Memoire Online - Effets de l?activation de la voie du peroxisome proliferator-activated receptor beta (pparβ) dans le processus de régénération musculaire

Mémoire de recherche présenté en vue de l'obtention du Master Sciences et
Techniques des Activités Physiques et Sportives (STAPS)
Spécialité Sciences du Mouvement Humain (SMH) - Recherche

Effets de l'activation de la voie du Peroxisome Proliferator-
Activated Receptor Beta (PPARâ) dans le processus de
régénération musculaire

Sous la direction et co-direction de Anne-Sophie ROUSSEAU (MCU) et Isabelle SATNEY (CR1/ HDR)

3.2.1 Effet du traitement GW0742 sur la cinétique des quantités d'ARNm des gènes

1. Introduction

L'altération du processus de régénération musculaire est la cause ou la conséquence de nombreuses pathologies : des myopathies (Wilschut et al., 2012) aux pathologies du mode de vie telles que le diabète de type 2 (Souza et al., 2013), l'obésité (Akhmedov et al., 2013) ou la sarcopénie liée au vieillissement (Stephen EA et al., 2014). Indépendamment des facteurs liés à la pathologie ou au mode de vie, l'optimisation de la régénération musculaire est d'intérêt dans le cadre de la prise en charge de la blessure musculaire qui peut être favorisée par la pratique physique à tout âge et quel que soit le niveau d'expertise (Rapport d'expertise collective ANSES, 2016). L'optimisation du processus de régénération dépend de nombreux facteurs, non seulement de l'entrainement et probablement du niveau de sédentarité, mais aussi des apports nutritionnels. Toutefois, les mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération musculaire ne sont pas encore totalement élucidés car complexes, ce qui rend encore floues les stratégies thérapeutiques (médicamenteuses ou non) à adopter dans les différents cas où le processus normal de régénération est altéré ou dans le cas plus général de la blessure musculaire. Ce mémoire vise à mieux comprendre l'implication de l'activation de la voie moléculaire impliquant le facteur de transcription Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Beta (PPARâ), fortement impliquée dans la physiologie musculaire (Neels and Grimaldi., 2014), dans le processus de régénération musculaire.

1.1 La régénération musculaire

1.1.1 Les différentes phases de la régénération

Le processus de régénération suit trois phases : Une phase de destruction, une phase de réparation, puis une phase de remodelage (Järvinen, 2014). La première phase se caractérise par une destruction de l'ensemble des fibres musculaires. Durant cette étape, les macrophages positionnés dans le muscle, vont émettre des signaux chimio-attractifs (facteurs de croissance, cytokines) pour activer et recruter des cellules immunitaires circulantes (Rappolee et al., 1992).

La phase de réparation est caractérisée par la régénération, la revascularisation du muscle, et la production d'un tissu conjonctif cicatriciel. Durant cette étape, les cellules satellites vont avoir un rôle important. Celles-ci sont à la périphérie des myofibres, entre la membrane plasmique de la fibre et sa lame basale (Mauro A. 1961), dans un état

quiescent et vont exprimer Pax7, un facteur de transcription impliqué dans la prévention de la différenciation précoce. Les cytokines et les facteurs de croissances (tels que HGF, IGF-1, TGFâ, etc) libérés par les cellules inflammatoires vont conduire à l'activation des cellules satellites. Celles-ci vont ensuite proliférer, puis certaines des cellules satellites vont revenir à leur état quiescent pour permettre un auto-renouvèlement au sein du muscle (Kuang et al., 2007) pendant que d'autres vont se différencier en myocytes. Ces myocytes peuvent alors fusionner et former des myotubes de faibles calibres possédant des noyaux localisés dans la partie centrale de la fibre, soit intégrer des fibres partiellement lésées (Jory et al., 2007).

Enfin, la phase de remodelage permet une récupération progressive de la masse musculaire et des propriétés contractiles et métaboliques des fibres, ainsi que la migration des noyaux centraux vers la périphérie de la fibre (Järvinen TA, 2005).

1.1.2 Rôle des cellules immunitaires

Les cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes T) jouent un rôle central dans le processus de réparation du muscle. Les macrophages pro-inflammatoires (de type M1) dont le rôle est de phagocyter les débris cellulaires, sont recrutés dans les heures qui suivent la lésion musculaire. Ils jouent un rôle important dans la phase inflammatoire et vont stimuler la prolifération des cellules satellites (Chazaud B et al., 2009). Les macrophages anti-inflammatoires (de type M2) vont contribuer à la résolution de l'inflammation et à la réparation du muscle, notamment en permettant aux cellules satellites de se différencier et de fusionner entre elles (Chazaud B et al., 2009). A la fois les macrophages de type M1 et de type M2 sont nécessaires au processus normal de régénération musculaire (Wang et al., 2014). A la fin de ces étapes, les macrophages vont alors mourir par apoptose (Saclier et al., 2013). Même si les macrophages sont les cellules inflammatoires prédominantes dans le muscle squelettique lors de la régénération musculaire, d'autres types de cellules immunitaires vont présenter un rôle central (Kharraz et al., 2013). En effet, les cellules T de type régulatrices sont impliquées dans le changement phénotypique des macrophages pro-inflammatoires en macrophages anti-inflammatoires (Burzyn et al., 2013). Aussi, en blessant des souris déficientes en lymphocytes T, avec un venin de serpent (cardiotoxine), Castiglioni A et al. (2015) ont montré que ces souris avaient un défaut de prolifération des cellules satellites.

L'utilisation de souris sauvages leur a permis d'identifier que les cellules T régulatrices étaient la seule population de cellules majoritairement infiltrées dans le cas d'une lésion musculaire. Les cellules T régulatrices pourraient donc jouer un rôle déterminant dans la prolifération des cellules satellites.

1.1.3 Mécanismes moléculaires impliqués dans la régénération musculaire

La signalisation moléculaire impliquée dans le processus de régénération musculaire est complexe. Nous allons évoquer quelques-uns des signaux et des voies moléculaires dans cette partie. L'Oxyde nitrique (NO) est une molécule-signal dont la synthèse est favorisée lors de la blessure musculaire. Il est connu pour permettre l'activité de facteurs de croissance qui vont ensuite permettre aux cellules satellites de s'activer et d'entrer dans un cycle de prolifération. Les facteurs de croissances ont des rôles bien distincts : par exemple, l'HGF est le premier facteur à induire l'activation des cellules satellites. Il va ensuite stimuler la prolifération tout en inhibant la différenciation, pour l'obtention d'un nombre suffisant de myoblastes (Miller et al., 2000). Les IGFs vont permettre d'activer la prolifération des cellules satellites par le biais de l'activation de la voie Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPK) ainsi que leur différenciation (Allen et al., 1989) par les voies Phosphatidylinositol 3-OH kinase/ Protéine kinase B (PI3k/AKT) et Calcineurin/ Nuclear factor of activated T-cells (NFAT) (Sakuma et al., 2012). D'autres signaux sont impliqués dans la régulation de la prolifération et de la différenciation des cellules satellites. Par exemple, le TNFá, une cytokine sécrétée par les macrophages pro-inflammatoires, est impliqué dans la diminution de l'expression de MyoD (un facteur de transcription) (Warren et al., 2002). En activant la voie c-Jun N-terminal Kinase (JNK), le TNF-á va conduire à un blocage du signal d'IGF-1, pour favoriser la prolifération des cellules satellites et inhiber leur différenciation (Warren et al., 2002 ; Strle et al., 2006). Aussi, IL-4, une autre cytokine sécrétée par les myotubes, agit via un récepteur exprimé sur les myoblastes (IL-4Rá), et promeut la fusion de ces derniers avec les myotubes (Horsley et al., 2003). Enfin, la myostatine (un facteur de croissance) est particulièrement intéressante car c'est un régulateur négatif de l'activation, de la prolifération, de la différenciation (Langley et al., 2002 ; Joulia et al., 2003) et de l'autorenouvèlement des cellules satellites (McCroskery et al., 2003).

1.2 Rôle du facteur de transcription PPARâ

Le Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Beta (PPARf3), est un facteur de transcription appartenant à la superfamille des récepteurs nucléaires. Il existe trois isoformes des PPARs : á, f3, et ã. PPARf3 est impliqué dans la régulation du métabolisme, de l'inflammation, de la prolifération, et de la différenciation dans plusieurs types cellulaires (Neels et Grimaldi., 2014). En absence de ligands, PPARf3 forme un hétérodimère avec RXR (Retinoic X Receptor) lié avec l'ADN sur un PPRE (Peroxisome Proliferator Responsive Element) et en interaction avec le co-répresseur. Dès qu'un ligand vient se fixer, il y a un changement du complexe co-transcriptionnel qui permet la venue du co-activateur, et ainsi la transcription des gènes cibles de PPARf3. PPARf3 peut être activé par des ligands endogènes tels que des dérivés d'acides gras ou bien des ligands synthétiques comme le GW0742. PPARf3 est exprimé de façon ubiquitaire mais il est très exprimé dans le muscle squelettique.

