups of the ether-methanolic fraction which demonstrated some antisickling effect after bio-guided fractionation.

Bio-guided fractionation was performed on 25 g of lyophilized powder of BEAT-SS® and the result on the dry residue of the ether-methanolic solution represented 14.16% of the plant material used.

The evaluation of the in vitro antisickling activity was performed by the Emmel's test on four main fractions, of which the fraction insoluble in methanol and ether-methanolic fraction. The latter gave a rate of 42.96% on rehabilitation of red cells at the optimal concentration of 200 ìg/mL¹.

The phytochemical screening of the ether-methanolic fraction revealed the presence of polyphenols, coumarins, catechin tannins, sterols and triterpenes.

DEDICACES

REMERCIEMENTS

Avant de présenter le contenu de ce travail, il nous tient à coeur de témoigner notre profonde gratitude à toutes les personnes qui ont permis que nous puissions parvenir au terme de notre formation que ce soit par leurs enseignements, leur soutien ou leurs conseils :

Au Professeur Docteur José LAMI NZUNZU le promoteur de ce travail pour nous avoir accepté au sein du Laboratoire de Recherche Bio-Organique de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques de l'Université de Kinshasa et pour avoir dirigé ce travail de main de maître ;

Au Chef de travaux Marie NSIMBA MIEZI, pour la bienveillance et la disponibilité dont elle a fait preuve pour nous encadrer et partager avec nous son savoir ;

A Monsieur NYEMBWE KADIATA et son Centre de Phytothérapie Moderne NIECA, pour avoir bien voulu nous fournir le matériel végétal pour réaliser cette étude ;

Au Centre de Médecine Mixte d'Anémie SS Mabanga, pour avoir bien voulu nous fournir les échantillons de sang qui ont constitué notre matériel biologique ;

A tout le Corps Professoral de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques de l'Université de Kinshasa ainsi que tous nos Maîtres de stage, pour l'ensemble des connaissances scientifiques théoriques et pratiques reçues durant notre formation académique ;

A nos parents Rodolphe et Claire WOUNGLY, pour tous les sacrifices consentis pour notre réussite et épanouissement ; à nos soeurs et frère Christèle, Yolande et Jacques WOUNGLY ; ainsi qu'à tous nos amis et camarades.

AVANT-PROPOS

La pharmacie est une science dont la place se trouve au centre d'autres disciplines telle la biologie, la botanique, la chimie et la médecine. Elle s'intéresse à la conception, le mode d'action, la préparation et la dispensation des médicaments. Le médicament quant à lui est défini comme toute substance ou composition pouvant être utilisé chez l'homme ou chez l'animal ou pouvant leur être administré, en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier leur fonctions physiologiques en exerçant une activité pharmacologique, immunologique ou métabolique^2(*).

D'une part, d'une ou de plusieurs substances appelées principe(s) actif(s) en quantité donnée (dose) et ayant un effet pharmacologique démontré et un intérêt thérapeutique également démontré cliniquement. Toutefois toute substance pharmacologiquement active ne constitue pas nécessairement la base d'un médicament et encore moins d'une thérapie médicamenteuse ; D'autre part, on a les excipients, des substances auxiliaires inertes servant à la formulation de la forme galénique la mieux adaptée à la voie d'administration ou encore à la modulation de la vitesse de libération du principe actif vers l'organisme.

Les principes actifs utilisés en thérapeutique ont diverses origines. Certains proviennent de la synthèse chimique totale ou partielle ou encore du génie génétique. D'autres, puisés dans la nature, sont d'origine animale, minérale, végétale ou microbiologique, souvent après découverte empirique de leurs vertus chez l'homme ou l'animal^3(*). Les plantes ont toujours été une grande source de médicaments pour l'homme depuis les temps les plus reculés et, de nos jours, c'est l'un des piliers de la médecine traditionnelle africaine, où elle est devenue quasiment incontournable avec près de 80% de la population y ayant recours pour les besoins en soins de santé primaires^4(*). L'une de ses composantes majeures est la phytothérapie qui se fonde sur l'usage des extraits de plantes et des principes actifs naturels en thérapeutique et s'appuient sur des connaissances et traditions anciennes.

La tendance actuelle poursuivie par la phytothérapie est de fournir des phytomédicaments, c'est-à-dire des extraits actifs de plantes standardisés dont les protocoles de fabrication et de contrôle sont connus et conformes aux normes fixées par l'OMS et dont la circulation dans un pays requiert l'autorisation de mise sur le marché (AMM)^5(*). Malheureusement, dans le contexte de la République Démocratique du Congo, ces critères ne sont pas toujours respectés et on se contente de médicaments traditionnels améliorés dont les extraits peuvent contenir d'autres substances accompagnant le principe actif ; des substances pouvant posséder des effets pharmacologiques qui dans certains cas peuvent bien potentialiser l'effet recherché mais dans d'autres peuvent considérablement le diminuer, présenter des effets indésirables gênants, ou être source de toxicité chronique en cas d'usage à long terme.

C'est pourquoi, dans le but de présenter des médicaments avec une meilleure efficacité, une meilleure sécurité et un meilleur confort pour ses consommateurs, l'effort consenti est de séparer, d'isoler, de purifier, de déterminer la structure et de quantifier l'effet biologique du ou des principes actifs responsables de l'activité pharmacologique et de l'effet thérapeutique recherché dans la plante médicinale utilisée, afin que ces composés chimiques une fois connus servent de base soit à une formulation galénique adéquate, soit à une pharmacomodulation visant à augmenter ses effets ou diminuer sa toxicité, soit de modèles pour la synthèse chimique à l'échelle industrielle.

Tel est de manière globale le cadre dans lequel s'inscrit notre travail qui n'est en fait qu'une modeste contribution, visant au final la conception et le développement de nouveaux médicaments alternatifs efficaces, issus des recherches en pharmacognosie et phytochimie, et pouvant être utilisés dans le traitement symptomatique de la drépanocytose, une maladie qui affecte des millions de personnes à travers le monde, particulièrement en Afrique où le trait drépanocytaire est de 15 à 25% et les thérapies conventionnelles assez onéreuses pour la majorité des patients^6(*).

TABLE DES MATIERES

LISTE DES TABLEAUX, FIGURES ET PHOTOS

Tableau 1 : Répartition normale de l'hémoglobine chez différents types de sujet

Tableau 3 : Identification des échantillons de sang pour les essais biologiques

Tableau 10 : Screening chimique de la fraction éthéro-méthanolique de BEAT-SS®

Figure 2 : Falciformation des GR, perte d'élasticité et occlusion des vaisseaux

LISTE DES ABREVIATIONS, ACRONYMES, SYMBOLES ET UNITES

INTRODUCTION

0.1. Problématique

La drépanocytose demeure encore à l'heure actuelle l'une des maladies génétiques les plus fréquentes à travers le globe. Elle se caractérise par la présence de globules rouges (GR) contenant l'hémoglobine S (Hb S), une forme anormale de la molécule d'hémoglobine servant au transport de l'oxygène dans l'organisme des poumons vers les tissus. Les personnes qui héritent d'un gène drépanocytaire de leurs deux parents sont des «homozygotes» (dits SS) et développent la maladie, alors que celles qui n'héritent d'un tel gène que d'un seul parent sont porteuses du trait drépanocytaire (dits AS) et sont asymptomatiques, mais peuvent transmettre la maladie à leurs enfants.

On estime à 50 millions le nombre d'individus atteints de la drépanocytose^7(*) et selon l'OMS, 300 000 enfants naissent dans le monde chaque année avec une anomalie majeure de l'hémoglobine dont la plus fréquente est celle de l'anémie SS.⁶ Le continent africain demeure la région la plus meurtrie. En effet, on y enregistre, dans 40 pays au moins, des taux de prévalence du gène de l'Hb muté entre 2 % et 30 %, expliquant le niveau élevé de la mortalité et de la morbidité dues à la drépanocytose enregistré essentiellement chez les enfants de moins de cinq ans, les adolescents et les femmes enceintes^8(*). Selon les estimations, environ 50 % à 80 % des 400 000 enfants qui naissent chaque année en Afrique avec la drépanocytose meurent avant l'âge de cinq ans et ceux qui survivent présentent une atteinte des organes cibles, qui réduit considérablement leur espérance de vie⁸.

Ces taux élevés tiennent du fait que dans ces pays, on ne propose pratiquement pas de conseils génétiques aux futurs parents, les unions entre partenaires porteurs du trait drépanocytaire donnent lieu à la naissance d'enfants drépanocytaires et dans la plupart des pays, les politiques et plans nationaux de santé sont inadaptés, et les infrastructures, les outils de diagnostic, les services de traitement et les personnels formés sont rares⁸. A cela s'ajoute le fait que la prise en charge hospitalière de la maladie reste assez onéreuse. En République démocratique du Congo par exemple, 12 % des enfants hospitalisés dans les pavillons de pédiatrie sont drépanocytaires et on estime que le coût annuel du traitement est supérieur à 1 000 USD par patient^9(*), un coût difficilement supportable pour la majorité de la population dont le revenu moyen est inférieur à 2 USD par jour et qui pour les besoins de soins de santé primaire se tourne majoritairement vers la médecine traditionnelle.

C'est ainsi que dans la ville de Kinshasa qui compte à elle seule environ 80 000 drépanocytaires^10(*), plus précisément sur la Rue Kisangani N°8 dans la commune de Ngaba, le Centre Moderne de Phytothérapie NIECA, une ASBL agréée par l'Etat Congolais et créée en 1984 par le phytothérapeute NYEMBWE KADIATA, s'est spécialisée dans la prise en charge des patients souffrant de drépanocytose grâce à une préparation médicamenteuse à base de plantes brevetée et nommée BEAT-SS®. Cette recette à base de plantes, qui est utilisée par le centre depuis plus de 25 ans, a montré des résultats plus que satisfaisant dans le traitement `'symptomatique'' des crises chez les patients. C'est ainsi que plusieurs investigations ont été menées sur BEAT-SS® par le Laboratoire de Recherche Bio-organique de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques de l'Université de Kinshasa, dirigé par le Professeur Docteur José LAMI NZUNZU.

