Etude comparative de l'électrophorèse sur gel et l'électrophorèse sur l'automate capillarys

PARTIE THEORIQUE

Introduction 

L'électrophorèse des protéines sériques est une analyse de routine dans la pratique quotidienne d'un laboratoire de biochimie médicale. Les cliniciens requièrent cette analyse principalement pour le dépistage des pathologies qui modifient les profils électrophorétiques tels que les gammapathies monoclonales et les syndromes néphrotiques. Aujourd'hui, les laboratoires d'analyses médicales devraient idéalement disposer des techniques automatisées, aptes à détecter les dysprotéinémies, possédant une bonne résolution et une limite de détection des plus basses possible (détection des petits pics monoclonaux).(1)

Dans le laboratoire où j'ai effectué mon stage, on est passé de l'électrophorèse des proteines sériques sur gel d'acétate de la cellulose vers celle sur gel d'agarose puis vers l'électrophorèse capillaire.

Le but de cette étude est de comparer cette nouvelle technique d'électrophorèse capillaire à l'électrophorèse en gel d'agarose Hydrasys^® (Sebia).

I. Les protéines sériques

1 - Définition (2)

Les protéines représentent la plus grande partie des matières solides du plasma. En dehors du fibrinogène, protéine fibreuse, ce sont toutes des protéines globulaires. Seule la sérum-albumine est une holoprotéine, toutes les autres étant des hétéroprotéines pouvant contenir des lipides (lipoprotéines), des métaux (métalloprotéines) et surtout des glucides, la plupart des protéines plasmatiques sont en effet des glycoprotéines.

Leurs propriétés sont très variables : transporteurs, anticorps, enzymes, agents de pression oncotique, marqueurs de l'inflammation, marqueurs tumoraux, agents de la coagulation, facteurs de croissance, etc. Mais il faudra différencier les protéines toujours présentes dans le plasma, éléments constitutifs de celui-ci et celles, d'origine cellulaire, n'y apparaissant que transitoirement.

2- Les principales protéines sériques

2.1-Albumine (69 KDa) (2,3)

L'albumine sérique est une protéine d'origine exclusivement hépatique ; c'est la protéine plasmatique la plus importante quantitativement, représentant 50 à 60 % de l'ensemble des protéines du plasma. C'est une molécule relativement stable, contenant 564 aminoacides réparties sur une seule chaine peptidique.

Ses principaux rôles physiologiques : le pouvoir osmotique, une fonction de transporteur (calcium, acides gras, bilirubine, médicaments, ions métalliques, vitamines, certaines hormones, etc.), une fonction de réserve d'acides aminés.

v Intérêt de son dosage:

· dans un bilan de dénutrition.

· dans un bilan d'insuffisance hépatique

v Valeurs usuelles chez n adulte : 40 à 50 g/l.

v L'albumine augmente en cas de déshydratation.

v L'albumine diminue en cas de :

ü malnutrition

ü insuffisance hépatique.

ü inflammations et infections chroniques.

ü entéropathie.

ü syndrome néphrotique.

ü hémorragies, brulés.

ü grossesse.

2.2- Les Alpha 1 globulines

2.2.1- Orosomucoïde (40 KDa) (3,4) 

De synthèse hépatique, cette á₁ globuline est très riche en sucres et en acide sialique, ce qui lui a conféré aussi le nom de glycoprotéine acide á1.

v Valeur Usuelle chez un adulte : 0.6 à 1.2 g/l.

v L'orosomucoïde augmente dans le sang lors d'Inflammation aiguë en particulier lors du rhumatisme articulaire aigues de l'enfant.

v L'orosomucoïde diminue lors d'insuffisance hépatique et du syndrome néphrotique.

2.2.2- Alpha 1 antitrypsine : (5,6)

L'á1-antitrypsine qui constitue la fraction la plus importante des á₁ globulines est une glycoprotéine (10% de glucide) constituée d'une chaîne polypeptidique composée de 3 chaînes d'oligosaccharides. Elle est synthétisée dans les hépatocytes. L'á1-antitrypsine est l'inhibiteur de protéase le plus important dans le sang. Elle inactive de façon spécifique les sérine-protéases (comme par ex. la trypsine, la chymotrypsine, la collagénase, l'élastase leucocytaire, la plasmine et la thrombine), avec lesquelles elle forme de façon réversible un complexe enzyme-inhibiteur.

v L'á1-antitrypsine augmente en cas d'inflammation (infections, maladies rhumatismales, par ex.), de nécroses tissulaires, de tumeurs malignes et de traumatisme.

v L'á1-antitrypsine diminue en cas d'un déficit héréditaire aigu en L'á1-antitrypsine, lors d'hépatite néonatale avec cirrhose hépatique évolutive. Ce déficit est suspecté lorsque des emphysèmes pulmonaires sévères apparaissent chez l'adulte.

