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Activités larvicides des extraits de plantes sur les larves de moustiques vecteurs de maladies parasitaires( Télécharger le fichier original )par Meryem ALAOUI BOUKHRIS Faculté des sciences et techniques Fès - Master sciences et techniques 2009 |
Chapitre II :Matériel et méthodes1. Lieu et période de l'étude : Nous nous sommes proposés d'étudier l'activité larvicide des extraits aqueux de plantes et des huiles essentielles sur les larves de moustiques vecteurs de maladies parasitaires issues de différents gîtes surveillés de la ville de Fès. Ce travail d'une durée de 5 mois a été réalisé en deux parties : La première partie concernant l'extraction des huiles essentielles et l'obtention de la poudre à partir des plantes, s'est déroulée au niveau du Laboratoire de Valorisation et Application Industrielle de l'Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques de TAOUNAT(INPMA).
La deuxième partie concerne l'activité larvicide en la comparant aux insecticides utilisés par les services du Ministère de la Santé est réalisée à l'Unité d'Entomologie du Paludisme du Laboratoire Régional de Diagnostic Epidémiologique et d'Hygiène du Milieu (LRDEHM). Ce laboratoire est situé à l'Hôpital EL GHASSANI de Fès, disposant d'une Unité d'Entomologie chargé de l'identification de moustiques et du suivi de la sensibilité OMS des insectes aux pesticides. Il est la seule entité du Ministère de la Santé opérant sur l'identification et la surveillance des vecteurs culicidés et leurs tests de sensibilité vis-à-vis des insecticides au niveau de la région Fès-Boulemane. I- Matériel végétale 1. Choix des plantes Le choix des plantes est basé sur : - Une recherche bibliographique ; - Une observation de l'effet répulsif des plantes dans leur environnement naturel vis-à-vis des insectes ; - Utilisations traditionnelles des plantes par la population locale. 2. Identification des plantes : Les spécimens ont été identi?és à l'Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques de Taounate, par le Dr. Abdeslam Ennabili sous les numéros d'herbiers respectifs d'INP 216 à INP 251. 3. Récolte des plantes et extraction des huiles essentielles 3.1 Récolte des plantes : Des échantillons de plantes ont été récoltés dans le jardin expérimental de l'Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques (INPMA) de Taounate. Ces échantillons ont été prélevés en mois de mars 2010. 3.2 Séchage des plantes : La matière végétale (feuilles, tiges et bois) de 20 plantes locales (récoltées au niveau de l'Institut National des Plantes Médicinales et Aromatiques de Taounate), a été séchée dans une étuve à ventilation forcée portée à 40 °C pendant 24h à 48 h.
Figure 15 : Etuve à ventilation forcée 3.3 Broyage des plantes : Les feuilles des espèces végétales ont été ensuite broyées à l'aide d'un broyeur muni d'un tamiseur intégré de diamètre Ö < 1mm, jusqu'à réduction en poudre.
Figure 16 : Broyeur à tamis intégré - Taux d'humidité : 5 g de poudre de plantes a été introduite dans une étuve portée à 60 °C pendant 48 h, Cela permet d'exprimer la teneur en eau. Le Calculer du pourcentage du taux d'humidité TH est donné selon la formule : TH = (A/B) × 100 Où A = perte de poids par séchage (en g) ; B = masse initiale d'échantillon (en g). - Estimation des quantités du résidu sec : Dans le but de donner une signi?cation plus logique aux quantités de matières végétales solubles dans les extraits aqueux, ces derniers ont été concentrés par évaporation dans une étuve portée à 40 °C pendant 48 h, jusqu'à l'obtention d'un résidu sec dont la quantité est exprimée en mg. Cela permet d'exprimer les concentrations létales des résidus secs solubles dans l'eau en mg/l.
Le matériel végétal est constitué de la partie aérienne des plantes choisies, des fractions d'environ 160 g à 200 g de feuilles de chaque plantes vont être soumises à une hydrodistillation pendant 3 h, grâce à un appareillage de type Clevenger modifié. Les huiles essentielles recueillies par décantation à la ?n de la distillation vont être séchées sur du sulfate de sodium anhydre pour éliminer les traces d'eau résiduelles. L'essence ainsi obtenue va être mise dans des ?acons sombres, et le rendement d'extraction est calculé par rapport au poids du matériel végétal avant extraction.
