Partie II : Matériels et méthodes
I- Objectif. 23
II- Milieux de culture. 23
III- Matériel biologique. 23
IV- Méthode. 25
IIII-1- Echantillonnage. 25
IIII-2- Analyses physico-chimiques. 25
IIII-2-1- Teneur en eau ou humidité. 25
IIII-2-2- Potentiel d'hydrogène (pH). 25
IIII-2-3- Conductivité électrique (CE). 25
IIII-3- Isolement des microorganismes. 25
IIII-3-1- Enrichissement. 26
IIII-3-1-1- Dilution décimale. 26
IIII-3-1-2- Isolement des bactéries sur milieu solide.
26
IIII-3-2- Dénombrement des bactéries. 26
IIII-3-3- Observation macroscopique. 27
IIII-3-4- Observation microscopique. 28
IIII-3-4-1-Coloration de Gram. 28
IIII-3-4-2-Coloration de spores. 29
IIII-4-Purification des isolats. 29
IIII-5- Conservation des isolats. 29
IIII-6- Identification des microorganismes. 30
IIII-6-1- Recherche des enzymes respiratoires. 30
IIII-6-1-1- Recherche de la catalase. 30
IIII-6-1-2- Recherche de l'oxydase. 30
IIII-6-2-Test ONPG. 30
IIII-6-3- Recherche de Citrate. 31
IIII-6-4- Clark et lubs. 31
IIII-6-5- Hydrolyse a l'amidon. 31
IIII-6-6- Mannitol mobilité. 32
IIII-6-7- Viande-foie. 32
IIII-6-8- Étude du métabolisme protéique.
32
IIII-6-8-1-Recherche des décarboxylases (ODC, LDC,
ADH). 32
IIII-6-9- Sélection des bactéries par
utilisation de milieux de culture
spécifiques. 32
IIII-6-9-1-Croissance sur milieu King (King A et King B).
32
IIII-6-10- Bouillon nitraté. 33
IIII-7- Isolement de bactéries qui dégradent le
pétrole. 33
IIII-8- Détection de l'activité de
biodégradation des bactéries. 34
11
Partie III : Résultats et discussions
I- Analyses physico-chimiques. 35
I-1- Caractéristique du sol étudié.
35
I-2- Mesure du potentiel d'hydrogène. 35
I-3- Teneur en eau ou humidité 36
I-4- Conductivité électrique (CE). 37
II- Analyses microbiologiques du sol. 39
II-1- Caractéristiques des isolats purifies. 41
III- Etude des caractères morphologiques. 41
IIII- Recherche des enzymes respiratoires. 47
IV- Tests biochimiques. 48
V- Identification des souches isolées. 51
VI- Test de biodégradation. 54
VII- Détection de l'activité de
biodégradation des bactéries. 56
Conclusion. 61
Références bibliographiques.
62
Annexes. 65
Introduction
La pollution par les hydrocarbures constitue une menace
très sérieuse pour l'environnement en Algérie. Les pertes
et les fuites ainsi que les déversements accidentels font craindre une
situation écologique irréversible.
L'Algérie est un pays producteur et exportateur de
pétrole. En effet, la production du pétrole brut est en hausse.
De nombreux puits ne cessent d'être découverts sur le territoire
national par la Sonatrach et/ou par les Associés (Sociétés
étrangères d'exploitation et de production), ceci constitue des
sources de contamination du sol de plus en plus importante, de l'exploration au
transport des hydrocarbures.
Cette pollution nécessite donc l`intervention de
différents facteurs pour l`élimination de ce dernier. Parmi ces
facteurs, la biodégradation par les microorganismes et en particulier
les bactéries est le processus naturel le plus important dans la
dépollution de l`environnement. (VANESSA S. CERQUEIRA et al.
2011).
La réussite de La biodégradation des
hydrocarbures dans le sol réside non seulement dans le choix de l'agent
biologique mais également dans la maitrise des conditions
physicochimiques du sol telles que l'humidité, le pH, la
disponibilité des nutriments, la concentration des contaminants, qui
permettent son développement (KUMAR et GOPAL, 2015).
Les microorganismes jouent un rôle primordiale dans la
biodégradation, ils sont très divers dans la nature (YADAV et
HASSANIZADEH, 2011). Un certain nombre d'espèces
bactériennes sont connues pour la dégradation des hydrocarbures
et la plupart d'entre elles sont isolées à partir des sols
contaminés. Plusieurs espèces microbiennes sont recensées
et qualifiées aptes à dégrader des hydrocarbures
(HARITASH et KAUSHIK, 2009).