2.3- LES Alpha 2 globulines (7 ,8)

2.3.1- Céruloplasmine (150 KDa)

C'est une á2 glycoprotéine dotée de propriétés oxydatives qui utilise le cuivre comme cofacteur. Sa demi-vie est de 2-5 jours.

v valeurs usuelles chez un adulte: 0.3 à 0.6 g/l.

v La céruloplasmine diminue au cours de Maladie de Wilson : Au cours de la maladie de Wilson, le cuivre s'accumule dans les tissus de l'organisme (le cerveau, le foie entre autres) entraînant une atteinte cérébrale à type de dégénérescence hépato lenticulaire.

La céruloplasmine augmente au cours de:

Ø la grossesse et la prise de contraception orale et d'oestrogènes.

Ø pathologie infectieuse

Ø hyperthyroïdie (excès d'hormones thyroïdiennes dans le sang)

Ø la cirrhose du foie

Ø la leucémie aiguë

2.3.2- Haptoglobine 

Cette protéine est une glycoprotéine très riche en sucres, capable de fixer l'hémoglobine.

Son taux varie entre 0.5 et 1.5 g/l.

L'haptoglobine augmente en cas des inflammations et diminue lors des hémolyses intravasculaires.

2.4-LES Beta 1 globulines (8)

2.4.1- Transferrine : Cette protéine transporte le fer.

v Valeurs usuelles chez un adulte = 1.5 à 3g/l.

v La transferrine augmente lors de la carence martiale et diminue lors des états inflammatoires et des intoxications éthyliques.

2.5-LES Beta 2 GLOBULINES 

2.5.1- Fraction C3 du complément : Il existe des cas de diminution par surconsommation de C3.

La Fraction C3 du complément augmente au cours des états inflammatoires et diminue dans les syndromes infectieux et les maladies auto-immunes.

2.6-LES Gamma globulines

2.6.1- Les Immunoglobulines (8)

Sous forme d'anticorps, ces protéines représentent le support de l'immunité humorale. Ces immunoglobulines, très hétérogènes, sont classées en cinq classes : IgG, IgA, IgM, IgD, IgE (Tableau I)

Tableau I: Valeurs usuelles des gammaglobulines (16)

	IgG	IgA	IgM	IgD	IgE
concentration (g/l)	8 à 12	2 à 4	0.6 à 1.2	0.1 à 0.3	0.1 à 0.5

2.6.2- Protéine C Réactive (CRP= 120 KDa) (3)

La CRP est une glycoprotéine formée par l'union de 5 sous-unités identiques, cette protéine porte son nom en raison de sa propriété de précipiter au contact du polysaccharide C du pneumocoque.

La CRP augmente lors de la phase aigue d'inflammation, Elle s'élève deux à quatre heures après le début du processus inflammatoire.

II. Electrophorèse des protéines sériques 

1- Historique (9, 10)

Dès le début du XVIIIe siècle, les travaux de Charles de COULOMB (1736-1806), Alessandro VOLTA (1745-1827) et André-Marie AMPERE (1775-1836) avaient permis l'émergence des premières lois de l'électrostatistique et de l'électricité.

Un siècle plus tard, en 1859, L'Allemand Georg Hermann QUINCKE découvre qu'il était possible de déplacer des particules colloïdales (sous forme de colle gélatineuse) sous l'action d'un champ électrique : ce phénomène est appelé cataphorèse.

Par la suite, Hermann Von HELMHOTZ développe l'électro-osmose : sous un champ électrique, il observe que des particules chargées se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge.

En 1892, LINDER S.E et PICTON.H exploitent cette observation pour la séparation de particules chargées.

En 1937, le Suédois Arne Wilhelm Kaurin TISELIUS applique cette technique à la séparation des protéines du sérum et du lait, ce qui lui vaudra le prix Nobel en 1948. Sa méthode de fractionnement en phase liquide est alors trop onéreuse en matériel et en personnel pour la pratique courante, mais il la perfectionne et en 1950 il met au point l'électrophorèse sur papier, plus simple et permettant une utilisation plus large.