Figure 17 : Hydrodistillation par Clevenger Le rendement R en huile essentielle est calculé à l'aide de la formule suivante : Masse d'huile essentielle(g) Masse du matériel végétal utilisé(g) R = × 100 Un échantillon de chaque huile essentielle a été analysé pour déterminer la composition chimique par chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (CG/MS).
La composition chimique de l'huile essentielle a été analysée par chromatographie en phase gazeuse couplé à la spectrométrie de masse (CG/MS) ; ce qui permet à la fois l'analyse chromatographique de chaque huile ainsi que la détermination qualitative et quantitative des composés majoritaires. L'identification des constituants a été réalisée par couplage d'un chromatographe en phase gazeuse de marque PERKIN ELMER 8500 à un spectromètre de masse de type FINNIGAN ITD (Ion Trap Detector), modèle 800 enregistrant à 70 eV. La colonne capillaire 5% Phényl-Méthyl-Siloxane possède les caractéristiques suivantes : 30 m de longueur, 0.25 mm de diamètre interne, 0.25 ìm d'épaisseur du film). Les conditions opératoires sont : température de l'injecteur splitless (250°C), programmation de température (de 40°C à 250°C, à raison de 6°C/min), gaz vecteur (He à 1 ml/min, vitesse linéaire moyenne = 36 cm/s), températures de la source et du quadripôle (230°C et 150°C respectivement), énergie d'ionisation (70 eV), gamme de masse (35 à 400 amu). L'identification des différents constituants est réalisée à partir de leurs spectres de masse en comparaison avec ceux des composés standard de la banque de données informatisées WILEY 275.L (Adams, 2001). Pour les hydrocarbures terpéniques divers, les confirmations sont obtenues par comparaison des spectres de masse et de leurs indices de rétention selon Kovats, donnés par la littérature (Joulain et König, 1998 ; Adams, 2001). II- Matériel biologique 1. Choix des larves Nous nous somme intéressés dans notre étude à : - Anopheles labranchiae vecteur du paludisme au Maroc ; - Culex pipiens du faite qu'il est responsable de la nuisance. 2. Prospection des gîtes : La prospection des gîtes a pour but de recueillir des informations sur la présence ou l'absence des vecteurs potentiels de maladies parasitaires. Il existe plus de 25 gîtes au niveau de la ville de Fès, nous avons effectué une sortie de prospection des gîtes pour choisir les gîtes à culex et ceux à anophèle. Les critères retenus pour le choix des gîtes sont : - Passé épidémiologique du gîte ; - Présence d'une forte densité de larves de culicidés dans le gîte ; - Mouvement de la population prés du gîte. 3. Collecte et Conservation des larves : 3.1 Collecte des larves : La collecte des larves au niveau des gîtes larvaires a été effectuée par l'utilisation d'un plateau ou d'haricot, le plateau est introduit dans l'eau en inclinant son borde à 45° sous l'effet des forces de tension, la couche superficielle de l'eau est ainsi attirée ainsi que les spécimens qui y surnagent. 3.2 Conservation des larves : La conservation des larves a été faite au niveau du terrain, les larves récoltées sont mises dans des microtubes remplis au trois quart d'alcool à 70° (éthanol) à l'aide d'une pipette. 4. Identification entomologique : 4.1 Traitement au laboratoire Au laboratoire, les larves de moustiques de stade 3 et 4 ont été mises entre lame et lamelle et déterminées sous microscope. 4.2 Identification des larves : Un certain nombre de caractères morphologiques sont utilisés pour l'identification des larves. Dans notre étude, elles ont été déterminées à l'aide d'une clé d'identi?cation des culicidés du Maroc (Himmi, 1995). III- Préparation des extraits des plantes 1. Préparation des extraits aqueux Après réduction en poudre. Une quantité de 10 g de poudre de chaque plante a été diluée dans 100 millilitre d'eau distillée préalablement portée à ébullition, puis laissée refroidir sous agitation magnétique pendant 30 minutes. Le mélange obtenu a été ?ltré à l'aide du papier Whatman (125 MM). Le ?ltrat récupéré représente une solution stock initiale à 10 g par 100 ml soit 10 %. 