Le présent travail est réalisé dans le
but d'étudier la capacité de dégradation des
bactéries du sol contaminé par les hydrocarbures
pétroliers présente dans notre échantillon qui se trouve
au niveau de champs d'Ouargla, au niveau de la zone industrielle SONATRACH d'
Arzew.
La réalisation de ce modeste mémoire est
structurée en trois parties : la première partie présente
une synthèse bibliographique, la deuxième décrit le
matériel et les méthodes utilisés, et une troisième
partie consacré aux résultats et discussion qui sera suivi d'une
conclusion.
12
Rappel bibliographique
13
I. Les hydrocarbures dans l'environnement
I.1. Définition
Les hydrocarbures sont des composés organiques
uniquement constitués d'atome de carbone et d'hydrogène
(FRENENNEC et al., 1988). Ils possèdent une formule brute de
type C n H m, où n et m sont 2 entiers naturels. Ils peuvent être
classés en fonction de la forme de leur structure (linéaires,
cycliques) et de leur degré de saturation (TARAYRE, 2012).
I.2. Nature et origine
Les hydrocarbures sont considérés comme
étant des polluants à la fois organiques et chimiques
(KOLLER, 2004) provenant des activités des secteurs
énergétique et industriel. Certains composés, les HAP, se
forment naturellement par les incendies de forêt (BARRIUSO et al.,
1996).
I.3. Composition et caractéristiques
Malgré le fait que les principaux composants
présents dans les hydrocarbures soient le carbone et l'hydrogène,
une proportion significative d'autres atomes peut être présente.
Celle-ci inclue l'oxygène, le soufre et l'azote (MORGAN et
WATKINSON, 1994) et des métaux tels que le calcium et le
magnésium (CHITOUR, 1983). Les hydrocarbures peuvent être
classés en groupes de structures différentes.
I.3.1. Les hydrocarbures aliphatiques
Ce sont des hydrocarbures à chaînes droites
saturés ou insaturés. Les hydrocarbures aliphatiques
saturés sont des alcanes de formule générale C n H 2n+2,
ce sont les plus représentés dans le pétrole et vont du
méthane aux chaînes contenant 40 atomes de carbone et plus
(CERNIGLIA, 1992).
Les insaturés comportent les alcènes de formule
générale C n H 2n. Ces molécules contiennent une double
liaison et les alcynes qui ont pour formule C n H 2n-2 et contenant une triple
liaison dans leur molécule. Ils sont rares dans les pétroles
bruts, plus communs dans les produits de raffinage (CERNIGLIA,
1992).
I.3.2. Les hydrocarbures cycliques
Ils peuvent être saturés : appelés
cyclanes qui sont des cycles saturés isomères des alcanes, ou
insaturés appelés cyclènes s'ils possèdent une
double liaison dans leurs cycles et cyclines s'ils ont une triple liaison. Ils
sont dits hétérocycliques si le cycle de leur molécule
contient des
14
atomes autres que le carbone tels que le soufre, l'azote et
l'oxygène. Les hydrocarbures aromatiques sont des composés
contenant au moins un noyau benzénique dans leurs molécules.
C'est un cycle insaturé à six atomes de carbone. Ils constituent
une proportion très importante du pétrole et s'étalent du
benzène aux HAP. Ce sont des composés hydrophobes, persistants
dans les écosystèmes à cause de leur faible
solubilité dans l'eau (Cerniglia, 1992), certains, tels que
l'anthracène, sont quasiment insolubles (solubilité de 0.7
mg/l) (SMITH, 1994).
Figure 1 : Structure chimique des hydrocarbures
pétroliers (COLOMBANO et al., 2008).
I.4. Les type des pétroles
Le terme de pétrole recouvre un enssemle de produits
dont les compositions peuvent être très différentes. La
diversité de composition des bruts repose principalement sur leur
provenance. En effet , les conditions de formation d'un brut vont influencer
l'importance relative de chacune des familles de constituants citées
précédemment. Cependant, des bruts issus d'une région
donnée peuvent présenter des différences importantes
liées aux conditions de formation et d'évolution
différentes. Les bruts lourds contiennent des proportions importantes de
résines et d'alphaltènes par rapport aux hydrocarbures
saturés. Au contraire les bruts légers sont très riches en
hydrocarbures saturés et très pauvres en asphaltènes.
Cette diversité dans la composition des bruts est un aspect très
important dans l'industrie du raffinage (SYAKTI, 2004).
I.5. Les hydrocarbures en Algérie I.5.1.
Historique
Les hydrocarbures Algériens ont été
nationalises juste après l'indépendance (24 février 1971),
ils occupent une place importante par rapport l'économie nationale.