Depuis 1957, l'électrophorèse sur acétate de cellulose autorise une meilleure individualisation des fractions et ainsi l'établissement de tracés plus expressifs.

Les années suivantes, l'utilisation de gel de polyacrylamide permet l'obtention d'un fractionnement plus important, mais reste d'interprétation plus difficile et hors d'usage de la pratique courante.

Aujourd'hui cette technique, qui ne cesse de s'améliorer par la diversité des supports et des techniques de réalisation, est devenue un outil indispensable dans de nombreux laboratoires, tant au niveau de la recherche et de l'industrie que des sciences médicales au sens large.

Parallèlement, des automates d'électrophorèse sont apparus, permettant une meilleure standardisation des différentes étapes de la technique et notamment le mode de dépôt des échantillons et le contrôle des paramètres de la migration (voltage, température, durée de migration).

2- Principe Général (11, 12) 

L'électrophorèse consiste à faire migrer et à fractionner grâce à un champ électrique, et dans un tampon de pH déterminé, les constituants séparés en fonction de leur charge électrique. Ce principe d'électrophorèse s'applique aux protéines et pour qu'ils puissent migrer, elles doivent être ionisées. C'est ce qui se produit lorsque le milieu est au pH alcalin supérieur au pH isoélectrique (pHi) de différentes protéines.

3-Paramètres affectant l'électrophorèse (5, 12)

3.1- Le courant électrique 

Allant d'un bac à l'autre pour compenser la perte de liquide par évaporation.

3.2- La charge de la molécule 

Pour que la protéine se déplace dans un champ électrique, il est indispensable qu'elle soit ionisée soit par son groupement carboxyle soit par son groupement.

3.3- La nature du tampon 

La composition du tampon est importante du fait des interactions possibles entre certaines molécules le constituant et la protéine.

3.4- La diffusion 

Les particules incluses dans le gel ayant tendance à diffuser des régions les plus concentrées vers les moins concentrées, ce qui gêne la bonne séparation des zones.

3.5- La taille des particules 

Car à charge égale, une molécule plus petite migrera plus vite. Cet effet de tamisage moléculaire est surtout important pour les gels de polyacrylamide.

3.6- Le Choix du support 

Le support ayant été longtemps utilisé est le papier, remplacé ensuite par la membrane d'acétate de cellulose puis par le gel d'agarose qui permet une meilleure séparation et la détection des protéines monoclonales de faible concentration. Le gel de polyacrylamide a un très fort pouvoir séparateur exploité dans la séparation de lipoprotéines et des apoprotéines.

4- Les différents types d'électrophorèse 

4.1- Électrophorèse en veine liquide (13)

La migration dans ce type d'électrophorèse s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée soumis à un champ électrique de courant continu.
Cette méthode permet la détermination des mobilités électrophorétiques des différents constituants d'un mélange, cependant elle est très coûteuse.

Appareillage : La mise en oeuvre est longue et délicate. Les particules ne se séparent pas complètement mais ils se forment des frontières mises en évidence par des méthodes optiques telles que l'absorption ultra-violette pour les protéines.

4.2- Électrophorèse de zones (13,14, 15, 16)

Les principales applications utilisent un support poreux stabilisant la phase liquide : on parle alors d'électrophorèse sur support ou d'électrophorèse de zones. Le mélange à séparer est déposé sur un support convenable, poreux et imprégné de tampon (papier, dérivés de cellulose, polyoside « agarose », polyacrylamide...). Le support doit être homogène, poreux et inerte. Cependant, la condition d'inertie n'est jamais respectée et le support joue un rôle plus ou moins important dans la séparation.

Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de support :

4.2.1- Électrophorèse sur papier : Assez peu résolutive, cette technique d'électrophorèse est surtout destinée à séparer des molécules de petite taille, dont les acides aminés. Des phénomènes d'interférence liés à la charge des acides aminés et de la cellulose du papier interviennent de façon notable. Une goutte de solution contenant l'échantillon à analyser est déposée sur une bande de papier, puis séchée. La bande de papier est humidifiée avec un tampon convenablement choisi, puis les deux extrémités de la bande sont plongées dans deux réservoirs contenant le tampon. Chaque réservoir est connecté à une électrode. Un champ électrique continu est appliqué, et les acides aminés se déplacent en fonction de leur charge nette. En fin d'électrophorèse, la bande de papier est séchée puis les acides aminés sont révélés par une réaction colorimétrique telle que celle à la ninhydrine.