A ce jour, nous savons que cette recette a des propriétés de reverser la falciformation des globules rouges et d'empêcher leur agrégation¹. Nous savons également qu'elle comporte les groupes phytochimiques suivants : saponines (qui ont un effet perturbateur sur la réversion de la falciformation), alcaloïdes, polyphénols, quinones, tanins catéchiques, anthocyanes et terpénoïdes^11(*),12(*). Toutefois jusqu'à présent on ignore précisément le ou lesquels de ces groupes phytochimiques sont responsables des principales activités mises à profit dans le traitement symptomatique de la drépanocytose.

0.2. Hypothèses

Le fractionnement bio-guidé de BEAT-SS® se justifie par l'hypothèse selon laquelle il possède des groupes phytochimiques qui agissent soit individuellement, soit en synergie, conférant ainsi à la recette la propriété de reverser la falciformation des globules rouges chez les drépanocytaires, groupes phytochimiques qui nécessitent d'être identifiés. Ce travail nous permettra de mettre en évidence la ou les fractions qui possèdent cette activité et d'en déterminer la composition.

0.3. Objectifs

0.3.1. Objectif général

Le présent travail est une contribution à la lutte contre la drépanocytose et s'inscrit dans le processus de développement de médicament à partir de plantes car il vise à isoler des composés à activité antifalcémiante pouvant ultérieurement être identifier structurellement et servir de point de départ pour une pharmacomodulation, une formulation galénique ou de modèles ou précurseurs pour une synthèse chimique à l'échelle industrielle.

0.3.2. Objectifs spécifiques

o évaluer l'activité antifalcémiante de la fraction éthéro-méthanolique issue du fractionnement

o identifier les groupes phytochimiques de cette fraction éthéro-méthanolique

0.4. Plan du travail

En dehors de l'introduction et de la conclusion, le présent travail s'articule sur les parties suivantes :

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE 1 : GENERALITES SUR LA DREPANOCYTOSE

1.1. Définition

La drépanocytose (encore appelée anémie SS ou anémie falciforme ou hémoglobinose S) est une maladie héréditaire du sang, caractérisée par une mutation de l'hémoglobine (Hb) se traduisant par une grave anémie chronique souvent accompagnée de fièvres, douleurs et infections^13(*).

1.2. Etiologie et pathogénie

La drépanocytose résulte d'une mutation du gène porté par le chromosome 11 et codant pour de la synthèse de la chaine â de l'Hb. L'allèle muté S est un allèle co-dominant qui peut s'exprimer : soit à l'état homozygote SS et donner la forme grave de la maladie provoquant une anémie souvent mortelle, avec remplacement total de l'Hb A par de l'Hb S dans les hématies ; soit à l'état hétérozygote AS et donner une forme cliniquement inapparente dans laquelle le remplacement de l'Hb A par de l'Hb S est seulement partiel¹⁴.^14(*)

Les personnes qui héritent d'un gène drépanocytaire de leurs deux parents sont des «homozygotes» (dits SS) et développent la maladie, alors que celles qui n'héritent d'un tel gène que d'un seul parent sont porteuses du trait drépanocytaire (dits AS) et sont asymptomatiques, mais peuvent transmettre la maladie à leurs enfants¹⁴.

La mutation du gène du chromosome 11 est responsable d'un défaut de synthèse de l'Hb avec modification structurale et substitution de l'acide glutamique par la valine en position 6 dans la chaine â protéique. Cette substitution entraine une perte de solubilité de la molécule d'Hb qui précipitera et se polymérisera facilement en milieu pauvre en oxygène. Les molécules d'Hb sont normalement dispersées dans les GR chez le drépanocytaire mais lorsque la pression partielle en oxygène diminue, les molécules se prennent en masse, forment des filaments (polymérisation) et déforment le globule rouge en faucille (d'où le terme d'anémie falciforme). La falciformation du GR s'accompagne d'une perte d'élasticité de la membrane qui entraine une obstruction des vaisseaux de faibles calibres (occlusion vasculaire et ischémie). L'occlusion des petits vaisseaux se fait ressentir par des crises douloureuses, des gonflements des mains et des pieds et des douleurs articulaires. Contrairement aux 120 jours normaux de durée de vie du GR, les GR falciformes sont précocement détruits dans la rate à un rythme accéléré et leur durée de vie est d'environ 20 jours. Ainsi, dans le cas de la drépanocytose, il s'ensuit une hémolyse très sévère qui n'est pas compensée par la production de GR provoquant ainsi une anémie chronique¹⁴.

1.3. Symptomatologie

Les signes qui accompagnent la drépanocytose apparaissent entre le 4^e et 6^e mois après la naissance. Normalement, à la naissance le taux d'hémoglobine foetale (Hb F), qui a une grande affinité pour l'O₂, est largement élevé pour couvrir les besoins. L'Hb F est progressivement remplacée par l'Hb A (adulte) chez une personne normale. Mais chez les drépanocytaires, elle est progressivement remplacée par l'Hb S jusqu'à l'âge de 6 mois où les premiers symptômes commencent à apparaître (fièvres, infections à répétition, pâleur de la peau).

Ø Crises vaso-occlusives : les GR falciformes bloquent la circulation au niveau des artères et des vaisseaux ce qui empêche la distribution optimale de l'oxygène dans l'organisme. Ce processus peut se produire dans différentes parties du corps (os, abdomen, rein, cerveau, rétine...). Ces crises peuvent être très douloureuses.

Ø Anémie hémolytique : les GR des drépanocytaires, étant anormaux, sont éliminés de manière plus précoce par l'organisme au niveau de la rate.

Ø Infections : elles sont plus fréquentes chez les drépanocytaires, surtout à pneumocoques ou méningocoques liées à la destruction de la rate par infarctus tissulaires répétés ; on parle d'asplénie fonctionnelle. Elles peuvent aussi aggraver l'anémie en cas d'infection par le parvovirus B19.

Ø Des déficits nutritionnels (en folates, car cette vitamine est indispensable à la création des hématies qui sont renouvelées très rapidement lors des crises d'anémie, épuisant ainsi le stock de folates),

Ø Des troubles cardio-pulmonaires (augmentation de la taille du coeur, insuffisance respiratoire, tachycardie),

Ø Des anomalies rétiniennes (hémorragies dues à l'endommagement des petits vaisseaux au niveau de la rétine), etc.

1.4. Diagnostic biologique

Ø Electrophorèse des Hb sur acétate de cellulose en milieu alcalin, pH 8,6 (technique la plus utilisée) ou sur agarose en milieu acide, pH 6,2 :

L'électrophorèse permet la mise en évidence de la présence d'une fraction d'hémoglobine de migration différente de celles des hémoglobines normales. Elle permet également de différencier les formes homozygotes des formes hétérozygotes, ainsi que la présence éventuelle d'une autre anomalie de l'hémoglobine associée (autre mutation ou thalassémie). Le diagnostic de drépanocytose est confirmé par la présence majoritaire d'hémoglobine S. Chez le sujet hétérozygote le taux de Hb S est inférieur à 30%. L'hémoglobine normale adulte est composée d'Hb A en grande majorité avec un taux d'Hb A2 inférieur à 3,5%. Le sujet drépanocytaire ne possède pas d'Hb A, mais il existe un taux variable d'Hb F.

Remarque : Chez certains malades, lorsque deux mutations sont associées on parle de double hétérozygote (Exemple : S C).

Tableau 1 : Répartition normale de l'hémoglobine chez différents types de sujet

L'examen se fait par une observation des GR provenant d'un échantillon de sang, à l'aide d'un microscope. On observe alors à l'état frais, entre lame et lamelle, les GR qui prennent progressivement la forme typique en "faucille". Ce test est positif chez les homozygotes et hétérozygotes. L'examen du frottis sanguin d'un drépanocytaire peut être négatif, il est alors possible de déclencher au laboratoire la falciformation, soit en rajoutant un réducteur comme le métabisulfite au sang du malade, soit en créant artificiellement d'une autre manière une atmosphère pauvre en oxygène.

L'examen se fait dans un tube à essai transparent. L'hémoglobine S, réduite par action d'hydrosulfite de sodium, précipite dans une solution de phosphate 2,24 mol/L. La solution d'Hb précipité devient opaque tandis que le témoin reste transparent. Ce test n'est toutefois pas spécifique car d'autres hémoglobines, plus rares, peuvent également précipiter. Ce test ne distingue pas non plus les homozygotes des hétérozygotes.

Actuellement, il est recommandé d'effectuer des dépistages chez les couples afin de les informer que l'enfant conçu par deux porteurs sains présente un risque de probabilité d'une chance sur quatre d'être atteint d'anémie falciforme.

1.5. Prévention et traitement

Hormis la greffe de la moelle osseuse, à l'heure actuelle la drépanocytose n'est pas médicalement curable. Les hématies étant produites à partir de cellules souches dans la moelle osseuse, en détruisant celle du malade et en la remplaçant par celle d'un donneur, il y a possibilité d'obtenir une guérison totale. Environ 200 greffes ont été réalisées dans le monde chez des drépanocytaires, permettant d'obtenir la guérison dans 85 % des cas^15(*), il requiert cependant un donneur apparenté le plus possible (un frère, une soeur, etc.).

- le traitement des crises vaso-occlusives : antalgiques (pouvant aller jusqu'aux opiacés) et mise sous oxygène ;

- la prévention des facteurs déclenchant les crises (froid, altitude, infections, déshydratation) ;

- le traitement préventif des infections à pneumocoque et méningocoque (vaccination) ;

- L'Hydroxyurée (HYDREA®) et la Décitabine (DACOGEN®) qui stimulent la synthèse d'Hb F et limitent le risque d'anoxie. Cependant, tous les patients ne répondent pas à ces drogues et des cas de myelosuppression ont été reportés comme effets indésirables^16(*), ^17(*). De plus, vu qu'il s'agit d'un traitement à long terme, l'obstacle à leur utilisation reste le coût qui demeure exorbitant dans les pays en voie de développement.