L'Algérie dispose de
15
potentialités importantes en pétrole et gaz
naturel lesquels ne sont pas exploités sous forme de matières
premières mais transformés en partie sur place, selon une
stratégie et une planification rigoureuses. Le transport, la
transformation et la commercialisation des hydrocarbures ont été
confiés à la société nationale SONATRACH dont les
principaux sièges se trouvent à: Hassi Messaoud, Alger, Arzew et
Skikda. Arzew, wilaya d'Oran représente un pôle important de
transformation et transport des hydrocarbures. Elle renferme un grand complexe
d'industrie pétrochimique en Afrique. Néanmoins, le
développement d'une telle industrie s'est fait au détriment de
l'environnement de cette belle ville qu'on voit se dégrader
d'année en année.
I.5.2. Problématique liée aux hydrocarbures
pétroliers en Algérie
Le littoral de l'Ouest d'Algérie recèle un
potentiel biologique important, une flore et une faune riches et variés,
des sites naturels exceptionnels, un tel littoral devrait faire l'objet d'un
soin minutieux. Les hydrocarbures représentent la plus importante source
de pollution. Cette pollution résulte de plusieurs activités
liées surtout à l'extraction du pétrole, à son
transport et en aval à l'utilisation des produits finis dans les
raffineries. En effet, de nombreuses études ont permis d'observer
l'apparition de problèmes de santé lors de la baignade ou de
pratique de sports aquatiques en eau contaminées. Les plus
fréquents sont des troubles digestifs et des infections cutanées.
Cette pollution à retenue l'attention de l'opinion mondiale et a
suscité de nombreuses conventions nationales et internationales. En mai
1974, l'Algérie porta ratification de la convention de Bruxelles, puis,
elle adopta le décret n°94-279 du 17 septembre 1994, portant
organisation de lutte contre les pollutions marines et institutions de plans
d'urgence. Enfin, le 05 février 2002 la loi algérienne
n°02-02 relative à la protection et à la valorisation du
littoral est promulguée. Théoriquement la législation
protège la baie algérienne, cependant la réalité
est toute autre. Les textes de la loi restent inappliqués, puisque sur
le terrain rien n'est respecté. Les rejets des déchets riches en
hydrocarbures émanant des zones industrielles se déversent
directement dans la grande bleue et sans parler de ceux émanant des
bateaux poubelles et les navires de ballastage qui traversent quotidiennement
la côte, comme ce fut le cas en 1989 par le pétrolier `Maas Luis'
et en 2003 par le navire italien `Valbruna' (SAKER, 2007). En
attendant l'application de ces textes et la concrétisation de ces
projets, seule l'état de la faune et la flore pourra témoigner de
la triste vérité. En effet, la pollution par les hydrocarbures en
Algérie a fait l'objet de plusieurs études, parmi lesquelles on
cite les travaux de TALBI (2009) et GHAOUAS en 2005 qui
touchent aux techniques physico-chimiques de traitement des effluents de la
raffinerie d'Arzew- Oran, ils montrent la composition des produits
pétroliers tels que Naphta léger et le Naphta lourd, le
kérosène et gasoil. Le gasoil est le produit le plus
chargé en alcane (62.36%), ces composés varient entre
16
(C1 à C30), et en aromatique (17.36%) et il regroupe le
benzène et des hydrocarbures aromatiques non identifiés.
YASSA (2005) cible la pollution atmosphérique, ces travaux
traitent la composition en particules organiques de la torche (combustion du
pétrole brut) émis par la raffinerie à Hassi-Messaoud et
la comparer avec la pollution présente en ville. La composition en
particules chimiques atmosphériques en n-alcanes est de 33% pour (C16 et
C34) tel Octadecane (0.012 ppm), et de 47% pour les n-alcanoique acides (A10
à A30) tel acide pamitique (0.061 ppm). En HAPs 20% tels
Phénanthrène (0.011 ppm) et pyrène (0.003 ppm). LADJI
(2010) étudie la composition organique du sable du Sahara
pollué par les hydrocarbures des différentes régions
d'Algérie, Hassi-Messaoud, Hassi-Bahbah, Laghouat, Tougguort et
Ghardaia, la plus grande pollution est détectée en n-alcanes
à HassiBahbah avec 66% entre (C16 à C35), le % de chaque
n-alcanes est défini dans le sable pollué et pour chaque ville.
En HAPs la ville la plus polluée est Laghouat avec 21.8% entre les
aromatiques légers tels phénanthrènes, anthracène
et les aromatiques lourds tels pyrènes et benzo[a]pyrène, le % de
chaque composé aromatique est défini dans le sable pollué
et pour chaque ville. BOUTENFNOUCHET en (2005) a permis
d'établir une cartographie de la pollution et à évaluer la
pollution industrielle par les hydrocarbures totaux au niveau de la plateforme
industrielle de Skikda. Cependant, il serait intéressant de
connaître l'identité de ces hydrocarbures directement dans
l'effluent industriel et même dans le pétrole brut avant et
après le traitement en raffinerie, qui est un élément
important pour définir le degré du danger qu'ils constituent.