4.2.2- Électrophorèse sur acétate de cellulose : L'électrophorèse se fait dans des conditions proches de celles de l'électrophorèse sur papier. Les bandes d'acétate de cellulose sont fragiles, mais elles limitent la diffusion des molécules à séparer. La révélation des protéines se fait également par une réaction colorimétrique (rouge de ponceau par exemple). Cette technique, peu résolutive, permet de séparer grossièrement des groupes de protéines. Elle est peu coûteuse et permet une analyse rapide des protéines sériques.

4.2.3- Électrophorèse sur gel d' amidon : L'électrophorèse sur gel d'amidon est particulièrement utile l'analyse et la séparation des isoenzymes. Le principe de la technique repose sur une séparation électrophorétiques des protéines sur une matrice poreuse composée d'un gel d'amidon, de pH précis. Les enzymes présentes sont détectées en incubant le gel dans une solution contenant un substrat spécifique de l'enzyme donnant lieu à un produit coloré. Les profils obtenus sont désignés sous le nom de zymogrammes.

4.2.4- Électrophorèse sur gel d' agarose : L' électrophorèse sur gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer les protéines, l' ADN, l' ARN en fonction de leurs poids moléculaires.

Les molécules de plus petites tailles se déplacent plus rapidement et migreront plus loin que les molécules de tailles supérieures.

4.2.5- Électrophorèse sur gel de polyacrylamide : Les gels, formés entre deux plaques de verre, sont obtenus par polymérisation d'un mélange d'acrylamide (CH₂ = CH-CO-NH₂) et de bisacrylamide (CH₂ = CH-CO-NH-CO-CH= CH₂), ce qui aboutit à la formation d'un réseau réticulé. Les concentrations en acrylamide et le ratio acrylamide/bisacrylamide déterminent la taille des pores et donc les capacités résolutives du gel. Ces techniques peuvent être utilisées pour séparer des protéines ou bien des acides nucléiques (de courte séquence en général) en condition native ou dénaturante.

L'électrophorèse est réalisée à l'aide d'un montage vertical, les échantillons étant déposés dans des puits localisés au sommet du gel.

4.3- Électrophorèse Capillaire  (17)

C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre essentiellement les avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la très grande sensibilité de la détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de diamètre d'environ 50 ìm et de longueur 1 m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages élevés (15 à 30 kV). Ceci aboutit à des vitesses de migration très rapides des composés dans les capillaires et ceux-ci sont détectés par absorption U.V., fluorimétrie ou conductimétrie directement sur le capillaire, donc dans un volume très faible. Ceci fournit donc une sensibilité particulièrement élevée (on injecte seulement quelques nanolitres de l'échantillon). Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides, d'acides aminés, d'oligonucléotides ... Le nombre de plateaux est de l'ordre de 500 000 par mètre, ce qui fournit une résolution remarquable (on peut séparer des peptides différant d'un acide aminé, des mélanges complexes d'oligonucléotides, des fragments tryptiques de peptides ; la méthode est utilisée pour tester la pureté de peptides ou d'oligonucléotides de synthèse...). La technique peut également s'appliquer à des molécules non ionisées en présence de micelles de détergents appropriés.

5- Exemples d'applications d'électrophorèses 

Ø Électrophorèse des dysprotéinémies sériques.

Ø Analyse des protéines urinaires.

Ø Analyses des protéines du liquide céphalo-rachidien (LCR). 

III- Les différents profils protéiques

1-Définition (8)

Un profil électrophorétiques est Représentation graphique des résultats des dosages de plusieurs protéines. Les résultats étant exprimés en g/L ou en % de la valeur normale en fonction de l'âge du patient.

2- Intérêt du profil électrophorétiques des protéines sériques(8)

Ce profil permet d'orienter le diagnostic d'une infection avec profil élargi d'orientation par dosage de 8 à 10 protéines très différentes en ce qui concerne leurs fonctions, leurs régulations.

Ce profil permet le suivi de l'évolution d'une maladie avec un profil ciblé.