- DREPANOSTAT® qui, selon son concepteur Dr D'ALMEIDA AYIGAN Oscar, a comme principe actif l'acide hydroxyméthylbenzoïque et agirait en augmentant le taux de Hb F. Il est commercialisé au Togo et obtenu à partir d'extrait de Fagara xanthoxyloïdes^18(*)

- NICOSAN® (HEMOXIN® aux Etats Unis d'Amérique, Nicosan ou Nix-0699), il s'agit d'une teinture obtenue à partir de graines de Piper guineense, d'écorces de Pterocarpus osum, de fruits d'Eugenia caryophyllum et de feuilles de Sorghum bicolor. Cette recette possède également des effets antifalcémiants^19(*) ; initialement lancée au Nigéria par le National Institute for Pharmaceutical Research and Development (NIPRD), elle est actuellement en Phase 3 des essais cliniques^20(*). Son criblage phytochimique a révélé la présence de flavonoïdes, alcaloïdes, saponines, tanins, glycosides et des traces d'anthraquinones^21(*).

- VK-500® mis au point par Dr MEDEGAN FAGLA Jérôme à partir de plusieurs plantes dont Fagara xanthoxyloïdes et exploité au Bénin depuis 1999^22(*)

- Au Laboratoire des substances naturelles et chimie médicinale du département de Chimie de l'Université de Kinshasa, Professeur Docteur MPIANA TSHIMANKINDA Pius et son équipe de recherche ont confirmé l'activité antifalcémiante des anthocyanes de plusieurs plantes congolaises dont Annona senegalensis, Alchornea cordifolia, Ocimum basilicum L., Bombax pentadrum, Ficus capensis, Jatropha curcas L., Justicia secunda Vahl, etc.^23(*)

Des recherches sur le sang, les greffes de cellules souches de moelle osseuse, la thérapie génique et de nouveaux médicaments pour l'anémie falciforme sont en cours ; les chercheurs espèrent trouver de meilleurs traitements pour la maladie.

La thérapie génique est étudiée comme un possible traitement de l'anémie falciforme. Les chercheurs aimeraient savoir s'il est possible qu'un gène normal soit introduit dans les cellules souches de la moelle osseuse d'un drépanocytaire afin que ce dernier puisse induire le corps du malade à fabriquer des globules rouges normaux. Les chercheurs étudient également une possibilité de « désactiver » le gène de l'Hb S ou « d'activer » un gène qui puisse induire les globules à se comporter normalement¹².

- les agonistes des récepteurs d'adénosine A2a, ces médicaments peuvent réduire les complications liées à la douleur chez les personnes qui ont la drépanocytose

- 5-hydroxyméthyl-2-furfural ou 5-HMF, un aldéhyde aromatique naturel ayant une forte affinité pour Hb S et qui inhibe la falciformation par augmentation allostérique du taux d'oxygène dans le GR^24(*)

- Le MX-1520, une pro drogue de la vanilline, forme également une liaison covalente avec Hb S et augmente la saturation en oxygène du GR, ce qui permet de prévenir ou reverser la falciformation^25(*)

- La thérapie à base de supplément de L-Glutamine semble aussi avoir un effet favorable dans la prévention des crises. L'acide aminé naturel serait un précurseur essentiel dans la synthèse du potentiel redox NAD, protégeant ainsi le globule rouge du stress oxydatif^26(*)

1.6. Distribution géographique

La drépanocytose affecte des millions de personnes à travers le globe, cependant elle est plus répandue en Afrique noire. Selon l'OMS, dans le monde entier 300 000 enfants naissent chaque année avec une anomalie majeure de l'hémoglobine dont la plus fréquente est celle de l'anémie falciforme⁶. L'allèle S, responsable de l'anomalie, est surtout répandu dans le continent africain (atteignant dans certaines populations la fréquence de 30 %) ; on le trouve également en Inde, en Arabie Saoudite et dans d'autres régions du bord de la Méditerranée, en Italie (surtout en Sicile) et en Grèce. Les migrations ont accru la fréquence de cette maladie sur le continent américain.

Cette distribution se superpose assez bien avec celle de la malaria. Ceci s'explique par le fait que les GR des porteurs AS possèdent une certaine résistance vis-à-vis du paludisme et on note chez eux de très rares épisodes de malaria, alors que cette dernière tue beaucoup les enfants de moins de 5 ans qui ne sont pas porteurs AS. Il s'ensuit à la longue, une lente sélection naturelle qui voit le nombre de porteurs AS augmenté, multipliant les chances d'avoir des naissances homozygotes SS, d'où au final on observe le taux de drépanocytose augmenter avec celui de la malaria.

CHAPITRE 2 : GENERALITES SUR LE DEVELOPPEMENT DES MEDICAMENTS A PARTIR DE PLANTES

Le monde végétal a depuis très longtemps constitué l'une des principales sources de médicaments utilisés en thérapeutique pour soigner les maladies de l'homme. Les plantes médicinales sont des drogues végétales dont au moins une partie possède des propriétés médicamenteuses. Elles peuvent être utilisées à leur état naturel ou servir de modèles ou précurseurs pour la synthèse chimique partielle ou totale.

De nombreuses plantes, connues depuis des lustres, demeurent encore irremplaçables de nos jours à cause des principes actifs qu'elles renferment. On peut citer parmi tant d'autres³:

Comme nous pouvons le remarquer, ces nombreuses plantes sont pour la plupart des plantes européennes ou asiatiques et si elles sont universellement connues c'est parce que des recherches scientifiques ont permis de les valoriser. L'Afrique également dispose d'une flore immense où de nombreux principes actifs attendent d'être découverts ou révélés au grand public.

Dans les coins les plus reculés, la médecine traditionnelle soigne de manière empirique de nombreuses maladies grâce aux plantes. Depuis quelques années, ces dernières sont sujettes à de nombreuses publications scientifiques dans le cadre du processus de découverte et de développement des médicaments à partir de plantes. De façon générale, ce processus implique successivement les étapes suivantes^27(*):

- Quantification et comparaison des effets biologiques à des composés de référence connus

2.1. Enquête ethno-pharmacologique

Elle vise d'une part à identifier la plante étudiée à l'aide d'un herbier (ordre, famille, genre, espèce), et d'autre part à connaître la partie de la plante utilisée traditionnellement en thérapeutique et la forme sous laquelle elle est administrée (décocté, infusion, etc.) afin d'orienter la recherche de l'activité pharmacologique.

2.2. Screening biologique et analyse biologique de l'extrait brut

Ici le matériel végétal est partagé entre l'eau et un solvant organique polaire comme l'éthanol ou le méthanol et les extraits bruts obtenus sont examinés biologiquement. Les tests biologiques ont pour but de mettre en évidence les activités pressenties dans la plante.

La solution la plus active est extraite avec différents solvants organiques en vue de réaliser la séparation de différents métabolites secondaires de l'extrait brut et les différents extraits obtenus sont analysés biologiquement.

2.3. Screening phytochimique de l'extrait brut

L'extrait le plus actif obtenu précédemment est soumis à un screening phytochimique pour identifier les groupes de composés présents et prévoir le mode d'extraction à utiliser ultérieurement.

- Recherche des flavonoïdes (acide chlorhydrique et copeau de Mg puis extraction par l'alcool isoamylique : réaction de Shinoda)

- Recherche des hétérosides cardiotoniques (réactif de Keller-Killiani et réaction de Kedde)

- Recherche des stérols (réactif de Libermann - H₂SO₄, anhydride acétique)

2.4. Isolement et purification des composés de l'extrait actif

Cette étape nécessite la combinaison de plusieurs techniques chromatographiques : chromatographie sur colonne, chromatographie sur papier, chromatographie sur couche mince CCM, chromatographie liquide haute performance HPLC, chromatographie liquide en phase gazeuse GLC, ainsi que la cristallisation.

2.5. Analyse biologique et identification des composés isolés

Ici on procède à nouveaux à des tests biologiques in vitro ou in vivo, puis on procède à l'identification des composés isolés :

2.6. Quantification et comparaison des effets biologiques à des composés de référence

Les expériences peuvent se faire in vitro ou in vivo. Les tests pharmacologiques spécifiques in vivo consistent à provoquer une maladie chez l'animal et à observer l'effet d'un échantillon (produit) sur cette maladie. L'activité quantifiée est comparée à un produit connu et/ou à un produit de référence, ceci pour voir si le produit testé possède l'activité recherchée d'une part et s'il peut par exemple remplacer un produit connu utilisé pour la pathologie expérimentée d'autre part.

2.7. Etudes pharmacologique et toxicologique des produits actifs

Cette étape vise à tenter d'établir les mécanismes d'action des produits actifs sur base notamment de la structure élucidée et est complétée d'une étude toxicologique pour évaluer l'innocuité du médicament.

2.8. Développement galénique

Le médicament est mis sous sa forme galénique définitive avant de procéder aux essais cliniques. Cette forme pharmaceutique définitive est conçue en tenant compte des propriétés physico-chimiques du principe actif, du type de patient auquel le produit sera destiné, son acceptabilité, la stabilité et la biodisponibilité du principe actif.

2.9. Essais cliniques

Il s'agit des différents essais effectués sur l'être humain sain et malade dans le but de déterminer les conditions d'utilisation du médicament (indications, posologie, précautions d'emploi etc.). Ils se déroulent en 4 phases :

Son objectif est de déterminer le profil de tolérance et l'innocuité du médicament, la posologie qui entraîne les premiers effets thérapeutiques et celle qui entraîne les premiers effets indésirables. Elle s'opère sur des sujets volontaires en bonne santé (20 à 80 personnes) et c'est au cours de cette phase qu'on débute les études initiales de pharmacocinétique humaine. Sa durée maximale est de 1 an.

Les études sont réalisées chez des patients volontaires (100 à 200) avec une maladie ciblée. L'objectif poursuivi est de définir les conditions de l'efficacité (suppression des symptômes caractéristiques de la maladie) et à définir les modalités thérapeutiques (dose efficace et effets secondaires observés). Sa durée s'étend de plusieurs mois à 4 ans.

