II.MILIEUX, MATERIELS, METHODES
II.1.MILIEU
Les investigations ont été menées au deux
endroits de la ville de Lubumbashi précisément dans deux communes
c'est-à-dire commune de Lubumbashi et annexe.
Le bassin de captage d'eau de Kimbembe se trouve dans la commune
annexe, sur la route Likasi aux environs du camp kimbembe à 17km du
centre-ville de Lubumbashi. Tandis que le Quartier CRAA se trouve dans
l'ancienne concession du centre de recherche agro - alimentaire, en sigle CRAA
qui est localisé dans la commune de Lubumbashi au N0 1 de
l'avenue président ILEO, sur la route Likasi et à environ 10km du
centre-ville de Lubumbashi.
II.2.MATERIELS ET REACTIFS
Ø Erlenmeyer de 250ml ;
Ø Microscope binoculaire ;
Ø Centrifugeuse électrique ;
Ø Source de chaleur (plaque chauffante) ;
Ø Tube à essai ;
Ø Comptes -gouttes stérile (pipette
pasteur) ;
Ø Pissette de 200ml ;
Ø Lame porte objet ;
Ø Lamelle ;
Ø Violet gentiane ;
Ø Lugol ;
Ø Alcool - acétone ;
Ø Fuchsine au 1/10em ;
Ø Eau distillée ;
Ø Mac conkey agar ;
Ø SS Agar ;
Ø Mannitol Salt Agar (M.S.A.) ;
Ø Gélose au sang
Ø Etuve réglé à 37oC ;
Ø Galerie API20E ;
Ø Micros tubes ;
Ø Tableau de caractère biochimique et
d'identification ;
Ø Catalogue analytique ou logiciel d'identification.
II .3.METHODES
1. PRELEVEMENT D'ECHANTILLON D'EAU
Tout commence par le prélèvement des
échantillons d'eau aux robinets de la REGIDESO le matin et
l'après-midi à l'aide des erlenmeyer de 250ml stérile dans
différentes avenues du Quartier CRAA de la commune Lubumbashi ; et
aussi à la station de captage et de distribution de L'UNILU au Quartier
Kimbembe de la commune annexe.
2. EXAMENS A L'ETAT FRAIS ET APRES COLORATION
- EXAMEN A L'ETAT FRAIS
· Nous identifions les lames porte - objet et les tubes
à essai
· Agiter doucement l'erlenmeyer pour mettre les
sédiments en suspension homogène ;
· Remplir aussitôt au ¾ un tube à essai
à centrifuger;
· Centrifuger pendant 5minuutes à 1500 tours/minute
ou à l'aide d'une centrifugeuse à main ;
· Rejeter le surnageant en retournant le tube à essai
d'un coup sec ;
· Avec le compte-goutte capillaire, aspirer et refouler
trois fois le culot du fond du tube à essai pour rendre
homogène ;
· Prélever quelques gouttes
culot « homogénéisés » ;
· Déposer une goutte d'eau du culot à l'aide
d'une pipette pasteur stérile sur la lame porte objet.
· Couvrir la préparation d'une lamelle couvre
objet ;
· Examiner au microscope entre lame et lamelle à
l'objectif 10X et 40X.
- EXAMEN APRES COLORATION DE GRAM
Principe :
Le violet de gentiane qui colore toutes les bactéries en bleu
violet ;
Le lugol fixe plus au moins fort le violet de gentianes dans les
bactéries ;
L'alcool acétone qui décolore certaines
bactéries où le violet est peu fixé par le lugol ;
La Fuchsine recolore les bactéries qui ont
été décoloré par l'alcool -acétone en rouge
rose et n'agit pas sur les bactéries qui ont été
coloré en bleu violet et restée intacte.
Mode
opératoire :
Préparer un frottis mince et laisser sécher
à l'air libre, puis fixer en faisant passer la lame sur la
flamme ;
Couvrir la préparation avec le violet de gentiane pendant
30sécondes, puis laver ;
Mordancer pendant 30sécondes le frottis par la solution
de Lugol ;
Laver la préparation à l'eau distillée au
moyen d'une pissette ou de robinet.
Décolorer la lame à l'aide de l'alcool
acétone jusqu'à la disparition complète du colorant
Laver à l'eau comme précédemment
Appliquer la fuchsine pendant 30sécondes
Rincer à l'eau de robinet ou distillée
Sécher la lame
Observer au microscope à l'objectif à immersion
(100X).
Résultat
Les bactéries gram + (positif) sont colorées en
bleu -violet et Gram-(négatif) en rouge rose.
3. MISE EN CULTURE
En homogénéisant un millilitre
prélevé dans l'échantillon d'eau dans 9ml d'eau
physiologique stérile, le nombre de micro-organisme par millilitre est
réduit à un dixième(facteur de dilution 10).
A l'aide d'une pipette stérile ensemencer 1ml de chaque
dilution (càd10 à10) sur le milieu Mac conkey, SS agar, le
mannitol Salt agar et sur gélose au sang cuit, respectivement. En suite
étuver à 370C pendant 24Heures. Après culture
pratiquer l'identification par le système API20E comporte 20 micros
tubes inoculé avec une suspension bactérienne qui reconstitue le
milieu.
Le résultat s'observe après une
période d'incubation qui se traduit par des réactions qui
produisent le virage de couleur spontané.
Ces réactions s'interprètent à l'aide d'un
tableau de caractères biochimiques et l'identification de germes est
obtenue à l'aide d'un catalogue analytique ou d'un logiciel
d'identification.
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