1.2.1 Rôle de PPARâ dans le muscle squelettique

Comme nous venons de le voir précédemment, le niveau d'expression de PPARf3 dans le muscle squelettique est plus élevé que dans certains tissus. Cependant, son expression peut varier dans certaines conditions. Par exemple, il a été montré que le vieillissement entraîne une diminution de son expression, et à l'inverse, un entrainement aigu ou chronique de type aérobie l'augmente d'un facteur deux (Rousseau et al., 2016). PPARf3 joue un rôle important dans la réponse angiogénique, dans l'hyperplasie, et dans le changement métabolique du muscle squelettique, par un remodelage de la composition des fibres musculaires. En effet, une surexpression de la protéine PPARf3 muscle-spécifique, ou une activation pharmacologique de la voie PPARf3 par le GW0742, induit dans le Tibialis anterior (TLA) (dont le métabolisme est principalement glycolytique), un remodelage qui est caractérisé par une augmentation de la capacité oxydative des fibres musculaires. Le potentiel oxydo-lipidique est favorisé par une diminution du potentiel d'oxydation du glucose et une augmentation du potentiel à cataboliser les acides gras. L'activation pharmacologique de la voie PPARf3 conduit aussi à une augmentation du nombre de capillaires ainsi qu'à une augmentation de l'expression de certains marqueurs myogéniques impliqués dans la prolifération et la différenciation des cellules satellites tels que Myf5 et MyoD (Gaudel et al., 2008).

1.2.2 Implication de PPARâ dans la myogenèse et la régénération musculaire 1.2.2.1 Implication de PPARâ dans la myogenèse

Giordano et al. (2009) ont traité des souris avec un agoniste de PPARâ, le GW0742, par injection sous cutanée. L'activation de la voie PPARâ dans le muscle TLA a conduit à une augmentation du nombre de noyaux par millimètre de fibre, de 14% comparé aux souris non traitées. Si ceci témoigne d'une activation des cellules satellites ainsi que d'une fusion favorisée par le traitement, la technique d'immunohistologie, n'a pas permis de montrer une augmentation de la prolifération des cellules satellites.

D'autres auteurs ont à l'inverse montré une prolifération diminuée de moitié et une différenciation des cellules satellites doublée chez des souris n'exprimant pas PPARâ dans les cellules satellites, par rapport aux souris sauvages (Angione et al., 2011). L'expression de la myogénine (marqueur de différenciation) est plus élevée chez les souris mutantes n'exprimant pas PPARâ. Toutefois, ces auteurs n'ont pas montré de différences du nombre de cellules satellites quiescentes ou en autorenouvèlement.

Enfin, deux autres études (Bonala et al., 2012 ; Chandrashekar et al., 2015) ont montré que la régulation par la myostatine est altérée chez les souris qui n'expriment pas PPARâ dans le muscle. Cela conduit à un défaut de prolifération et de différenciation des myoblastes. Cet effet passerait par le biais d'un antagoniste de la myostatine (Gasp-1).

1.2.2.2 Implication de PPARâ dans la régénération musculaire

Le pourcentage de fibres de petit calibre est augmenté de 30% et celui de gros calibre diminué de 20 % lorsque les souris n'exprimant pas PPARâ dans les cellules satellites sont blessés dans les TLA avec du venin de serpent (Cardiotoxine) (Angione et al., 2011). Néanmoins, après 30 jours, les TLA des souris mutantes ont complètement régénéré. Les résultats de cette étude suggèrent que la régénération musculaire chez des souris n'exprimant pas PPARâ dans les cellules satellites est retardée.

Enfin, Chandrashekar P et al. (2015) ont blessé les TLA de souris qui n'expriment pas PPARâ dans les cellules musculaires, avec un venin de serpent (la notexine) et montrent que la réponse inflammatoire est augmentée et la prolifération des cellules satellites est altérée lors du processus de régénération. A la fin de la régénération musculaire, les fibres présentent une atrophie et une diminution du nombre de noyaux

centraux, ce qui suggère qu'il y a eu un défaut de régénération musculaire. Toutefois, l'administration chez ces souris d'un inhibiteur de l'activité de la myostatine, au contraire augmente le nombre de noyaux centraux, et l'hypertrophie dans les fibres régénérées. Ceci suggère que PPARâ a un impact sur le processus de régénération musculaire, probablement en partie, par le biais de la régulation de l'activité de la myostatine.

1.2.3 Rôle de PPARâ dans l'inflammation

L'inflammation est un processus normal de protection de l'organisme contre les traumatismes et les infections. Dans des conditions normales, la réponse inflammatoire est contrôlée pour prévenir des dommages excessifs à l'organisme. Lorsque celle-ci n'est pas bien contrôlée, il va y avoir une production accrue de cytokines inflammatoires (TNF, IL-1, IL-6). Dans le tissus adipeux obèse enflammé, les effets anti-inflammatoires de PPARâ peuvent affecter le phénotype des macrophages favorisant ainsi le phénotype anti-inflammatoire (M2) au détriment du phénotype pro-inflammatoire (M1) (Kang et al., 2008). PPARâ apparait donc jouer un rôle central dans la polarisation des monocytes en macrophages de type M2 (Kang et al., 2008). Dans les cellules endothéliales, l'activation pharmacologique de PPARâ diminue la réponse inflammatoire induite par le TNF-á, en réduisant le recrutement des leucocytes (Piqueras et al., 2009). Aussi, dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, il a été rapporté une activité anti-inflammatoire de PPARâ (Bassaganya-Riera et al., 2004). Les effets anti-inflammatoires de PPARâ passent également par l'interaction physique de la protéine PPARâ avec la sous-unité p65 de NFêB, empêchant par ce biais l'activité de la voie NFêB et donc la production de cytokines pro-inflammatoires (Rodriguez-Calvo et al., 2008). Toutefois, à notre connaissance, il n'a pas été encore mis en évidence d'effets de l'activation de la voie PPARâ dans le cas de l'inflammation du muscle squelettique.

Le rôle de PPARâ dans les lymphocytes T n'a été que très peu exploré. Néanmoins, il en ressort dans des études menées dans un contexte de sclérose en plaque induite chez la souris, un effet de l'activation de la voie PPARâ dans la différenciation des cellules T. Plus en détail, il existe différentes sortes de lymphocytes T dont les lymphocytes considérés comme pro-inflammatoires, tels que les lymphocytes T helper 1 (Th1) et T helper 17 (Th17) et les lymphocytes considérés comme anti-inflammatoires tels que les lymphocytes T helper 2 (Th2) et les T régulatrices (Treg). Or, des cellules T CD4+ de

souris déficientes en PPARâ produisent plus de cytokines spécifiques des polarisations de Th1 et de Th17 (Kanakasabai et al., 2011). A l'inverse, des souris traitées avec un agoniste de PPARâ ont une augmentation de Th2 et de Treg (Kanakasabai et al., 2010). Il en ressort dans ces conditions, lors de l'activation de la voie PPARâ, une régulation de la balance pro-anti-inflammatoire en faveur d'une production de cytokines ayant davantage un rôle anti-inflammatoire.

1.3 Problématique

Le processus de régénération musculaire peut être découpé en trois grandes étapes (phase inflammatoire, de réparation et de remodelage). C'est un processus complexe qui mobilise différents types cellulaires durant ces étapes. D'après la littérature actuelle, PPARâ, un facteur de transcription, joue un rôle majeur sur la résolution de l'inflammation. PPARâ est aussi impliqué dans la prolifération et la différenciation des cellules satellites, à travers la régulation de différentes voies moléculaires (Giordano et al. (2009), Angione et al. (2011), Bonala et al. (2012), Chandrashekar et al. (2015)). Sachant que l'inhibition de la voie PPARâ conduit à une altération du processus de régénération, nous nous posons la question si à l'inverse, une activation pharmacologique de la voie PPARâ peut conduire à une accélération du processus de régénération. Le but de notre étude va donc être de comprendre davantage l'impact de la voie PPARâ aux différents stades du processus de régénération musculaire. En effet, nous pensons que la voie PPARâ est impliquée dans la phase inflammatoire ainsi que dans la phase de réparation du muscle. Nous mènerons un protocole de dommages musculaires induits par l'injection de cardiotoxine dans le tibialis anterior (TLA) de souris afin de vérifier les hypothèses selon lesquelles l'activation de la voie PPARâ: (1) durant la phase inflammatoire, favorise un profil anti-inflammatoire des macrophages (de type M2) et le recrutement des lymphocytes T; (2) durant la phase de réparation, favorise la prolifération et la différenciation des cellules satellites. Enfin, si nos hypothèses sont validées, nous pensons et vérifierons que ces effets s'accompagnent d'une amélioration des capacités fonctionnelles des souris.