I.6. Mobilité des hydrocarbures dans
l'environnement
Une fois déplacé, transformé ou
éliminé dans l'environnement, l'hydrocarbure est soumis à
différents processus qui vont entraîner des modifications de son
aspect général et de ses caractéristiques
physico-chimiques. Ces processus sont soumis au contrôle de facteurs
physiques, chimiques et biologiques. On citera les facteurs environnementaux
qui sont (R.E1, 2004) :
I.6.1. Evaporation
Qui, selon le type de pétrole, peut affecter la quasi
totalité ou une partie insignifiante du pétrole
déversé. Les fractions de faible poids moléculaires, les
plus volatiles des hydrocarbures déversés se perdent dans
l'atmosphère à un taux qui est déterminé par le
type d'hydrocarbure, la vitesse du vent et la température ambiante. La
plupart des pétroles bruts déversés perdent jusqu'à
40% de leur volume dans les première 48 heures alors que les fuels
17
moins ils lourds, qui contiennent peu de composés
volatils, s'évaporent très peu, même après plusieurs
jours (R.E1, 2004).
I.6.2. Solubilisation
Bien que les hydrocarbures soient des composés
insolubles dans l'eau, certains d'entre eux peuvent partiellement se dissoudre
(hydrocarbures aromatiques et hydrocarbures à faible nombre de carbone)
(BERTRAND et MILLE, 1989). Un hydrocarbure est d'autant plus soluble
que sa masse moléculaire est faible et que sa polarité est
élevée (SOLTANI, 2004). Il est important de noter que
ces hydrocarbures solubles sont parmi les plus dangereux pour l`environnement,
ils sont difficiles à éliminer et sont adsorbés par la
faune et la flore (SOLTANI, 2004).
I.6.3.Emulsification
C'est le mélange de deux fractions non miscibles :
l'eau et le pétrole. Deux types d'émulsions peuvent se former :
Les émulsions directes « huile dans l'eau »: si la surface de
l'eau est turbulente ; les hydrocarbures peuvent se fragmenter en gouttelettes
qui ensuite restent en suspension dans l'eau. Ces émulsions facilitent
l'élimination des hydrocarbures (R.E1, 2004). Et l'eau dans
huile appelée « mousse chocolat » Ce type d'émulsion ;
que l'on qualifie également d'émulation inverse ; peut se
produire en l'espace de quelques heures ; et contient jusqu'à 90% d'eau
.Le résultat est une augmentation de la densité et de la
viscosité, aussi que des volumes à traiter ou à enlever
(R.E1, 2004). Les émulsions eau dans huile sont
constituées par des hydrocarbures de haut poids moléculaires
(SOLTANI, 2004).
I.6.4. Sédimentation
Elle résulte de l'augmentation de la densité du
pétrole par rapport à celle de l'eau de mer. Divers processus
interviennent dans l'accroissement de cette densité, à savoir
l'évaporation, la dissolution des composés légers,
l'oxydation des paraffines, la formation d'agrégats et l'adsorption du
pétrole dispersé sur les particules en suspension. Les
hydrocarbures aromatiques et aliphatiques à haut poids
moléculaires, sont plus facilement adsorbés par les
matières organiques particulaires et colloïdales et donc
incorporés plus rapidement dans les sédiments (BERTRAND et
MILLE, 1989).
I.6.5. Photo-oxydation
Photo-oxydation est observée au niveau de la surface de
l'eau ou l'air (oxygène) et la lumière (radiation solaires) sont
présents pour la transformation des hydrocarbures. Etant donné la
réduction rapide de la diffusion de la lumière dans les couches
épaisses d'hydrocarbures ; la
18
photo-oxydation affecte essentiellement les couches minces ou
la surfaces des couches épaisses d'hydrocarbures (BERTRAND et MILLE,
1989). La photo-oxydation touche plus particulièrement les
composés aromatiques qui sont plus photo-sensibles que les
composés aliphatiques elle transforme les hydrocarbures en leurs
homologues oxygénés généralement beaucoup plus
solubles que les hydrocarbures de départ, mais parfois beaucoup plus
toxiques (BERTRAND et MILLE, 1989).
Figure 2 : Représentation schématique du
devenir d'une pollution pétrolière à la surface du sol
(MORGAN et WATKINSON, 1989).
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