La répartition de ces différentes fractions apporte des nombreux renseignements qui aident au diagnostic de différentes pathologies :

- syndrome inflammatoire

- syndrome cirrhotique

- syndrome néphrotique

- gastro-entéropathies

- maladies héréditaires (dysprotéinémies...)

- infections chroniques

- certains cancers, myélomes

- maladies auto-immunes

- hypo-gamma globulinémie

3- Profil protéique normal 

Les concentrations des différentes fractions d'un profil électrophorétique normal sont rassemblées dans le Tableau I.

Tableau I : Concentrations normales des différentes fractions des protéines sériques obtenues par électrophorèse

	Hydrasys ®		Capillarys ®
	Cc en %	Cc en g/l	Cc en %	Cc en g/l
Albumine	60.0 à 71.0	43.0 à 51.0	55.8 à 66.1	40.2 à 47.6
Alpha 1	1.4 à 2.7	1.0 à 2.0	2.9 à 4.9	2.1 à 3.5
Alpha 2	7.0 à 11.0	5.0 à 8.0	7.1 à 11.8	5.1 à 8.5
Beta 1	6.0 à 9.0	4.0 à 6.0	4.7 à 7.2	3.4 à 5.2
Beta 2	2.0 à 5.0	1.0 à 4.0	3.2 à 6.5	2.3 à 4.7
Gamma	8.0 à 16.0	6.0 à 12.0	11.1 à 18.8	8.0 à 13.5

Figure 1 : Un profil normal d'électrophorèse des protéines sériques

4-Profils protéiques pathologiques  (8, 18,19)

Ø -

+

Le Cirrhose hépatique : Au stade avancé, la cirrhose se caractérise par une fusion des fractions béta et gamma (= bloc béta-gamma) (aspect en «dos de chameau«) liée à l'augmentation de la synthèse des IgA et des IgM, qui dépasse celle des IgG et qui se positionne à l'électrophorèse dans la zone entre les béta et gamma globulines .

Ø Syndrome néphrotique :

Caractérisé par une augmentation de la fraction alpha2 liée à l'augmentation de l'alpha 2 macroglobuline, associée à une hypoprotidémie sévère due à une protéinurie massive.

+

-

Ø Syndrome inflammatoire aigu

- -

+ -

Caractérisé par l'augmentation des alpha 1 et alpha 2 liées à l'augmentation des protéines de l'inflammation.

Ø Syndrome inflammatoire chronique.

Caractérisé par l'augmentation des alpha1, alpha2 et gammaglobulines liées à l'augmentation du taux d'immunoglobulines témoignant de la chronicité de la maladie inflammatoire.

+ -

- -

Ø Hypogammaglobulinémie :

- -

+ -

Caractérisé par une diminution de la fraction gammaglobuline liée à une diminution congénitale ou acquise de la production des IgG.

Ø Gamma

Alb

Hypogammaglobulinémie monoclonale :

- -

+ -

Caractérisé par la présence d'un pic monoclonal au niveau de la fraction de gammaglobulines témoignant de la prolifération d'un clone de lymphocytes B au dépend des autres.

Ø Bisalbuminémie :

Une bisalbuminémie se caractérise par un dédoublement ou un simple épaulement du pic de l'albumine sur le tracé de l'électrophorèse des protéines sériques. Elle est soit héréditaire permanente, soit acquise. Lorsqu'elle est acquise, la bisalbuminémie est transitoire pouvant survenir dans deux circonstances : lors d'un traitement prolongé aux bêtalactamines en présence d'une fistule pancréatique.

Ø - -

+ -

Déficit en alpha 1 antitrypsine :

- -

+ -

Caractérisé par une fraction alpha1globuline plate liée à la diminution importante de l'alpha1 antitrypsine.

PARTIE PRATIQUE

MATERIELS ET METHODES

Introduction :

L'électrophorèse de zone est utilisée dans les laboratoires de biologie médicale depuis une soixantaine d'années pour séparer et identifier les protéines sériques. Initialement réalisée sur acétate de cellulose et par des techniques manuelles, elle utilise aujourd'hui très majoritairement les gels d'agarose et peut être automatisée.

Le but de notre travail est de comparer la méthode semi-automatique utilisée au laboratoire : l'électrophorèse en gel d'agarose Hydrasys ^® de Sebia et le système d'électrophorèse capillaire de Sebia entièrement automatisable, Capillarys ^®.