2. Matériels et méthodes

Au total, 48 souris sont utilisées dans ce protocole. La moitié des souris reçoit une alimentation spécifique et l'autre moitié une alimentation avec un véhicule. Après 15 jours de traitement, toutes les souris sont blessées à la patte gauche, et une injection de solution saline est administrée à la patte droite (patte contrôle). 12 souris sont sacrifiées aux jours 4, 7, 9 et 14 post-blessure. 2 jours avant la blessure et la veille du sacrifice des jours 7 et 14, certaines souris sont soumises à des tests physiques. Pour des raisons méthodologiques (mode de sacrifice différent des autres souris) nous n'avons pas considéré les analyses par qPCR des souris sacrifiées au jour 9 post-blessure.

2.1.1 Animaux

48 souris mâles sauvages de type C57Bl/6J, âgées de 10 semaines à J0 (Charles Rivers, France) sont hébergées à l'animalerie dans des cages de 2 ou 4 souris, à une température ambiante (20°). La moitié des souris (n=24) est traitée avec du GW0742 par voie orale (dans l'alimentation). L'autre moitié des souris est supplémentée avec le véhicule (DMSO). Les animaux sont blessés au TLA 15 jours après le début du traitement, sont sacrifiés à différents temps par dislocation cervicale et les muscles TLA sont récupérés immédiatement après le sacrifice.

2.1.2 Traitement au GW0742 par l'alimentation

La moitié des souris reçoit de la nourriture standard (AO4) supplémentée en GW0742 (3 mg/kg/jour). Pour cela, 2g de bicarbonate est dissout dans 1L d'eau miliQ, puis 28mg de GW0742 sont rajoutés ou non suivant la nourriture produite. Ensuite, 1kg de croquettes est mélangée dans la solution. L'autre moitié des souris, qui sont les souris

« contrôle » ne reçoivent que de la nourriture supplémentée en DMSO (véhicule). Tous les 3 ou 4 jours, la nourriture restante et les souris sont pesées, puis la nourriture est renouvelée.

Après 15 jours de traitement, les souris sont blessées, sous anesthésie gazeuse (Vetflurane) à la patte gauche avec une injection de 50 ul de cardiotoxine (0,03 mg/ml, purifiée à partir du venin de serpent Naja pallida) et reçoivent une injection de 50ìl de sérum physiologique à la patte droite (patte contrôle). Pour des raisons éthiques, un anti-douleur (Buprenorphine) est administré en sous-cutané (Buprecare : 30ìg/ml) 20 minutes avant l'anesthésie.

2.1.4 Evaluation des capacités fonctionnelles

Une partie des souris (celles sacrifiées aux jours 7 et 14 post-blessure), est évaluée physiquement la veille de l'injection de cardiotoxine et la veille du sacrifice. Les souris sont habituées à faire les tests une semaine avant l'évaluation des tests physiques.

Le grip test permet d'évaluer la force maximale des membres supérieurs des souris. Les souris sont tenues pas la queue, s'agrippent à l'appareil et l'opérateur essaie d'éloigner la souris de la barre. Le test est répété plusieurs fois (au minimum deux fois) et la meilleure valeur est retenue. La force maximale est mesurée en Newton par gramme (N/g).

L'exercice consiste à courir en un temps limite sur un tapis roulant incliné à 5° (1 heure maximum) au moins à 30 cm/s (35cm/s les 15 dernières minutes) après une augmentation progressive de l'intensité de l'effort (30 secondes à 15 cm/s, 30 secondes à 20 cm/s, 30 s à 25 cm/s). Les souris reçoivent des stimulations électriques (0,2 mA a une fréquence de 0,25 Hz) pour stimuler la course (maximum 50 stimulations). L'exercice est arrêté lorsque les souris ont reçu plus de 50 stimulations.

6 souris traitées au GW0742 et 6 souris traitées au DMSO sont sacrifiées aux différents temps par dislocation cervicale. Elles sont ensuite pesées puis les TLA gauches

et droits sont récupérés et pesés. Sur 4 souris traitées au GW0742 et 4 souris traitées au DMSO, les 2/3 de chaque TLA sont récupérés pour la technique de dissociation des cellules musculaires et de cytométrie en flux et le tiers restant (haut du TLA) est mis à congeler à -80° pour la technique de RT qPCR. Sur les 4 autres souris, chaque TLA est prélevé et mis dans un tube avec de l'Optimal Cutting Temperature compound (OCT) puis congelé à -80° pour la technique d'histologie et d'immunohistochimie.

2.2 Techniques et dosages

Après la dissection du TLA, celui-ci est nettoyé dans du Phostphate Buffer Saline (PBS) puis mis dans un tube contenant 3mg de collagénase de type A et 1.5 ml de DMEM 10% de sérum foetal de veau (SVF). Le TLA est ensuite dissocié grâce à la collagénase et aux différents temps d'incubations à 37° (une fois 60 minutes puis 15 minutes). Une fois la dissociation terminée, les culots sont repris dans 1 ml de DMEM 20% SVF. Les cellules sont ensuite marquées avec des anticorps spécifiques des protéines d'intérêt (listés ci-dessous) couplés à différents fluorochromes. Puis elles sont passées devant un faisceau laser pour mesurer leur taille, leur granulosité et la longueur d'onde émise par le fluorochrome après excitation. Les cellules sont donc reconnues en fonction de la fluorescence qu'elles émettent. Les cellules reprises dans un volume de 300ul de DPBS 0,5% SVF, passent dans le cytomètre. Après différents contrôles (morphologie, viabilité, compensation des fluorochromes), les cellules sont analysées individuellement. Trois types de cellules sont étudiées : Les lymphocytes T, les macrophages et les cellules satellites à différents temps post blessure (J4, J7, J9 et J14).

2.2.2 Extraction d'ARN, Reverse transcription (RT) et PCR quantitative (qPCR) Les ARN totaux sont extraits à partir de 1/3 des muscles TLA lysés dans 1mL de trizol auquel est ensuite ajouté du chloroforme. Ils sont ensuite précipités sur la nuit avec

de l'isopropanol. Après lavage avec de l'éthanol 70%, les ARN sont repris dans de l'eau ne contenant pas de RNase et dosés avec la technique de spectrophotométrie (Nanodrop). Ensuite, les ARN sont rétro-transcrits grâce au kit QuantiTech reverse transcription (Qiagen) afin d'obtenir de l'ADN complémentaire (ADNc). Après l'élimination de l'ADN génomique par ajout du gDNA « wipeout » buffer, 1 ug d'ARN est rétro-transcrit pendant 30 minutes à 42°C avant l'inactivation de l'enzyme par la chaleur (95°C) pendant 3 min. Enfin, l'ADNc est récupéré puis dilué au 1/50 en présence de 0.3uM de primer listés ci-dessous, et de SYBRGreen (Takara). Toutes les réactions de qPCR sont réalisées en triplicats. La quantité relative des ARNm est calculée selon la méthode de CT comparatif et le gène 36B4 est utilisé comme gène de référence.

Nom	Séquence
PPARâ	F-AGATGGTGGCAGAGCTATGACC/R-TCCTCCTGTGGCTGTTCC
PDK4	F-GGGTCTCAATAGTGTCACC/R-GTGGGCCTGGGCATTTAGCA
CD34	F-GGAGTTCTGCTGGCCATCTT/R-TAAGGGTCTTCACCCAGCCTT
Pax7	F-CGATTAGCCGAGTGCTCAGA/R-GGAGGTCGGGTTCTGATTCC
MyoD	F-AGCACRACAGTGGCGACTCA/R-GCTCCACTATGCTGGACAGG
Myf5	F-TGAGGGAACAGGTGGAGAAC/R-AGCTGGACACGGAGCTTTT
MRF4	F-AGAGGGCTCTCCTTTGTATCC/R-CTGCTTTCCGACGATCTGTGG
Myogénine	F-AACTACCTTCCTGTCCACCTTCA/R-GTCCCCAGTCCCTTTTCTTCCA
Myostatine	F-CAGCCATGGTAGTAGACCGC/R-TACAGCCTGTGGTGCTTGAA
36B4	F-TCCAGGCTTTGGGCATCA/R-CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA

2.3 Analyses statistiques

Les comparaisons appariées entre les pattes contrôles et les pattes blessées ont été testées par le test de rang de Wilcoxon et quand le nombre de souris était inférieur à 4, nous avons utilisé le test exact de permutation. L'effet du traitement (GW0742 vs DMSO) a été évalué en utilisant le test de Mann et Whitney. La cinétique de régénération a été testée grâce au test de Kruskal Wallis en considérant les 3 groupes (J4, J7 et J14). Les différences sont considérées comme significatives pour une valeur de p < 0.05. Les résultats sont présentés sous forme de moyenne #177; écart type. Les données sont analysées

avec le logiciel Statview (version 4.57) et le logiciel StatXact (version 8) pour le test exact de permutation.