L'objectif poursuivi au cours de cette phase est la recherche d'une différence entre l'évolution de deux groupes (groupe expérimental et groupe témoin) avec modification statistique significative du paramètre d'appréciation. Le groupe expérimental reçoit le produit étudié tandis que le groupe témoin reçoit soit un placebo, soit un produit de référence (médicament reconnu actif dans l'indication). Le nombre de patients concerné par cette étape est de 200 à 1 000 et la durée s'étend sur plusieurs années.

Le but de cette phase est de déceler des effets indésirables rares qui ne peuvent pas être repérés dans les études des phases précédentes. La phase comporte des études d'efficacité et de tolérance dans les conditions usuelles de prescription après la mise du médicament sur le marché.

2.10. Autorisation de mise sur le marché

L'AMM est en quelques mots une homologation que doit obtenir un médicament pour pouvoir être commercialisé. Le médicament « candidat » à l'obtention d'une AMM est examiné par l'Autorité ayant la Santé Publique dans ses attributions à partir d'un dossier de demande d'autorisation de mise sur le marché qui comprend 4 parties :

Défini le médicament par ses conditions de fabrication et de contrôle sur les matières premières et le produit fini

· Dossier pharmacologique (pharmacocinétique, biodisponibilité, marge thérapeutique)

CHAPITRE 3 : APERCU ETHNO-MEDICAL ET DONNEES ANTERIEURES SUR BEAT-SS®

3.1. Présentation de BEAT-SS®

BEAT-SS® est un médicament traditionnel disposant d'un brevet et utilisé dans le traitement de la drépanocytose. Il est préparé et administré à des patients drépanocytaires depuis de nombreuses années par le Centre de Phytothérapie Moderne NIECA, dont le siège est situé dans la commune de Ngaba sur la Rue Kingasani N°8.

BEAT-SS® est présenté sous forme de solution buvable. Il est préparé à partir d'écorces de tronc et de branches d'un grand arbre des régions tropicales de la famille des Bombacacées.

Selon le centre NIECA, une amélioration significative des symptômes cliniques a été observée chez les patients suivant un traitement à base de ce médicament, particulièrement en ce qui concerne la fatigue, les douleurs aigües, le gonflement des mains et des pieds, la pâleur de la peau et cela sans recours à des transfusions sanguines pendant de longues périodes¹.

3.2. Données phytochimiques

Des travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence les groupes phytochimiques présents dans BEAT-SS® : dont les polyphénols, les saponines, les quinones, les tanins catéchiques, les anthocyanes et les terpénoïdes¹² (voir Tableau 2) toutefois, il est à noter que ces études antérieures ont démontré que les saponines ont un effet néfaste sur la réhabilitation des globules rouges falciformes.¹¹

De plus, il a également été montré in vitro que la fraction éthéro-méthanolique (qui constitue d'ailleurs le point focal de ce travail) et la fraction butanolique de BEAT-SS® améliorent la solubilité de l'Hb S dans les conditions d'hypoxie^28(*).

Groupes phytochimiques	Réactifs	Résultats
Groupes phytochimiques	Réactifs	Extrait aqueux	Extrait CHCl3
Saponines	Test de mousse	++
Alcaloïdes	Dragendorff	+++
Polyphénols	Barton	+++
Flavonoïdes	Shinoda	-
Quinones	Bornträger	+++
Tanins catéchiques	Stiasny	+++
Tanins galliques	FeCl₃ 2%	-
Composés réducteurs	Fehling	-
Hétérosides cardiotoniques	Kedde	-
Composés aminés	Ninhydrine	-	-
Anthocyanes	HCl 20%	+++	-
Coumarines	NH₄OH 10%		-
Stéroïdes et terpénoïdes	Lieberman		+

3.3. Données pharmacologiques et toxicologiques

Des études in vitro réalisées sur BEAT-SS® ont démontré les faits suivants :

Pour des concentrations allant de 20 à 500 ug/mL, l'extrait aqueux est dépourvu d'effet hémolytique même après 24 h d'incubation (la lyse des globules rouges survient et ne devient significative qu'à partir de 2500 ug/mL) ;

A la concentration optimale de 200 ug/mL, l'extrait aqueux restaure la morphologie normale des globules rouges falciformes placés dans des conditions d'hypoxie. C'est cette importante propriété qui justifie son usage dans le traitement symptomatique de la drépanocytose ;

L'extrait aqueux de BEAT-SS® s'oppose à l'adhésion des globules rouges entre eux, ce qui permettrait d'améliorer la viscosité du sang des malades drépanocytaires et contribuerait également à prévenir les occlusions au niveau des vaisseaux de faible calibre ;

- Prolongation du temps de coagulation et diminution de l'activité de la thrombine^29(*) :

Il s'agit d'une autre propriété que possède l'extrait aqueux. Observée aussi bien chez les drépanocytaires que chez les sujets sains, elle pourrait être exploitée dans la recherche de nouvelles thérapies concernant les maladies cardiovasculaires ;

- Absence de toxicité jusqu'à 7 g de produit par Kg de poids corporel²⁸ :

Ce résultat fut obtenu à l'Institut National de Recherches Biomédicales (INRB) de Kinshasa après que la toxicité de BEAT-SS® ait été évalué par étude in vivo sur 15 souris males et 15 souris femelles de poids différents, en présence de 3 souris males et 3 souris femelles comme témoins.

PARTIE EXPERIMENTALE

CHAPITRE 4 : MATERIELS ET METHODES

Excepté l'étape de lyophilisation, toutes les opérations dans le cadre de ce travail ont été effectuées au Laboratoire de Recherche Bio-Organique de la Faculté des Sciences Pharmaceutiques à l'Université de Kinshasa.

4.1. Matériels

4.1.1. Matériel végétal

La poudre de BEAT-SS®, issue du broyage des écorces séchées de troncs et de branches d'arbres, a constitué notre matériel végétal. Il nous a été fourni par le Centre de Phytothérapie moderne NIECA en date du 15 mars 2013.

4.1.2. Matériel biologique

Les échantillons de sang de patients drépanocytaires (SS) utilisés dans ce travail ont été collectés au Centre de Médecine Mixte d'Anémie SS Mabanga situé à Yolo dans la ville de Kinshasa, avec l'approbation du Comité Congolais d'Ethique. Les patients choisis furent ceux n'ayant pas reçu de transfusion sanguine durant les 2 mois précédents leurs dons de sang.

Le sang fut introduit dans des tubes à essai contenant l'EDTA 10% comme anticoagulant (acide éthylène diamine tétra acétique 10% : 0,05 mL pour 3 mL de sang). Les échantillons furent placés dans une glacière lors du transport jusqu'au laboratoire puis conservé au réfrigérateur à 4°C avant les essais biologiques. Ces échantillons de sang se présentent comme indiqué au Tableau 3.

Tableau 3 : Identification des échantillons de sang pour les essais biologiques

- verrerie usuelle d'un laboratoire de chimie (ballon à fond rond, bécher, pied gradué, erlenmeyer, entonnoir conique, entonnoir Büchner, ouate, papier filtre Laborimpex, papier indicateur de pH Macherey Nagel, etc.)

- Réactif de Dragendorff (Sous nitrate basique de Bi0,85 g ; KI 8 g ; CH₃COOH glacial 10 mL ; eau distillée 70 mL)

- Réactif Fehling B (Tartrate de Na et K 20 g ; NaOH 15 g ; eau distillée qsf 100 mL)

4.2. Méthodes

4.2.1. Fractionnement de BEAT-SS®

En se référant à la recette telle que décrite par les phytothérapeutes (bouillir 50 g de poudre d'écorce dans 1 L d'eau distillée pendant 5 minutes), deux décoctions de la poudre de BEAT-SS® furent préparées séparément puis mélangées pour obtenir un décocté de 365 g de poudre dans 7,5 L d'eau distillée. Celui-ci fut filtré à chaud sur de l'ouate et le marc fut lavé 4 fois avec 100 mL d'eau chaude. Au final, nous avons obtenu 7,3 L de décocté qui furent lyophilisés à l'INRB. Le lyophilisat pesait 29,4354 g.

25 g de lyophilisat ont été pesés et dissouts dans 420 mL de méthanol sous sonication. La solution fut filtrée sous vide à l'aide d'un entonnoir Büchner. La partie du lyophilisat insoluble dans le méthanol fut récupérée, séchée à l'étuve à 40°C puis pesée pour donner 13,9260 g.

A la solution méthanolique obtenue, nous avons ajouté 1680 mL d'éther di éthylique. Il y a eu formation d'un précipité floconneux que nous avons isolé par filtration sur Büchner. Nous avons obtenu au final d'une part la solution éthéro-méthanolique (eaux mères) qui fut concentrée à l'évaporateur rotatif à 40°C et d'autre part le précipité de saponines brutes. Les 2 fractions obtenues furent séchées à l'étuve à 40°C et pesées. Leurs poids étant de 7,5325 g pour le précipité sec de saponines et de 3,5412 g pour le résidu sec de la solution éthéro-méthanolique.

Poudre lyophilisée de départ = 25 g
Résidu sec des différentes fractions	Quantité obtenue (en g) X	Facteur de proportionnalité x/25	Pourcentage %
Solution éthéro-méthanolique	3,5412	0,1416	14,16
Saponines brutes	7,5325	0,3013	30,13
Insoluble dans le méthanol	13,9260	0,5570	55,70
Total			100,00%

4.2.2. Evaluation de l'activité antifalcémiante

La falciformation des GR est induite par l'état d'hypoxie créé par l'addition de métabisulfite de sodium (Na₂S₂O₅ 2% préparée extemporanément) sur les échantillons de sang de patients drépanocytaires selon le test d'Emmel. La méthode pour l'évaluation de l'activité antifalcémiante des différents extraits sur un échantillon de sang peut être brièvement décrite comme suit :

Un volume déterminé de l'échantillon de sang d'un patient drépanocytaire a été mélangé avec un volume équivalent de métabisulfite de sodium (2%). Le mélange a été incubé pendant 1 h à température ambiante pour compléter la falciformation. Les observations au microscope ont confirmé que la falciformation des GR commencent à se produire au moins 30 min après l'addition de métabisulfite de sodium, ainsi la durée de 1 h d'incubation était suffisante pour une falciformation complète pour la majorité des GR¹.

