Memoire Online - Recherche et validation de résistance génétique au dépérissement bactérien causé par pseudomonas syringae chez l'abricotier.

Elaboré par: Mlle Mouna HADJ BRAHIM Encadrée par: Mr.Jean-Marc Audergon

DEDICACE

les soutiens et les sacrifices dont il a fait preuve à mon égard.
A ma mère, ma raison d'être, ma raison de vivre, la lanterne qui éclaire
mon chemin et m'illumine de douceur et d'amour.
A mes oncles et mes tantes, Hédi, Achour, Hafed, Mohamed, Salah,

Noura, Souad, dont leurs mérites, leurs sacrifices, leurs qualités humaines
m'ont permis de vivre ce jour

Les mots me manquent pour exprimer toute la reconnaissance, la fierté et le
profond amour que je vous porte. Que vous trouvez ici le témoignage de mon
attachement ma reconnaissance, gratitude et respect.

Wafa que ce travail soit l'expression de ma profonde affection. Je vous
remercie pour le soutien moral et l'encouragement que vous m'avez accordés.
Je vous souhaite tout le bonheur que vous méritez.

Je remercie toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce mémoire, ainsi qu'au bon déroulement du stage.

REMERCIEMENTS

Je tiens à exprimer ma plus profonde gratitude, ainsi que mon plus grand respect à mon encadreur JEAN-MARC AUDERGON de m'avoir accepté, suivie, de m'avoir fait confiance tout au long de mon travail, pour les discussions conduites pendant des heures qui m'ont appris à mieux analyser. J'ai eu le plaisir de travailler avec GUILLAUME ROCH qui n'a jamais manqué de me conseiller et de trouver des solutions à mes inquiétudes. Je remercie également ANNE-MARIE FERROL, ERIC MARTIN, JEAN LEONETTI pour leur aide sur le terrain et leur gentillesse.

Un grand merci à GUY CLAUZEL et ALAIN BLANC, pour leur contribution à ce travail par leur grande expérience sur la culture et la sélection de l'abricotier. Merci à LAURENT BRUN, CHRISTOPHE GROS, PEDRO ASCENSIO, SIMON RUZAND pour leur aide et leur participation aux inoculations et aux lectures.

Mes remerciements s'adressent autant à l'équipe de phytopathologie d'Avignon pour leur aide, leur conseils et leur orientation scientifique, particulièrement CINDY MORRIS, LUCIANA PARISI, CLAUDIA BARTOLI, et JAY RAM LAMICHHANE.

Je souhaite remercier particulièrement CHRISTOPHER SAUVAGE, pour son aide, sa patience et ses conseils en matière de génétique d'association.

J'associe à mes remerciements BENEDICTE QUILOT pour son aide au logiciel R, et VINCENT MASDUPUY côté informatique pour sa disponibilité et sa gentillesse.

Une pensée à mes amis d'Avignon, Zeineb FAKHFAKH mon amie et mon accompagnante de ces cinq dernières années pour son soutien, Alejandra CARILLO avec son café mexicain et son espagnol, Margaux JULLIEN pour son soutien moral, Noémi PUSKAS et son beau sourire, Timmy DEFERT et sa timidité anormale, Margot DULAIS pour ses confiture de framboises, Pierre BOUVARD avec son kinder bueno.

Je n'oublie pas bien évidement toutes les personnes à l'Institut Agronomique Méditerranéen de Saragosse, particulièrement RAMZI BEELKHODJA pour son aide, sa disponibilité, sa patience, sa gentillesse.

SOMMAIRE

2.1 Analyse de liaison dans les populations biparentales pour la sensibilité à

2.1.1 Etude de la résistance à Pseudomonas syringae sur rameaux au sein de la

2.1.2 Etude de la resistance à Pseudomonas syringae sur feuilles au sein de la population GoMo 59

séquencées pour la sensibilité à P. syringae observée sur rameaux et feuilles 61

RESUME

Parmi les cultures fruitières, l'abricotier connaît un développement important au niveau Européen et en France tout particulièrement. Le principal facteur limitant la culture en zone septentrionale est l'extrême sensibilité de l'espèce au dépérissement bactérien causé par Pseudomonas syringae et l'absence de traitements phytosanitaires pour lutter contre la maladie. La création de nouvelles variétés d'abricot portant des facteurs de résistance à cette maladie, représente donc un enjeu prioritaire pour assurer la durabilité de la filière.

Dans ce contexte un panel de ressources génétiques et deux populations biparentales (BerBa et GoMo) ont été mobilisés pour étudier la sensibilité tissulaire des rameaux et des feuilles suite à des inoculations contrôlées avec un isolat pathogène de P. syringae pv. syringae (souche 41A) en conditions climatiques naturelles. Les données de phénotypage ont montré (i) qu'il existait des sources de résistance potentielles et (ii) que les composantes de résistance étaient sous contrôle polygénique et fortement influencées par les conditions climatiques.

L'adossement des données de phénotypage sur les données de génotypage disponibles: cartes génétiques basées sur des marqueurs SSR (Single Sequence Repeat) pour les populations bi-parentales et données SNP (Single Nucleotide Polymorphism) issues de re-séquençage pour la collection (76 accessions), ont permis (i) d'identifier des QTL et (ii) de mettre en évidence des associations (264) entre SNP et caractères de sensibilité. Ces données préliminaires demandent encore à être consolidées. Elles permettent néanmoins d'envisager à terme la mise en oeuvre de travaux de Sélection Assistée par Marqueurs (SAM)

Mots-clés: abricotier, chancre bactérien, criblure bactérienne, Pseudomonas syringae, inoculation, vascularisation, rameaux, limbes, Single Sequence Repeat, Single Nucleotide Polymorphism, analyse de liaison, analyse d'association, ressources génétiques, hérédité.

RESUMEN

Entre los cultivos frutales, el albaricoque tiene un desarrollo importante a nivel europeo y muy particularmente en Francia. El factor limitante a dicho cultivo en la zona septentrional es la extrema sensibilidad de la especie a la bacteriosis causada por Pseudomonas syringae y la ausencia de tratamientos fitosanitarios para luchar contra la enfermedad. La creación de nuevas variedades del albaricoque que contengan los factores de resistencia a esta enfermedad representa entonces una problemática prioritaria para asegurar la durabilidad del sector.

En este contexto, un panel de recursos genéticos y dos poblaciones biparentales (Berba y GoMo) fueron movilizados para estudiar la sensibilidad de los tejidos de ramas y hojas gracias a una serie de inoculaciones controladas por una suspensión patógena de P. syringae pv. syringae (cepa 41A) en condiciones climáticas naturales. Los datos fenotípicos muestran (i) que existían potencialmente fuentes de resistencia dentro del germoplasma albericoque y (ii) que los compuestos de resistencia estaban bajo control poligenético y que eran fuertemente influenciados por las condiciones climáticas.

La confrontación de los datos fenotípicos sobre los datos de genotipado disponibles: una carta genética basada en marcadores SSR (Single Sequence Repeat) para las poblaciones biparentales y datos SNP (Single Nucleotide Polymorphism) provenientes de la secuenciación de 76 accesiones dentro de la colección, permitió (i) de identificar los QTL y (ii) de poner en evidencia las asociaciones (264) entre SNP y caracteres de sensibilidad. Sin embargo, estos datos preliminares requieren ser consolidados. No obstante permiten la consideración a futuro de trabajos de selección asistida por marcadores moleculares (SAM).

Palabras clave: albaricoque, bacteriosis, Pseudomonas syringae, inoculación, vascularización, ramas, hojas, Single Sequence Repeat, Single Nucleotide Polymorphism, análisis de enlace, análisis de asociación, recursos geneticos, herencia.

Among the fruit crops, apricot knows an important development at the European level and in France in particular. However its cultivation is limited in the French Rhône valley by the extreme sensitivity to bacterial canker caused by Pseudomonas syringae and by the lack of phytosanitary treatment to prevent the disease. The creation of new varieties of apricot carrying resistance factors for this disease represents therefore, a priority stake for the sustainability of the sector.

In this context, a panel of genetic resources and two parent populations (Berba and GoMo) were mobilized to study tissue sensitivity of branches and leaves after controlled inoculations with a pathogenic isolate of P. syringae pv. syringae (strain 41A) in natural climatic conditions. The phenotyping data showed (i) that there were potential sources of resistance within the apricot germplasm and (ii) that the resistance components were under polygenic control and strongly influenced by the climatic factors.

The association in between the phenotyping datasets and the genotyping datasets (genetic map based on SSR markers (Single Sequence Repeat) for the two-parent and SNP data (Single Nucleotide Polymorphism) issued from the re-sequencing of 76 accessions), allowed (i) to identify QTL and (ii) to highlight associations (264) between SNP and traits of sensitivity. These preliminary data still need to be consolidated. Nevertheless, they open new opportunities based on the integration of the related resistance components through Assisted Selection Markers (SAM) approaches.

Keywords: apricot, bacterial canker, Pseudomonas syringae, inoculation, vascularization, shoots, limbs, Single Sequence Repeat, Single Nucleotide Polymorphism, linkage analysis, association analysis, genetic resources, heredity.

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Liste des espèces de Pseudomonas et des pathovars de P. syringae,

Tableau 2: Phytotoxines produites par différents pathovars de P. syringae et modes

Tableau 3: Représentation synthétique des sensibilités aux bioagresseurs dans une

Tableau 5: Dispositif expérimental mobilisé pour les études de sensibilité à Ps syringae

Tableau 6: Distribution de l'intensité des symptômes de sensibilité des hybrides de la population BerBa suite à une inoculation bactérienne sur rameaux en 2013 et 2014. Les distributions portent sur les moyennes de 5 rameaux testés par individu. Mesures en

Tableau 7: Matrice de coefficient de corrélation de Pearson des variables mesurées sur

Tableau 8: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations des rameaux au sein de la population hybride Bakour x Bergeron (5 répétitions, 224

Tableau 9: Distribution de l'intensité des symptômes de sensibilité de la core-collection (129 individus) suite à une inoculation bactérienne mesurés sur rameaux en 2013 et 2014. Les distributions portent sur les moyennes de 3 rameaux testés par individu.

Tableau 10: Matrice de corrélation de Pearson des variables mesurées sur rameaux

Tableau 11: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations sur

Tableau 12: Distribution des notes de sévérité des symptômes sur feuilles observées après inoculations au sein de la population hybride Goldrich x Moniqui. Les

distributions portent sur les moyennes de 4 feuilles x 4 rameaux par individus. 50

Tableau 13: Matrice de corrélation de Pearson entre les variables mesurées sur feuilles

Tableau 14: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations sur

Tableau 15: Distribution des notes de sévérité des symptômes sur feuilles observées

Tableau 16: Matrice de coefficient de corrélation de Pearson entre les variables

Tableau 17: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations des

Tableau 18: QTLs détectés pour les symptômes de sensibilité bactérienne sur feuilles dans la population hybride Goldrich x Moniqui de 196 individus par Interval mapping

Tableau 19: Caractéristiques du jeu de 16478 SNPs et la position des marqueurs au sein des gènes (76 accessions). La distance moyenne est celle entre deux SNP

Tableau 20: Nombre d'associations marqueurs-caractères significatives avec le modèle

LISTE DES FIGURES

Figure 1: Cycle biologique de P.s percicae sur pêcher (Gaignard and Luisetti, 1993) 10

Figure 2: Le modèle de résistance Zig-zag d'après (Jones and Dangl, 2006) 21

Figure 4: Représentation synthétique des données de sensibilité tissulaire mesurées sur rameaux suite à une inoculation bactérienne - ACP des variables mesurées en 2013 et 2014 sur rameaux au sein de la population BerBa (moyennes par individus des 5

Figure 5: Représentation synthétique des données de sensibilité tissulaire mesurées sur rameaux suite à une inoculation bactérienne - ACP des variables mesurées en 2013 et 2014 sur rameaux au sein de la core-collection (moyennes par individus des 3 rameaux,

Figure 6: Représentation synthétique des données de sensibilité bactérienne mesurées sur feuilles suite à une inoculation bactérienne - ACP des variables mesurées en 2013 et 2014 sur feuilles au sein de GoMo (moyennes de 4 feuilles x 4 rameaux par individus).

Figure 7: Représentation synthétique des données de sensibilité bactérienne sur feuilles - ACP sur l'ensemble des variables mesurées sur feuilles sur la core-collection (125

LISTE DES ABREVIATIONS

ABRIWG : projet ANR de génomique comparative et fonctionnelle de la résistance à la sharka et des besoins en froid chez les arbres fruitiers à noyaux.

CribMoy : note de criblure moyenne des symptômes observés sur feuilles obtenue à partir des notations de 0 à 3 sur feuilles.

CribRegLog : note de criblure observée sur feuilles obtenue à l'aide du modèle de régression logistique multinomiale basé sur les notes de criblure de 0 à 3.

DL : déséquilibre de liaison: association non aléatoire entre des allèles à des loci différents

GLM : General Linear model - Modèle linéaire généralisé GoMo : population biparentale Goldrich x Moniqui

lge : longueur de blessure ouverte issue de l'entaille. Mesure la lésion corticale ouverte

Pseudo-F1: 1ère génération issue de parents qui ne sont pas des lignées pures

Psm: Pseudomonas syringae pv. morsponorum Pss : Pseudomonas syringae pv. syringae

RLM : Régression Linéaire Multinomiale SAM: Sélection Assistée par Marqueurs

SevMed : note de sévérité des symptômes observés sur feuilles reflétant le pourcentage de nécrose réel, basé sur une moyenne de la médiane des classes représentées par les notes de sévérité de 0 à 5.

SevMoy : note de sévérité moyenne des symptômes observés sur feuilles obtenue à partir des notations de 0 à 5.

SevRegLog : note de sévérité observée sur feuilles obtenue à l'aide du modèle de régression logistique multinomiale basé sur les notes de sévérité de 0 à 5.

INTRODUCTION GENERALE

Parmi les Prunus l'abricotier est une espèce présente dans des régions très variées, des régions froides et humides d'Amérique du Nord aux régions chaudes et sèches du Maghreb. Cependant, des contraintes biotiques et abiotiques contraignent la culture dans des zones très limitées où les panels variétaux restent restreints, tel est le cas en France et notamment dans la vallée du Rhône. Le dépérissement bactérien causé par Pseudomonas syringae fait partie des contraintes biotiques majeures pour la culture qui s'expriment préférentiellement en zone à hiver froid.

Pour pallier les problèmes de la culture et donner la possibilité d'un élargissement du panel variétal, l'INRA a initié un programme d'amélioration génétique depuis 40 ans, il s'est intensifié depuis les années 1980. Dans un premier temps son objectif était d'implémenter les gammes variétales afin d'étendre la période de production vers la précocité et la tardiveté, d'assurer une bonne qualité organoleptique et technique en termes de présentation (calibre, couleur), de saveur, d'arôme, d'évolution après récolte et de résistance au transport. Aujourd'hui les enjeux de durabilité du verger en lien notamment avec les contraintes phytosanitaires conduisent à prioriser la sélection des variétés résistantes aux parasites majeurs de la culture; le chancre bactérien, la sharka, le monilia et l'enroulement chlorotique.