3. Résultats

Dans un premier temps, nous avons vérifié que l'agoniste de PPARâ (le GW0742) administré dans la nourriture des souris conduisait bien à une activation de la voie PPARâ. La quantité d'ARNm du gène PDK4 (gène cible de PPARâ dans le muscle), est significativement plus élevée (2,5 fois) dans le TLA des souris traitées au GW0742 pendant 15 jours, que dans le TLA des souris contrôles (Figure 2), confirmant que la voie PPARâ est plus active dans le TLA de souris traitées au GW0742. En revanche, nous n'avons pas observé de variation significative de masse corporelle des souris en réponse au traitement.

	4
U.A expression de PDK4	4
	3 2	*


	1 0

Figure 2 : Quantité d'ARNm de PDK4 dans les TLA de souris traitées ou non au GW0742. * : p< 0.05 Différent de DMSO.

Indépendamment de la blessure, et afin d'établir une valeur basale de référence, nous avons évalué si l'apport de GW0742 impactait sur l'expression des gènes utilisés dans la caractérisation des différentes étapes du processus de régénération. La quantité d'ARNm de Pax7 est significativement plus basse dans le TLA des souris traitées avec du GW0742. Aucune différence significative n'est montrée pour les autres gènes (Tableau 3).

Tableau 3 : Rôle des gènes impliqués dans la régénération musculaire et quantité d'ARNm dans les TLA de souris non blessées, traitées au GW0742 ou avec un véhicule (DMSO). Les valeurs présentées sont des moyennes +/- écart-type.

[ARNm]	Marqueurs des	Traitement DMSO. n=6		Traitement GW0742. n=6
Pax7	Cellules satellites quiescentes, actives	0,77	#177; 0,21	0,47	#177; 0,23	*
Myf5	Cellules satellites activées, destinées à proliférer	1,00	#177; 0,43	0,54	#177; 0,32
MyoD	Myoblastes proliférés destinées à se différencier	1,19	#177; 0,42	0,77	#177; 0,56
CD34	Cellules souches hématopoïétiques	1,36	#177; 1,06	0,38	#177; 0,08
Myogénine	Myocytes en train de se différencier	1,07	#177; 0,67	0,91	#177; 0,77
MRF4	Myocytes en train de fusionner	0,93	#177; 0,11	0,92	#177; 0,13

La blessure induite par la CTX dans le TLA des souris a conduit à une différence de masse corporelle plus élevée chez les souris traitées au GW0742 qui tend à être négativement plus élevée que celle des souris contrôles (p= 0.06) (Tableau 4), ceci à tous les temps. De même, nous observons une tendance (p=0.06) à ce que la variation de masse des TLA (comparativement à la masse des TLA non blessés) soit plus élevée, quel que soit le temps de sacrifice post-blessure, chez les souris traitées au GW0742, comparativement aux souris contrôles (Tableau 4). Néanmoins, toutes les souris ont récupéré leur masse de TLA initial au jour 14 post-blessure.

Tableau 4 : Effet du GW0742 sur la variation de masse des TLA blessés versus contrôles et sur la variation de masse corporelle des souris, entre le jour de la blessure et les temps de sacrifice.

	Variation poids souris (g)		Variation masse TLA blessés versus contrôles (mg)
	DMSO	GW0742	DMSO	GW0742
Jour blessure à J4 post blessure	0,05 #177; 0,30	-1,08 #177; 2,05	-8,61 #177; 1,38 *	-13,2 #177; 2,01 *
Jour blessure à J7 post blessure	0,06 #177; 2,43	-0,62 #177; 2,36	-6,9 #177; -2,59 *	-6,36 #177; 3,58 *
Jour blessure à J14 post blessure	1,36 #177; 0,68	-0,28 #177; 1,65	7,14 #177; 2,63	1,31 #177; 5,27

Il y a une diminution significative des performances d'endurance chez les souris traitées au GW0742, après la blessure. En revanche, le traitement au GW0742 n'a pas conduit à de différence significative sur les performances de force (Tableau 5). Il est à noter que le traitement n'a pas conduit à de diminution significative des capacités physiques avant la blessure.

Tableau 5 : Variation des performances d'endurance et de force des souris DMSO et GW0742.

	Temps limite sur tapis (min)		Grip test (N/g)
Jours sacrifice	DMSO	GW0742	DMSO	GW0742
J7	-13,94 #177; 14,69	-7,5 #177; 8,54 *	-0,005 #177; 0,007	0,00 #177; 0,006
J14	-18,04 #177; 22,15	-20,35 #177; 13,92 *	-0,004 #177; 0,003	0,00 #177; 0,006

Figure 3 : Quantités d'ARNm dans les TLA des marqueurs exprimés dans les cellules satellites lors de l'état quiescent, activé et de prolifération, selon les conditions de

3.1 Effet de la blessure sur la cinétique de régénération musculaire

3.1.1 Expression des gènes impliqués dans les étapes de la régénération musculaire

Avec la technique de RT-qPCR, nous avons pu comparer les quantités d'ARN messagers des gènes impliqués aux différentes étapes du processus de régénération. La blessure du TLA a conduit dans le TLA blessé (comparativement au TLA contrôle) à une augmentation des quantités d'ARNm de Myf5, MyoD et Myogénine (Figure 3-B, C ; Figure 4-B) et à une diminution des quantités d'ARNm de MRF4 (Figure 4-C) au jour 4. Cette différence entre patte blessée et contrôle est significative dans les 2 groupes (DMSO et GW0742) au jour 4 pour Myogénine et MRF4. Pour Pax7, Myf5 et MyoD, la différence entre patte blessée et contrôle au jour 4 n'est significative que pour le groupe traité au GW0742 (Figure 3-A, B, C). Les quantités d'ARNm de MyoD et de MRF4 reviennent à des valeurs non différentes des pattes contrôles au jour 7 (Figure 3-C ; Figure 4-C), alors que les quantités de Pax7, Myf5 et Myogénine restent significativement plus élevées dans les pattes blessées au jour 7 pour revenir à des valeurs non différentes des valeurs observées dans les pattes contrôles au jour 14 (Figures 3-A et B ; Figure 4-B).

blessure et de traitement aux différents temps post-blessure. Les valeurs présentées sont des moyennes +/- écart-type. * : p < 0.05 Différence significative entre les pattes blessées DMSO et GW0742 (Test de Mann et Whitney) ; # : p < 0.05 Différence significative entre pattes blessées et pattes contrôles (Test exact de permutation) ; Trait orange : Niveau d'expression de base chez des souris non blessées traitées au DMSO.

Dans les deux groupes, les quantités d'ARNm de CD34 dans les TLA blessés ne sont pas significativement différentes au jour 4 post-blessure des pattes contrôles, mais le sont au jour 7 post-blessure et le restent au jour 14 dans le groupe DMSO (Figure 4-A).

Figure 4 : Quantités d'ARNm dans les TLA des marqueurs de la différenciation et de la fusion des cellules musculaires selon les conditions de blessure et de traitement aux différents temps post-blessure. Les valeurs présentées sont des moyennes +/- écart-type. * : p < 0.05 Différence significative entre les pattes blessées DMSO et GW0742 ; # : p < 0.05 Différence significative entre pattes blessées et pattes contrôles ; § : p < 0.05 Différence significative entre le jour 4 et les autres jours (Test de Kruskal Wallis); Trait orange : Niveau d'expression de base chez des souris non blessées traitées au DMSO

3.1.2 Effet de la blessure sur l'expression des gènes Myostatine et PPARâ

Quel que soit le traitement administré, la quantité de Myostatine (Figure 5-A) est plus faible dans les pattes blessées que dans les pattes contrôles, ceci à tous les temps

post-blessure. Dans les pattes blessées, son expression est toutefois significativement plus faible 4 jours post-blessure comparativement aux autres jours. Les quantités d'ARNm de PPARâ (Figure 5-B) et de PDK4 (un gène cible-de PPARâ) (Figure 5-C) sont plus basses au jour 4 dans les pattes blessées comparativement aux pattes contrôles. Cette différence n'est pas observée aux jours 7 et 14. La quantité de PPARâ et de PDK4 revient à des valeurs non différentes des pattes contrôles au jour 7.

Figure 5 : Quantité d'ARNm (A) de Myostatine, (B) de PPARâ et (C) de PDK4 selon les conditions de blessure et de traitement aux différents temps post-blessure. Les valeurs présentées sont des moyennes +/- écart-type. * : p < 0.05 Différence significative entre les pattes blessées DMSO et GW0742 ; # : p < 0.05 Différence significative entre pattes blessées et pattes contrôles ; § : p < 0.05 Différence significative entre le jour 4 et les autres jours ; Trait orange : Niveau d'expression de base chez des souris non blessées traitées au DMSO.