Après 1 h d'incubation du sang avec du métabisulfite de sodium, un volume équivalent de chaque extrait à différentes concentrations a été ajouté à celui du mélange précédent (Sang de patient SS + Métabisulfite de sodium) et incubé de nouveau pendant 30 ou 120 min de plus à température ambiante. Un échantillon a été prélevé pour l'examen microscopique. Les GR ont été comptés afin de déterminer le nombre de GR falciformes (déformés et allongés) et de GR normaux (arrondis). Le nombre de GR totaux a été déduit par la somme des GR falciformes et GR normaux. Le pourcentage de GR normaux a été obtenu par calcul et il représente le rapport des GR normaux sur le total des GR comptés¹.

Les concentrations utilisées étaient de 100, 200 et 400 ìg/mL par rapport à la poudre initiale de BEAT-SS®, ce qui a déterminé l'introduction d'un facteur de proportionnalité pour la préparation des différents extraits afin que cette concentration soit la même pour toutes.

Deux témoins ont été utilisés pour le contrôle de l'échantillon de sang du patient SS : un Témoin positif dans lequel le sang est en hypoxie (Sang SS + Na₂S₂O₅ 2%) et un Témoin négatif dans lequel le sang est en milieu oxygéné (Sang SS + NaCl 0,9%).

a) Préparation des échantillons témoins

A 50 ìL de l'échantillon de sang, on a ajouté 50 ìL de Na₂S₂O₅ 2% puis on a laissé reposer 1 h avant de prélever 5 ìL pour l'observation au microscope électronique.

A 50 ìL de l'échantillon de sang, on a ajouté 50 ìL de NaCl 0,9% puis on a laissé reposer 1 h avant de prélever 5 ìL pour l'observation au microscope électronique.

b) Préparation des solutions mères et des dilutions

Les solutions mères de chaque extrait des fractions isolées ont été préparées à une concentration équivalente à 1 mg/mL de poudre lyophilisée de BEAT-SS®. Pour avoir cette concentration pour chaque fraction il nous a fallu tenir compte des facteurs de proportionnalité figurant dans le Tableau 4 qui rendent compte de la proportion de chaque fraction par rapport à la poudre lyophilisée de BEAT-SS® de départ.

Ainsi pour préparer un volume de 5 mL pour chacune des fractions, chaque quantité m à peser fut dissoute sous sonication dans quelques mL de solution physiologique (NaCl 0,9%) contenue dans un micro tube et la solution fut portée au volume à 5 mL avec du NaCl 0,9%. Le Tableau 5 présente de manière explicite le mode de préparation.

Fractions	Facteur de proportionnalité	Concentration (en mg/mL)	Quantités pesées (en mg)	Volume final de la solution	Concentration finale équivalente à la poudre de départ
Poudre lyophilisée de BEAT-SS®	1	1	5	5 mL	1 mg/mL
Résidu sec de la solution éthéro-méthanolique	0,1416	0,1416	0,7080
Résidu sec des saponines brutes	0,3013	0,3013	1,5065
Résidu de la partie insoluble dans MeOH	0,5570	0,5570	2,7850

De manière concrète, pour préparer la solution mère de la fraction éthéro-méthanolique de concentration 1 mg/mL équivalente à la poudre lyophilisée de BEAT-SS® : nous avons pesé 0,7080 mg du résidu sec de la solution éthéro-méthanolique que nous avons dissout sous sonication dans environ 3 mL de NaCl 0,9% contenu dans un micro tube et la solution fut portée au volume à 5 mL avec du NaCl 0,9%. Nous avons procédé ainsi pour chaque fraction, seule la nature des solutés et leur quantité ont différé. Au total, 4 fractions ont été préparées et évaluées. Il s'agit de :

Pour chacune des fractions, les concentrations utilisées pour l'évaluation de l'activité antifalcémiante étaient de 100, 200 et 400 ìg de la poudre initiale de BEAT-SS® par mL de sang. Pour avoir exactement ces concentrations dans les extraits à évaluer nous avons procédé selon le schéma suivant :

800 uL de solution de NaCl 0,9% ont été mélangés avec 200 uL de la solution mère de l'extrait, ensuite 50 uL du mélange obtenu précédemment ont été mélangé avec 50 uL de sang traité par la solution de Na₂S₂O₅ 2%.

600 uL de solution de NaCl 0,9% ont été mélangés avec 400 uL de la solution mère de l'extrait, ensuite 50 uL du mélange obtenu précédemment ont été mélangé avec 50 uL de sang traité par la solution de Na₂S₂O₅ 2%.

200 uL de solution de NaCl 0,9% ont été mélangés avec 800 uL de la solution mère de l'extrait, ensuite 50 uL du mélange obtenu précédemment ont été mélangé avec 50 uL de sang traité par la solution de Na₂S₂O₅ 2%.

Au final, nous avons eu 3 concentrations de travail et 4 fractions à évaluer pour 3 échantillons de sang, soit un total de 36 solutions d'extraits à observer au microscope.

c) Observation au microscope et comptage des globules rouges

Une fois leur préparation terminée, les solutions d'extraits à évaluer ont été numérotées puis laissées au repos pendant 60 min. Ensuite, 5 ìL de chaque solution d'extrait ont été observés au microscope et pour chaque fraction, 2 champs d'observation au microscope ont été photographiés afin de permettre le comptage des GR.

Comme décrit dans les paragraphes précédents, les GR ont été comptés afin de déterminer le nombre de GR falciformes (déformés et allongés) et de GR normaux (arrondis). Le nombre de GR total a été déduit par la somme des GR falciformes et GR normaux. Le pourcentage de GR normaux représente le rapport des GR normaux sur le total des GR comptés multiplié par 100.

4.2.3. Screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique de BEAT-SS®

Les principaux groupes phytochimiques présents dans la fraction éthéro-méthanolique (E) ont été recherchés par les méthodes standards^{3, 30(*), 31(*), 32(*), 33(*), 34(*)};

Des solutions aqueuse et éthanolique, à partir desquelles les aliquotes ont été prélevées pour servir lors des tests, ont été préparées comme suit :

20 mg de résidu de poudre de la fraction (E) ont été dissouts dans 20 mL d'eau distillée, puis la solution obtenue fut filtrée.

20 mg de résidu de poudre de la fraction (E) ont été dissouts dans 20 mL d'éthanol, puis la solution obtenue fut filtrée.

a) Détection des alcaloïdes (Bouchardat et Dragendorff)

La mise en évidence des alcaloïdes est basée sur leur capacité à former des précipités ou des complexes insolubles avec des métaux lourds et/ou des métalloïdes (Bi, Hg, I₂, etc.) contenus dans les « réactifs généraux des alcaloïdes » (Mayer, Bouchardat, Dragendorff, etc.)³².

Traitez 2 mL de solution éthanolique par HCl dilué, répartissez la solution dans 2 tubes à essai numérotés et enfin ajoutez respectivement 2 gouttes de réactif de Bouchardat dans le tube n°1 et 2 gouttes de réactif de Dragendorff dans le tube n°2. L'apparition d'un précipité jaunâtre dans le tube n°1 et d'un précipité orange dans le tube n°2 indique un test positif.

b) Détection des sucres réducteurs (Fehling)

La réaction de Fehling sert couramment à caractériser des aldéhydes par leur oxydation avec des ions cuivre (II) Cu²⁺. En biochimie, elle permet de mettre en évidence la présence d'aldoses et de sucres réducteurs.

La solution de Fehling (A et B) contient des ions Cu²⁺ complexés par les ions tartrate en milieu basique (les ions tartrate permettent de maintenir en solution les ions Cu²⁺ à un pH auquel ils seraient précipités sous forme d'hydroxyde Cu(OH)₂ s'ils n'étaient complexés). Au cours de la réaction, s'effectuant en milieu basique, l'ion cuivre (II) Cu²⁺oxyde l'aldéhyde pour donner un ion carboxylate, et un précipité rouge brique d'oxyde de cuivre(l) CU₂O selon l'équation d'oxydoréduction³² :

Dans un tube à essai, à 1 mL de solution aqueuse ajoutez quelques gouttes de HCl 0,1M, ensuite neutralisez avec quelques gouttes de NaOH 0,1M, rajoutez 1 mL de solution de Fehling A et B (1 : 1) et chauffez le mélange 15 min au bain-marie à 70°C. L'apparition d'un précipité rouge indique un test positif.

c) Détection des glycosides cardiotoniques (Keller Killiani)

Les 2-désoxy-hexoses des cardénolides peuvent être mis en évidence par le test de Keller Killiani. Les oses sont dissouts dans l'acide acétique contenant des traces de chlorure ferrique puis est superposé de l'acide sulfurique concentré. Il y a formation d'un anneau brun à l'interface puis diffusion de la couleur dans l'acide acétique qui devient bleu^{3, 32}.

Dans un tube à essai, à 1 mL de solution aqueuse ajoutez 1 mL d'acide acétique glacial et 1 mL de H₂SO₄ concentré, puis au mélange rajoutez 2 à 3 gouttes de FeCl₃ 2%. L'apparition d'une coloration bleu vert indique un test positif.

d) Détection des saponines (Test de mousse)

Les saponines sont des hétérosides dont la génine stéroïdique ou triterpénique (lipophile) est reliée à des résidus sucrés (polaires), cette structure particulière leur confère des propriétés amphiphiles (tensioactives) qui en font de véritables savons. Leur mise en évidence dans une drogue végétale est basée sur leur pouvoir aphrogène c'est-à-dire, la possibilité qu'ont leurs solutions aqueuses de mousser par agitation³².