I- Matériels

1- Collecte des échantillons :

Les échantillons sériques analysés proviennent des différents services du CHU Sahloul de Sousse. Durant un mois de travail, nous avons passés 66 échantillons simultanément en électrophorèse capillaire (Capillarys^®) et en électrophorèse sur gel d'agarose (Hydrasys^®).

ü Trente deux échantillons ayant donné de profils électrophorétiques normaux et 33 échantillons ayant donné de profils pathologiques sur le Capillarys, nous les avons servit pour l'étude de corrélation des différentes protéiques sur Capillarys^® et Hydrasys^®.

ü Deux échantillons sériques ont été utilisés pour l'étude de repétabilité.

Nos électrophorèse ont été effectués sur des échantillons sériques issus de prélèvements sanguins sur des tubes sans coagulant après centrifugation à 3000 tr/min et pendant 5 min, les sérums sont décantés puis analysés immédiatement ou conservés à +4°C.

2- Appareillage :

2.1-Système HYDRASIS® SEBIA.

L'électrophorèse sur gel d'agarose (Hydrasys^®) est une technique semi-automatisée permettant la migration et la séparation des protéines sériques en tampon alcalin (pH = 9,2)

2.2-Système CAPILLARYS® SEBIA.

3- Réactifs 

· Kit HYDRAGEL PROTEIN(E) K20 (sur le système Hydrasys).

· Kit CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 (sur le système Capillarys).

· Sérum de contrôle normal (Réf 4785 ; N° de lot 19039/01).

v Ce contrôle nous a servi pour l'étude d'exactitude.

II- Méthodes

1- Electrophorèse sur gel d'agarose

Principe:

L'électrophorèse des protéines du sérum ou d'autres liquides biologiques humains est une analyse très utile en laboratoire d'analyses cliniques pour rechercher les modifications du profil protéique. L'agarose, d'utilisation très facile. Il donne une séparation des constituants sériques humains en six fractions majeures de mobilités différentes : albumine, alpha-1 globulines, alpha-2 globulines, bêta globulines et gamma globulines.

2-Électrophorèse Capillaire :

Principe : Le système CAPILLARYS utilise le principe de l'électrophorèse capillaire en solution libre, qui représente la forme la plus courante de l'électrophorèse capillaire. Il permet la séparation de molécules chargées en fonction de leur mobilité électrophorétiques propre dans un tampon de pH donné, et, selon le pH de l'électrolyte, d'un flux électro-osmotique plus ou moins important. Le système CAPILLARYS comprend 8 capillaires en parallèle, permettant 8 analyses simultanées. Sur ce système, l'injection dans les capillaires de l'échantillon (dilué dans le tampon d'analyse) est effectuée à l'anode par aspiration. La séparation est ensuite réalisée en appliquant une différence de potentiel de plusieurs milliers de volts aux bornes de chaque capillaire. La détection directe des protéines est effectuée à 200 nm côté cathode. Les capillaires sont ensuite lavés par une solution de lavage, puis par le tampon d'analyse. Avec le tampon utilisé à pH basique, l'ordre de migration des protéines sériques est le suivant : gamma globulines, bêta-2 globulines, bêta-1 globulines, alpha-2 globulines, alpha-1 globulines et albumine. Chaque fraction contient un ou plusieurs constituants sériques.

3-Dosage des protides sériques totaux 

Ce dosage a été effectué au niveau de chaque échantillon sérique par la méthode de Biuret sur l'auto analyseur CX9 de (Synchron clinical system CX9 PRO, BECKMAN COULTER) et nous a servi pour déterminer les pourcentages des cinq fractions électrophorétiques (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines).

4- Paramètres étudiés entre la méthode sur gel d'agarose sur Hydrasys el la méthode capillaire sur Capillarys :

4.1- Etude de la corrélation:

Cette étude a été faite par le logiciel Microsoft Excel 2007.

* Coefficient de corrélation : Ce coefficient a des valeurs extrêmes de zéro (aucune liaison et à 1 (liaison maximale), donc plus on se rapproche de 1, plus la liaison entre les deux paramètres étudiés est importante.

Deux types des profils électrophorétiques (Normale et pathologique) ont été distingués. Pour chaque type cinq coefficients de corrélations (R²) et cinq droites de régression (Y = ax+b) correspond aux cinq fractions (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines) effectués sur Capillarys et Hydrasys ont été déterminés.

4.2- Etude de la précision : c'est la qualité de l'accord, dans une zone définie de valeurs à mesurer entre des mesures répétées, effectués sur le même échantillon, dans les conditions déterminées.

