ANNEXES
ANNEXE 1
Préparation des milieux de culture pour L.
pneumophila Milieu gélosé BCYE : Composition pour 1
litre :
Dissoudre dans 900 ml d'eau distillée:
· Extrait de levure 12 g
· Tampon ACES 10
· Charbon actif 2 g
· Alpha-cétoglutarate 1 g
· Hydroxyde de potassium 2,8 g
· Agar 15 g
Le pH est ajusté à 6.9 #177; 0,05 à l'aide
de solution de HCl 1 M ou de solution de KOH 1 M si nécessaire. Ensuite,
compléter le volume à 1 litre avec de l'eau distillée.
Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 min.
Lorsque le milieu est refroidi, il est ajouté stérilement :
· L-cystéine hydrochloride
· Pyrophosphate de fer
La L-cystéine est préparée à une
concentration de 80 g/L et le pyrophosphate de fer à 50 g/L à
l'aide d'eau distillée puis filtrés sur filtre seringue 0,2 um et
seront ajoutées au milieu en surfusion à 50°C lors de
l'utilisation à raison de 2,5 ml/500 ml de milieu.
Milieu liquide BYE
La composition pour 1 litre est la même que celle du
milieu gélosé sans charbon actif ni agar. Le milieu n'est pas
autoclavé mais stérilisé par filtration sur 0,22um..
ANNEXE 2
Milieu PYG liquide : Composition pour 1 litre:
Dissoudre dans 900 ml d'eau distillée:
· Protéose peptone 20 g
· Extrait de levure 1 g
· MgSO4 : 7H2O 0,4M 10 ml
· CaCl2 : 2H2O 0,05M 8 ml
· Citrate de sodium 1 g
· Na2HPO4 : 2H2O 0,25M 10 ml
· KH2PO4 0,25M 10 ml
Le pH est ajusté à 6,5 avec une solution de HCl 1N
ou de NaOH 1N puis le milieu est autoclavé à 120°C pendant
20 min. Lorsque le milieu est refroidi, il est ajouté stérilement
:
- (NH4)2FeII(SO4)2 : 6H2O 5mM stérile (filtré sur
0,22um) 10 ml - Glucose 2M stérile 50 ml
Préparation du tampon amibes pour 1 L :
La préparation est la même que pour le milieu PYG mais sans
peptone, extrait de levure ni glucose.
Milieu riche pour Escherichia coui (
Gélose nutritive ) :
Composition pour 1 litre: Dissoudre dans 900 ml d'eau
distillée: 20 grammes de gélose nutritive, et 5 grammes d'agar, 3
grammes NaCl. Ajusté avec de l'eau distillée jusqu'à 1
litre. Le milieu ensuite est autoclavé a 121°C pendent 15 min.
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ANNEXE 3
Milieu Chang (SCGYEM) liquide : Composition
pour 1 litre
Dissoudre dans 900 ml d'eau distillée:
· 12,5 g de caséine hydrolysée à
l'acide
· 6,25 g d'extrait de levure
· 1 g de KH2PO4
· 1,65 g de Na2HPO4
·2H2O
· 3,1 g de glucose anhydre 99%
Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 20
minutes. Le milieu peut être conservé 3 mois à
température ambiante.
Le tampon est préparé de la manière
suivante : pour 1 L, ajouter à 1 L d'eau distillée:
· 1 g de KH2PO4 (Sigma-Aldrich, P-0662),
· 1,65 g de Na2HPO4
·2H2O (Sigma-Aldrich,
N-0876).
De la même manière, le tampon est autoclavé
pendant 20 minutes à 121°C. Le tampon se conserve également
pendant 3 mois à température ambiante.
Préparation de milieux de culture
gélosée LB pour Escherichia coui Composition
pour 1 litre :
· Bactotryptone 10 g
· Extrait de levure 5 g
· Chlorure de sodium 10 g
· Agar 15 g
· Eau distillée q.s.p 1 L
Le milieu est ensuite stérilisé 15 min à
121°C.
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