3.1.2 Effet de la blessure sur la réponse immunitaire (macrophages, lymphocyte T)

totaux dans les pattes blessées, à tous les temps. Le nombre de macrophages M1

(macrophages pro-inflammatoires) est significativement plus élevé dans les pattes blessées par rapport aux pattes contrôles (à tous les temps) alors que le nombre de M2 (macrophages anti-inflammatoires) n'est significativement plus élevé comparativement aux pattes contrôles qu'au jour 4 post-blessure (Figure 6-A) et au jour 7 pour les souris DMSO. L'expression de CD68, un marqueur de surface des macrophages (totaux) dans le TLA des souris est significativement (50 fois) plus élevé au jour 4 dans les pattes blessées, confortant la réponse immunitaire induite par la blessure observée par l'analyse par cytométrie de flux (Figure 6-B).

Figure 6 : Nombre de macrophages totaux et sous populations M1 et M2 pour 10mg de TLA et quantité d'ARNm de CD68, un marqueur des macrophages, selon les conditions de blessure et de traitement aux différents temps post-blessure. Les valeurs présentées sont des moyennes +/- écart-moyen (macrophages) ou écart-type (CD68). * : p < 0.05

Différence significative entre les pattes blessées DMSO et GW0742 ; # : p < 0.05 Différence significative entre pattes blessées et pattes contrôles ; § : p < 0.05 Différence significative entre le jour 4 et les autres jours ; Trait orange : Niveau d'expression de base chez des souris non blessées traitées au DMSO

Le nombre de lymphocytes T (Figure 7) est significativement plus élevé 4 jours post-blessure, dans les pattes blessées des souris DMSO par rapport aux pattes contrôles. A partir du 7^ème jour, le nombre de lymphocytes est fortement diminué. A 4 jours post-blesure, les pattes blessées des souris DMSO sont infiltrées de CD4+ et de CD8+, puis ces populations ne sont plus représentées à partir du 7^ème jour (Tableau 6).

Figure 7 : Nombre de lymphocytes CD3, pour 10mg de TLA selon les conditions de blessure et de traitement aux différents temps post-blessure. Boites à moustaches résumant le maximum, les quartiles Q1, Q2 (médiane) et Q3 et le minimum. # : p < 0.05 Différence significative entre pattes blessées et pattes contrôles ; § : p < 0.05 Différence significative entre le jour 4 et les autres jours ; Trait orange : Niveau d'expression de base chez des souris non blessées traitées au DMSO

		Nombre CD4 pour 10mg TLA				Nombre CD8 pour 10mg TLA
Jours	Traitement	Contrôle		Blessée		Contrôle	Blessée
J4	DMSO	2,94 #177; 1,81 §		147,27 #177; 135,84	§ #	0,98 #177; 0,63	82,05 #177; 72,49	#
J4	GW	25,24 #177; 42,24	§	122,52 #177; 114,29	§ #	22,35 #177; 39,84	102,4 #177; 73,73	#
J7	DMSO	2,25 #177; 0,80		26,81 #177; 17,65 #		0,86 #177; 0,64	6,5 #177; 4
J7	GW	6,12 #177; 6,42		36,45 #177; 8,26 #		1,13 #177; 1,31	10,59 #177; 5,54
J14	DMSO	0,45 #177; 0,40		3,37 #177; 2,04		0,98 #177; 0,87	14,88 #177; 19,72
	GW	0,55 #177; 0,61		0,89 #177; 0,34		1,22 #177; 1,56	4,28 #177; 4,46

# : p < 0.05 Différence significative entre pattes blessées et pattes contrôles ; § : p < 0.05 Différence significative entre le jour 4 et les autres jours.

3.2 Effet du traitement GW0742 sur la cinétique de régénération du muscle
3.2.1 Effet du traitement GW0742 sur la cinétique des quantités d'ARNm des

La réponse musculaire à la blessure varie en fonction du traitement administré. Le

traitement GW0742 conduit à une récupération plus rapide du niveau d'expression basal observable de Myf5, CD34 et de Myogénine. En effet, les quantités d'ARNm de Myf5 (Figure 3-B), CD34 (Figure 4-A) et Myogénine (Figure 4-B) sont significativement plus basses dans les TLA blessés des souris GW0742 comparativement à celles des souris DMSO. La différence n'est plus significative après le jour 7 pour Myf5 (Figure 3-B), Myogénine (Figure 4-B) et CD34 (Figure 4- A). Les quantités d'ARNm de MRF4 sont significativement plus basses dans les TLA blessés des souris traitées au GW0742 comparativement aux TLA des souris DMSO (Figure 4-C). Cette différence n'est plus significative au jour 7. Le traitement au GW0742 a également conduit à des diminutions plus marquées, significatives au jour 4, des quantités d'ARNm de myostatine et de PPARâ en réponse à la blessure, comparativement à celles des souris traitées au DMSO (Figure 5-A, B). La quantité d'ARNm de PDK4 est, quant à elle, significativement plus élevée au jour 7 post-blessure chez les souris traitées au GW0742, dans les pattes blessées ainsi que dans les pattes contrôles comparées au souris DMSO (Figure 5-C). Nous n'avons pas observé d'effet significatif du traitement sur le nombre de cellules satellites (évalué au jour 9), que ce soit dans les pattes blessées ou dans les pattes contrôles (DMSO : 211 #177; 153 et GW : 129 #177; 57 cellules pour 10mg de TLA).

3.2.2 Effet du traitement GW0742 sur la réponse immunitaire

Au jour 4 post-blessure, les macrophages totaux, de type M1 et de type M2 sont en nombres plus élevés dans les pattes blessées GW0742 comparées aux pattes blessées DMSO (Figure 6-A). Il n'y a pas de différence significative de quantité d'ARNm de CD68 (Figure 6-B) au jour 4 post-blessure. Au regard du nombre de lymphocytes T totaux (CD3), une tendance (p=0,08) à une sur-représentation de cette population est observée au jour 4 et 7 chez les souris GW0742 comparativement au souris DMSO, dans les pattes contrôles, sans différence significative au jour 14 post-blessure (Figure 7). L'ensemble de ces effets apparait montrer une réponse immunitaire globale plus marquée en réponse au traitement par le GW0742.

4. Discussion

Dans ce mémoire, nous nous sommes demandé si une activation pharmacologique de la voie PPARâ peut conduire à une accélération du processus de régénération impliquant des effets sur les phases inflammatoires et de réparation. L'activité de la voie PPARâ peut être augmentée de deux façons : par une augmentation de l'expression de la protéine PPARâ et/ou par une augmentation de son activation en augmentant la quantité de ligand (Neels et Grimaldi., 2014). Dans notre étude, nous avons traité des souris avec du GW0742, un agoniste puissant et spécifique de PPARâ, dans l'objectif d'augmenter l'activation de PPARâ dans le TLA. L'augmentation observée, dans le TLA, de l'expression de PDK4, un gène-cible de PPARâ, après 15 jours de traitement au GW0742 administré dans l'alimentation des souris, témoigne que le l'agoniste a bien induit l'activation de PPARâ. Cet effet est d'une amplitude comparable à celui induit en réponse à 48h de traitement GW0742 administré par voie sous-cutanée (Giordano et al., 2008).

Nous montrons que les effets du GW0742 observés dans les TLA des souris non blessées, ne sont pas totalement similaires à ceux observés dans les TLA non blessés des souris qui ont subi une blessure sur l'autre patte. En effet, la blessure dans le TLA a conduit à une diminution de l'expression de PPARâ lui-même, significative au jour 4 post-blessure et davantage marquée chez les souris traitées avec du GW0742. L'augmentation de l'activité de la voie JNK (voie du stress impliquée dans la réponse inflammatoire) en réponse à la blessure (Alter et al., 2008) pourrait expliquer cet effet.

