Memoire Online - à‰tude de la relation entre des bactéries legionella et des amibes isolées d'un écosystème aquatique à Marrakech.

L'objectif de nos travaux, est de chercher la capacité des bactéries viables non cultivables à se revivifier suite au passage dans les amibes après un traitement thermique préliminaire (Figure 13).

	5,90 5,80 5,70 5,60 5,50	Témoin
*Log ufc/ml*	5,90 5,80 5,70 5,60 5,50
	5,40
	5,30 5,20

Figure 13: Impact du traitement thermique sur la cultivabilité de Legionella pneumophila

La figure 13 présente l'évolution du nombre de bactéries cultivables/ml en fonction du choc thermique appliqué. Pour les suspensions témoins (sans traitement thermique) la concentration bactérienne était de 6,53.105 cellules cultivables/ ml. Après le choc thermique nous observons que le nombre de bactéries cultivables diminue (0,36 unités log environ) suite à un traitement de 1 h à 62°C. Plus la température augmente, plus le nombre de cellules cultivables diminue sans qu'il atteigne le zéro UFC/ml, donc nous ne pouvons pas déterminer la température moyenne d'inhibition, (TMI) « c'est-à-dire la température minimale pour laquelle nous n'observons pas de bactéries cultivables ». Ceci pourrait laisser supposer que les bactéries à l'état VBNC sont plus résistantes aux stress environnementaux et spécifiquement la température, ce qui a déjà été suggéré par Chang et al, 2007.

			*Témoin* *SA1* *SA2*

			*T °c*

Figure 14: L'état viable non cultivable de L. p après co-culture avec les amibes

En ce qui concerne la capacité des bactéries viables non cultivables à se revivifier suite à une prolifération intra-amibienne, nous pouvons observer qu'après infection, les bactéries récupèrent leur cultivabilité que ça soit pour la souche amibienne SA1 dont la concentration bactérienne a augmenté à environ 8,13.105 cellules cultivables/ ml pour les bactéries sans traitement avec une augmentation de (0,1 unités log environ), ou pour la souche amibienne SA2 qu'après l'incubation des légionelles à l'intérieur d'elle n'arrivent qu'à une concentration de 7,47.105, ce qui fait une augmentation de (0,06 unités log environ). Aussi, pour les bactéries traitées pendant 1 h à 62°C et incubées par la SA1 une augmentation de concentration d'environ (0,06 unités log) correspond à 3,28.10⁵ par rapport au témoin qui était de 2,87.10⁵. Par contre les concentration bactéries, incubées par la SA2 leur concentration augmente faiblement et atteint un nombre de 2,98.105 cellules cultivables/ ml ( environ 0,02 unités log) sur la courbe d'évolution. Donc d'après ces résultats on peut dire que nos souches amibiennes permettent à la Legionella pneumophilla sérogroupe 1 de retrouver sa cultivabilité après une incubation en co-culture. L'analyse statistique de corrélation a montré une différence très hautement significative (p<0,01) entre les résultats témoin (avant co-culture) et les résultats obtenus après une co-culture avec la SA1 et la SA2. Donc les résultats témoin et (R-SA1 ; R-SA2) sont corrélées, ainsi l'analyse a montré une corrélation entre les résultats de la souche amibienne 1 et celles de la souche amibienne 2 avec (p<0,01).

Notre étude s'est intéressée à la problématique Legionella et notamment à la relation amibes-légionelles. En effet, dans la littérature 3 genres amibiens (Acanthamoeba, Naegleria et Hartmannella) permettent la prolifération de Legionella sont les plus décrites (Declerck et al, 2007). Pour étudier la problématique dans notre écosystème, deux souches amibiennes ont été isolées. Les essais, portant sur les co-cultures, ont montré que les 2 souches d'amibes testées sont perméables à L. pneumophila. Dans un premier temps, nous avons cherché à déterminer la capacité de ces 2 souches amibiennes issues de différents endroits à permettre la prolifération d'une souche de L. pneumophila. La souche amibienne est apparue comme un facteur discriminant pour la prolifération de Legionella, ce qui est en accord avec ce qui est décrit dans la littérature (Dey et al, 2010). La souche amibienne SA1 apparaît comme la plus propice à la multiplication de Legionella pneumophila. Cependant, la comparaison des proliférations dans différents souches laisse entrevoir une influence du genre (souche) sur la prolifération. Ce qui est en accord avec la littérature (Dupuy et al, 2013).

Dans notre étude, nous n'avons pas observé de différences significatives de prolifération entre les différentes souches amibiennes. En effet, après 72 heures de co-culture à la température de 28°C et pour une MOI de 0,1, une multiplication d'environ 3,8 unités logarithmiques a été observée dans les 2 souches. Malgré l'absence de différences significatives, nous avons, tout de même, pu observer une tendance à une prolifération de Legionella plus importante dans la souche amibienne SA1. Au regard de nos résultats, est vu l'absence de différence significative entre les souches vis-à-vis de la MOI on peut dire que la prolifération de Legionella est dépendante de la souche et non du ratio.

Ainsi, la souche de Legionella pneumophila sérogroupe 1 a induit une diminution du nombre de trophozoïtes due à l'effet cytotoxique. Cependant, après 3 jours de co-culture au MOI de 10, nous avons observé une résistance de la souche amibienne SA2 plus que la souche SA1. D'après Messi et al. (2013), la virulence des souches de Legionella pourrait être liée à leur capacité à proliférer au sein des amibes et aussi à leur cyto-phatogénicité, c'est-à-dire à leur capacité à lyser la cellule hôte. D'après d'autres auteurs, les souches peu virulentes de Legionella seraient moins aptes à se multiplier dans les amibes (Tyndall et Domingue, 1982). Ainsi, au vue des résultats que nous avons obtenus, nous pouvons dire que notre souche Legionella est plus virulente.

Notre travail porté sur l'impact des traitements par la chaleur sur la souche de Legionella pneumophila nous a permis d'observer que ces traitements étaient capables de conduire à la formation de bactérie viables non cultivables. Après une co-culture de 72 h de Legionella pneumophila avec les deux souches amibiennes, Legionella a pu retrouver leur cultivabilité. Ces résultats correspondent à l'hypothèse selon laquelle les bactéries à l'état VBNC sont potentiellement infectieuses et virulentes pour les cellules hôtes. Ainsi, si ces bactéries à l'état VBNC se retrouvent inhalées par l'Homme, on peut envisager qu'elles puissent être responsables du développement de la maladie chez celui-ci.

Au final, cette étude a montré la capacité de Legionella à s'adapter à son hôte amibien et à se proliférer au sein des amibes. Non seulement, la présence des amibes permet une prolifération rapide de Legionella mais la multiplication intracellulaire de Legionella permet de diminuer la sensibilité de la bactérie aux traitements (monochloramine, ozonation, etc..). La protection de Legionella dans les amibes contre la désinfection est un phénomène bien connu (Greub et Raoult, 2004).

à‰tude de la relation entre des bactéries legionella et des amibes isolées d'un écosystème aquatique à Marrakech.

I-3. Impact du traitement thermique sur Legionella pneumophila