C'est dans ce contexte que se situe ce projet dans lequel nous nous proposons d'étudier l'hérédité du caractère de résistance au dépérissement bactérien en axant notre travail sur le comportement de descendances biparentales issues de géniteurs aux comportements contrastés (sensibles et résistants), relativement aux parents, ainsi que sur le comportement d'une collection de ressources génétiques. Tout l'enjeu et la difficulté de cette approche réside dans le fait de disposer de méthodes d'évaluation phénotypiques précises, discriminantes et reproductibles, sans perdre de vue que les paramètres sont liés à des phénomènes biologiques complexes, méconnus et fortement influencés par les conditions climatiques. Pour ceci, un protocole d'inoculation et de phénotypage a été développé en exploitant les résultats des travaux antérieurs réalisés en conditions de contrôlées en verger. Sur ces bases notre projet s'est consacré à l'étude de la variabilité génétique de la sensibilité de l'abricotier aux Pseudomonas au sein de

descendances hybrides en ségrégation et dans une collection de ressources génétiques. Deux mécanismes ont été abordés : la réaction tissulaire de rameaux en lien avec les mécanismes de vascularisation, et les réactions locales suite à des lésions locales sur limbes. Puis, les données de phénotypage acquises ont étés mises en relation avec les données de génotypage disponibles afin d'identifier les régions du génome concernées. Si ces approches devaient être concluantes, elles devraient permettre de déployer une stratégie de Sélection Assistée par Marqueurs et d'augmenter ainsi l'efficacité des programmes de sélection.

ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE

ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE 1. L'abricotier, Prunus armeniaca

1.1 Description taxonomique et botanique de l'espèce

L'abricotier appartient à la famille des Rosacées, sous-famille Prunoidea, au genre Prunus L. et au sous-genre Prunophora. Les abricotiers les plus cultivés appartiennent à l'espèce Prunus armeniaca L. (Armeniaca vulgaris Lam.). D'autres espèces apparentées sont P. brigantiaca Vill. (prune alpine), P. ansu Komar (abricot Ansu), P. mume Sieb et Zucc. (abricot japonais), P. sibirica. L. (abricot sibérien), P. mandshurica (Maxim.) Koehne (abricot Mandchourien), et P. dasycarpa Ehrh. (abricot noir).

D'origine allogame, l'abricotier est une espèce diploïde à 8 paires de chromosomes (2n = 16), son génome de petite taille (294Mbp/n), fortement hétérozygote, dépasse légèrement celui de pêcher (290 Mbp/n) considéré comme l'espèce modèle pour les études de génomique chez les Prunus (Baird et al., 1994).

La base de données publique et internationale Genbank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov) réunit les séquences nucléotiques de plus de 55 000 organismes. Concernant l'abricotier, 5102 séquences nucléotiques et 192 séquences protéiques étaient enregistrées dans Genbank au 12 novembre 2003, elles proviennent de différents laboratoires de recherche, de programmes de séquençage systématique d'ADNc (EST ou Expression Sequence tag) et des programmes de séquençage physique des génomes (Benson et al., 2000).

1.2 Origine et aires de répartition

Vavilov (1951) indique trois centres d'origine de l'abricotier. Dans ces centres, les régions les plus importantes sont:

c) Le centre Asiatique, comprenant la région montagneuse qui s'étend du sud de Tien-Shan, y compris de l'HinduKush, au Cachemire.

1.3 Diversification variétale

Les travaux réalisées par Kostina (1969) et Zohary et Spiegel Roy (1975) ont conduit sur la base des caractères phénotypiques, à la classification des variétés en 4 groupes éco-géographiques et 13 sous-groupes régionaux au sein de l'espèce P.armeniaca :

Plus récemment, l'utilisation des marqueurs moléculaires, dans le cadre d'études sur la diversité génétique, a permis d'identifier six phylogroupes. Le phylum européen se structure alors en trois sous-groupes : groupe Sud et Nord Europe et un groupe d'adaptation géographique, intégrant les variétés issues de programme d'amélioration variétale (Hagen et al., 2002).

Bien que l'abricotier soit caractérisé par une large gamme de variétés, en France, la culture, localisée à 90% dans le quart sud-est du pays, s'appuie sur un nombre restreint de variétés attachées à des régions très limitées. En effet, la production repose principalement sur une variété qui représente près de 50% des surfaces cultivées : `Bergeron'.

1.4 Importance économique de la culture

L'abricotier (Prunus armeniaca L) est l'une des espèces fruitière à noyau caractéristique du bassin méditerranéen. Elle est considérée comme la troisième espèce fruitière à noyau en volume après le pêcher et prunier (FAOSTAT, 2012).

La production mondiale de l'abricotier était d'environ 3,9 millions de tonnes en 2012, dont 50% correspondant au bassin méditerranéen. La superficie mondiale occupée par l'abricotier est de 492,196 ha en 2012, avec un rendement moyen de 8 tonne/ha.

La Turquie est le premier pays producteur mondial avec une production de 676,131 tonnes (FAOSTAT, 2012).

En France, cette superficie est de 13,778 ha donnant une production de 189,711 tonnes. La vallée du Rhône est la principale région de production française avec près de 50% de la production nationale, soit un potentiel de production de l'ordre de 80 000tonnes annuel. La culture est en expansion, et elle se développe au dépriment du pêcher, du fait des problèmes économiques et sanitaire liés à la sharka.

1.5 Contraintes biotiques et abiotiques

L'abricotier est aujourd'hui la principale culture de la vallée du Rhône, elle est cependant confrontée à des problèmes sanitaires majeurs qui la mettent en danger. Les maladies les plus préoccupantes sont:

- d'origine bactérienne telle que le chancre bactérien ou dépérissement bactérien dont l'importance diffère selon les années et les dégâts sont renforcés lors d'hiver froids et humides, et les criblures bactériennes dues à Xanthomonas arboricola pv pruni.

- des maladies à virus comme la sharka (maladie de quarantaine) et à phytoplasmes comme l'enroulement chlorotique de l'abricotier « E.C.A ».

- des maladies cryptogamiques telles que le monilia, principale cause d'irrégularité de la production de l'espèce au niveau mondial.

A cela s'ajoute des maladies de statut secondaire comme l'oïdium, la rouille sur les feuilles et des maladies du sol comme les pourridiés et le verticilium (Gilbert et al., 2009).

2. Le chancre bactérien

La maladie a été décrite dans les années 60, suite au développement rapide de nouvelles plantations. Tout d'abord signalée en verger de pêcher dans la vallée du Rhône, elle est certainement la première cause de dépérissement du verger d'abricotier en Drôme-Ardèche.

2.1 Agent causal

L'agent causal est une bactérie du genre Pseudomonas, qui se caractérise par un chromosome circulaire entre 5,9 et 6,5 Mbp. Globalement, le génome contient environ 5000 gènes dont un minimum 30% sont spécifiques aux pathovars (Baltrus et al., 2011; Buell et al., 2003; Green et al., 2010).

Elle colonise les surfaces et les tissus végétaux de la plante hôte. En se basant sur la pathogénicité et la gamme des plantes hôtes, Pseudomonas syringae, l'agent pathogène responsable de la maladie du chancre bactérien (Preston, 2004), regroupe 50 pathovars (Young, 2010) signalés sur 180 espèces dans le monde (Kaluzna et al., 2010). Chez les arbres fruitiers six pathovars pathogènes ont été identifiés (tableau 1).

L'étude du chancre bactérien a été initiée en Pologne par Brzezinski (1902) qui a déterminé que la gommose et le dépérissement du pêcher, de l'abricotier, du prunier, et du cerisier était d'origine bactérienne. En même temps en Hollande, Van Hall (1902) décrit l'agent causal de la brûlure bactérienne du Lilas comme Pseudomonas syringae.

Plus tard, la position taxonomique de P. syringae et P. morsprunorum a été changée après la révision des statuts des bactéries pathogènes. La classification récente des pathovars de P. syringae déterminée par hybridation d'ADN a montré que P. syringae pv. syringae (Pss), P. syringae pv. morsprunorum (Psm) race 1 et race2 sont des agents pathogènes génétiquement distincts adaptés aux mêmes plantes hôtes (Bultreys and Kaluzna, 2010) .

P. syringae est caractérisé par une grande variabilité génétique, physiologique et biologique que certains auteurs expliquent par les nombreuses combinaisons possibles en fonction des conditions de climat, sol, et méthode de culture (Roos and Hattingh, 1987b).

L'abricotier (Prunus armeniaca L.), le pêcher (P. persica), le prunier (P. domestica L.) peuvent être sévèrement attaqués par trois bactéries : Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss), Pseudomonas syringae pv. monorsprunorum (Psm), et Pseudomonas viridiflava (Prunier and Cotta, 1985). Cette dernière bien qu'on lui ait attribué un nom d'espèce, fait partie du complexe P. syringae (Gardan et al., 1999; Young, 1991). Au sein des Pseudomonas syringae pv. monorsprunorum (Psm), il a été déterminé deux races : P. syringae pv monorsprunorum race 1 et P. syringae pv. Monorsprunorum race 2 (Freigoun and Crosse, 1975; Vicente et al., 2004).

Une étude menée en Turquie sur l'abricotier montre que sur 53 isolats de P.syringae, 42 isolats était identifiées comme Pss et 11 comme Psm (Donmez et al., 2010; Kennelly et al., 2007). (Crosse and Garrett, 1966; Kennelly et al., 2007) ont identifié que la souche Pss était plus pathogène pour l'abricotier tandis que Psm était plus pathogène sur le cerisier (Latorre and Jones, 1979).

Tableau 1: Liste des espèces de Pseudomonas et des pathovars de P. syringae, rencontrées chez les arbres fruitiers

P. syringae est un bacille à gram négatif, aérobie strict, pathogène fluorescent, capable de se déplacer grâce à ses flagelles polaires. La plupart des espèces de ce genre sont ubiquistes, et peuvent coloniser une grande variétés de niches écologiques et microclimatiques, en exprimant des symptômes de gravité variable (Kaluzna et al., 2010). Ces Pseudomonas présentent des molécules qui peuvent être des antigènes (Samson and Saunier, 1987), dont la connaissance est à la base de la discrimination des pathovars.

L'espèce P. syringae possède trois propriétés importantes: un pouvoir pathogène, un pouvoir glaçogène, et une aptitude à la vie épiphyte.

Pseudomonas syringae est un germe ubiquiste et pathogène de nombreuses plantes mais sa principale caractéristique est une présence épiphyte à la surface d'un très grand nombre de plantes hôtes; il y constitue alors des populations qui sont particulièrement abondantes au printemps (Hirano and Upper, 1990). Cette aptitude à coloniser la surface des organes aériens des plantes et à s'y multiplier conduit à des populations

bactériennes élevées, essentielles pour l'initiation de l'infection, et forment un réservoir d'inoculum (Gaignard and Luisetti, 1993).

Le cycle de la maladie du chancre bactérien comporte des phases d'hiver et d'été (Cameron, 1962). Durant la phase hivernale, les bactéries sont présentes sur l'écorce des tiges et des branches alors que durant l'été, les bactéries occupent les tissus verts (les feuilles, les fleurs et les pousses) (Crosse, 1966). Le cycle de P.s pv persicae proposé par Luisetti est décrit dans la figure 1.

C'est avec les travaux de Crosse (1959) que l'on commence à considérer la feuille comme un habitat pour les micro-organismes, à parler de phyllosphère (habitat localisé à la surface des feuilles et dans les espaces intercellulaire) et de vie épiphyte (population résidentes à la surface des feuilles dont la croissance est associée aux tissus sains de la plante). Afin de se protéger de la dessiccation, des rayons UV et des radicaux libres, les P. syringae peuvent former des agrégats par l'intermédiaire de structures extracellulaires comme des exopolysaccharides (EPS tel que l'alginate).

Figure 1: Cycle biologique de P.s percicae sur pêcher (Gaignard and Luisetti, 1993)

Le pouvoir pahogène traduit une spécificité d'hôte liée au pathovar considéré, sauf pour le pathovar syringae dont la gamme d'hôte est actuellement contestée. En effet, l'adaptation à de nombreuses espèces végétales, à des environnements différents, résulte d'une sélection permanente, en réponse à la pression du milieu, favorisant l'apparition de sous-populations (écotype, pathotypes).

Une fois que P. syringae a colonisé la surface extérieure de la plante, la bactérie pénètre les espaces intercellulaires par des lésions ou des ouvertures naturelles. Le pouvoir pathogène de P. syringae s'exprime alors suivant deux processus: la sécrétion de protéines effectrices à l'intérieur des cellules des plantes hôtes afin de moduler les fonctions de la plantes, et/ou la production d'exopolysaccharides, de phytotoxines, de phytohormones et d'enzymes dégradant les parois cellulaires.

La réussite de l'infection est fonction de la quantité de l'inoculum, du niveau de sensibilité de la plante au moment de la pénétration et des conditions environnementales (Young, 1991). A une phase épiphyte succède une phase pathogène et réciproquement. Des études ont ainsi montré qu'il y avait une relation entre le nombre de bactéries de P.s pv syringae présentes à la surface des organes aériens du maïs et l'intensité des dégâts de gel. Des analyses (Luisetti et al., 1991) sur vigne ont également montré que les dégâts dus au gel étaient plus intenses lorsque le nombre de P.s pv syringae augmentait.

La production de toxine apparait être également un élément important du pouvoir pathogène. La virulence de P.s pv syringae est attribuée d'une part aux nécroses au niveau des fleurs, branches, des bourgeons et des feuilles induites par une toxine, connue sous le nom de syringomycine (antibiotique) (Bender et al., 1999; Quigley and Gross, 1994). En effet des inoculations avec cette toxine pour des concentrations variables sur des bourgeons de pêcher (Sinden et al., 1971) ont donnés des symptômes similaires à ceux de l'inoculation avec la bactérie. Il semble que la syringomycine produite par P.s pv syringae, perturbe les fonctions physiologiques localisées au sein des membranes plasmiques des cellules hôtes via des flux H⁺,Ca2⁺ et K⁺ (Gross and Cody, 1985; Zhang and Takemoto, 1987), avec la perturbation du gradient pH de la membrane plasmique, l'acidification cytoplasmique, et la création d'un environnement riche en nutriment pour la bactérie, initiant la mort cellulaire (Bender et al., 1999;

Quigley and Gross, 1994). Outre son effet perturbateur, la syringomycine facilite la diffusion des bactéries à la surface des plantes par la diminution de la tension superficielle de l'eau (Bender et al., 1999). Bien qu'elle soit un important facteur de virulence, la syringomycine peut non seulement induire l'exsudation de métabolites par la plante sans pour autant créer de maladie, mais elle agit comme un biosurfactant (composé actif qui favorise l'humidification, la solubilisation et l'émulsion de composés organiques) régulant la disponibilité en eau pour la bactérie (Lindow and Brandl, 2003).

Trois facteurs importants sont impliqués dans la synthèse de la syringomycine : la reconnaissance des signaux de plantes par les bactéries, l'induction des gènes impliqués dans la production de syringomycine (six gènes étroitement liés, dans un cluster, sont impliqués dans la synthèse (syrB1, syrB2, syrC, et SyrE), la sécrétion (syrD), la régulation (syrP) de la syringomycine), et la sécrétion de cette phytotoxine (Quigley and Gross, 1994). En effet, l'activation de la production de cette toxine se produit dans les molécules de signalisation de la plante, telles que les glycosides phénoliques, qui sont présentes dans les feuilles, les écorces, les fleurs et les plantes sensibles à l'infection par P. syringae pv. syringae. De plus, cette production de syringomicine est améliorée en présence de sucres, en particulier le saccharose et le fructose. Dans le cas du cerisier, les feuilles possèdent deux glycosides de flavonol, et un glycoside de flavanone, tandis que de grandes quantités de saccharose et le fructose sont aussi présents. La grande disponibilité de ces molécules de signalisation de la plante, et leur implication dans la production de syringomycine, peut expliquer la sensibilité de la cerise à P. syringae pv. syringae (Bender et al., 1999).