Dans un tube à essai, reprenez quelques mg de résidu sec de la fraction (E) dans 5 mL d'eau distillée. Bouchez l'ouverture du tube à essai et agitez-le vigoureusement dans le sens de la longueur pendant 15 s. La formation d'une mousse stable de hauteur supérieure à 1 cm, persistant pendant plus de 15 min indique la présence de saponines.

e) Détection des polyphénols (FeCl3 2%)

Les polyphénols naturels regroupent un vaste ensemble de substances chimiques comprenant au moins un noyau aromatique, portant un ou plusieurs groupes hydroxyles, en plus d'autres constituants (phénols simples, acides-phénols, coumarines, naphtoquinones, flavonoïdes, anthocyanes, tanins, etc.). Ils ont la capacité de former des chélates colorés avec des sels de métaux lourds. Leur présence au sein d'une drogue végétale est mise en évidence par l'apparition d'une coloration ou la formation d'un précipité noirâtre intense, après ajout de chlorure de fer (III) à l'extrait de cette drogue.^{3, 32, 34}

Dans un tube à essai, à 1 mL de solution éthanolique ajoutez quelques gouttes de FeCl₃ 2%. L'apparition d'une coloration noirâtre indique la présence de polyphénols.

f) Détection des tanins (Bate-Smith, Stiasny et FeCl3 2%)

- les tanins hydrolysables ou galliques, ce sont des esters d'acides gallique et ellagique

- les tanins condensés ou catéchiques ou proanthocyanidoliques, ce sont des oligomères ou polymères de flavanols

Les tanins, étant des polyphénols, réagissent avec le chlorure ferrique pour donner une coloration bleu-noir avec les tanins galliques ou vert-noir avec les tanins catéchiques. Cependant, seuls les tanins catéchiques donnent avec le réactif de Stiasny un précipité beige³. On peut donc se servir de ces deux réactifs (Stiasny et FeCl₃) pour mettre en évidence les différents types de tanins présents dans une drogue végétale.

Par ailleurs toujours pour l'identification des tanins catéchiques, on peut se servir de la réaction spécifique de Bate-Smith dans laquelle les tanins condensés, traités à chaud par un acide, se dégradent en anthocyanidols pigments colorés en rouge.^{3, 32}

Dans un tube à essai, à 2 mL de solution aqueuse ajoutez quelques gouttes de réactif de Stiasny et chauffez au bain-marie à ébullition pendant 15 min. L'apparition d'un précipité beige indique la présence de tanins catéchiques. Filtrez ensuite la solution qui a servi à la recherche des tanins catéchiques ci-haut et au filtrat rajoutez quelques gouttes de FeCl₃ 2%. L'apparition d'une coloration bleu-noir indique la présence de tanins galliques.

Dans un tube à essai, à 1 mL de solution aqueuse ajoutez quelques gouttes de réactif au butanol chlorhydrique et portez au bain-marie à 90°C pendant 15 min. La formation d'une coloration rouge indique la présence de tanins catéchiques.

g) Détection des anthocyanes (HCl conc et NH4OH 25%)

Les anthocyanes sont des pigments dérivés de l'ion flavinium. Ils sont mis en évidence par leur coloration qui varie sensiblement en fonction du pH^{3, 32, 34} :

Dans un tube à essai, à 1 mL de solution aqueuse présentant une coloration plus ou moins foncée, ajoutez 1 mL de HCl concentré puis 1 mL de NH₄OH 25%. Si la coloration s'accentue par acidification puis vire au bleu violacé en milieu basique, on peut conclure à la présence d'anthocyanes.

h) Détection des flavonoïdes (Shinoda)

La réaction de Shinoda (ou réaction de la cyanidine) est basée sur l'obtention de couleurs caractéristiques du noyau flavonoïdique après sa réduction par l'hydrogène naissant issu d'un métal plongé dans la solution en milieu acide. Les couleurs caractéristiques sont³ :

Dans un tube à essai, à 1 mL de solution éthanolique, 5 mL d'éthanol chlorhydrique (2 : 1, v/v) sont additionnés 2 à 3 copeaux de Mg et quelques gouttes d'alcool isoamylique. L'apparition d'une coloration intense rose-orange ou violacée indique un test positif.

i) Détection des stéroïdes et triterpènes (Liebermann Burchard)

En milieu anhydride acétique, les noyaux stérols réagissent avec l'acide sulfurique concentré provoquant ainsi des changements de coloration dus à l'augmentation de la conjugaison des doubles liaisons au sein des cycles adjacents³².

Dans un tube à essai, dissolvez quelques mg de résidu de poudre de la fraction (E) dans CHCl₃ puis rajoutez au filtrat 1 mL d'anhydride acétique, ensuite laissez couler le long des parois du tube 0,5 mL de H₂SO₄ concentré. La formation d'un anneau brun à la zone de contact des deux liquides avec une couche surnageante verte ou violette indique la présence de stéroïdes et de triterpènes.

j) Détection des aminoacides (Test à la ninhydrine)

La ninhydrine est un composé aromatique utilisé comme révélateur. Elle possède la particularité de former à chaud avec les acides aminés un produit coloré en violet³².

Sur un papier filtre, déposez une goutte de la solution aqueuse. Au même endroit déposez une goutte de réactif à la ninhydrine et chauffez le papier filtre à l'étuve à 90°C pendant 5 min. Procédez à un essai à blanc sur le même papier filtre. L'apparition d'une teinte bleue ou violette nettement différente de celle de l'essai à blanc indique un test positif.

k) Détection des coumarines (Fluorescence à la lampe UV)

La mise en évidence des coumarines est basée sur leur observation sous la lumière ultraviolette après l'ouverture du cycle lactone et solubilisation en milieu alcalin^{3, 32}.

Répartissez dans 2 tubes à essai chacun 2 mL de la solution éthanolique obtenue à partir du résidu. Dans un des tubes à essai, ajoutez 0,5 mL de NaOH 10%, puis chauffez les 2 tubes à essai au bain-marie jusqu'à ébullition. Après refroidissement, observez les tubes à la lampe UV à 365 nm. L'absence de fluorescence jaune dans les 2 tubes indique un test négatif.

l) Détection des anthraquinones (Bornträger)

La caractérisation des principes actifs anthracéniques dans une drogue végétale est basée sur la coloration rouge intense que fournissent les 1,8-dihydroxy anthraquinones lorsqu'elles sont placées en milieu fortement alcalin^{3, 32}.

Dans un tube à essai, dissolvez quelques mg de résidu de poudre de la fraction (E) dans 10 mL de HCl dilué au 1/5, chauffez au bain-marie bouillant pendant 20 min, puis extrayez avec 20 mL de CHCl₃ après refroidissement. À la phase organique, ajoutez 0,5 mL de NH₄OH 25%. L'apparition d'une teinte allant du rouge au violet indique un test positif.

CHAPITRE 5 : RESULTATS ET DISCUSSION

5.1. Résultats

5.1.1. Fractionnement de BEAT-SS®

Partant de 25 g de poudre lyophilisée de notre matériel végétal, le fractionnement a abouti à 3 résidus secs dont les proportions figurent dans le Tableau 4 déjà illustré plus haut.

Poudre lyophilisée de départ = 25 g (L)
Résidu sec des différentes fractions	Quantité obtenue (en g) X	Facteur de proportionnalité x/25	Pourcentage %
Solution éthéro-méthanolique (E)	3,5412	0,1416	14,16
Saponines Brutes (S)	7,5325	0,3013	30,13
Insoluble dans le méthanol (I)	13,9260	0,5570	55,70
Total			100,00%

5.1.2. Evaluation de l'activité antifalcémiante

Après observation au microscope et comptage des GR, les résultats obtenus pour les 3 échantillons de sang sont présentés dans les Tableaux 6, 7 et 8. Un récapitulatif de ces 3 Tableaux, présentant les différentes moyennes obtenues par les extraits à différentes concentrations pour les 3 échantillons, est consigné dans le Tableau 9.

Echantillon N°1
#	Conc (ìg/mL)	GR falciformes			GR normaux			% de GR normaux
#	Conc (ìg/mL)	1^er champ	2^e champ	Moyenne	1^er champ	2^e champ	Moyenne	% de GR normaux
L	100	-	-	-	-	-	-	-
	200	18	-	18	23	-	23	56,09
	400	7	29	18	59	9	34	65,38
E	100	-	-	-	-	-	-	-
	200	25	27	26	30	41	35	57,38
	400	50	-	50	4	-	4	07,41
S	100	-	-	-	-	-	-	-
	200	40	61	50	28	15	21	29,58
	400	49	-	49	7	-	7	12,50
I	100	26	17	21	43	33	38	64,41
	200	23	3	13	66	32	49	79,03
	400	20	-	20	171	-	171	89,53
Témoin Positif		60	-	60	5	-	5	07,69
Témoin Négatif		5	10	7	88	67	77	91,67

Echantillon N°2
#	Conc (ìg/mL)	GR falciformes			GR normaux			% de GR normaux
#	Conc (ìg/mL)	1^er champ	2^e champ	Moyenne	1^er champ	2^e champ	Moyenne	% de GR normaux
L	100	18	4	11	38	40	39	78,00
	200	9	11	10	37	43	40	80,00
	400	18	-	18	13	-	13	41,93
E	100	54	53	53	13	27	20	27,40
	200	26	17	21	10	10	10	32,26
	400	20	26	23	3	6	4	14,81
S	100	47	42	44	5	4	4	08,33
	200	27	36	31	3	9	6	16,22
	400	13	-	13	3	-	3	15,00
I	100	5	10	7	22	13	17	70,83
	200	3	-	3	13	-	13	81,25
	400	11	7	9	11	9	10	52,63
Témoin Positif		96	-	96	4	-	4	04,00
Témoin Négatif		5	-	5	42	-	42	89,36

