Etude de la biodiversité microbienne dans un sol polué par les hydrocarbures

Annexe 3:

Mise en oeuvre pratique

Coloration de Gram :

· Selon la norme (NF EN ISO 7218, octobre 2007)

· Préparer un frottis d'un produit pathologique ou d'une culture bactérienne pure

· Recouvrir le frottis de violet de cristal oxalaté laisser agir 1 min rincer a l eau distillée

· Verser de lugol et le laisser agir pendant une minute 1 minute rincer a l eau distillée

· Décolorer à alcool à 95 entre 15 et 30 secondes rincer à l eau distillée

· Recolorer avec le safranine pendant 10 à 30 secondes rincer a l eau distillée

· Sécher au dessus de la flamme d u bec Bunsen

· Observer au microscope a l objectif 100 immersion

Avec cette coloration double les bactéries Gram + apparaissent en violet foncé tandis que les bactéries Gram - sont colorées en rose ou en rouge

Coloration des spores bactérienne :

· réaliser un frottis en routine puis :

· le recouvrir d une solution aqueuse vert de vert malachite 0,5 % chauffer pendant quelques minutes sur une platine chauffante jusqu' a émission de vapeurs Rajouter du colorant pendant le chauffage si nécessaire sans jamais laisser évaporer complètement le colorant

· laver a l eau distillée

· colorer avec de la safranine pendants 30 secondes

Les cellules végétatives apparaissent colorée en rouge les spores en vert dans leur sporange rouges et les spores libres colorées en vert

Annexe 4:

Contrôle de qualité du milieu

Gélose king B :

Souches bactériennes Couleur des colonies après 24 h a 48 h d

incubation a 36 °C

Pseudomonas aeruginosa ATTC 10145 Jaune vert fluorescente

équivalente a NCTC 10332

Pseudomonas fluorescens CIP 69.13 Jaune vert faible

équivalente a ATCC 13525

Gélose king A :

Souches bactériennes Couleur des colonies après 24 h a 48 h d

incubation a 30 °C

Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853 Bleu vert

Pseudomonas aeruginosa ATTC 9027 Pseudomonas aeruginosa ATTC 17934

77

78

Pseudomonas fluorescens CIP 69.13 T Incolore

DELARRAS C., 2014. Pratique en microbiologie de laboratoire recherche de bactéries et de levures moisissures, Paris : Edition Céline Poiteaux 570, 586, 115, 66, 88, 71, 66 p Hohzoh Kiyohara, 1982) (Jyothi K, K Surendra Babu 2012)

Annexe 5 :

Suivi de la cinétique de la croissance microbienne

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SI) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

	T0	T1	T2	T3	T4	T5	T6	T7	T8	T9
T	5,0028	5,3654	5,3741	5,3808	5,4502	5,5087	5,4308	5,5481	5,6095	6,1610
	8569	8798	3709	1401	4911	541	2727	8461	9441	6839
P	5,00	5,7634	5,8750	5,8864	5,8976	5,9084	5,9777	6,0293	6,2041	6,4563
	63025	2799	6126	9073	2709	8502	2361	8378	1998	6603
P	4,9867	4,5910	4,8450	5,0128	5,1522	4,9344	5,2552	5,2695	5,2810	5,4814
h	7173	6461	9804	3722	8834	9845	7251	1294	3337	4263

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne de la souche (L) cultivée sur le milieu bouillon nutritif, MSM additionné de 1% de pétrole brut et ou phénol

	t0	t1	t2	t3	t4	t5	t6	t7	t8	t9
T	4,8994	5,1977	5,3610	5,5428	5,5906	5,5498	5,5407	5,7047	5,7072	6,2776
	557	9754	9797	2543	9326	2037	4646	2233	8623	0921
P	5,0211	5,4969	5,6053	5,9822	6,0644	6,0648	6,1875	6,1461	6,1271	6,4533
	893	2965	0505	7123	5799	3222	2072	2804	048	1834
P	5,0128	5,1583	5,2013	5,4771	5,0086	5,2922	5,2944	5,2966	5,2988	5,6106
h	3722	6249	9712	2125	0017	5607	6623	6519	5308	6016

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SH) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

	t0	t1	t2	t3	t4	t5	t6	t7	t8	t9
T	5,0969	5,1603	5,3371	5,3046	5,5365	5,5567	5,5518	5,6901	5,7140	6,3279
	1001	6847	2634	3412	5844	0444	5645	9608	502	7162
P	5,2227	5,6998	5,7024	5,7067	5,8750	6,0170	5,9684	6,1105	6,1034	6,3692
	1647	3773	3054	1778	6126	3334	8295	8971	6162	1586
P	5,0718	5,0492	5,1613	5,1522	5,0827	5,0569	5,0791	5,2041	5,2787	5,5740
h	8201	1802	68	8834	8537	0485	8125	1998	536	3127

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SG) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7 t8 t9

79

T	5,0517	4,9956	5,1388	5,1751	5,4199	5,5215	5,5369	5,6092	5,6975	6,2697
	9545	3519	288	2509	5575	739	7907	3858	1994	4637
P	5,3222	5,7923	6	6,0413	6,0969	6,1351	6,1322	6,2240	6,1875	6,4471
	1929	9169		9269	1001	3265	5969	1481	2072	5803
P	4,9590	4,6989	4,8450	4,8061	4,6627	4,6776	4,6901	4,7781	4,9542	5,2798
h	4139	7	9804	7997	5783	0695	9608	5125	4251	9498

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol

Tableau : Suivi de la cinétique de la croissance microbienne d'une souche bactérienne (SJ) durant la biodégradation du pétrole et du phénol.

	t0	t1	t2	t3	t4	t5	t6	t7	t8	t9
T	5,3528	5,4345	5,4497	5,4292	5,5087	5,4205	5,5158	5,6842	5,7631	6,2451
	2544	689	3545	1379	541	0584	7384	4675	7833	0121
P	5,6020	5,9837	6,2139	5,7853	6,0632	5,8426	5,8893	5,9890	6,1683	6,4297
	5999	7659	6024	2984	0822	0924	017	0462	0101	5228
p	5,2329	4,3010	4,8450	4,8061	4,6020	4,6776	4,6901	4,7781	4,9542	5,2798
h	9611	3	9804	7997	5999	0695	9608	5125	4251	9498

80

T : témoin P : pétrole Ph : Phénol