Cette toxine contribue significativement au niveau de la virulence de la bactérie, ainsi (Luisetti, 1983) a démontré que l'agressivité de P.s pv persicae était corrélée avec leur aptitude à produire des toxines. Les toxines produites par P. syringae appartiennent à différentes familles et sont issues de voies de synthèse diverses :

Tableau 2: Phytotoxines produites par différents pathovars de P. syringae et modes d'action (Bender et al., 1999)

a incluant les toxines relatives comme la syringotoxine, la syringostatine, et la pseudomycine.

Certaines espèces du genre Pseudomonas, dont P. syringae, P. viridiflava et P. fluorescens peuvent être glaçogènes, c'est-à-dire avoir la capacité d'augmenter la température du point de congélation de l'eau dans les tissus (Hirano and Upper, 2000), provoquant ainsi la rupture de la paroi cellulaire végétale et permettant la colonisation des tissus (Scortichini, 2010). Cette capacité est fréquente pour les souches épiphytes du pathovar syringae mais n'a jamais été rencontrée au sein du pathovar morsprunorum race 1 (Mittelstädt and Rudolph, 1998). Cette propriété est considérée comme un des facteurs favorisant les premières phases de l'infection bactérienne.

Dans cette catégorie avec une activité de prise en glace (ou INA pour Ice Nucletation Activity) (Gross et al., 1984), on trouve la majorité des pathovars de l'espèce P.syringae dont P. syringae pv syringae. La majorité (80%) des souches de P. syringae pv syringae isolées en France ont une activité glaçogène à une température de -5°C.

2.2 Dégâts économiques

Plusieurs épidémies provoquées par P. syringae ont été recensées dans le monde, créant de nombreuses pertes économiques. Ces impacts économiques sont en augmentation constante. Ils sont causés par la réémergence d'anciennes maladies telles que la moucheture bactérienne de la tomate, et l'émergence de nouvelles maladies telle que (i) le chancre bactérien sur kiwi découvert en 2010 et 2011 en France et en Italie et qui est en train de dévaster la production en Nouvelle Zélande, ainsi que (ii) le « bleeding canker » chancre de châtaignier (Mansfield et al., 2012).

En France, quatre départements de la région Rhône-Alpes ont été affectés en 1968 et 1969. Suite aux conditions climatiques favorables à la maladie, des dégâts considérables allant jusqu'à la perte de vergers entiers ont été notés chez l'abricotier au cours des années 1996, 1997 ainsi qu'en 2000, 2004, 2005, 2008, 2009 et 2010 en Vallée du Rhône.

Le chancre bactérien est la maladie la plus importante des arbres fruitiers à noyau en Afrique du sud, causant des dégâts annuels de 10 million de US$ (Hattingh et al., 1989) et de 8 millions de US$ en Oregon pour les arbres ligneux (Scheck et al., 1996). Des études effectuées par Kotan et Sahin (2002) ont montré que durant les années 1999 et 2001, 80% des vergers d'abricotier ont été touchés par le chancre bactérien en Turquie dans les provinces de Erzurum, Erzincan et Artvin et 20% dans la province de Malatya (Donmez et al., 2010).

En Pologne, vu les conditions climatiques favorable, la maladie est observée pratiquement chaque année (Bultreys and Kaluzna, 2010).

2.3 Symptômes

Les symptômes induits par l'ensemble des pathovars de P. syringae sont semblables à quelques exceptions près et bien reconnaissables tout spécialement au début de l'infection.

Au nord de la France, les premières observations de la maladie sur cerisier datent des années 1965 (Vigouroux, 1968), les symptômes étaient caractérisés par la présence de chancre de l'écorce, tout le long du tronc et par une exsudation de gomme. Un brunissement étendu du xylème a été observé et le chancre peut encercler le tronc ou les

branches provoquant un dépérissement des extrémités. Un autre symptôme est la destruction des bourgeons et la mort des arbres (Menard et al., 2003).

P. syringae cause deux types de maladies chez les arbres ligneux (Agrios, 2005);

1 - celles dont les symptômes se limitent aux tissus parenchymateux, dans ce cas le pathogène ne se déplace pas dans le système vasculaire de l'hôte, causant des tâches au niveau des feuilles et des fruits (Bedford et al., 1988; Destefano et al., 2010), des nécroses apicales, le dépérissement des pousses (terminales), ainsi qu'une excroissance sur feuilles (nécroses parfois entourées d'un halo chlorotique évoluant ou non en criblure), jeunes pousses et charpentières. Cette infection localisée cause rarement la mort de l'arbre, et la perte est due généralement limitée à des dégâts des fleurs et de la production photosynthétique (Lamichhane et al., 2014). L'organe peut ensuite pourrir, dans le cas d'association avec P.s viridiflava, comme chez le kiwi (Luisetti and Gaignard, 1987).

2 - celles dont les symptômes sont systémiques, dans ce cas l'agent pathogène se déplace dans le système vasculaire de la plante notamment chez les arbres à feuilles caduques. Ces maladies vasculaires sont généralement dévastatrices causant des symptômes tels qu'un flétrissement brusque (Scortichini, 2002), la présence du chancre sur les tiges, les branches et les troncs, et une production d'exsudats et de gommose (Kennelly et al., 2007; Scortichini et al., 2012).

En tenant compte de la phénologie des arbres à feuilles caduques, le risque d'infection par P. syringae peut être élevé étant donnée l'abondance des portes d'entrée de cette bactérie (tissus tendres et ouvertures naturelles au système vasculaire). Cette bactérie est à la fois à l'origine de stress lié au gel et aggrave les dégâts de gel par invasion ultérieure des tissus végétaux, conduisant à la mort des plants (Nejad et al., 2004).

2.4 Epidémiologie

En phytopathologie, l'épidémiologie concerne la dispersion de la maladie dans le temps et dans l'espace et la survie de l'agent pathogène dans l'environnement. La gestion et le contrôle des dégâts, nécessitent la connaissance de l'agent pathogène, de son cycle de vie et de son mode de colonisation. Ainsi les facteurs biotiques, et abiotiques jouent un

rôle important dans l'épidémiologie. Il a ainsi été signalé la corrélation entre la teneur en eau des arbres, l'effet d'exposition à la température de congélation et les nécroses causés par P. syringae chez l'abricotier (Klement et al., 1974), le cerisier, et le pêcher (Vigouroux, 1999).

Généralement, les populations épiphytes, les infections latentes, les sites d'hivernage dans les plantes hôtes ainsi que la présence du couvert végétal des vergers représentent autant de réservoirs de P. syringae. En effet, la propagation de la maladie dans le monde est probablement causée par le semis de graines contaminées pour les cultures annuelles et par la propagation de parties végétatives contaminées par les arbres ligneux, ce qui représente une importante source d'inoculum (Tarkowski and Vereecke, 2013). Mais la dissémination de la bactérie se fait essentiellement par le vent et la pluie (Agrios, 1997). Leur dissémination est largement liée au cycle de l'eau (Morris and Sands, 2012) ce qui explique comment l'agent pathogène se propage sur de grandes distances. Riffaud et Morris (2002) ont aussi suggéré de prendre en compte les bassins de rétention d'eau d'irrigation comme sources d'inoculum, suite à la détection de P.syringae pv. aptata. Sur haricot et sur soja, des études ont démontré que l'inoculum pouvait se disséminer de proche en proche par les éclaboussures de la pluie (phénomène de « splashing ») et par le vent. Roos et Hattingh (1987a) ont démontré que Ps. pvmorsprunorum se multiplie dans les chambres sous-somatiques des feuilles de cerisier et pénétre dans les tissus du mésophylle avant d'être vascularisé.

Contrairement aux champignons pathogènes, les bactéries phytopathogènes ne sont pas capables de générer leurs propres portes d'entrées (Agrios, 2005). En effet, les portes d'entrée (ouvertures) naturelles (lenticelles, stomates et trichomes) ainsi que les blessures causées par des facteurs biotiques (hommes, insectes) et abiotiques (gelé) sont les principales portes d'entrée jusqu'alors identifiées (Agrios, 2005).

Les agents pathogènes vasculaires utilisent un grand nombre de portes, y compris les ouvertures naturelles et des lésions (Crosse, 1966; Kennelly et al., 2007). Les lésions sur les tissus ligneux permettent un accès direct au système vasculaire et sont les portes les plus accessibles par les agents pathogènes vasculaires tandis que les ouvertures naturelles ne sont pas toujours exploitées par les différents agents pathogènes P.

syringae de plantes ligneuses. Il semble qu'il y ait une relation entre les portes d'entrée et les symptômes causés par des pathogènes vasculaires P. syringae. Pour le cerisier (Garcia et al., 2003) et le marronnier (Green et al., 2009), le rôle des lenticelles sur les rameaux et les charpentières comme portes d'entrée a été démontré. En effet, les lésions à proximité de lenticelles sont apparues lorsque les tiges de marronnier d'Inde ont été inoculées par pulvérisation (Green et al., 2009). Sur la noisette comme chez le pêcher, Pseudomonas syringae pénètre à travers les cicatrices foliaires et des lésions sur les tissus ligneux (Psallidas, 1993; Scortichini, 2002) permettant un accès direct du pathogène au système vasculaire.

Bien que les cicatrices foliaires soient l'une des principales portes d'entrée pour P. syringae, sur cerisier et prunier, elle n'est pas systématique notamment dans le cas de températures chaudes en particulier (Cao et al., 2013).

2.5 Sensibilité variétale

Les influences écologiques sur l'apparition et la gravité de la maladie peuvent être nombreuses. Citons l'uniformité génétique et la sensibilité de la culture qui peuvent engendrer une colonisation rapide et la propagation de l'agent pathogène sur de grandes surfaces.

La grande sensibilité de certains cultivars d'abricots récemment introduits semble un facteur principal dans l'amélioration de l'agressivité du Pss (Scortichini, 2010). En fait, les variétés Aurora, Lady Elena, Orange Ruby, Manicot, Sweetcot, Lillycot et Orangecot sont particulièrement endommagées par le chancre bactérien dans les vergers nouvellement plantés et plus généralement en région méditerranéenne (Scortichini, 2006). La variabilité génétique ainsi que l'intensité de la production semblent avoir un effet moyen sur l'épidémiologie des maladies des plantes ligneuses causées par P. syringae. Un exemple récent est celui du chancre bactérien du Kiwi qui révèle que la culture d'une gamme étroite de diversité menace la durabilité de la résistance des plantes (Ferguson, 1999). La culture d'une variété commerciale, représentant de plus de 80% de la production de kiwi cultivé dans le monde, a ainsi mis en péril l'industrie du kiwi en entier (Scortichini et al., 2012).

2.6 Sources de résistance

Chez les plantes ligneuses, et spécialement les Prunus il est assez commun d'observer des périodes dites « résistantes ». Ces périodes qui coïncident avec les périodes de forte activité méristématiques sont caractérisées par la production de tissus péridermique d'origine subéreuses autour des tissus affectés par la maladie ce qui limite les infections et bloque la progression de la maladie (Crosse, 1966). Des exemple de résistance acquise après une agression bactérienne sur concombre et sur tabac et s'apparentant à une réaction d'immunité ont été cités par (Sequeira, 1983). En effet, la réaction d'hypersensibilité provoque chez certaines plantes, l'apparition d'une résistance à une seconde infection. L'introduction de cette résistance, déclenchée par des protéines effectrices produites par P.s syringae (Greenberg and Vinatzer, 2003), s'accompagne de l'apparition de nouvelles protéines solubles (protéines b, appelées aujourd'hui protéines PR pour Pathogenesis Related) produites par les plantes.

L'existence d'une résistance variétale a été mise en évidence chez le cerisier; 83% de ces cultivars sont résistants à la race 1 de P.s pv morsprunorum alors que seulement 32% le sont pour la deuxième race (Garrett, 1978). Chez les variétés d'abricotier, Early Blush® Rutbhart, qui est sensible à la maladie, la résistance se manifeste par la mort des jeunes rameaux, et par blocage de la vascularisation du chancre vers les rameaux plus âgés ou vers les charpentières. Par contre chez la variété tunisienne « Bakour », les études préliminaires ont montré qu'il s'agit d'une résistance (tableau 3) polygénique qui ralentirait la diffusion des bactéries dans les rameaux inoculés. Des études de la sensibilité variétale au chancre bactérien conduites en verger ont permis de révéler l'absence de mortalité de branches chez Bakour, après inoculation.

Tableau 3: Représentation synthétique des sensibilités aux bioagresseurs dans une collection variétale d'abricotiers (Brun L et al., 2011)

2.7 Mécanismes de résistance:

L'amélioration de la résistance des plantes cultivées aux parasites constitue un objectif majeur de la plupart des programmes de sélection génétique. Une bonne connaissance et une conservation adéquate des ressources génétiques, associées à une gestion raisonnée des gènes de résistance identifiés, apparaissent comme des éléments clefs dans la poursuite de cet objectif.

Parmi les mécanismes de résistance des plantes aux micro-organismes, la « résistance non hôte » est la situation la plus commune. Elle met en jeu divers mécanismes (i) constitutifs dont les barrières physico-chimiques qui empêchent la pénétration du pathogène ou (ii) inductibles de diverses natures qui impliquent des peptides, des protéines, et autres métabolites dont les saponines qui dégradent les stérols membranaires des micro-organismes (Osbourn, 1996).

La plante réagit très tôt à la tentative d'invasion des agents pathogènes. Les mécanismes de défense induits chez le végétal se caractérisent par un bouleversement du métabolisme. On note ainsi la synthèse ou l'augmentation de la synthèse de molécules constitutives ou non de la plante, pouvant entrainer des modifications morphologiques visant essentiellement à empêcher ou à stopper la colonisation du pathogène. Plusieurs mécanismes de défense sont mis en place au moment de l'infection ou de l'élicitation.

Facteurs génétiques influençant la résistance des plantes: s Coévolution des deux adversaires:

Le modèle Zig-Zag, représente de manière schématique l'évolution simultanée des protéines végétales et des protéines bactériennes, au cours du temps, ainsi que leurs conséquences pour la plante : résistance ou maladie (Jones and Dangl, 2006) (figure 2). Les plantes peuvent détecter des motifs conservés chez les agents pathogènes (appelés PAMPs) via les récepteurs membranaires (Zipfel and Felix, 2005), et mettre en place la résistance basale (PTI, PAMP-Triggered Immunity). Un des exemples les plus étudiés concerne la reconnaissance de la flagelline, constituant principal du flagelle bactérien. Chez Arabidopsis, la perception se fait via FLS2 (Flagellin Sensing 2), un récepteur PRR (Pattern Recognition Receptor). FLS2 présente les caractéristiques d'un récepteur-kinase: domaine LRR extracellulaire potentiellement impliqué dans les interactions protéine-protéine, domaine transmembranaire et domaine Ser/Thr kinase cytoplasmique. L'activation de FLS2 induit alors la production d'espèces réactives de l'oxygène, le déclenchement de cascades d'activation de MAP kinases ou encore l'activation de gènes de défense (Asai et al., 2002; Zipfel et al., 2004) .

La reconnaissance des PAMPs par la plante aboutit donc à une résistance appelée PTI (PAMP-Triggerd Immunity). Celle-ci peut être contournée par les bactéries

phytopathogènes via l'injection d'effecteurs dans la cellule de la plante hôte, résultant en une sensibilité de la plante (ETS, Effector-Triggered Susceptibility). La plante développe alors à son tour, une protéine de résistance (R) qui reconnaît l'un de ces effecteurs et qui déclenche la résistance spécifique, souvent accompagnée d'une HR (ETI, Effector-Triggered Immunity). Enfin, au cours de l'évolution, les pathogènes modifient l'effecteur reconnu par la plante et gagnent éventuellement d'autres effecteurs afin de contourner la surveillance mise en place par la plante. Chez la plante, la sélection favorise de nouveaux allèles de gènes R, capables de reconnaître ces nouveaux effecteurs, résultant en une résistance spécifique.