Elle est également appelée fidélité. En fait on détermine habituellement l'imprécision, qui s'exprime par le coefficient de variation (CV).

n : nombre de mesures répétées de l'échantillon.

X₁, X₂, ....... X_n = valeurs obtenues.

m : moyenne : m=? Xi/n

Dans notre cas, il s'agit de moyennes correspondantes à chacune des cinq fractions (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines)

S : écart type : est la racine carré de la variance (notée V), la chiffre la dispersion des points autour de la moyenne.

Donc S= v?(Xi - m)² / (n - 1)

CV % = 100 S/m

Pour cela, nous avons estimé la précision de chaque méthode par l'étude de la repétabilité

*La repétabilité : nous avons fait cette étude sur deux types d'échantillons sériques donnant un profil électrophorétiques normal pour l'un et pathologique pour l'autre.

L'électrophorèse de chacun des deux types d'échantillon a été répétée dix fois sur Hydrasys et Capillarys par le même opérateur et dans le même sérum.

Analyse Statistique : L'étude statistique a été réalisée par le logiciel Excel.

Le Test de Student a été utilisé pour la comparaison des cinq fractions (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines) exprimés en pourcentages (%) sur les deux appareils Hydrasys et Capillarys.

La limite de significativité a été fixée à 0,05.

4.3- Etude de l'exactitude : L'exactitude (ou justesse) d'une méthode est la qualité de l'accord entre l'estimation d'une propriété mesurée (valeur mesurée) et la valeur vraie, en dehors des erreurs fortuites : on utilise pour son expression le coefficient d'exactitude : CE= (X-X₀/X₀) *100.

Avec : X₀= Valeur Théorique ou attendue et X= Valeur mesurée.

Pour ceci, nous avons dosé 5 fois un avec chaque méthode le sérum de contrôle de concentration connue et nous avons calculé les CE.

Résultats et discussions

1-Etude de corrélation des fractions de profils protéiques normaux sur l'Hydrasys et le Capillarys :

La comparaison de moyennes des cinq fractions de profils électrophorétique normaux (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines) sur les deux appareils Hydrasys et Capillarys, a montré des différences significatives partout. L'albumine et les alpha1 globulines sont significativement plus élevées sur le Capillarys (p< 0.001 ; p= 0,005 respectivement) tandis que les alpha 2 globulines, les beta-globulines et les gammaglobulines sont significativement plus diminués (p<0 ,001 ; p= 0.008 ; p= 0.011 respectivement) (Tableau I).

Tableau I : Etude de corrélation des fractions de profils protéiques normaux sur l'Hydrasys et le Capillarys

	Albumine		Alpha1 globulines		Alpha2 Globulines		Beta globulines		Gamma globulines
	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys
Moyenne (%)	57.6	51.7	4.3	3.8	10.3	14.3	11.6	12.3	16	17.6
Ecart-type (%)	2.8	2.8	0.7	0.5	1.5	1.9	1.14	1.2	2.6	2.6
p	<0.001		0.005		<0.001		0.008		0.011
Coefficient de corrélation (R^2)	0.4		0.6		0.6		0.2		0.81

Aucune corrélation n'a été constaté entre les deux appareils Hydrasys et Capillarys (Figure 1).

Figure 1 : Etude de corrélation des fractions de profils protéiques normaux sur

l'Hydrasys et le Capillarys

2- Étude de corrélation des fractions de profils protéiques pathologiques sur l'Hydrasys et le Capillarys :

La comparaison de moyenne des cinq fractions (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines) des profils électrophorétiques pathologiques (Albumine diminué, Alpha1, Alpha2 et Gamma globulines diminués) sur les deux appareils Hydrasys et Capillarys, a montré des différences significatives uniquement pour l'albumine et les alpha1 globulines. Comme pour les profils électrophorétiques normaux, l'albumine et les alpha1 globulines des profils pathologiques, étaient significativement plus élevés sur le Capillarys (p= 0,056 ; p= 0,045 respectivement) (Tableau II).