Echantillon N°3
#	Conc (ìg/mL)	GR falciformes			GR normaux			% de GR normaux
#	Conc (ìg/mL)	1^er champ	2^e champ	Moyenne	1^er champ	2^e champ	Moyenne	% de GR normaux
L	100	10	-	10	15	-	15	60,00
	200	8	-	8	22	-	22	73,33
	400	20	-	20	70	-	70	77,78
E	100	51	-	51	13	-	13	20,31
	200	22	-	22	14	-	14	38,89
	400	20	18	19	21	23	22	53,66
S	100	11	17	14	6	1	3	17,65
	200	20	12	16	7	4	5	23,81
	400	26	-	26	16	-	16	38,09
I	100	9	3	6	29	15	22	78,57
	200	4	-	4	12	-	12	75,00
	400	11	9	10	3	6	4	28,57
Témoin Positif		66	69	67	3	8	5	06,94
Témoin Négatif		6	3	4	43	60	51	92,73

#	Concentration (ìg/mL)	Echantillon 1 (%)	Echantillon 2 (%)	Echantillon 3 (%)	Moyennes (%)
L	100	-	78,00	60,00	69,00
	200	56,09	80,00	73,33	69,80
	400	65,38	41,93	77,78	61,70
E	100	-	27,40	20,31	23,85
	200	57,72	32,26	38,89	42,96
	400	07,41	14,81	53,66	25,29
S	100	-	08,33	17,65	12,99
	200	29,58	16,22	23,81	23,20
	400	12,50	15,00	38,09	21,86
I	100	64,41	70,83	78,57	71,27
	200	79,03	81,25	75,00	78,43
	400	89,53	52,63	28,57	56,91
Témoin Positif		7,69	04,00	06,94	06,21
Témoin Négatif		91,67	89,36	92,73	91,25

5.1.3. Screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique

Les résultats du screening phytochimique du résidu sec de la solution éthéro-méthanolique sont présentés dans le Tableau ci-dessous :

Tableau 10 : Screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique de BEAT-SS®

Groupes phytochimiques	Réactifs	Résultats
Alcaloïdes	Bouchardat et Dragendorff	-
Sucres réducteurs	Fehling	-
Glycosides cardiotoniques	Keller Killiani	-
Saponines	Test de mousse	-
Polyphénols	FeCl₃ 2%	+
Tanins catéchiques	Stiasny et Bate-Smith	+
Tanins galliques	Stiasny et FeCl₃ 2%	-
Anthocyanes	HCl conc et NH₄OH 25%	-
Flavonoïdes	Shinoda	-
Stéroïdes et triterpènes	Liebermann Burchard	+
Aminoacides	Test à la ninhydrine	-
Coumarines	Lampe UV	+
Anthraquinones	Bornträger	-

5.2. Discussion

Les objectifs spécifiques de ce travail étaient de fractionner BEAT-SS®, d'évaluer l'activité antifalcémiante de la fraction éthéro-méthanolique et d'identifier les groupes phytochimiques présents dans cette fraction.

5.2.1. Fractionnement de BEAT-SS®

Au niveau du Tableau 4, on note que sur les 25 g de poudre lyophilisée de départ (L) nous n'avons obtenu que 3,5412 g de résidu sec de la solution éthéro-méthanolique (E), soit 14,16% seulement de notre produit. Tandis que la fraction des saponines brutes (S) et la partie insoluble dans le méthanol (I) ont représenté respectivement 30,13% et 55,70%.

La fraction (E) (et ses constituants) représente donc quantitativement la plus faible proportion pouvant se trouver dans la poudre de BEAT-SS.

5.2.2. Evaluation de l'activité antifalcémiante

Les Tableaux 6, 7, 8 et 9 ont pu faire ressortir en pourcentage les résultats de l'évaluation de l'activité des 4 fractions évaluées pour les 3 échantillons de sang.

En comparant l'activité antifalcémiante des différentes fractions dont les valeurs moyennes sont consignées dans le Tableau 9, on constate que : d'une part, la concentration optimale offrant les meilleurs résultats pour toutes les fractions est de 200 ìg/mL ; d'autre part, la partie insoluble dans le méthanol (I) présente une meilleure activité que le lyophilisat (L), soit 78,43% de réhabilitation des GR après falciformation contre 69,80%, ceci dû probablement à l'absence des saponines dans l'extrait qui exercent un effet freinateur sur la réhabilitation des GR. Nous avons ainsi une confirmation des résultats des travaux antérieurs.^1,
11

Toutefois, la solution éthéro-méthanolique (E) a donné un taux de réhabilitation des GR de 42,96%, ce qui n'est pas moindre tandis que la fraction des saponines brutes (S) ne présente que 23,20% de réhabilitation des GR. Bien que (I) présente la meilleure activité, il est peu probable que les résultats du taux de réhabilitation des GR de (E) soient dus à des traces de (I) ayant diffusées dans les eaux mères ; quoique cette hypothèse ne peut être totalement écartée.

Une autre hypothèse envisageable serait que les fractions (E) et (I) possèderaient des principes actifs différents pouvant agir en synergie pour produire les effets antifalcémiants.

Toutes ces interrogations trouveraient un début de solution si on pouvait comparer les résultats du screening phytochimique de (E) et (I) et procéder à des CCM avec détermination des R_f, on pourrait ainsi confirmer ou infirmer chacune des hypothèses émises ci-haut.

5.2.3. Screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique

Le screening phytochimique de la fraction (E) nous a montré la présence des groupes suivants :

Une étude approfondie de cette fraction (E) par des méthodes chromatographiques peut être envisagée dans le but d'isoler chacun de ces groupes et de les tester individuellement. De même il serait intéressant de comparer les résultats du screening phytochimique des deux fractions (E) et (I) pour les raisons évoquées au point 5.2.2.

CONCLUSION

Les objectifs spécifiques de ce travail étaient de fractionner BEAT-SS®, d'évaluer l'activité antifalcémiante de la fraction éthéro-méthanolique (E) et d'identifier les groupes phytochimiques présents dans cette fraction.

Au terme de ce travail, nous avons obtenu une fraction (E) représentant 14,16% de la poudre lyophilisée de BEAT-SS® ; une faible proportion qui néanmoins a été évaluée et a fourni un taux de réhabilitation des GR non négligeable de 42,96%. S'agissant de la composition de cette fraction, le criblage phytochimique a révélé la présence de polyphénols, de tanins catéchiques, de coumarines, de stéroïdes et triterpènes. Par ailleurs, la fraction la plus active issue du fractionnement de BEAT-SS® fut la fraction de l'insoluble dans le méthanol (I) avec un taux de réhabilitation des GR de 78,43%.

En introduction nous avions dit que le fractionnement bio-guidé de BEAT-SS® se justifiait par l'hypothèse selon laquelle il possèderait des groupes phytochimiques qui agiraient soit individuellement, soit en synergie, conférant ainsi à la recette la propriété de reverser la falciformation des globules rouges chez les drépanocytaires. Pour expliquer l'activité antifalcémiante de la fraction (E), deux éventualités furent donc envisagées :

- la première attribue l'activité antifalcémiante de la fraction (E) à des traces de (I) ayant diffusé dans (E) lors de la dissolution du lyophilisat dans le méthanol ;

- la seconde attribue cette activité à un (ou plusieurs) groupe phytochimique de (E) différent de celui responsable de l'activité de (I) et BEAT-SS® agirait donc par synergie.

Résoudre ce questionnement nous renvoie donc à poursuivre nos investigations sur les deux fractions en question.

Face aux résultats obtenus au terme de ce travail, nous convenons que la recherche doit se poursuivre et des travaux ultérieurs doivent être effectués. Ainsi nous suggérons de :

- comparer les groupes phytochimiques présents dans la fraction la plus active de BEAT-SS à ceux présents dans sa fraction éthéro-méthanolique pour établir si oui ou non nous sommes en face d'une synergie ou pas, à cet effet une comparaison des résultats du screening chimique des deux fractions et des CCM devraient permettre d'y répondre ;

- isoler chacun des groupes phytochimiques de la fraction éthéro-méthanolique par des méthodes chromatographiques et procéder à une évaluation de l'activité antifalcémiante des groupes isolés.

Ceci pourra permettre plus tard qu'une détermination structurale de la molécule active puisse être effectuée ; que le mécanisme d'action de BEAT-SS® puisse être élucidé ; qu'une pharmacomodulation puisse être envisagée et enfin que nous puissions disposer de modèles ou précurseurs pour une synthèse chimique totale ou partielle à l'échelle industrielle.

BIBLIOGRAPHIE

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3) Ngombe K (2012). Eléments de pharmacopée traditionnelle et de pharmacognosie, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

4) OMS (2010). Partie du site consacrée aux médecines traditionnelles, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/fr/, (02 juin 2014)

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10) Radio Okapi (2014). Dr Ange Ngonde : « Kinshasa compte environ 80 000 drépanocytaires », http://radiookapi.net/emissions-2/linvite-du-jour/2014/01/24/dr-ange-ngonde-kinshasa-compte-environ-80-000-drepanocytaires/ (14 mars 2014)

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12) Ndokolo M (2003). Revalorisation scientifique des médicaments naturels congolais : investigation chimique préliminaire sur BEAT-SS, phytomédicament utilisé contre la drépanocytose ; Mémoire, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

13) Drépanocytose, dans : Encyclopédie Larousse Médical (2006), CD-Rom version électronique

14) Nsimba M (2012). Notions d'hématologie et d'immunologie, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

15) Site des hôpitaux de Lyon (2008). http://www.chu-lyon.fr/web/File/17466 (14 mars 2014)

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18) Présentation d'un médicament anti drépanocytaire - ReMeD, http://www.remed.org/Plan-Drepanostat81 .rtf (07 mai 2014)

19) Iyamu EW et al (2002). In vitro effects of NIPRISAN (Nix-0699) : a naturally occuring, potent antisickling agent. Br J Haematol. 118(1):337-43, http://www.nhlbi.nih.gov/m/pubmed/12100171/ (25 janvier 2014)

20) Nicosan - Wikipedia, the free encyclopedia ; http://en.wikipedia.org/wiki/Nicosan (07 mai 2014)