Figure 2: Le modèle de résistance Zig-zag d'après (Jones and Dangl, 2006)

Le système de sécrétion de type III (Type Three Secretion System, TTSS) est le plus fréquemment employé par les bactéries phytopathogènes pour l'injection d'effecteurs (Alfano and Collmer, 2004; Buttner and Bonas, 2002; He et al., 2004; Yip and Strynadka, 2006). Il s'agit d'un complexe multiprotéique assemblé sous la forme d'une «seringue» transmembranaire, qui permet l'injection de protéines bactériennes, appelés effecteurs de type III, directement à l'intérieur de la cellule de l'hôte. Le TTSS et les protéines injectées sont donc essentiels pour la multiplication de la bactérie dans les tissus végétaux et le développement de la maladie (Bender et al., 1999; Buttner and

Bonas, 2002; Kjemtrup et al., 2000). Deux grands rôles peuvent être attribués à ces effecteurs : participer à la libération de nutriments favorisant le développement de l'agent pathogène, ou interférer avec le métabolisme de la plante pour inhiber ses mécanismes de défense (Abramovitch and Martin, 2004; Truman et al., 2006). Afin d'assurer un bon développement de l'agent pathogène dans la plante hôte, les effecteurs bactériens ciblent fréquemment des protéines végétales impliquées dans les voies de transduction du signal menant à la résistance. La figure 3 montre un exemple de différents évènements de signalisation se déroulant dans la plante hôte et étant ciblés par certains effecteurs de Pseudomonas syringae (Boller and He, 2009).

Ces gènes sont très variables. D'une espèce à l'autre les protéines Avr ne présentent pas entre elles de similitudes de séquence. Le gène Avr lui-même peut être reconnu par R, par exemple pour le couple AvrPto, et AvrPtoB de Pseudomonas syringae avec les protéines Pto, Api2, Api3, et Api4 de la tomate (Bogdanove and Martin, 2000; Kim et al., 2002; Tang et al., 1996). Il est aussi envisagé que le produit du gène Avr s'associe à un ligand et que le complexe formé soit reconnu par le produit du gène R correspondant tel le cas de l'interaction entre AvrRpm1 de Pseudomonas syringae avec Rin4 d'Arabisospsis thaliana qui à son tour se lie avec Rpm1. La pérennité des gènes Avr réside dans leur ambivalence ; il a été démontré qu'ils avaient un effet positif sur la virulence chez des plantes hôtes qui ne possèdent pas le gène R correspondant (Kjemtrup et al., 2000).

Des approches de ciblage génétique et bioinformatique suggèrent que les effecteurs de P. syringae sont localisés au niveau des chloroplastes et des mitochondries des cellules hôtes (Guttman et al., 2002), ceci est probablement le résultat de l'origine commune, des mécanismes du système de sécrétion de type III chez les chloroplastes, et les mitochondries. Ces chloroplastes ont montré une ultrastructure modifiée durant l'infection par P. syringae (Levine et al., 1996), ce qui peut être important pour l'arrangement du développement des symptômes. En outre, les chloroplastes sont le site de synthèse de l'acide salicylique, le signal de défense, donc il est vraisemblable que

certains effecteurs ciblent les chlorophylles, et altèrent la production d'acide salicylique et/ou autres aspects de ses fonctions.

Selon le modèle de Flor, les plantes possèdent des protéines de résistance capables de reconnaître un ligand, puis de transmettre un signal associé afin d'initier les réponses de défense (Flor, 1971). Les premières protéines R ont été identifiées sur la base de leur fonction, elles sont nécessaires à la résistance d'un génotype donné à une race d'agent pathogène donnée, et leur absence rend la plante correspondante sensible.

Malgré le large spectre de résistance assuré par les protéines R (résistance aux bactéries, champignons, oomycètes, virus, insectes et nématodes), celles-ci peuvent être classées en seulement cinq grandes classes sur la base de critères structuraux (Dangl and Jones, 2001) :

Le modèle génétique le plus simple d'interaction entre les facteurs d'avirulence (Avr) et les produits des gènes de résistance (R) est le modèle «gène-pour-gène»(Flor, 1971).

Ce modèle prédit que la résistance spécifique ou `race-cultivar' se caractérise par l'action concertée de deux gènes dominants : le gène de résistance (R) chez la plante et le gène d'avirulence (Avr) spécifique correspondant chez l'agent pathogène. Lorsque

les deux gènes sont présents et fonctionnels, l'agent pathogène ne peut pas se développer, l'interaction est dite incompatible, dans tous les autres cas, la maladie se développe. En raison des similarités de structure entre les protéines R et les récepteurs, la reconnaissance R/Avr a longtemps été expliquée, au niveau biochimique, par un modèle de type Récepteur-Ligand. Cependant, malgré une recherche active pour valider ce modèle, une interaction physique directe entre un facteur d'avirulence et une protéine de résistance n'a pu être démontrée que dans un nombre très limité de cas. Ainsi on peut citer deux exemples : la protéine de résistance Pita interagit avec le facteur d'avirulence AvrPita dans le pathosystème Riz/Magnaporthe grisea (Jia et al., 2000), et RRS1 interagit avec la protéine d'avirulence PopP2 dans le pathosystème Arabidopsis/Ralstonia solanacearum (Deslandes et al., 2003).

Un autre modèle, basé sur de nombreuses données expérimentales, a donc été proposé et appelé « modèle de garde » (van der Biezen and Jones, 1998). Ce modèle place les protéines de résistance comme des «antennes moléculaires» qui enregistrent les interactions entre les facteurs d'avirulence et leurs cibles dans la cellule hôte (Hammond-Kosack and Parker, 2003). La protéine de résistance ne reconnaît pas directement le facteur d'avirulence mais la modification d'une autre protéine ciblée par le facteur d'avirulence. On dit que la protéine R «garde » une protéine végétale donnée dont elle surveille les modifications (Dangl and Jones, 2001).

Le modèle de garde peut être illustré au cours de l'interaction entre des plantes d'Arabidopsis exprimant le gène de résistance RPM1(Résistance à Pseudomonas syringae pv. maculicola 1) et des souches de Pseudomonas syringae exprimant les facteurs d'avirulence AvrRpm1 et AvrB (Holt et al., 2003). Aucune interaction directe entre Rpm1 et AvrRpm1 ou AvrB n'a pu être mise en évidence mais la protéine RIN4 (Rpm1 Interactor 4) interagirait avec ces trois protéines. Le complexe RPM1-RIN4 est présent constitutivement chez Arabidopsis et l'entrée d'AvrRpm1 dans le cytoplasme de la cellule hôte engendre une hyper-phosphorylation de RIN4 qui est reconnue par RPM1, ce qui va déclencher la résistance (Mackey et al., 2002). RIN4 interagit également avec la protéine de résistance RPS2 (Résistance à Pseudomonas syringaepv. tomato2) qui est complémentaire du facteur d'avirulence AvrRpt2 (Belkhadir et al., 2004). Le complexe RPS2-RIN4 est présent constitutivement chez Arabidopsis et

l'entrée d'AvrRpt2 dans le cytoplasme de la cellule hôte engendre la disparition de RIN4 par protéolyse (Schulze-Lefert and Bieri, 2005), RPS2 est alors activé.

De même le gène Pto confère la résistance à Pseudomonas syringae pv. Tomato chez la tomate (Martin et al., 1993), c'est une sérine/thréonine protéine kinase qui reconnait deux effecteurs de Pseudomonas syringae, AvrPto et AvrPtoB (Abramovitch and Martin, 2005). L'activité de Pto requiert la présence de Prf, une protéine à domaine NB-LRR, l'association des deux déclenchant les mécanismes de défense (Mucyn et al., 2006).

Après l'étape de reconnaissance spécifique de l'agent pathogène par la plante, des cascades de transduction du signal vont permettre d'acheminer cette information jusqu'au noyau, conduisant ainsi à la mise en place des mécanismes de résistance. Ces voies de transduction utilisent de nombreux messagers secondaires impliqués dans un réseau de voies interconnectées. La régulation des mécanismes de défense spécifique s'effectue à différents niveaux. Le premier niveau de régulation se situe lors de la reconnaissance spécifique entre la plante et le pathogène. Cette étape implique un dialogue moléculaire qui aura des conséquences multiples dans la cellule végétale. Ensuite, les réponses de défense sont régulées par des évènements précoces qui découlent de la reconnaissance spécifique : modifications des flux ioniques, production de formes actives de l'oxygène, accumulation de SA, activation de certains loci, (Lamb and Dixon, 1997; Mur et al., 2008; Simon et al., 2010). Enfin, plusieurs hormones jouent un rôle important dans le contrôle de la défense. Ces différentes étapes sont illustrées dans la figure 3.

La reconnaissance R/Avr déclenche des flux ioniques, et en particulier une modification de la concentration en Ca2+ cytosolique qui active la production des ROS. Les ROS vont induire des cascades de MAPK qui permettent l'activation de facteurs de transcription. Ces derniers vont activer des gènes de défense. La HR, qui accompagne fréquemment la résistance spécifique, est induite par les flux ioniques ainsi que par une balance entre ROS et NO. Tous les évènements précoces mènent à la résistance de la plante.

3. Les facteurs influençant le développement du chancre bactérien

3.1 Facteurs pédoclimatique et agronomique

Les causes et les conditions d'expression de la maladie sont étroitement liées : (i) aux paramètres environnementaux (température, pluie, humidité, gel) qui peuvent déclencher la multiplication et la propagation de l'agent pathogène; (ii) aux caractéristiques agronomiques (c'est à dire les caractéristiques du sol, la fertilisation, le régime d'irrigation) de la culture (Scortichini, 2010).

3.1.1 Influence du climat

Les températures négatives interviennent dans le développement de la maladie bactérienne soit en créant les conditions favorables à la pénétration bactérienne soit en augmentant la sensibilité des tissus à ces microorganismes. Ainsi les cycles de gel et de dégel, intervenant en hiver, en provoquant un afflux d'eau dans les espaces intercellulaires des tissus parenchymateux (water soaking), favorisent la pénétration et le développement de l'infection du pêcher par P.s pv persicae (Vigouroux, 1974).

3.1.2 Influence de porte greffe et hauteur de greffage

Le choix du porte greffe ainsi que de la hauteur du greffage jouent un rôle dans la sensibilité des pêcher et abricotiers à la maladie par P. syringae (Prunier et al., 1999). En outre, l'utilisation de porte greffe myrobolan et GF 677 semble induire une plus grande sensibilité des cultivars d'abricotier (Morone et al., 2005). L'effet variétal est très marqué. Sur l'abricotier, les portes greffes induisent des sensibilités très variables, les pruniers sont plus sensibilisants. Des travaux conduits par la chambre de l'agriculture de l'Ardèche en liaison avec INRA ont mis en évidence un meilleur comportement des abricotiers greffés sur Rubira. Pour les zones à fort risque de bactériose deux stratégies sont désormais disponibles: l'utilisation de porte greffe Rubira et le greffage à partir de 60 cm (Prunier et al., 2005).

3.1.3 Influence du type de sol

La nature du sol semble influencer la sensibilité des Prunus à la bactériose. En effet, des travaux antérieurs ont montré que les sols acides à texture grossière et peu profonds sont sensibilisants car l'eau en hiver y est très disponible avec un niveau d'oxygénation élevé, condition qui favorisent une forte hydratation des arbres (Vigouroux and Bussi, 1994). Ainsi une teneur élevée en eau du végétal au moment de l'arrivée du froid prédispose fortement à l'expression de la maladie. En été, au contraire, il y a risque de stress hydrique et d'une mauvaise alimentation calcique, ce qui sensibilise les arbres. Par ailleurs, les sols sablonneux et argileux ainsi que les sols caractérisés par une faible teneur en calcium peuvent contribuer à l'augmentation de la sensibilité de l'abricotier et des pêcher aux infection par Pss (Scortichini, 2010; Vigouroux and Bussi, 1999). D'ailleurs (Backman and DeVay, 1971) ont montré que les ions ca²⁺ ont un pouvoir d'inhibition important sur les toxines produites par Pss. Le potassium de même a un rôle important dans le métabolisme de l'eau en général, y compris en hivers. Il pourrait donc influencer le comportement des plantes au froid, ce dernier facteur étant un élément essentiel de prédisposition du pêcher au dépérissement bactérien (Vigouroux, 1974).

3.1.4 Influence des pratiques culturales

Les stratégies de contrôle des pratiques culturales visant le chancre bactérien ont également été étudiées. Par exemple, des essais sur terrains ont été menés sur le prunier pour évaluer l'efficacité de la pulvérisation de cuivre et la fertilisation N-P-K sur la gravité et l'incidence de la maladie. Les résultats indiquent que la pulvérisation de cuivre tout au long de la saison de dormance en combinaison avec l'application semestrielle du N-P-K ainsi que les micronutriments réduisent de manière significative les risques de chancre bactérien par rapport au témoin non traité (Sayler and Kirkpatrick, 2003). Une très bonne gestion de l'alimentation hydrique (éviter les accours) contribue également à réduire la sensibilité. Les tailles tardives (fin hiver) sont à privilégier. Une explication de l'inefficacité des mesures de contrôle comme les antibiotiques tient à ce que les gènes de résistance aux antibiotiques sont très communs chez P. syringae (Kennelly et al., 2007) en raison de la sélection des populations pathogènes pour leur résistance au cuivre et à la streptomycine (Scheck et al., 1996). D'ailleurs la résistance plasmidique au cuivre et la résistance à la streptomycine sont de plus en plus répandues chez plusieurs bactéries phytopathogènes telles que les Pseudomonas, Xanthomonas, et Erwinia (Cooksey, 1990). Des souches de P. syringae pv syringae résistant à des concentrations élevées de cuivre et de streptomycine (Spotts and Cervantes, 1995) ont ainsi été prélevées dans les vergers à l'ouest des Etats Unis et dans les pépinières de plantes ligneuses commerciales (Sundin and Bender, 1993).

En Nouvelle Zélande, un programme a été mis en oeuvre pour identifier des produits permettant le contrôle de Pseudomonas syringae pv actinidea chez le kiwi, dont l'un des éliciteurs (molécule produite par un agent phytopathogène ou un ravageur, qui induit chez une plante la production de phytoalexines et par extension, une molécule qui déclenche les mécanismes de défense des plantes avec production de substances défensives). L'un des plus efficaces chez A. chinensis est l'acibenzolar-S-methyl (ASM), analogue à l'acide salicylique (Scortichini and Liguori, 2003), sous le nom commercial de Bion (syngenta). Son efficacité est démontrée pour les maladies d'origine bactérienne telle que Xanthomonas et Pseudomonas chez la tomate, le pommier, le poirier, et les oignons. Afin de surmonter les limites des bactéricides, de nouvelles recherches se sont orientés vers des composés biodégradables et

biocompatibles qui activent la défense des plantes et induisent leurs résistance telle que la chitosane en raison de sa forte activité antimicrobienne sur une large gamme de pathogènes (Badawy and Rabea, 2011). D'autres éliciteurs ont montré in vitro des effets inhibiteurs sur P. syringae comme les peptides antimicrobiens (Cameron and Sarojini, 2014), et les terpènes (Ferrante and Scortichini, 2010).