Tableau II : Étude de corrélation des fractions de profils protéiques pathologiques sur l'Hydrasys et le Capillarys

	Albumine		Alpha1 globulines		Alpha2 Globulines		Beta globulines		Gamma globulines
	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys
Moyenne (%)	42.7	39.9	5.77	5.016	12.6	15.13	12.79	12.58	26.13	27.27
Ecart-type (%)	7.05	6.19	2.04	1.37	6.64	6.95	3.81	4.67	9.89	10.25
P	0.056		0.045		0.072		0.423		0.329
Coeff. de corrélation (R^2)	0.80		0.74		0.95		0.69		0.95

De bonnes corrélation ont été constaté pour les alpha2 et les gammaglobulines sur les deux appareils Hydrasys et Capillarys (R² = 0,95 ; R² = 0.95 respectivement) (Figure2).

Figure 2 : Étude de corrélation des fractions de profils protéiques pathologiques sur l'Hydrasys et le Capillarys

3- Étude de repétabilité des fractions de profils normaux :

Nous avons constaté que pour les profils normaux, le Capillarys présente une meilleure précision que l'Hydrasys avec un CV toujours inférieur à 5% et ceci pour les cinq fractions protéiques (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines). (Tableau III)

Tableau III : Etude de repétabilité des fractions de profils normaux

	Albumine		Alpha1 globulines		Alpha2 Globulines		Beta globulines		Gamma globulines
	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys
Moyenne (%)	60.53	59.57	3.68	3.41	8.53	8.96	9.63	12.1	17.63	15.96
Ecart-type (%)	0.53	0.87	0.09	0.22	0.24	0.41	0.14	0.72	0.29	0.83
CV (%)	0.87	1.47	2.49	6.69	2.92	4.65	1.55	6.02	1.69	5.26

4- Étude de repétabilité des fractions de profils pathologiques :

Pour les profils pathologiques (Albumine et gammaglobulines diminuées ; beta globuline élevé) le Capillarys présente toujours une meilleure précision que l'Hydrasys avec un CV toujours inférieur à 5% et ceci pour les cinq fractions protéiques (Albumine, alpha1 globulines, alpha2 globulines, beta globulines et Gamma globulines). (Tableau IV)

Tableau IV : Etude de repétabilité des fractions de profils pathologiques

	Albumine		Alpha1 globulines		Alpha2 Globulines		Beta globulines		Gamma globulines
	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys
Moyenne (%)	36.11	35.38	5.09	4.05	10.06	12.39	45.75	43.18	2.99	5
Ecart-type (%)	0.23	1.09	0.11	0.21	0.15	0.42	0.24	1.04	0.11	0.47
CV (%)	0.65	3.08	2.35	5.23	1.49	3.39	0.53	2.41	3.68	9.56

La précision dans la détermination des fractions albumine et gamma globulines sur Hydrasys est d'étant plus médiocre que ces derniers sont diminués.

En faisant passer la fraction d'albumine de 59,7% à 35,38%, les gammaglobulines de 15,96% à 5%, les CV correspondants passent de 1,47% à 3,08% et de 5,26% à 9,56% respectivement

L'élévation des beta globulines de 12,10 à 43,18%améliore la précision de l'Hydrasys et le CV passe de 6,02 à 2,41%.

5- Étude d'exactitude :

Le Tableau V montre que le Capillarys donne une très bonne exactitude avec le sérum contrôle normal avec un CE toujours inférieur à 5% avec les cinq fractions protéiques .Par contre, l'Hydrasys s'avère non exact avec les fractions alpha1 globulines et beta globulines (CE= 18,7% et 8,48%).

Tableau V : Etude d'exactitude 

	Albumine		Alpha1 globulines		Alpha2 globulines		Beta globulines		Gamma globulines
	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys	Capillarys	Hydrasys
CE(%)	1.56	0.6	2.22	18.7	2.12	4.8	2.03	8.48	2.78	4.8

CONCLUSION

Notre étude comparative des deux méthodes d'électrophorèses capillaire (sur Capillarys , Sebia) et sur gel d'agarose (Hydrasys, Sebia) a montré :

- peu de corrélation entre les deux méthodes.

-l'électrophorèse capillaire présente toujours des fractions d'albumine et d'alpha1 globulines significativement plus élevés que celles sur gel d'agarose.

-l'électrophorèse capillaire s'avère plus précise et plus exacte que celle sur gel d'agarose.

Ainsi, étant ses performances analytiques et le fait qu'elle soit plus automatisée, l'électrophorèse capillaire sur l'appareil Capillarys, s'adapte parfaitement aux besoins et aux attentes de notre laboratoire.

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