21) Niprisan Brevet US5800819 Piper guineense, Pterocarpus osum, Eugenia caryophyllum and Sorghum bicolor extracts for treating sickle cell disease ; http://www.google.com.tr/patents/US5800819 (07 mai 2014)

23) Mpiana P, Mudogo V, Tshibangu D et al (2007). Antisickling activity of some Congolese plants, in : Drug discovery from African flora, The 12th Symposium of the Natural Product Research Network for Eastern and Central Africa, July 22-26; University of Makerere, Kampala, Uganda, p.45 ( PS-6 ) ; http://www.researchgate.net/profile/Pius_Tshimankinda_MPIANA/publications/1 (07 mai 2014)

24) Abdulmalik O et al (2005). 5-hydroxyméthyl-2-furfural modifies intracellular sickle haemoglobin and inhibits sickling of red blood cells. Br J Haematol. ; 128(4):552-61, http://www.nhlbi.nih.gov/m/pubmed/15686467/ (25 janvier 2014)

25) Zhang C et al (2004). Anti-sickling effect of MX-1520, a prodrug of vanillin : an in vivo study using rodents. Br J Haematol. 125(6):788-95, http://www.nhlbi.nih.gov/m/pubmed/15180869/ (25 janvier 2014)

26) Niihara Y et al (1998). Oral L-glutamine therapy for sickle cell anemia : I. Subjective clinical improvement and favorable change in red cell NAD redox potential. AM J Hem. 58:117-121

27) Masiala T (2012). Méthode de recherche scientifique, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

28) Mulamba B (2004). Investigation préliminaire sur le mécanisme d'action de BEAT-SS, phytomédicament utilisé contre la drépanocytose, Mémoire, Faculté des Sciences pharmaceutiques, Université de Kinshasa

29) Nsimba M, Lami N, Hayakawa Y, Yamamoto C et Toshiyuki K (2013). Decreased thrombin activity by a congolese herbal medicine used in sickle cell anemia. Journal of ethnopharmacology 148 : 895-900

30) Prashant T, Bimlesh K, Mandeep K et al (2011). Phytochemical screening and Extraction: A Review. Inter. Pharm. Sciencia, 1: 6 -7, http://www.ipharmsciencia.com/Dacuments/1/11 .pdf (07 mai 2014)

31) Kone M, Ouattara K, Gnahoue G, Ouattara A, Coulibaly A. (2013). Study ethnopharmacological and phytochemical pf somes plants involved in the treatment of abdominal infections in the department of Kouto (Côte d'Ivoire). Scholars Journal of Applied Medical Sciences ; 1(2) : 56 - 61

32) Bruneton J (1993). Pharmacognosie, Phytochimie : Plantes médicinales ; 2e Ed : TEC et DOC (Paris) ; p: 914.

33) Tona L, Kambu K, Ngimbi N, Cimanga K et al (1998). Antiamoebic and phytochemical screening of some Congolese medicinal plants. J. Ethnopharm. 61: 57-65.

34) Kambu K (2012). Pharmacognosie II, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

ANNEXES

A la concentration de 200 ìg/mL respectivement de gauche à droite et de haut en bas : Fraction L ; Fraction S ; Fraction E ; Fraction I ; Témoin + et Témoin -

* ¹ Nsimba M, Lami N, Chika Y, Toshiyuki K et al (2012). In vitro reversal of deformity and inhibition of aggregation of sickle red blood cells by two Congolese herbal medicines. Journal of Medicinal Plants Research 6(31) : 4601-4608, DOI: 10.5897/JMPR11.376

* ³ Ngombe K (2012). Eléments de pharmacopée traditionnelle et de pharmacognosie, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

* ⁴ OMS (2010). Partie du site consacrée aux médecines traditionnelles, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/fr/, (02 juin 2014)

* ⁵ Phytothérapie - Wikipedia, the free encyclopedia, http://fr.wikipedia.org/wiki/Phytothérapie, (02 juin 2014)

* ⁶ OMS (2006). Rapport sur la Drépanocytose, http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/WHA59/A59_9-fr.pdf , (25 janvier 2014)

* ⁷ Arnal C et Girot R (2002). Drépanocytose chez l'adulte. Encycl Méd Chir (Éditions Scientifiques et Médicales Elsevier SAS, Paris), Hématologie, 13-006-D-16 :15

* ⁸ OMS (2010). Drépanocytose : une stratégie pour la région africaine de l'OMS. Rapport du Directeur régional 3

* ⁹ Tshilolo L et al (2009). Neonatal screening for sickle cell anaemia in the Democratic Republic of Congo: experience from a pioneer project on 31204 newborns. Journal of Clinical Pathology 62:35-38.

* ¹⁰ Radio Okapi (2014). Dr Ange Ngonde : « Kinshasa compte environ 80 000 drépanocytaires », http://radiookapi.net/emissions-2/linvite-du-jour/2014/01/24/dr-ange-ngonde-kinshasa-compte-environ-80-000-drepanocytaires/ (14 mars 2014)

* ¹¹ Lami M (2010). Evaluation de l'activité de la recette désaponifiée de BEAT-SS utilisée comme anti-drépanocytaire. Mémoire, Faculté des sciences pharmaceutiques, Université de Kinshasa

* ¹² Ndokolo M (2003). Revalorisation scientifique des médicaments naturels congolais : investigation chimique préliminaire sur BEAT-SS, phytomédicament utilisé contre la drépanocytose ; Mémoire, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

* ¹³ Drépanocytose, dans : Encyclopédie Larousse Médical (2006), CD-Rom version électronique

* ¹⁴ Nsimba M (2012). Notions d'hématologie et d'immunologie, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

* ¹⁵ Site des hôpitaux de Lyon (2008), http://www.chu-lyon.fr/web/File/17466 (14 mars 2014)

* ¹⁶ Platt OS, Orkin SH, Dover G, Beardsley GP, Miller B, Nathan DG (1984). Hydroxyurea enhances fetal hemoglobin production in sickle cell anémia, J Clin Invest ; 74:652-656, http://www.jci.org/articles/view/111464 (25 janvier 2014)

* ¹⁷ How is sickle cell anemia treated ? - National Heart, Lung, and Blood Institute NHLBI, National Institutes of Health NIH, http://www.nhlbi.nih.gov/health/health-topics/topics/sca/treatment (25 janvier 2014)

* ¹⁸ Présentation d'un médicament anti drépanocytaire - ReMeD, http://www.remed.org/Plan-Drepanostat81 .rtf (07 mai 2014)

* ¹⁹ Iyamu EW et al (2002). In vitro effects of NIPRISAN (Nix-0699) : a naturally occuring, potent antisickling agent. Br J Haematol. 118(1):337-43, http://www.nhlbi.nih.gov/m/pubmed/12100171/ (25 janvier 2014)

* ²⁰ Nicosan - Wikipedia, the free encyclopedia ; http://en.wikipedia.org/wiki/Nicosan (07 mai 2014)

* ²¹ Niprisan Brevet US5800819 Piper guineense, Pterocarpus osum, Eugenia caryophyllum and Sorghum bicolor extracts for treating sickle cell disease ; http://www.google.com.tr/patents/US5800819 (07 mai 2014)

* ²³ Mpiana P, Mudogo V, Tshibangu D et al (2007). Antisickling activity of some Congolese plants, in : Drug discovery from African flora, The 12th Symposium of the Natural Product Research Network for Eastern and Central Africa, July 22-26; University of Makerere, Kampala, Uganda, p.45 ( PS-6 ) ; http://www.researchgate.net/profile/Pius_Tshimankinda_MPIANA/publications/1 (07 mai 2014)

* ²⁴ Abdulmalik O et al (2005). 5-hydroxyméthyl-2-furfural modifies intracellular sickle haemoglobin and inhibits sickling of red blood cells. Br J Haematol. ; 128(4):552-61, http://www.nhlbi.nih.gov/m/pubmed/15686467/ (25 janvier 2014)

* ²⁵ Zhang C et al (2004). Anti-sickling effect of MX-1520, a prodrug of vanillin : an in vivo study using rodents. Br J Haematol. 125(6):788-95, http://www.nhlbi.nih.gov/m/pubmed/15180869/ (25 janvier 2014)

* ²⁶ Niihara Y et al (1998). Oral L-glutamine therapy for sickle cell anemia : I. Subjective clinical improvement and favorable change in red cell NAD redox potential. AM J Hem. 58:117-121

* ²⁷ Masiala T (2012). Méthode de recherche scientifique, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

* ²⁸ Mulamba B (2004). Investigation préliminaire sur le mécanisme d'action de BEAT-SS, phytomédicament utilisé contre la drépanocytose, Mémoire, Faculté des Sciences pharmaceutiques, Université de Kinshasa

* ²⁹ Nsimba M, Lami N, Hayakawa Y, Yamamoto C et Toshiyuki K (2013). Decreased thrombin activity by a congolese herbal medicine used in sickle cell anemia. Journal of ethnopharmacology 148 : 895-900

* ³⁰ Prashant T, Bimlesh K, Mandeep K et al (2011). Phytochemical screening and Extraction: A Review. Inter. Pharm. Sciencia, 1: 6 -7, http://www.ipharmsciencia.com/Dacuments/1/11 .pdf (07 mai 2014)

* ³¹ Kone M, Ouattara K, Gnahoue G, Ouattara A, Coulibaly A (2013). Study ethnopharmacological and phytochemical pf somes plants involved in the treatment of abdominal infections in the department of Kouto (Côte d'Ivoire). Scholars Journal of Applied Medical Sciences ; 1(2) : 56 - 61

* ³² Bruneton J (1993). Pharmacognosie, Phytochimie : Plantes médicinales ; 2^e Ed : TEC et DOC (Paris) ; p: 914.

* ³³ Tona L, Kambu K, Ngimbi N, Cimanga K et al (1998). Antiamoebic and phytochemical screening of some Congolese medicinal plants. J. Ethnopharm. 61: 57-65.

* ³⁴ Kambu K (2012).Pharmacognosie II, Note de cours, Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa

Activité antifalcémiante et screening phytochimique de la fraction éthéro-méthanolique de BEAT-SS

RESUME