Cependant, tandis que ces éliciteurs peuvent être efficaces dans des conditions de contrôle, la réponse de l'hôte peut être très variable au champ, ce qui soulève la question de leur intérêt potentiel pour la gestion de la maladie. Par ailleurs, il a été montré que la résistance induite par l'utilisation de ces éliciteurs chimiques, peut s'accompagner d'une réduction de la production des fruits et /ou de la qualité (Walters and Heil, 2007).

MATERIEL ET METHODES

1. Matériel végétal

Deux types de population de travail ont été mobilisés dans le cadre de nos travaux:

- Pour tester la résistance à P.syringae sur rameaux, une population issue d'un croisement `Bergeron x Bakour' (BerBa), constituée de 224 individus en pseudo-F1 (ou pseudo-cross), plantés sur leurs propres racines dans une parcelle homogène, a été inoculée dans un verger au cours de trois années consécutives. Cette population a été obtenue en 2004 et plantée sur le Domaine INRA de Gotheron (26), près de Valence dans la Drôme (moyenne vallée du Rhône). Bergeron est la variété locale issue du phylum d'Europe continentale (Bourguiba et al, 2012), sensible au chancre bactérien (Prunier et al., 1991), et Bakour une variété tunisienne locale issue du phylum Nord-africain (Bourguiba et al., 2012) dont la faible sensibilité variétale a été mise en évidence, validée par Prunier et al (1991), et confirmé par l'INRA de Gotheron (Brun et al., 2011). Parallèlement aux travaux de phénotypage, la population hybride BerBa est entrain de faire l'objet d'une cartographie génétique à l'aide de marqueurs microsatellites couvrant le génome. Une étude des régions du génome impliquées dans les caractères mesurés sera engagée par analyse de liaison.

- Pour tester les symptômes sur feuilles causé par P. syringae, une population biparentale en pseudo-F1 `Goldrich x Moniqui' (GoMo), de 196 individus a été choisie et inoculée pendant deux années consécutives (2013 et 2014). Goldrich présente fréquemment des criblures sur feuilles qui ne sont pas observées chez Moniqui. Cette population est maintenue sur le domaine de l'Amarine (30). Une carte génétique étant disponible pour les deux parents, il va être possible d'identifier les régions du génome impliquées dans l'élaboration des caractères mesurés.

La collection variétale des ressources génétiques contient 587 variétés issues de différents phylums (Annexe I). Elle est maintenue sur le domaine de l'INRA de l'Amarine à Bellegarde (30) où elle est répartie sur trois parcelles. Une partie de cette

collection, 76 accessions, a été re-séquencée dans le cadre du projet ANR ABRIWG, cette core-collection servira à détecter des QTLs par analyse d'association qui repose sur la recherche d'une association statistique entre le polymorphisme allélique SNP et la variation phénotypique.

2. Méthodes

a. Dispositif expérimental

Les individus sont répartis sur plusieurs rangs à raison d'un arbre par génotype disposés aléatoirement. Les observations ont été effectuées au mois de mai et juin 2014. Les variables mesurées sont:

Tableau 5: Dispositif expérimental mobilisé pour les études de sensibilité à Ps syringae

b. Inoculations

Les inoculations ont été réalisées en période hivernale pour les inoculations sur rameaux conformément aux préconisations de Prunier et al (1991), et au printemps pour les inoculations des limbes et des bourgeons. Dans chacun des cas les inoculations ont été réalisées par apport d'une suspension bactérienne sur feuilles et bourgeons. Elles ont été réalisées à l'aide d'une souche pathogène (41A) identifiée par le CTIFL à Larnage (26) dans un verger d'abricotier et considérée comme la souche la plus pathogène actuelle travaillée (Lamichhane et al., 2014). Il s'agit d'un isolat de Pseudomonas syringae pv syringae. L'inoculum a été préparé par le

laboratoire de pathologie de l'INRA de Montfavet avec une concentration de 10⁸ UFC/ml.

Sur rameaux: les inoculations ont été réalisées le 16 décembre 2013 sur la population « BerBa » et le 18 décembre 2013 sur la collection à raison respectivement de 5 et 3 rameaux par génotype. Pour chaque génotype, un rameau supplémentaire a été inoculé avec de l'eau distillée et utilisé comme référence. L'inoculation a été réalisée suivant la méthode de Prunier et al (1991) qui consiste à introduire une goutte de 20 ul d'une suspension bactérienne titrée à 10⁸UFC/ml dans une plaie réalisée dans l'écorce du rameau jusqu'au cambium et à entourer la plaie avec du parafilm.

Sur feuilles : les inoculations ont été effectuées les 09 et 12 mars 2014 respectivement sur la collection et sur la population GoMo. Seize feuilles (4 rameaux x 4 feuilles) pleinement développées ont été inoculées par génotype en effectuant une perforation à l'aide d'une brosse en inox suivie d'une pulvérisation sur les deux côtés de chaque limbe à l'aide d'1 ml de suspension bactérienne titrée par pulvérisation. Trois semaines après inoculation, les feuilles ont été collectées, stockées rapidement au froid (+4°C), puis scannées pour la notation.

3. Phénotypage

Sur rameaux: Les notations ont été effectuées le 20 mai 2014. Les résultats obtenus sont exprimés (Annexe II) en terme de :

- Longueur de chancre (lgc) : elle correspond à la zone de symptômes visibles extérieurement englobant la zone cicatrisée et le méplat formé par la destruction des tissus du cambium.

- Longueur de la blessure résultant de l'entaille (lge) : c'est la partie ouverte au contact de l'air formant une fente plus ou moins large formée à partir de l'entaille de l'inoculation.

- Longueur de brunissement superficiel (bs) : observée directement sous l'écorce dans les tissus verts de l'année, elle est mesurée après élimination de l'écorce.

- Longueur de brunissement interne (bi) : le décollement profond de l'écorce montre un brunissement des tissus cambiaux, supérieur ou égal à la longueur de chancre.

Sur feuilles : Afin de quantifier les dégâts et le développement de la maladie, une note a été attribuée à chaque feuille suivant une échelle d'intensité croissante de dégâts allant de 0 à 5, et correspondant à un pourcentage de surface nécrosée (Annexe III). Cette notation est complétée d'une évaluation de la criblure notée de 0 à 3 (Annexe IV) ainsi que de la taille de la feuille, notée de 1 à 3, qui a été prise en compte en tant que covariable.

4. Génotypage

La cartographie de QTL (Quantitative Trait Loci) est fondée sur la recherche systématique de déséquilibre de liaisons entre locus marqueurs et locus contrôlant les caractères quantitatifs. Dans cette approche, deux méthodes de cartographie de QTL ont été utilisées dans ce travail:

- La cartographie par liaison, qui se base sur deux populations de cartographie issue des croisements biparentaux : le génotypage de la population BerBa a été réalisé en 2014, après un criblage du polymorphisme de 300 marqueurs SSR (Single Sequence Repeat) chez les deux parents à l'UR GAFL (Avignon), ensuite un génotypage de 72 SSR a été réalisé par la société ADNiD sur un panel de 87 individus sélectionnés pour représenter la gamme de symptômes de 2013 et 2014 (Annexe V). Pour la population GoMo, nous nous sommes appuyés des deux cartes développées au sein du laboratoire en 2007 et complétées depuis lors. Les cartes génétiques comportent 129 marqueurs SSR pour Goldrich (480,8 cM) et 94 pour Moniqui (580,5 cM) répartis sur l'ensemble des 8 groupes de liaison (Annexe VI).

- La cartographie par association, qui se base sur une population non structurée d'individus représentatifs de la diversité génétique de l'espèce, et qui cherche à déceler une association entre un variant génétique et la résistance au chancre au sein de la core-collection.

5. Analyses statistiques

a) Données de phénotypage :

Les traitements statistiques des données ont été réalisés avec les logiciels XLSTAT et R Traitement des notations sur rameaux:

- Normalité des résidus: une transformation logarithmique (Ln) a été effectuée pour stabiliser la variance. La normalité a été testée par un test shapiro (p-value<0.01), et l'homogénéité des variances par un test de Bartlett.

- Pour toutes les variables, les histogrammes de fréquence ont été réalisés.

- Pour comparer les échantillons de rameaux « inoculés» et « non inoculés» et entre les phénotypes de deux parents, un test de student (p-value<0.05) a été utilisé.

- Pour savoir si certaines variables de résistance étaient corrélés au sein des populations et entre les années, le test de Pearson a été utilisé (P-value<0.05).

- Une analyse du dispositif a été effectuée avec un modèle linéaire général (ANCOVA) où les variables expliquées sont (lgc, lge, bs et bi) et les variables explicatives sont le génotype, le diamètre et la hauteur de point d'inoculation des rameaux.

- Enfin une analyse en composantes principales (PCA : Principal component Analysis) a été effectuée pour étudier simultanément la contribution des

individus observés et la contribution des variables à la diversité observée.

L'effet du génotype est testé à partir des notes brutes par le test non paramétrique du chi². A partir de la notation individuelle des feuilles, cinq notes synthétiques ont été établies afin de discriminer les individus de différentes manières :

- Sevmed : la moyenne des notes transformées en pourcentage de nécrose par une moyenne sur la médiane de chaque individu,

- Sevreglog : un index calculé grâce au modèle de régression logistique multinomial

- CribMoy : note de criblure moyenne des symptômes observés sur feuilles obtenue à partir des notations de 0 à 3 sur feuilles.

- Cribreglog : note de criblure observée sur feuilles obtenue à l'aide du modèle de régression logistique multinomiale basé sur les notes de criblure de 0 à 3.

b) Données de génotypage :

Détection de QTLs par analyse de liaison: Les données phénotypiques de la descendance ont été reliées aux données de cartographie génétique, afin de détecter la présence des régions du génome impliquées dans les caractères mesurés (QTLs). Trois méthodes d'estimation ont systématiquement été mobilisées : la régression marqueur par marqueur, l'intervalle mapping (IM) qui consiste à estimer la présence d'un QTL entre les 2 marqueurs qui l'encadrent, et le Composite Interval Mapping (CIM) qui consiste à estimer l'emplacement d'un QTL en s'appuyant sur une plage de marqueurs qui l'encadre dans une régression pas à pas. La signification des QTLs est fondée sur le calcul du LOD score. Le LOD seuil a été fixé par 1000 simulation à une valeur de 2,3. La position d'un QTL a été estimée d'après la position de la valeur maximale de LOD (LODmax). L'intervalle de confiance associée correspond à la projection de la courbe de LOD sur l'axe des abscisses (longueur du chromosome). L'effet individuel de chaque QTL sur la variable phénotypique (R²) a été donné par le modèle.

Les QTL ont été recherchés avec le logiciel WinQTL cartographer version 2.5(Wang S. et al., 2007)

Inférence du nombre de population ancestrales: elle vise à estimer la structure génétique d'un ensemble d'individus en rassemblant ces derniers dans des groupes, sur la base de leurs profils génétiques, elle permet l'identification de groupe génétiques différents selon la méthode deltaK (Evanno et al., 2005) grâce au logiciel STRUCTURE (Pritchard et al., 2000).

Estimation de l'apparentement entre individus: la matrice des coefficients d'apparentement (compris entre 0 et 1) des individus deux à deux a été obtenue à l'aide de SPAGeDI (Hardy and Vekemans, 2002).

Afin d'éviter les risques de type I (détection de fausses associations) et de type II (non détection de vrais associations), différentes méthodes statistiques d'analyse de données, pouvant prendre en compte la structure des populations et la parenté entre individus, ont été développées, une solution consiste à chercher le modèle le plus approprié, entre un modèle strictement basé sur les marqueurs, un modèle linéaire prenant en compte la structure (Pritchard et al, 2000) et un modèle mixte prenant en compte la structure et l'apparentement (Meuwissen et al., 2001). Les modèles testés sur la sensibilité au chancre sur rameaux et la sensibilité aux criblures sur feuilles ont été : GLM `simple' (sans correction de structure de la population), GLM'Q' (modèle simple avec les coefficients de structures comme covariables), et MLM'Q+K' (correction à la fois de la structure et des différentes parentés).

La recherche du meilleur ajustement a été faite à partir de l'appréciation graphique de la concordance entre une distribution observée et un modèle théorique représentée par le diagramme probabilités observées-probabilités cumulées (QQplot).

Le modèle le mieux adapté a ensuite été utilisé pour la recherche d'associations de tous les caractères.

Le DL entre marqueurs deux à deux, représenté par le DL (r²) a été calculé avec TASSEL 3.0.

RESULTATS ET DISCUSSION

1. Sensibilité variétale de l'abricotier à P.syringae - éléments de phénotypage

1.1 Analyses des réactions aux inoculations sur rameaux

1.1.1 Caractérisation de la sensibilité de la population biparentale BerBa

La distribution des variables lgc, lge, bs et bi au sein de la descendance BerBa est représentée dans le tableau 6. Les courbes sont caractérisées par des distributions continues suggérant l'existence de contrôles polygéniques pour les variables observées au cours des 3 années. La disposition des parents traduit d'une part l'existence de composantes de résistance chez la variété Bakour et d'autre part l'existence d'une transgression au sein de la population avec présence d'hybrides plus résistants que le parent `Bakour'. Le « brunissement superficiel» est caractérisé par des valeurs singulièrement faibles en 2014, ce qui n'est pas le cas du « brunissement interne » qui demeure stable pendant les deux années.

Une ACP a été réalisée sur le jeu de données complet. La figure 4 résume les projections des variables et des individus sur les deux premiers axes qui représentent 62% de la variabilité et la matrice des corrélations est présentée dans le tableau 7. La figure 4 traduit l'importance de l'effet année qui structure fortement la diversité observée. En effet les variables de 2013 contribuent le plus à l'axe 1 et expliquent plus de 42 % de la variabilité tandis que celles de 2014 sont expliquées préférentiellement par l'axe 2 suggérant ainsi un effet environnement (année) sur l'expression des symptômes sachant que les inoculations avaient été réalisées avec la même souche et à la même concentration. Ceci peut être confirmé par la matrice de corrélation qui montre:

- Une faible corrélation entre les variables de 2013 et 2014 (en bleu) sauf pour la variable « bi » avec R=0,486.

- Une corrélation moyenne entre les variables d'une même année surtout en 2013. - Un comportement particulier de « bi » qui se distingue des autres réactions.

En 2013 comme en 2014, les réactions suite aux inoculations sur rameaux montrent une différence significative entre les rameaux inoculés avec la suspension bactérienne et les rameaux témoins (Test de Wilcoxon, p-value < 2.2e-16) quelles que soient les variables.

Les notes de Bakour montrent que ce dernier est plus tolérant que Bergeron, mais la différence n'est significative que pour le caractère `brunissement interne'. En effet les valeurs aussi bien pour Bakour que pour Bergeron ont pratiquement doublés entre 2013 et 2014 (effet année avec p-valeur<0.05). Les valeurs mesurées des deux parents confirment le caractère contrasté entre Bakour et Bergeron dans l'ensemble des notes.

Figure 4: Représentation synthétique des données de sensibilité tissulaire mesurées sur rameaux suite à une inoculation bactérienne - ACP des variables mesurées en 2013 et 2014 sur rameaux au sein de la population BerBa (moyennes par individus des 5 rameaux, 211 individus.

A : nuage des individus (moyennes sur 5 rameaux) selon l'axe 1 et 2 de l'ACP. B : représentation des variables mesurées en 2013 et en 2014.