En effet, cette voie apparait jouer un rôle dans la régulation du niveau d'expression de PPARâ (Rousseau et al., 2016). PPARâ est par ailleurs connu, dans d'autres modèles cellulaires, pour être impliqué dans la régulation de l'inflammation par son interaction physique avec la sous-unité p65 de NF-êB, inhibant par ce biais son activité transcriptionnelle (Neels et Grimaldi., 2014). Cet effet pourrait-être dépendant du niveau d'expression protéique de PPARâ (Neels et Grimaldi., 2014). Il est donc possible que la baisse de l'expression de PPARâ en réponse à la blessure, soit une réponse adaptative pour permettre une moindre interaction inhibitrice de PPARâ sur la voie NF-êB et ainsi permettre l'activité transcriptionnelle de ce dernier. NF-êB est en effet un facteur de transcription impliqué dans l'expression de plusieurs cytokines pro-inflammatoires dont le TNF-á qui est connu comme nécessaire au bon déroulement du processus de régénération (Chen et al., 2005). Nous avons également montré une plus forte augmentation du nombre de macrophages et de lymphocytes T CD3 infiltrés au jour 4 post-blessure chez les souris traitées au GW0742, dans les pattes contrôles et dans les pattes blessées. L'ensemble de ces effets nous laisse penser que le traitement au GW0742 augmente le stress inflammatoire induit par la blessure. En parallèle, la quantité de myostatine est plus faible chez les souris traitées au GW0742 par rapport aux souris DMSO au jour 4. Il a été montré qu'une inhibition de l'expression de la myostatine favorise l'infiltration des macrophages durant les premiers jours de la régénération musculaire (McCroskery et al., 2005) et favorise l'activation et la prolifération des cellules satellites. Le mécanisme est encore peu étudié mais l'infiltration des macrophages serait due à une augmentation de la quantité de chémoattractants dans l'environnement de la blessure (Siriettet al., 2006). Nous pouvons donc suggérer que l'augmentation du nombre de macrophages observable au jour 4 post-blessure plus marquée en réponse au traitement GW0742 est, au moins en partie, la conséquence de la baisse de l'expression de la myostatine et donc possiblement de son activité. Toutefois, il est connu que l'activation de PPARâ favorise l'angiogenèse (Gaudel et al., 2008 ; Wagner et al., 2009). L'augmentation de la capillarisation du muscle, induite par le traitement, pourrait également expliquer un nombre de cellules immunitaires (macrophages et lymphocytes) infiltrées, également observable dans les pattes contrôles, plus élevé dans le TLA des souris traitées.

Pour rappel, les macrophages jouent un rôle crucial lors de la phase de régénération du muscle. Il a été montré qu'en l'absence de macrophages, le délai de prolifération et de différenciation des cellules satellites est augmenté (Segawa et al., 2008). En effet, les macrophages pro-inflammatoires (de type M1) vont permettre aux cellules satellites d'entamer leur prolifération (Chazaud B et al., 2009) et sont prédominants dans le muscle après la blessure avant que n'augmente le nombre de macrophages anti-inflammatoires (de type M2) qui eux vont permettre aux myoblastes de se différencier et de fusionner (Chazaud B et al., 2009). Dans notre étude, les macrophages sont en nombre plus élevé dans le muscle jusqu'au septième jour puis leur nombre diminue, ce qui est en accord avec d'autres études sur la régénération musculaire (Novak et al., 2014 ; Wang et al., 2014). De plus, le traitement au GW0742 conduit à la fois à un nombre de macrophages de type M1 mais aussi de type M2 plus élevé dans le muscle, observable 4 jours post-blessure, que le traitement avec du DMSO, sans différence au jour 7. Le rôle des macrophages dans le processus de régénération est dépendant non seulement de leur nombre et de leur profil mais aussi de la chronicité de leur présence (Mann et al., 2011), ce qui laisse penser que leur présence en plus grand nombre chez les souris traitées avec du GW0742 puisse être favorable à une réponse adaptative plus marquée à la blessure. En effet, nous observons sur plusieurs marqueurs de la régénération un retour plus rapide (7 jours versus 14 jours) vers des valeurs de base, chez les souris traitées avec du GW0742 comparativement aux souris contrôles. De manière intéressante, et même si nous ne l'avons pas quantifié dans le cadre de ce travail, l'augmentation du nombre de macrophages devrait s'accompagner d'une modification des sécrétions de cytokines. Sachant que les cytokines telles que le TNF-á, l'IL-1â et l'IL-6 sont sécrétées par les macrophages pro-inflammatoires et favorisent la prolifération des cellules satellites (Strle et al., 2006; Otis et al., 2014; Cantini et al., 1995), et que l'IL-10, et l'IL-4 sont sécrétées par les macrophages anti-inflammatoires et favorisent la différenciation des myoblastes (Villalta et al., 2011; Horsley et al., 2003), nous pensons qu'une augmentation aigue des macrophages à la fois de type M1 et de type M2 dans les premiers jours suivant la blessure peut favoriser la prolifération et la différenciation des cellules satellites et donc être "bénéfique" au processus de régénération. Toutefois, nous n'avons pas montré de différence significative, liée au traitement, sur la quantité de Myf5, de MyoD et de Myogénine (marqueurs de prolifération et de différenciation des cellules satellites) au

jour 4 post-blessure. En accord avec l'étude de Lee et al (2013) les gènes Myf5, MyoD, myogénine et myostatine varient de la même façon, dans notre étude, en réponse à une blessure musculaire induite. En revanche, au regard des effets du traitement GW0742, nos résultats diffèrent de ceux de Gaudel et al (2008) qui, chez la souris qui n'était pas sujette à une blessure musculaire et dont le traitement était administré par voie sous-cutanée pendant une durée de 96h maximum, montraient une augmentation de l'expression de Myf5 et de MyoD. De manière intéressante, les effets montrés étaient rapides et transitoires. En effet, l'expression de Myf5 est élevée dès 2h post-injection puis diminue significativement après 48h de traitement. De même, l'expression de MyoD est élevée dès 5h de traitement, reste élevée jusqu'à 48h de traitement, mais retourne à des valeurs de base après 96h (Gaudel et al., 2008). Une autre étude (Lee et al., 2016) a montré qu'en traitant des C12 en culture avec du GW0742 pendant 2 jours, la quantité d'ARNm de MyoD et de Myogénine était significativement augmentée. Ces études diffèrent méthodologiquement de la notre au regard du modèle utilisé (C12, TLA de souris non blessées) et du traitement (durée, mode d'administration). Dans notre étude, au jour 7 post-blessure, le traitement au GW0742 semble avoir l'effet inverse des effets du GW0742 préalablement montrés sur les gènes de Myf5 et de Myogénine (Gaudel et al., 2008 ; Lee et al., 2016). En effet, la quantité d'ARNm de Myf5 et de Myogénine revient à un niveau basal dès le 7^ème jour de blessure, chez les souris traitées au GW0742 comparées aux souris DMSO pour qui les quantités d'ARNm reviennent à leur niveau de base au jour 14 post-blessure. Il est tout à fait possible de penser que le retour à des valeurs basales d'expression soit plus rapide mais nous pouvons également penser que la cinétique d'expression de ces marqueurs entre le jour de la blessure et le jour 4 soit décalée vers une réponse plus précoce chez les souris traitées au GW0742. Dans ce dernier cas, cette réponse pourrait-être déjà terminée 48h après la blessure. Il serait donc intéressant, dans une prochaine étude, de regarder ces marqueurs dans les heures qui suivent la blessure. En parallèle aux effets observés sur les marqueurs de prolifération et de différenciation et probablement en cohérence avec ces effets, l'expression du facteur MRF4, un marqueur de fusion des myocytes et présent dans les fibres matures (Chargé et al., 2004), est plus basse au jour 4 post-blessure chez les souris traitées au GW0742 comparée aux souris DMSO. Cet effet laisse suggérer que sa moindre expression favorise la prolifération et la différenciation des cellules satellites.

Enfin, il est observable dans notre étude que la Myostatine reste exprimée de manière plus faible dans les pattes blessées comparées aux pattes contrôles jusqu'au jour 14 post-blessure quel que soit le traitement administré. Il est connu que la diminution de l'expression de la Myostatine favorise l'activité de la voie Akt/mTOR (voie de synthèse protéique) impliquée dans la différenciation et la fusion des myocytes ainsi que dans la maturation des fibres musculaires (Park et al., 2005 ; Amirouche et al., 2009 ; Miyabara et al., 2010). Il est donc possible que l'expression de la Myostatine ne soit pas revenue à un niveau de base car la voie Akt/ mTOR doit être active pour terminer le processus de maturation des fibres. De plus, les capacités physiques d'endurance des souris, ne sont pas revenues au niveau de leur performance initiale, malgré le fait que la masse musculaire de la patte blessée ne soit pas différente de la patte contrôle au jour 14 post-blessure, et que les souris ne présentent pas de problème biomécanique, visible, lors de la marche et de la course. L'absence de retour à un niveau d'expression de base de la myostatine ou identique au niveau d'expression dans le TLA de la patte non blessée au jour 14 post-blessure, suggère que la patte blessée n'a pas complétement régénéré au jour 14 quel que soit le traitement administré.