2. Préparation à partir des huiles essentielles : 3. À partir des huiles essentielles extraites, des solutions mères d'huiles essentielles de chaque échantillon ont été préparées dans l'éthanol à 95-96°, à partir desquelles des dilutions ont été réalisées dans l'eau de gîte pour obtenir des concentrations expérimentales ?nales prête à être tester. IV- Tests de toxicité La méthodologie de nos tests a été inspirée de la technique des tests de sensibilité normalisés par l'Organisation Mondiale de la Santé, adoptée pour tester la sensibilité des larves, vis-à-vis des insecticides utilisés en campagnes de lutte (OMS, 1963), (Aouinty et al.,2006). Expérimentation 1: Détermination de l'effet larvicide de 6 extraits aqueux. - Protocole de la 1ère expérimentation : À partir de l'extrait initial (solution stock 10 %) de chaque plante et l'eau du gîte larvaire, des concentrations de 9 %, 8 %, 7 % , 6 % et 5 % ont été préparées. 10 larves du stade 3 et 4 ont été prélevées à l'aide d'une pipette pasteur et mises dans des gobelets de 5 cm du diamètre, contenant chacun 99 ml d'eau du gîte (par introduction d'un millilitre de chaque solution ainsi diluée dans les gobelets précédemment préparés). Le même nombre de larves a été placé dans un gobelet témoin contenant 100 ml d'eau du gîte. Trois répétitions ont été réalisées pour chaque dilution ainsi que pour le témoin. Expérimentation 2: Détermination de l'effet larvicide de 6 huiles essentielles. - Protocole de la 2ème expérimentation : À partir des solutions mères d'huiles essentielles (solution stock 0,5 %) de chaque plante, des concentrations de 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % et 0,1 % ont été préparées. 10 larves de stade 3 et 4 ont été prélevées à l'aide d'une pipette pasteur et mises dans des gobelets du 5 cm de diamètre, contenant chacun 99 ml d'eau du gîte (par introduction d'un millilitre de chaque solution ainsi diluée dans les gobelets précédemment préparés, ce qui correspond dans tous les cas à une concentration en éthanol de 0,1 %). Trois répétitions ont été réalisées pour chaque dilution ainsi que pour le témoin. Expérimentation 3: Comparaison entre l'action des extraits de plantes et des insecticides sur les larves des moustiques. - Protocole de la 3ème expérimentation : À partir des concentrations mères d'insecticide, des concentrations de 0,00125 mg/l, 0,0025 mg/l, 0,005 mg/l, 0,0125 mg/l, 0,025 mg/l ont été préparées (Tableau 3). 10 larves de stade 3 et 4 ont été prélevées à l'aide d'une pipette pasteur et mises dans des gobelets de 5 cm du diamètre, contenant chacun 99 ml d'eau du gîte (par introduction d'un millilitre de chaque solution ainsi diluée dans les gobelets précédemment préparés, pour le témoin on introduit 1ml éthanol). Trois répétitions ont été réalisées pour chaque dilution ainsi que pour le témoin. Parmi les insecticides utilisés dans la lutte antivectorielle, nous avons choisi de tester le Téméphos et le Malathion. Tableau 3 : Concentration d'insecticides utilisés.
Figure 18 : Tests de sensibilités réalisés sur les larves de moustiques. Après un temps de contacte de 24 h, on dénombre les larves mortes et vivantes. On calcule le pourcentage de mortalité chez les témoins en utilisant la formule : % m = NLm / (NLtotal - NNy) %m = pourcentage de mortalité NLm = nombre de larves mortes NLtotal = nombre de larves total NNy = nombre de nymphes Le test est considéré valide si le pourcentage de mortalité chez les témoins est inférieur à 5% ou compris entre 5% et 20%. Si le pourcentage de mortalité chez les témoins est compris entre 5% et 20%, la mortalité après exposition doit être Corrigée en utilisant la formule d'Abbott (OMS, 2004a). % Mortalité corrigée = (%Mort.Observée - %Mort.Témoin/100- % Mort.Témoin) ×100 Si la mortalité chez les témoins excède 20 %, le test est invalide et doit être recommencé. |
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