Tableau 7: Matrice de coefficient de corrélation de Pearson des variables mesurées sur rameaux dans la

	lgc2014	lge2014	bs2014	bi2014	bi2013	bs2013	lgc2013	lge2013
lgc2014	1
lge2014	0,406	1
bs2014	0,196	0,156	1
bi2014	0,290	0,157	0,154	1
bi2013	-0,083	-0,169	-0,024	0,486	1
bs2013	0,110	0,068	0,193	0,340	0,546	1
lgc2013	0,202	0,113	0,188	0,380	0,525	0,796	1
lge2013	0,100	0,000	0,150	0,358	0,571	0,748	0,867	1

*La couleur rose indique la forte corrélation entre les variables et la couleur bleu indique les faibles corrélations entre variables d'une année à l'autre.

L'analyse de la variance critère par critère a mis en évidence, de façon hautement significative, un effet génotype et un effet année pour l'ensemble des variables. L'interaction génotype x année n'est significative que pour la variable lgc.

Tableau 8: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations des rameaux au sein de la population hybride Bakour x Bergeron (5 répétitions, 224 individus)

Variables

2013

2014

2013 et 2014

lgc

lge

lgc

lge

lgc

lge

Effet de l'année

2,2 e-16

Effet du génotype

2,2 e-16

0,002

2,8611e-16

2,2 e-16

2,957e-15

2,2 e-16

Effet interactions GxE (Génotype x Année)

4,5 e-06

Effet diamètre du rameau

0,0004

2,708 e-05

0,0007

0,003

Distribution normale (shapiro)

non

Homoscédasticité % an

0,613

0,0184

2,2 e-16

2,64 e-06

Homoscédasticité % génotype

0,713

0,990

0,879

0,994

0,990

0,993

0,997

Comparaison % témoin (wilcoxon)

2,2 e-16

Moyenne de la population (cm)

4,94#177;2,60

3,57#177;2,05

7,55#177;4,98

17,61#177;14,36

3,69#177;1,73

2,85#177;2,24

2,80#177;5,45

28,35#177;14,21

Différence entre parents (wilcoxon)

0,110

0,056

0,268

0,011

0,088

0,969

0,101

0,007

3,24e-08

0,0356

1,77e-07

1,65e-05

Moyenne Bergeron (cm)

9,5#177;4,16

5,9#177;2,07

15,8#177;8,22

42,5#177;11,43

2,54#177;1,10

2,5#177;0,97

2,07#177;3,36

32,4#177;13,93

Moyenne Bakour (cm)

6,1#177;2,6

3,85#177;4,58

9,9#177;5,13

22,35#177;7,69

3,52#177;1,11

2,61#177;0,44

0,26#177;0,82

13,76#177;6,59

NS : non significatif, % : par rapport à ; #177; indique l'écart-type, lgc : longueur du chancre; lge : longueur de la blessure; bs : brunissement superficiel; bi: brunissement interne.

1.1.2 Caractérisation de la sensibilité des variétés de la - core-collection

Les distributions (tableau 9) sont caractérisées par des variations continues. Et une large variabilité pour les différentes variables, à l'exclusion de la variable bi en 2014 concentrée autour de valeurs nulles.

Tableau 9: Distribution de l'intensité des symptômes de sensibilité de la core-collection (129 individus) suite à une inoculation bactérienne mesurés sur rameaux en 2013 et 2014. Les distributions portent sur les moyennes de 3 rameaux testés par individu. Mesures en centimètres.

Comme précédemment, une ACP a été réalisée pour illustrer l'étendue de la diversité mise en évidence sur les données de sensibilité tissulaire mesurée sur les rameaux. Les deux axes principaux de l'ACP qui représentent la majeure partie de la variabilité (48,7%), montrent que:

- Toutes les variables sont bien représentées dans ce plan factoriel puisque leurs corrélations avec les axes sont importantes (les projections sont proches du cercle de corrélation) (figure 5b).

- Une corrélation des variables entre elles selon les années, et la relative indépendance des variables de brunissement (bi, bs) et des variables liées aux longueurs de chancre (lgc, lge).

- Une large variabilité des individus représentée par un nuage des individus étendu et continu illustrant l'effet variété (génotype) sur la résistance des rameaux, les variétés les plus sensibles étant sur la partie droite du graphe (figure 5a).

Figure 5: Représentation synthétique des données de sensibilité tissulaire mesurées sur rameaux suite à une inoculation bactérienne - ACP des variables mesurées en 2013 et 2014 sur rameaux au sein de la core-collection (moyennes par individus des 3 rameaux, 129 individus).

A : nuage des individus (moyennes sur 3 répétitions) sur les deux axes principaux. B : représentation des variables mesurées en 2013 et en 2014.

Tableau 10: Matrice de corrélation de Pearson des variables mesurées sur rameaux dans la core-

Variables	lgc2013	lge2013	bs2013	bi2013	lgc2014	lge2014	bs2014	bi2014
lgc2013	1
lge2013	0,680	1
bs2013	0,364	0,335	1
bi2013	0,078	0,029	0,326	1
lgc2014	0,144	0,136	0,003	-0,082	1
lge2014	0,041	-0,011	0,063	0,021	0,541	1
bs2014	0,100	-0,071	0,011	0,067	0,020	0,145	1
bi2014	-0,047	-0,108	-0,070	0,060	0,307	0,312	0,351	1

*La couleur rose indique la forte corrélation entre les variables et la couleur bleu indique les faibles corrélations entre variables d'une année à l'autre.

La matrice de corrélation montre une relation entre les variables proches (en rose) d'une même année (lgc et lge), (bs et bi) ainsi qu'une faible corrélation (bleu) des variables entre les deux années illustrant l'indépendance entre les années.

La synthèse des analyses représentée dans le tableau ci-dessous traduit un effet inoculation significatif pour l'ensemble des variables mesurées. L'effet génotype est significatif en 2013 mais pas en 2014 laissant supposer que cette année n'est pas une année favorable au développement au chancre ce qui est confirmé par l'analyse de ACP et les résultats de l'analyse de variance avec un effet année significatif pour l'ensemble des variables sauf pour le brunissement interne.

Nous avions collecté la variable diamètre afin d'évaluer si l'importance des symptômes n'était pas fonction de la vigueur des rameaux. Les analyses montrent que le diamètre ne semble pas jouer un rôle dans le développement de la maladie pour les variables mesurées. De manière complémentaire le tableau de synthèse montre que l'interaction GxE n'est significative que pour la longueur du chancre (lgc) entre 2013 et 2014.

Tableau 11: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations sur rameaux au sein de la core-collection (129 individus).

Variables

2013

2014

2013 et 2014

lgc

lge

lgc

lge

lgc

lge

Effet de l'année

2,2 e^-16

0,041

Effet du génotype

2,995e-05

0,0021

1,586e-05

3,8 e^-06

1,641e^-06

0,0027

0,054

Effet interactions GxE (Génotype x
Année)

4,5 e^-06

Effet diamètre du rameau

0,0246

0,04

Distribution normale (shapiro)

non

Homoscédasticité % an (Fligner-
Killeen)

5,15 e^-06

0,372

0,1912

0,2634

Homoscédasticité % génotype
(Fligner-Killeen)

0,937

0,994

0,999

R² du modèle

0,543

0,503

0,558

0,387

0,428

0,447

0,454

0,44

0,605

0,2758

0,1566

0,0096

Comparaison % témoin (wilcoxon)

2,2 e^-16

2,2 _e-16

Moyenne des individus

4,57#177;2,17

2,33#177;0,97

11,62#177;8,77

27,18#177;11,14

2,70#177;0,6

1,39#177;0,72

8,93#177;8,52

25,81#177;10,25

1.2 Analyses des réactions aux inoculations sur feuilles

1.2.1 Caractérisation de la sensibilité de la population biparentale GoMo

Les distributions des notes de sévérité au sein de la population biparentale (tableau 12) traduisent l'existence d'une variabilité de réaction au sein de la population, validée statistiquement. En effet, les analyses statistiques (tableau 14) traduisent une différence de sensibilité d'origine génétique. Les variables SevRegLog et CribRegLog issues du modèle de régressions logistique ont permis de discriminer les hybrides en deux classes résistant/sensible confirmées par le test chi2 (p-value < 2,2^e-16). Cependant, la comparaison des deux parents ne montre pas de différence significative entre eux.

Tableau 12: Distribution des notes de sévérité des symptômes sur feuilles observées après inoculations au sein de la population hybride Goldrich x Moniqui. Les distributions portent sur les moyennes de 4 feuilles x 4 rameaux par individus.

Un fort effet environnement a été observé dans nos mesures, traduit par l'effet année en interaction avec le génotype sur les variables sévérité et criblure qui s'explique par des conditions de printemps humide particulièrement en 2013 favorables au développement des symptômes.

Le modèle explique une bonne partie de la variabilité. Pour la sévérité, 42% de la variabilité est expliqué par les effets génotype, année et leur interaction, de même pour la criblure avec 43% de la variabilité expliquée par le modèle. Comme précédemment, dans le cas du diamètre avec les mesures sur rameaux, nous nous sommes interrogés sur l'influence de la taille des feuilles sur l'intensité des symptômes observés, les résultats traduisent une relative indépendance avec les variables sévérité et criblure.

La ségrégation du caractère résistance à la criblure au sein de la population hybride a été complétée par l'étude des corrélations (tableau 13) entre les variables afin d'appréhender le degré de liaison existant entre elles. L'ACP réalisée sur les jeux de données 2013 et 2014 traduit un effet année (figure 6) et une représentation continue des individus au sein de la population hybride.

Tableau 13: Matrice de corrélation de Pearson entre les variables mesurées sur feuilles dans la population GoMo en 2013 et 2014.

Variables	SevMoy14	SevMed14	Cribreglog14	sevmoy13	sevmed13	sevreglog13	cribReglog2013
SevMoy14	1
SevMed14	0,815	1
Cribreglog14	0,631	0,474	1
sevmoy13	0,227	0,255	0,166	1
sevmed13	0,184	0,255	0,166	0,918	1
sevreglog13	0,252	0,209	0,206	0,748	0,578	1
cribReglog2013	0,174	0,265	0,135	0,586	0,488	0,620	1

*La couleur rose indique la forte corrélation entre les variables et la couleur bleu indique les faibles corrélations entre variables d'une année à l'autre. Les chiffres 13 et 14 : indique l'année 2013 et 2014.

Figure 6: Représentation synthétique des données de sensibilité bactérienne mesurées sur feuilles suite à une inoculation bactérienne - ACP des variables mesurées en 2013 et 2014 sur feuilles au sein de GoMo (moyennes de 4 feuilles x 4 rameaux par individus).

A : nuage des individus (moyennes sur 4 x 4 répétitions) sur les deux axes principaux. B : représentation des variables mesurées en 2013 et en 2014.

Tableau 14: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations sur feuilles au sein de la population GoMo en 2013 et 2014.

NS :non significatif, les symboles, % : par rapport à ; #177; indique l'écart-type.

1.2.2 Caractérisation de la sensibilité observée au sein de la core-collection :

Les distributions des symptômes au sein de la core-collection constituée de 125 individus peuvent être visualisées dans le tableau ci-dessous.

Tableau 15: Distribution des notes de sévérité des symptômes sur feuilles observées après inoculation au sein de la core-collection en 2013 et 2014

Ces distributions montrent clairement une variabilité de comportement au sein de la core-collection sous forme de distributions continues. Les moyennes brutes par classes `SevMoy' montrent une majorité d'individus répartis entre les notes 0,5 et 1,25 pour les deux années. La note de sévérité médiane se caractérise par un grand nombre d'individus moyennement à peu touchés aussi bien en 2013 qu'en 2014. En ce qui concerne la criblure, les distributions montrent un grand nombre d'individus avec des valeurs faibles en 2014 par rapport à 2013. Ainsi pour toutes les variables, les symptômes observés en 2014 ont été moins intenses. L'ACP (figure 7) illustre cette diversité génétique, caractérisée par une grande capacité de recombinaisons entre les variables observées et par une influence majeure de l'année sur les variables observées. Les relations entre variables restituées par la matrice de corrélation (tableau 16) rendent

compte de liaisons étroites entre variables d'une même année et entre la sévérité et la criblure.

Tableau 16: Matrice de coefficient de corrélation de Pearson entre les variables mesurées sur feuilles

*La couleur rose indique la forte corrélation entre les variables d'une même année et la couleur bleu indique les faibles corrélations entre variables d'une année à l'autre. Les chiffres 13 et 14 : indique l'année 2013 et 2014.

Les résultats mettent en évidence l'effet du génotype, de l'année et les interactions GxE au sein de la core-collection. Elles ont été réalisées sur les 4 répétitions des valeurs brutes de la sévérité et de la criblure (tableau 17).

Par opposition avec ce qui a été observé pour la descendance biparentale, le modèle utilisé a montré un effet génotype et un effet taille des feuilles significatif pour les deux années dont nous pouvons imaginer qu'il peut être lié notamment à une variabilité des tailles de limbes bien plus importante au sein de la collection par rapport à la descendance.

Figure 7: Représentation synthétique des données de sensibilité bactérienne sur feuilles - ACP sur l'ensemble des variables mesurées sur feuilles sur la core-collection (125 individus) en 2013 et 2014.

Tableau 17: Synthèse des analyses statistiques effectuées suite aux inoculations des feuilles au sein de la core-collection en 2013 et 2014.

2. Analyse de la résistance de l'abricotier à P.syringae - recherche des régions du génome impliquées.

2.1 Analyse de liaison dans les populations biparentales pour la sensibilité à P. syringae sur rameaux et sur feuilles

2.1.1 Etude de la résistance à Pseudomonas syringae sur rameaux au sein de la population BerBa

Les analyses conduites sur la population BerBa restent très préliminaires car elles reposent sur des cartes génétiques trop lâches. Toutefois des éléments d'intérêt apparaissent:

Allèles de Bakour : une zone significative ressort de l'analyse de cartographie d'intervalle simple et composite sur la variable ln bs2013 (LOD score respectivement de 22,1 et 19,88). Elle est localisée à 14,5cM du GL8 entre les marqueurs CPPCT006 et UDAP98-409. L'intervalle de confiance autour de cette position est de 5,1cM. Le pourcentage de variation expliqué par le QTL est faible, de 7,34%.

Deux zones sont en limite de significativité selon les deux méthodes d'analyse pour deux variables. Pour lge2013, elle se situe sur le GL1-a en position de 40cM encadrée par les marqueurs bga_002_111.pca et PGS1.21 avec un LOD score de 2,88. Cette zone est significativement liée avec le marqueur bga_002_111.pca avec un r² de 0,003. Pour bi2013, cette zone se situe à 21,1cM au niveau de GL1-b sur le marqueur BPPCT011 dont lequel l'analyse par marqueur révèle une forte liaison de ce dernier avec le caractère bi2013 avec r² de 0,01.

Allèles de Bergeron: aucun QTL n'a pu être mis en évidence sur les variables mesurées (lgc, lge, bs, bi en 2013 et 2014). Deux zones en limite de significativité ont pu être détectées, la première correspond à la variable lge2013 située à 35,1cM du GL1-a au niveau du marqueur AMPPG016, fortement lié au QTL (r² de 0,003) avec un LOD score de 2,09 et expliquant 9,8% de la variabilité. Le second correspond à lgc2013 à 62,1cM du GL6 avec un LOD score de 2,39 à proximité du marqueur EPPCU4092.

Une analyse des données obtenues sur les rameaux témoins inoculés à l'eau a pu mettre en évidence la cohérence des résultats et ainsi confirmer que les QTLs détectés notamment pour le bruissement ne sont pas liés aux effets de blessure.