5. Conclusion

Le but de cette étude était de comprendre davantage l'impact de la voie PPARâ aux différents stades du processus de régénération musculaire. Pour ce faire, nous avons vérifié les hypothèses selon lesquelles l'activation de la voie PPARâ favorise un profil anti-inflammatoire des macrophages (de type M2) et le recrutement des lymphocytes T pendant la phase inflammatoire puis favorise la prolifération et la différenciation des cellules satellites pendant la phase de régénération. En effet, il est connu que l'activation de la voie PPARâ favorise le remodelage des fibres musculaires et pourrait par ce biais impacter les dernières phases du processus de régénération musculaire. Dans cette étude, nous avons apporté quelques éléments de preuve montrant que la voie PPARâ est aussi impliquée dans les phases précoces du processus de régénération. Nous pouvons conclure que l'activation pharmacologique de la voie PPARâ favorise les étapes de prolifération et de différenciation des cellules satellites en affectant positivement la réponse inflammatoire induite par la blessure. La prolifération et la différenciation pourraient être plus précoces après la blessure mais contrairement à l'hypothèse initiale, ces effets

n'apparaissent pas liés à une amélioration du profil anti-inflammatoire mais au contraire à une amplitude de la réponse inflammatoire plus élevée.

Toutefois, d'autres analyses par des techniques de RT-qPCR mais aussi immunohistochimie, doivent être menées pour renforcer notre argumentation : notamment, le dosage des cytokines secrétées par les différents types de macrophages et le dosage de marqueurs de l'angiogenèse dans le TLA.

Dans notre étude, nous n'avons regardé que les étapes précoces du processus de régénération, et donc n'avons pas pu déterminer si l'impact positif de l'activation de la voie PPARâ menait à une augmentation de la vitesse du processus global de régénération. En effet, au jour 14 post-blessure, le processus n'est pas terminé. Dans une prochaine étude il serait intéressant de sacrifier des souris dans les premières heures et les premiers jours de la blessure, ainsi que dans les derniers jours où la régénération musculaire se termine.

S'il s'avère que l'activation de la voie PPARâ a un impact bénéfique sur la prolifération et la différenciation des cellules satellites, la compréhension des mécanismes impliqués dans ces effets pourrait permettre d'envisager l'activation de PPARâ dans le muscle comme une cible thérapeutique dans le cadre des maladies musculaires affectant le processus normal de prolifération et de différenciation. Toutefois, d'autres modèles que la blessure qui est une contrainte aigue, nécessiteraient d'être utilisés. Enfin d'autres études sont nécessaires pour justifier l'intérêt potentiel d'une activation de la voie PPARâ dans le cadre de la récupération fonctionnelle post-blessure chez l'athlètes qui n'a pu être montré ici chez la souris durant la phase précoce de régénération.

Bibliographie

Akhmedov D, Berdeaux R. The effects of obesity on skeletal muscle regeneration. Front Physiol. 2013 ; 17;4:371.

Allen RE and LK Boxhorn. Regulation of skeletal muscle satellite cell proliferation and differentiation by transforming growth factor-beta, insulin-like growth factor I, and fibroblast growth factor. J.Cell Physiol. 1989 ; 138:311-315.

Alter J, Rozentzweig D, Bengal E. Inhibition of myoblast differentiation by tumor necrosis factor alpha is mediated by c-Jun N-terminal kinase 1 and leukemia inhibitory factor. J Biol Chem. 2008 ; 22;283(34):23224-34.

Amirouche A, Durieux AC, Banzet S, Koulmann N, Bonnefoy R, Mouret C, Bigard X, Peinnequin A, Freyssenet D. Down-regulation of Akt/mammalian target of rapamycin signaling pathway in response to myostatin overexpression in skeletal muscle. Endocrinology. 2009 ; 150(1):286-94.

Angione AR, Jiang C, Pan D, Wang YX, Kuang S. PPARö regulates satellite cell proliferation and skeletal muscle regeneration. Skelet Muscle. 2011 ; 1(1):33.

Bassaganya-Riera J, Reynolds K, Martino-Catt S, Cui Y, Hennighausen L, Gonzalez F, Rohrer J, Benninghoff AU, Hontecillas R. Activation of PPAR gamma and delta by conjugated linoleic acid mediates protection from experimental inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 2004 ; 127(3):777-91.

Bonala S, Lokireddy S, Arigela H, Teng S, Wahli W, Sharma M, McFarlane C, Kambadur R. Peroxisome proliferator-activated receptor â/ö induces myogenesis by modulating myostatin activity. J Biol Chem. 2012 ; 287(16):12935-51.

Burzyn D, Kuswanto W, Kolodin D, L. Shadrach J, Cerletti M, Jang Y, Sefik E, Guan Tan T, J. Wagers A, Benoist C and Mathis D. A Special Population of Regulatory T Cells Potentiates Muscle Repair. Cell. 2013; 155(6): 1282-1295.

Cantini M, Massimino ML, Rapizzi E, Rossini K, Catani C, Dalla Libera L, Carraro U. Human satellite cell proliferation in vitro is regulated by autocrine secretion of IL-6 stimulated by a soluble factor(s) released by activated monocytes. Biochem Biophys Res Commun. 1995 ;216(1):49-53.

Castiglioni A, Corna G, Rigamonti E, Basso V, Vezzoli M, Monno A, Almada A, Mondino A, Wagers AJ, Manfredi A, Rovere-Querini P. FOXP3⁺ T Cells Recruited to Sites of Sterile Skeletal Muscle Injury Regulate the Fate of Satellite Cells and Guide Effective Tissue Regeneration. PLoS One. 2015; 10(6): e0128094.

Chandrashekar P, Manickam R, Ge X, Bonala S ,McFarlane C, Sharma M, Wahli W, Kambadur R. Inactivation of PPARâ/ö adversely affects satellite cells and reduces postnatal myogenesis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2015;309(2):E122-31.

Chargé SB, Rudnicki MA. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 2004; 84(1):209-38.

Chazaud B, Brigitte M, Yacoub-Youssef H, Arnold L, Gherardi R, Sonnet C, Lafuste P, Chretien F. Dual and beneficial roles of macrophages during skeletal muscle regeneration. Exerc Sport Sci Rev. 2009 ;37(1):18-22.

Chen SE, Gerken E, Zhang Y, Zhan M, Mohan RK, Li AS, Reid MB, Li YP. Role of TNF-{alpha} signaling in regeneration of cardiotoxin-injured muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 2005; 289(5):C1179-87.

D'Souza DM, Al-Sajee D, Hawke TJ. Diabetic myopathy: impact of diabetes mellitus on skeletal muscle progenitor cells. Front Physiol. 2013 ; 20;4:379.

Gaudel C, Schwartz C, Giordano C, Abumrad NA and Grimaldi PA. Pharmacological activation of PPARâ promotes rapid and calcineurin-dependent fiber remodeling and angiogenesis in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008; 295(2): E297-E304.

Horsley V, Jansen KM, Mills ST, Pavlath GK. IL-4 acts as a myoblast recruitment factor during mammalian muscle growth. Cell 2003 ; 113 : 483-94.

Järvinen TA, Järvinen TL, Kääriäinen M, Kalimo H, Järvinen M. Muscle injuries: biology and treatment. Am J Sports Med. 2005; 33(5):745-64.

Joulia D, Bernardi H, Garandel V, Rabenoelina F, Vernus B, Cabello G. Mechanisms involved in the inhibition of myoblast proliferation and differentiation by myostatin. Exp Cell Res. 2003; 286(2):263-75.

Jory A, Cousin Xavier, Tajbakhsh S. Muscle formation, strain cells and muscular regeneration. Biofutur. 2007 ; Vol26 (281) : 37-40.

Kanakasabai S, Chearwae W, Walline CC, Iams W, Adams SM, Bright JJ. Peroxisome proliferator-activated receptor delta agonists inhibit T helper type 1 (Th1) and Th17 responses in experimental allergic encephalomyelitis. Immunology 2010; 130: 572-588.

Kanakasabai S, Walline CC, Chakraborty S, Bright JJ. PPARdelta deficient mice develop elevated Th1/Th17 responses and prolonged experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain Res 2011; 1376: 101-112.

Kang K, Reilly SM, Karabacak V, Gangl MR, Fitzgerald K, Hatano B, Lee CH. Adipocyte-derived Th2 cytokines and myeloid PPARdelta regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metab. 2008; 7(6):485-95.

Karlijn J. Wilschut, Vivian B. Ling and Harold S. Bernstein. Concise Review: Stem Cell Therapy for Muscular Dystrophies. Stem Cells Transl Med. 2012; 1(11): 833-842.

Kharraz Y, Guerra J, J. Mann C, L. Serrano A and Muñoz-Cánoves P. Macrophage Plasticity and the Role of Inflammation in Skeletal Muscle Repair. Mediators of Inflammation 2013 ; (10):491497.

Kuang S, Kuroda K, Le Grand F, Rudnicki MA. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 2007;129(5):999-1010.

Langley B, Thomas M, Bishop A, Sharma M, Gilmour S, Kambadur R. Myostatin inhibits myoblast differentiation by down-regulating MyoD expression. J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 4983149840.

Lee YS, Lee SJ. Regulation of GDF-11 and myostatin activity by GASP-1 and GASP-2.Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110(39):E3713-22.

