II.3 Evaluation de l'activité antidermatophytique
in vitro
II.3.1 Evaluation de l'effet des extraits et
fractions sur la croissance radiale mycélienne des dermatophytes
g) Préparation de l'inoculum fongique
Le front de croissance d'une culture de dermatophyte
âgée de 10 jours a été inondé avec 10 ml
d'eau physiologique stérile (NaCl 0,9%). Après agitation et
filtration, 1 ml de la suspension obtenue a été répandu
sur la surface du milieu Sabouraud dextrose agar (SDA) préalablement
coulé et gélifié dans une boîte de Pétri de
90 mm de diamètre intérieur. Les boîtes de Pétri ont
ensuite été incubées pendant 10 jours à 30°C
(Kuiate et al.,2006).
h) Préparation des solutions mères
d'extrait et des concentrations tests
L'extrait/fraction (0,08 g) a été dissout dans
500 ul de diméthylsulfoxide (DMSO), puis le volume de la suspension a
été complété à 5 ml avec de l'eau
distillée stérile pour une concentration finale de 16 mg/ml. A
partir de cette solution mère des dilutions successives en
série de 2 ont été effectuées pour obtenir des
concentrations tests comprises allant de 8 à 0,25 mg/ml (Tableau 1).
Tableau 1: protocole de préparation des
différentes concentrations d'extraits et fractions
testées
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Echantillons Témoin
négatif Tests
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volume de solution mère 0
2,25 1,13 0,56 0,28 0,14 0,07
d'extrait (ml)
volume de SDA en 4,5
2,25 3,37 3,94 4,22 4,36 4,43
surfusion (ml)
concentration test (mg/ml) 0
8 4 2 1 0,5 0,25
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i) Procédure
L'évaluation de l'inhibition de la croissance radiale
mycélienne a été réalisée par la
méthode d'incorporation en milieu solide (Kuiate et al., 2006).
A cet effet, nous avons utilisé des plaques de 24 puits
(NUNC®). Nous avons introduit 1,5 ml de SDA
supplémenté à différentes concentrations
d'extrait/fraction dans chaque puit. Trois essais ont été
réalisés pour chaque concentration. Après
gélification du milieu, chaque puit a été inoculé
en son centre à l'aide d'un explant (2 mm de diamètre
intérieur) prélevé du front de croissance d'une culture
âgée de 10 jours. Les plaques ont ensuite été
recouvertes et incubées à 30°C pendant 7 jours. La
croissance radiale mycélienne des dermatophytes a été
mesurée chaque jour, à la même heure, à l'aide d'une
règle graduée, dans deux directions perpendiculaires passant par
le centre de l'explant et ôtée du diamètre de l'explant.
A partir de ces mesures, les pourcentages d'inhibition de la croissance radiale
mycélienne de chaque dermatophyte par l'extrait/fraction ont
été calculés en utilisant la formule :
%I : pourcentage d'inhibition
Dt : diamètre moyen de la colonie du
témoin négatif
Dx : diamètre de la colonie dans le
puit test
Les explants dont la croissance a été totalement
inhibée ont été prélevés et
ensemencés sur un autre milieu non supplémenté en extraits
ou fractions, puis incubés pendant 7 jours à 30°C pour
déterminer si la substance est fongicide ou fongistatique (Thompson,
1989).
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