2.1.2 Etude de la resistance à Pseudomonas syringae sur feuilles au sein de la population GoMo

On dispose des cartes génétiques des parents ainsi que de 120 et de 94 marqueurs répartis respectivement sur les 8 chromosomes pour Goldrich et Moniqui. L'effet individuel de chaque QTL sur la variabilité phénotypique (R²) a été donné par le modèle. Les caractéristiques des différents QTLs détectés dans la descendance GoMo sont rassemblées dans le tableau 18.

Des QTLs ont été détectés pour la sévérité (SevMoy, SevMed, et SevRegLog), ils se positionnent surtout sur GL4 et GL1 avec une redondance de quelques marqueurs;

- UDAp416 explique 19,2% et 17,4% de la variabilité phénotypique respectivement pour SevMoy2013 et SevRegLog2013.

Pour la criblure, trois zones ressortent de l'analyse en cartographie d'intervalle composite sur les GL1 et GL3 avec des LOD score de 2,93 à 5,34, ils n'expliquent toutefois qu'une faible part de la variabilité phénotypique observée (de 1% à 1.9%).

La cartographie d'intervalle ne révèle pas d'autre zone significative. Allèle de Moniqui :

Plusieurs zones ressortent de l'analyse de cartographie d'intervalle et de d'intervalle composite sur les groupes de liaisons 2, 7 et 8.

Les marqueurs ECU3216m (GL8) et UDAp478 (GL7) ressortent dans les deux types d'analyses, et chacun est impliqué dans les deux notes de sévérité (SevMoy2013 et SevRegLog2013). La part de variation phénotypique au QTL est respectivement 18,6% et 18,16 en moyenne.

Un QTL localisé au niveau du marqueur AMPA95m sur GL2 est impliqué dans les caractères sévérité (SevRegLog2013) et criblure (CribRegLog2013), il explique respectivement 5,8% et 5,9% de la variabilité observée. Une région chromosomique semble stable d'une année à une autre chez les deux parents, elle est impliquée pour le

caractère sévérité (SevMed2013 et SevMed2014) est localisée au niveau du marqueur UDAp470 sur le GL8.

Tableau 18: QTLs détectés pour les symptômes de sensibilité bactérienne sur feuilles dans la population hybride Goldrich x Moniqui de 196 individus par Interval mapping (IM) et composite interval mapping (CIM).

Caractère	parent				IM			CIM
Caractère	parent	marqueur	GL	P_valeur (r2)	position (cM)	LOD	R2	position (cM)	LOD	R²
Sevmed 2014	Goldrich	UDAp470	8	0,033 *	-	-	-	16	3,31	5,2
Sevmed 2013		Pgms2m UDAp471B AMPA94 CPPTCT34m	4 1 1 1	0,821 0,187 0,164 0,049 *	- - - -	- - - -	- - - -	5,5 37,5 46 55,2	3,88 3,42 3,2 4,25	3,4 2 2,2 4,5
Sevmoy 2013		UDAp416 pgms5m	4 4	1.e-05 ** 5e-04 *	48,9 25	4,25 2,74	19,2 13,3	- -	- -	- -
Sevmoy 2013		ECU1775	4	4 e- 04****	-	-	-	52	3,33	17,4
SevRegLog 2013		UDAp416 DAp405 ECU1775 AMPA121m	4 2 4 6	1e-05 ** 0,002 7 e-05 **** 0,256	45,7 - -	3,81 - -	17,4 - -	- 0,1 51,7 66,1	- 4,47 4,89 2,72	- 8,7 16,9 1,5
CribRegLog 2013		CPSCT24m UDAp446m UDAp436	1 3 3	0,202 0,916 0,33	- - -	- - -	- - -	54,2 17,6 36	5,34 2,93 3,9	1,9 1 1,1
Sevmed 2013	Moniqui	UDAp470	8	0,071	-	-	-	33	2,53	17,4
Sevmoy 2013		UDAp424A UDAp478 ECU3216m	5 7 8	5e-04 * 4 e-5 1 e-5**	0,1 66,9 0,1	2,65 3,66 4,13	8 e- 4 17,9 19,2	- 0,1	- 3,4	- 19,2
SevRegLog 2013		UDAp457 UDAp478	2 7	0,835 3 e- 05****	58,2 66,9	2,66 3,76	0,5 18,3	66,7	5,13	18,3
SevRegLog 2013		ECU3216m	8	5e-05 ***	0,1	3,6	17,4	-	-	-
SevRegLog 2013		AMPA95m	2	5e-04 ***	-	-	-	58,1	2,57	5,8
CribRegLog 2013		AMPA95m	2	9 e-3 **	58,1	2,58	5,9	58	2,85	5,9

*Les symboles* indiquent le niveau de significativité. R² : part de variation du phénotype expliquée par marqueur. r²: significativité de liaison entre marqueur et QTL. La couleur rose indique la redondance de deux marqueurs dans les résultats. La couleur verte indique un marqueur identifié en 2013 et 2014.

2.2 Analyse d'association dans le panel de RG constitué de 76 accessions re-séquencées pour la sensibilité à P. syringae observée sur rameaux et feuilles.

Les analyses d'association effectuées ont été réalisées avec 16478SNPs de positions physique connue et répartis sur l'ensemble du génome. Leur répartition est présentée dans le tableau ci-dessous:

Tableau 19: Caractéristiques du jeu de 16478 SNPs et la position des marqueurs au sein des gènes (76 accessions). La distance moyenne est celle entre deux SNP consécutifs, en kilobases.

Les 76 accessions re-séquencées représentent au mieux la diversité de Prunus armeniaca. Les analyses sont menées sur les caractères liés à la sensibilité à la maladie sur rameaux et feuilles: lgc, lge, bs, bi, sévérité, criblures, ainsi que leurs transformations pendant deux années consécutives. L'ensemble de 16478 SNPs ont servi à établir la structure populationnelle du panel. Le modèle le plus probable obtenu par STRUCTURE est celui de huit groupes génétiques.

L'apparentement (kinship) entre les individus est faible avec une moyenne de 0,012 et 33% de valeurs nulle.

Le choix du modèle d'association se fait par l'étude des relations entre les valeurs observées et les valeurs prédites par le modèle : plus la distribution est uniforme et se rapproche de la diagonale, meilleur est le modèle. Pour tous les caractères étudiés, le modèle le plus pertinent est le modèle GLM'simple' qui intègre seulement les données

de phénotypage et génotypage. En effet, il est le modèle donnant pour chacune des variables une répartition des p_valeurs observées la plus proche des p_valeurs théoriques (Annexe VII). Le seuil de probabilité retenu pour déclarer une association significative a été de p<0.001. La liste des marqueurs significatifs est reportée en Annexe VIII. Un total de 264 associations (222 SNPs) a été détecté et n'a pas été modifié après correction car l'ensemble des p-valeurs restent significatives au seuil 1.10^-3. Des associations ont été détectées pour toutes les variables (portant sur les rameaux et les feuilles) et sur tous les chromosomes, ce qui suggère une régulation polygénique de ces caractères.

De manière synthétique, le tableau 20 dresse un bilan des associations significatives entre marqueur et caractère observées (Annexe VIII) par variable. Chaque cellule reporte donc le nombre d'associations obtenues au cours des 2 années quelles que soient les transformations. La bissectrice correspond donc aux nombres d'association par variable. Les cellules situées sous la première bissectrice correspondent aux nombre d'associations communes à plusieurs variables: 2 marqueurs impliqués dans la longueur du chancre et de l'entaille, un marqueur impliqué dans le brunissement superficiel et le brunissement interne, et 2 marqueurs pour la sévérité et la criblure.

Ces observations suggèrent que le contrôle des composantes de la résistance des rameaux et des feuilles se fait de façon indépendante. Notons cependant qu'aucun marqueur n'a été détecté pour une variable donnée au cours des deux années.

Le nombre de SNPs significatifs pour chaque variable varie de 20 pour lgc à 90 pour bs. Le pourcentage de variation phénotypique expliqué par ces marqueurs varie de 3,6% à 53%.

Parmi les 42 marqueurs de bi et les 18 marqueurs de criblure, un marqueur colocalise avec la variable lgc, mais aucun chromosome ne contient toutes les variables liées aussi bien à la sensibilité sur rameaux et sur feuilles.

Le chromosome 4 est le chromosome contenant le plus d'associations significatives (47 associations) intégrant les variables liées à la sensibilité sur rameau de 2013 et 2014 ainsi que la variable criblure (Cribmoy13 et CribReglLog13).

Seul le chromosome 8 rassemble des associations pour toutes les variables liées aux deux organes et pour les deux années.

Tableau 20: Nombre d'associations marqueurs-caractères significatives avec le modèle GLM'simple'

3. Discussion et perspectives

L'objectif de nos travaux était de décrire et explorer la variabilité génétique de la sensibilité de l'abricotier à Pseudomonas syringae et d'identifier les régions du génome impliquées dans la résistance ou la tolérance de l'espèce au chancre bactérien. Sur la base des résultats obtenus nous allons structurer la discussion en synthétisant les informations obtenues sur les rameaux, puis sur les feuilles avant de les rapprocher et de terminer en proposant des pistes pour la suite à donner à notre travail.

Inoculation: Les travaux conduits sur la population biparentale `BerBa' et sur le panel de ressources génétiques pendant les années 2013 et 2014, ont systématiquement opposé une inoculation tissulaire avec de l'eau (témoin) et une inoculation à l'aide de suspension bactérienne titrée de Pseudomonas syringae pv. syringae (souche 41A). La comparaison des couples de rameaux témoin vs inoculés montre que les lésions tissulaires observées résultent de la présence des bactéries et de leur mise en contact avec le système vasculaire. Les variables analysées s'avèrent dont être pertinentes pour rendre compte de la réaction des plantes à l'inoculation.

Dans le cadre des essais conduits sur la population bi-parentale « BerBa », et toutes choses étant égales par ailleurs, des différences significatives de comportement ont été observées au sein de la population hybride pour les variables étudiées. Le caractère de résistance ségrége au sein de la population de manière quantitative (contrôle génétique polygénique) avec un effet annuel et des interactions GxAnnée significatifs. Malgré tout les effets années, fonction des conditions de milieu (froids et humidité hivernale),

n'altèrent pas le classement relatif des individus qui reste inchangé et permet d'identifier les matériels les plus intéressants. L'année 2013 a ainsi été caractérisée par des symptômes plus sévères (lgc, lge notamment) que l'année 2014. A des fins de sélection, les individus C026, C041 et C029 ont été parmi identifiés comme les plus résistants au chancre (et au monilia) en cohérence avec les données obtenues en (2012) par Carlos Gil .

Dans le cadre de la collection, une grande diversité de comportements a aussi été mise en évidence entre les accessions étudiées, ainsi que des différences de comportement selon les années. Les accessions potentiellement les plus résistantes restent A1314 « Arrogante », A2311 « Lambertin n°1 » et A2137 « Bakour ». Ces observations vont dans le même sens que celles obtenus par Prunier et al (1987; 1991) sur une collection de 81 cultivars suivis pendant deux années sur les domaines des Bannettes en Avignon et de Mevouillon en Drôme.

Les corrélations entre les différentes variables montrent des liens intéressant entre les mesures de longueur de chancre (lgc/lge), de brunissements (bs/bi) mais aussi entre lgc et bs et bi. Ce résultat nous invite à chercher à exploiter cette diversité de comportement pour concourir à la sélection de matériel de moindre sensibilité.

La mise en relation des données de phénotypage et de génotypage a permis la détection des régions du génome (QTLs) impliquées dans les variables étudiées:

- les analyses de liaison mises en oeuvre sur la descendance bi-parentale BerBa ont ainsi permis de détecter, malgré une profondeur de marquage limitée, 3 QTLs liés aux variables bs2013 et lge2013 sur le GL8, ainsi que 4 autres à la limite du seuil de significativité sur GL1 pour les variables lgc2013, lge2013 et bi2013. Ces résultats confirmés par l'analyse par marqueur révèlent une forte liaison des QTLs avec les marqueurs adjacents.

- Les analyses d'association mises en oeuvre sur 76 accessions re-séquencées représentatives de la collection sont caractérisées par le fait que malgré la forte densité de marqueurs (16478SNPs), il n'y a pas d'influence de la structure du panel variétal sur la qualité du modèle de prédiction. Cette information suggère que les composantes de résistance observées sont « indépendantes » de l'origine phylogéographique des individus. Un total de 209 associations liées aux

différentes variables observées a été obtenu avec des parts de variabilité phénotypique expliquées pouvant atteindre 53%.

- Cependant, aucune liaison stable n'a pu être détectée pour une variable donnée pendant les deux années. Ce manque de stabilité pourrait être expliqué d'une part par les fortes interactions GxE et notamment les situations climatiques très contrastées des 2 années d'étude, et d'autre part par la taille des populations génotypées (87 individus dans le cas de la population bi-parentale et 76 accessions dans le cas de la core-collection) qui n'explore certainement pas toutes les possibilités de recombinaison.

Mécanismes : Bien qu'il existe une corrélation non négligeable entre les différentes variables, leurs liens nécessitent d'être éclairés dans la mesure où ils pourraient nous renseigner sur la nature des mécanismes de résistance impliqués. Les relations entre la mesure classique de la « résistance» avec la longueur de la lésion induite après inoculation et les phénomènes de brunissement observés méritent une attention particulière. Le brunissement interne n'est pas significatif dans la core-collection au cours des deux années d'étude, les interactions GxE ne sont pas significatives pour les deux types de population or l'effet génétique est très hautement significatif au sein de la population biparentale BerBa. Il s'agit donc d'un effet génétique spécifique dont l'impact pourrait nous intéresser et justifier des travaux complémentaires.

En outre, et au-delà des limites liées à l'aspect très préliminaire de la carte génétique et donc de l'approche QTL sur la population BerBa. Les associations mises en évidence en GWAS traduisent des liens indirects entre lésions et brunissements:

- 2013 a été caractérisé par des lésions importantes et des brunissements réduits avec 50 associations en lien avec le brunissement,

- 2014 a été caractérisé par des lésions limitées et des brunissements importants avec des associations plus nombreuses en lien avec le brunissement allant jusqu'à 99 associations qui traduisent d'une part une forte corrélation entre le nombre de candidats détecté et l'intensité du trait et d'autre part une interaction entre ces deux caractères.

Ces brunissements pourraient être la résultante de deux hypothèses. Une première hypothèse liée à l'excrétion par le pathogène d'enzymes de nature protéique

(Chevaugeon J, 1957). Des études ont montré suite à une inoculation de tomates par Fusarium vasinfectum et Gibberella Fujikuroi que la présence d'une toxine appelée `vasinfuscarine' dans le filtrat produit une couleur brune des vaisseaux de la tige et des nervures des feuilles (Stoll and Kern, 1953). Une seconde hypothèse pourrait être basée sur une réaction de la plante. Dans ce cas, les phénomènes de brunissement (bs et bi) résulteraient d'interactions entre l'oxydation des tissus et la synthèse de toxines par la bactérie. A titre d'exemple les phytoalexines (enzymes de détoxication) sont connues pour être impliquées dans ces mécanismes de résistance et produites de la voie de biosynthèse des flavonoïdes et isoflavonoïdes. Ces molécules sont donc des composantes potentielles de la résistance quantitative. La présence d'un effet génétique au sein de la BerBa pourrait être liée à la synthèse de ses molécules. En effet des études biochimiques, dans le pathosysthème Arabidopsis-Botrytis, ont montré que le niveau de camalexine (phytoalexine) était corrélé à la présence de QTL (Denby et al., 2004) suggérant l'implication des gènes de la voie des phytoalexines dans la résistance quantitative, par contre des mutants d'Arabidopsis thaliana, incapables de produire des phytoalexines sont sensibles à un champigon Alternaria brassicicola mais capables de développer une résistance vis-à-vis de plusieurs pathogènes notamment la bactérie Pseudomonas syringae (Glazbrook, 1999). Des investigations autour de cette hypothèse telle que l'analyse des flavonoïdes pourraient consolider et éclaircir nos résultats.