Lee SJ, Go GY, Yoo M, Kim YK, Seo DW, Kang JS, Bae GU. Peroxisome proliferator-activated receptor â/ö (PPARâ/ö) activates promyogenic signaling pathways, thereby promoting myoblast differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 470(1):157-62.

Luquet S, Lopez-Soriano J, Holst D, Fredenrich A, Melki J, Rassoulzadegan M, Grimaldi PA. Peroxisome proliferator-activated receptor ä controls muscle development and oxidative capability FASEB J. 2003; 17(15):2299-301.

Mann CJ, Perdiguero E, Kharraz Y, Aguilar S, Pessina P, Serrano AL, Muñoz-Cánoves. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 2011 ; 4;1(1):21.

Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 1961; 9:493-5.

McCroskery S, Thomas M, Maxwell L, Sharma M, and Kambadur R. Myostatin negatively regulates satellite cell activation and self-renewal. J Cell Biol. 2003; 162(6): 1135-1147.

McCroskery S, Thomas M, Platt L, Hennebry A, Nishimura T, McLeay L, Sharma M, Kambadur R. Improved muscle healing through enhanced regeneration and reduced fibrosis in myostatin-null mice. J Cell Sci. 2005; 118(Pt 15):3531-41.

Miller, KJ, D. Thaloor S. Matteson, and GK Pavlath. Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle. Am.J.Physiol Cell Physiol 2000 ; 278.C174-C181.

Miyabara EH, Conte TC, Silva MT, Baptista IL, Bueno C Jr, Fiamoncini J, Lambertucci RH, Serra CS, Brum PC, Pithon-Curi T, Curi R, Aoki MS, Oliveira AC,Moriscot AS. Mammalian target of rapamycin complex 1 is involved in differentiation of regenerating myofib ers in vivo.Muscle Nerve. 2010; 42(5):778-87.

Neels JG, Grimaldi PA. Physiological Functions of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor I. Physiological Reviews. 1 July 2014 Vol. 94 no. 3, 795-858.

Novak ML, Weinheimer-Haus EM, Koh TJ. Macrophage activation and skeletal muscle healing following traumatic injury.J Pathol. 2014; 232(3):344-55

Otis JS, Niccoli S, Hawdon N, Sarvas JL, Frye MA, Chicco AJ ,Lees SJ. Pro-inflammatory mediation of myoblast proliferation. PLoS One. 2014; 9(3):e92363.

Palomer X, Alvarez-Guardia D, Rodríguez-Calvo R, Coll T, Laguna JC, Davidson MM, Chan TO, Feldman AM, Vázquez-Carrera M. TNF-alpha reduces PGC-1alpha expression through NF-kappaB and p38 MAPK leading to increased glucose oxidation in a human cardiac cell model. Cardiovasc Res. 2009; 81(4):703-12.

Park IH, Chen J. Mammalian target of rapamycin (mTOR) signaling is required for a late-stage fusion process during skeletal myotube maturation. J Biol Chem. 2005; 280(36):32009-17.

Piqueras L, Sanz MJ, Perretti M, Morcillo E, Norling L, Mitchell JA, Li Y, Bishop-Bailey D. Activation of PPARbeta/delta inhibits leukocyte recruitment, cell adhesion molecule expression, and chemokine release. J Leukoc Biol. 2009; 86(1):115-22.

Rapport d'expertise collective ANSES. Caractérisation des risques liés à la pratique d'activité physique. In : Actualisation des repères du PNNS- Révisions des repères relatifs à l'activité physique et à la sédentarité. (Ed) Scientifique, 2016 ; 339- 342.

Rappolee DA, Werb Z. Macrophage-derived growth factors. Curr Top Microbiol Immunol. 1992 ; 181: 87-140.

Rousseau AS, Sibille B, Murdaca J, Mothe-Satney I, Grimaldi PA, Neels JG. á-Lipoic acid up-regulates expression of peroxisome proliferator-activated receptor I in skeletal muscle: involvement of the JNK signaling pathway. FASEB J. 2016; 30(3):1287-99.

Saclier M, Cuvellier S, Magnan M, Mounier R, Chazaud B. Monocyte/macrophage interactions with myogenic precursor cells during skeletal muscle regeneration. FEBS J. 2013; 280(17):411830.

Sakuma K and Yamaguchi A. Molecular and Cellular Mechanism of Muscle Regeneration. In Cseri, J. (ed). Skeletal Muscle- From Myogenenis to Clinical Relations. 2012 ; 3-30.

A, Hayashi S, Miyagoe-Suzuki Y, Takeda S, Tsujikawa K, Yamamoto H.
Suppression of macrophage functions impairs skeletal muscle regeneration with severe fibrosis. Exp Cell Res. 2008; 314(17):3232-44.

Shuen-Ei Chen, Eric Gerken, Yingmin Zhang, Mei Zhan, Raja K. Mohan, Andrew S. Li, Michael B. Reid, Yi-Ping Li. Role of TNF-á signaling in regeneration of cardiotoxin-injured muscle. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 2005; Vol. 289 no. 5, C1179-C1187.

Siriett V, Salerno MS, Berry C, Nicholas G, Bower R, Kambadur R, Sharma M Antagonism of myostatin enhances muscle regeneration during sarcopenia. Mol Ther. 2007; 15(8):1463-70.

Strle K, Broussard SR, McCusker RH, Shen WH, LeCleir JM, Johnson RW, Freund GG, Dantzer R, Kelley KW. C-jun N-terminal kinase mediates tumor necrosis factor-alpha suppression of differentiation in myoblasts. Endocrinology. 2006; 147(9):4363-73.

Villalta SA, Rinaldi C, Deng B, Liu G, Fedor B, Tidball JG. Interleukin-10 reduces the pathology of mdx muscular dystrophy by deactivating M1 macrophages and modulating macrophage phenotype. Hum Mol Genet. 2011; 20(4):790-805.

Wagner N, Jehl-Piétri C, Lopez P, Murdaca J, Giordano C, Schwartz C, Gounon P, Hatem SN, Grimaldi P, Wagner KD. Peroxisome proliferator-activated receptor beta stimulation induces rapid cardiac growth and angiogenesis via direct activation of calcineurin. Cardiovasc Res. 2009; 83(1):61-71.

Wang H, Melton DW, Porter L, Sarwar ZU, McManus LM, Shireman PK. Altered macrophage phenotype transition impairs skeletal muscle regeneration. Am J Pathol. 2014; 184(4):1167-84.

Warren GL, Hulderman T, Jensen N, McKinstry M, Mishra M, Luster MI, Simeonova PP. Physiological role of tumor necrosis factor alpha in traumatic muscle injury. FASEB J. 2002; 16(12):1630-2.

The Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Beta (PPARâ), is a transcription factor playing an important role in muscle physiology and immunometabolism. We hypothesized that its activation with an agonist treatment (GW0742) of mice could alter the early-phase of the muscle regeneration process when immune cells infiltrate in injured muscle. To investigate this, tibialis anterior of mice treated or not with GW0742 were injured with cardiotoxin, and muscle regeneration was monitored on days 4, 7, 9 and 14 post-injury. The injury induced a decrease in PPARâ and Myostatin expression, the latter response was more pronounced in GW0742 treated mice. We found that treatment of mice with GW0742 increases the recruitment of macrophages (both M1 and M2) and CD3+ lymphocytes at day 4 post-damage. This effect is accompanied by a more pronounced response of markers of proliferation and differentiation of satellite cells and of Myostatin. Moreover, we observed an earlier return to basal level (7 days versus 14 days). Taken together, our results suggest that activating PPARâ pathway in skeletal muscle could be a therapeutic strategy in the case of certain skeletal muscle diseases or injuries.

Le Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Beta (PPARâ), un facteur de transcription, joue un rôle important dans la physiologie du muscle et l'immuno-métabolisme. Nous avons émis l'hypothèse que l'activation de PPARâ par un agoniste (le GW0742) affecte les phases précoces du processus de régénération musculaire. Pour la vérifier, les tibialis anterior de souris traitées ou non au GW0742 sont blessées avec de la cardiotoxine et la régénération musculaire est évaluée aux jours 4, 7, 9 et 14 post-blessure. Nos résultats montrent que la blessure induit une diminution de l'expression de PPARâ et de la Myostatine, plus marquée chez les souris traitées au GW0742. Le traitement induit une augmentation du nombre de macrophages (de types M1 et M2) et de lymphocytes CD3+ au jour 4 post-blessure. Ces effets sont accompagnés d'une réponse plus prononcée de l'expression des marqueurs de prolifération et de différenciation des cellules satellites et de la Myostatine. De plus, nous observons un retour plus précoce à des valeurs de base (7 jours versus 14 jours). L'ensemble de nos résultats suggère que d'activer la voie PPARâ dans le muscle squelettique pourrait être une stratégie thérapeutique dans le cas de certaines maladies ou blessures musculaires.