Les résultats obtenus sur le comportement des individus à l'inoculation par Pseudomonas syringae, traduisent l'extrême fragilité des variétés actuellement cultivée et notamment la sensibilité du fond génétique européen continental auquel est rattaché la variété Bergeron. Il serait primordial de valoriser le potentiel de résistance mis en évidence chez les variétés A2137, et A1314, et chez les hybrides BerBa C026 et C041 au cours des trois années d'évaluation (i) en continuant leur évaluation pour évaluer la robustesse du phénotypage et (ii) en caractérisant en même temps leur sensibilité à d'autres maladies comme le monilia et enroulement chlorique dans une logique de culture sous faible niveaux d'intrants afin d'identifier les sources de résistance les plus résilientes.

Inoculation : Pour les feuilles comme pour les rameaux, les résultats obtenus suite à l'inoculation tissulaire des feuilles de la population GoMo et de la core-collection sont caractérisés par une réaction due à la présence de la bactérie par comparaison avec le témoin eau. Un effet hautement significatif de l'inoculation a été systématiquement mis en évidence pour les variables mesurées. Comme précédemment nous pouvons donc considérer que les différences entre génotypes étudiés résultent de l'inoculation.

Dans le cadre de la population bi-parentale GoMo, les parents Goldrich et Moniqui ont été inoculés comme les hybrides de la descendance. Or les deux variétés ont présenté des comportements similaires après inoculation, ce qui ne correspondait pas au comportement attendu. En effet, nous avions observé en verger une sensibilité de Goldrich à la criblure sur les feuilles situées à la base des rameaux (tronçon préformé, préférentiellement) alors que nous n'avions rien observé sur les feuilles de la variété Moniqui cultivée dans les mêmes conditions. Cette sensibilité à la criblure avait été reliée, lors d'analyses préliminaires, à la présence de bactéries à Pseudomonas. Effectivement, ces bactéries épiphytes déjà présentes dans les bourgeons, pourraient coloniser les nouvelles feuilles pendant leur émergence au printemps (Crosse, 1966). Pour simuler cette contamination nous avons mis en place un test par blessure qui s'est avéré trop sévère et traduire une résistance des tissus du limbe à une attaque bactérienne. Nous pouvons donc considérer que la sensibilité tissulaire n'explique pas le syndrome de criblure, mais nous pouvons imaginer que les différences de comportement entre les variétés Goldrich et Moniqui pourraient être liées à la nature des portes d'entrées mobilisées par les bactéries et notamment les bourgeons.

Toutefois, les observations réalisées sur la descendance GoMo ont mis en évidence une ségrégation dans la réaction de la population hybride. Des effets « génétique » », effets « année» et des interactions « génotype x année» ont été enregistrés pour les deux caractères « sévérité et criblure » étudiés.

Génotypage : Dans le cadre de la population GoMo et malgré l'absence de différence entre les parents, des QTLs ont été détectés par analyse de liaison dont un stable en 2013 et 2014 et localisé sur le chromosome 8.

Dans le panel de RG, les analyses d'association ont permis la mise en évidence deux zones communes entre la sévérité et la criblure au niveau du GL1 et GL8.

Mécanismes: Même si nous n'avons pas pu mimer la sensibilité à la criblure de Goldrich, par analogie avec ce qui a été observé dans le cas de la résistance de la tomate à Pseudomoans syringae pv. Tomato. Nous devons constater qu'existe des mécanismes latents héritables et à l'état hétérozygote chez les variétés d'abricotier qui vont permettre à la plante de réagir à une inoculation bactérienne au niveau des limbes. Au regard du nombre de SNP candidats et de leur localisation, il serait intéressant de mettre en relation les réactions de la plante avec les mécanismes de régulation des métabolismes secondaires. On peut en effet supposer que ces QTLs liés à l'inoculation sont basés sur des gènes contrôlant l'activité des polyphénol oxydases et l'accumulation des phénols au niveau des feuilles. En effet, les phénols extraits de plantes résistantes inoculées sont connus pour inhiber la croissance du pathogène (Bashan et al., 1987). D'autre part, l'ouverture des stomates et leur densité, ou le degré d'hydrophobicité de la cuticule sont aussi connus pour avoir des effets importants sur la résistance à la maladie tout comme la surface et l'inclinaison foliaire (Melotto et al., 2006). Sur tomate deux QTLs dont l'un se situe à côté d'un cluster d'un gène de résistance et l'autre capable de diminuer la progression des symptômes en raison d'une augmentation du taux de maturation vasculaire (Coaker GL et al., 2002), ont été détectés et sont fortement liés à la résistance au chancre bactérien causé par Clavibacter michiganensis.

Quelles relations entre les variables étudiées et quelles conséquences sur l'appréciation de la sensibilité?

L'ensemble des caractères étudiés (lgc, lge, bs, bi, sévérité, criblure) dans les deux types de population (biparentale ou collection) montre une variation continue et un déterminisme de type polygénique. L'effet marqué du génotype sur les populations biparentales nous indique que les caractères observés ségrégent de manière quantitative au sein des populations choisies. On a aussi pu mettre en évidence une variabilité

génétique large au sein de la core-collection pour la plupart des variables étudiées, ce qui constitue un substrat de travail intéressant.

La comparaison entre les observations de résistance tissulaire sur les deux types d'organes nous conduit à considérer qu'il s'agit de deux caractères distincts, tous deux quantitatifs et non liés à la structure phylogénétique du panel étudié. En effet, les analyses en composantes principales sur l'ensemble des variables mesurées (Annexe IX) montrent que les variables ne sont pas liés et les approches génétiques impliquent des régions du génome différentes. Les résultats des études d'association vont dans le même sens que ceux obtenus sur les populations biparentales :

- les chromosomes 2, 4, et 8 possèdent la particularité d'avoir un nombre important de candidat liés à la longueur du chancre et au brunissement, et ils sont aussi caractérisés par de fortes interactions entre les variables

- le chromosome 1 contient le maximum de candidats liés à la résistance sur feuilles.

Sur feuilles comme sur rameaux, le modèle de résistance semble être une superposition d'effets faibles liés à des composantes de résistance à effet partiel (QTLs) (Poland et al., 2009). Enfin ces résultats ne signifient pas qu'une sélection basée sur lgc va favoriser une sélection des autres variables.

Aspects génétiques : Toutes les associations identifiées durant ce travail représentent autant de cibles d'intérêt pour mieux comprendre les déterminants génétiques. Cependant, il est important de noter que dans ces études d'associations, les « core-collections » restent des échantillons de taille restreinte et qu'il est nécessaire de valider les résultats obtenus, en testant un plus grand nombre d'accessions. En effet, d'après Korte et Farlow (2013) sur Arabidopsis, il est nécessaire pour avoir une puissance de détection correcte pour une association avec une variance phénotypique de 5% d'étudier 800 individus.

Au niveau des populations biparentales, et malgré la robustesse des marqueurs SSR, leur nombre est trop limité dans le cas de la population BerBa pour que des conclusions

pertinentes soient dressées. Par contre d'ores et déjà des pistes apparaissent et la densification du marquage en cours devrait renforcer la qualité des résultats. Une densification par des marqueurs SNPs, en cours d'élaboration, devrait accentuer la puissance de l'analyse et de faire le pont entre les résultats de la GWAS et le biparental.

De point de vue du phénotypage, une nouvelle méthode de lecture des symptômes sur feuilles, par des approches à haut débit pourrait aussi être envisagée afin de quantifier la sévérité. L'imagerie par fluorescence de la chlorophylle (Rousseau et al., 2013) a permis grâce au calcul du rendement quantique maximum de photosystème II de caractériser des plants de haricot cv. Flavet suite à une inoculation bactérienne. Cette technique mériterait d'être testée afin de minimiser l'effet d'observateur et d'accroitre potentiellement la vitesse de lecture.

S'agissant des mécanismes de résistance aux Pseudomonas syringae, nos dispositifs expérimentaux aussi bien sur rameaux que sur feuilles ont altéré les barrières physiques de la plante laissant la bactérie en contact direct avec le système vasculaire. Cette approche rend assez bien compte des comportements en verger dans le cas des inoculations sur rameaux. Par contre, elle ne renseigne pas sur les portes d'entrées des bactéries qui restent un enjeu majeur. Une étude complémentaire par inoculation des bourgeons à un stade précoce permettrait peut être de mimer la sensibilité typique de Goldrich et pouvoir traiter la question des portes d'entrées propres au syndrome de criblure sur cette variété.

Maîtrise des dispositifs expérimentaux dans le temps: Enfin, une contrainte non contrôlée, a engendré la perte d'une partie de l'information génétique au sein des populations biparentales du fait des facteurs environnementaux. En effet, sur un total de 300 individus de BerBa plantés en 2004, 224 individus seulement ont été analysés suite à la perte de matériel due au dépérissement bactérien et à l'enroulement chlorotique.

Variabilité de l'agent pathogène : Les résistances partielles, ou quantitatives sont censées être plus robustes et sommes-toutes plus difficiles à contourner que des résistances monogéniques vis-à-vis des différents isolats du pathogène. Toutefois des interactions de type spécifique ont pu être démontrées dans le cas d'autres agents pathogènes(Parlevliet, 1988). Or, de manière préliminaire, dans notre étude nous avons travaillé avec une seule souche (41A), agressive et très virulente, en faisant varier le

génotype de l'abricotier. Même si la démarche a été réfléchie en utilisant une souche naturelle très agressive. Il est d'importance majeure d'intégrer la variabilité de l'agent pathogène dans la logique de recherche de résistance stables et durables. L'existence d'une telle interaction pourrait signifier que le pathogène est susceptible d'éroder la résistance partielle, ce qui remettrait en cause sa durabilité. Dans ce contexte, une étude sur une échelle plus faible de plusieurs combinaisons (souches x variétés) notamment les souches portant les « woody genes» qui permettent à la bactérie de pénétrer le système vasculaire de l'hôte (Lamichhane et al., 2014) serait utile pour évaluer le potentiel d'adaptation à la résistance de Pseudomonas syringae. Cette hypothèse est soutenue par l'existence d'interactions isolat/cultivar et l'existence de QTL race-spécifique (Marcel TC et al., 2008).

CONCLUSION

Au cours de ce master, nous nous sommes intéressés à la variabilité génétique de la résistance de l'abricotier à Pseudomonas syringae sur feuilles et sur rameaux. Deux pseudo-F1 et un panel de ressources génétiques (76 accessions) ont été étudiés suite à des inoculations tissulaires. Le phénotypage a révélé une forte variabilité des symptômes en lien avec des facteurs génétiques d'origine polygénique. La caractérisation génétique des individus à l'aide des marqueurs SSR pour les populations biparentales et par l'analyse d'association (GWAS) a permis de localiser des zones du génome en lien avec les composantes de résistance observées, et de démontrer que les déterminants génétiques de la sensibilité des limbes et des rameaux étaient distincts. L'analyse d'association nous a permis d'identifier 222 SNPs candidats dans ou à proximité de gènes candidats. Une forte variabilité interannuelle était attendue et a été observée pour le phénotypage, d'autant que les conditions climatiques ont été contrastées entre les années d'études. Cette variabilité s'est retrouvée aussi dans l'identification des régions du génome impliquées. D'ores et déjà des régions candidates ont été ciblées mais elles devront être validées et consolidées notamment dans le cas de la sensibilité au chancre sur rameaux (population biparentale BerBa), avant d'envisager leur exploitation dans une démarche de sélection assistée par marqueurs.

Pour aller plus avant, il va être indispensable d'une part de densifier le marquage moléculaire dans le cas des descendances bi-parentales et plus particulièrement dans le cas de la BerBa et, d'autre part, de consolider les résultats en travaillant l'interaction avec la variabilité de l'agent pathogène afin de s'assurer en l'amont de la robustesse des constructions génétiques mises en oeuvre.

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ANNEXES

Annexe I : Liste des variétés et des pays d'origine représentant les 76 accessions du panel re-séquencé dans le cadre du projet ABRIWG.

Annexe II : Visualisation des quatre mesures effectuées sur rameaux après inoculation tissulaire de P. syringae (souche 41A), méthode Prunier.

2-Longueur de la blessure résultant de l'entaille: après décollement de la languette et léger pelage.

3-Brunissement superficiel: après avoir ôté l'écorce, tissus verts de l'année. 4-Brunissement interne : après un décorticage profond partant de l'entaille.

Annexe III: Repères visuels permettant la notation des symptômes de sévérité sur feuilles d'abricotier trois semaines après inoculation de P. syringae (souche 41A) sur des blessures réalisées par perforation à l'aide d'une brosse métallique. Détail du pourcentage de nécrose représenté par chacune des classes:

0= 0 à 5%, 1= 5 à 10%, 2= 10 à 25%, 3= 25 à 50%, 4= 50 à 75%, 5= 75 à 100%

Annexe IV : Repères visuels permettant la notation des symptômes de criblures sur feuilles d'abricotier trois semaines après inoculation de P. syringae (souche 41A) sur des blessures réalisées par perforation à l'aide d'une brosse métallique. Détail de notation de chaque classe:

0= absence de criblure, 1= présence de criblures au niveau des point de perforation, 2= dessèchement de la partie nécrosé et formation de trous, 3= forme dentelée de la criblure.

Annexe V: Cartographie de type « père-mère» de la population Bergeron x Bakour obtenue à l'aide de marqueurs SSRs parmi 89 individus. (52 marqueurs chez Bakour et 39 chez Bergeron). Les noms des chromosomes indiquent s'il s'agit du père « BK » pour Bakour ou de la mère « BG » pour Bergeron. Les positions sont données en centimorgans

Annexe VI : Cartographie de type « père-mère» de la population Goldrich x Moniqui (187 individus), réalisée à l'aide de 93 marqueurs SSR dans Map Maker (fonction Kosambi). La dernière lettre du nom des chromosomes (G1 à 8) indique s'il s'agit du père « G» pour Goldrich ou de la mère « M » pour Moniqui. Les positions sont données en centimorgans. Auteur : P. LAMBERT

Annexe VII: QQ plot représentant la distribution des p_valeurs obtenues selon les 3 modèles testés et permettant de comparer les différents modèles testés au sein d'un panel de 76 accessions et de 16478 SNPs.

Annexe VIII: Synthèse des marqueurs SNPs en association (264 associations) avec toutes les variables mesurant les symptômes sur feuilles et rameaux de 76 accessions d'abricotier après inoculation de P. syringae pv. syringae (souche A41). Position en paire de base. «P brute » obtenue dans TASSEL à l'aide d'un GLM `simple'. « P corrigé» obtenue par un FDR sur les p_valeurs < 1.10^-3. R² du modèle: part de variation du phénotype expliquée par le modèle d'association. DL : déséquilibre de liaison entre marqueurs deux à deux. La couleur rose indique la redondance de deux marqueurs dans les résultats.

Variables	SNP	chromosome	Position	P brutes	P corrigé	R² modèle	DL (r²)
	2476706	7	15947844	7,59E-05	8,09E-04	0,0585531	0,105
	1555612	4	17094864	4,90E-04	8,09E-04	0,04843911	0,015
	908812	2	23475380	6,20E-04	8,09E-04	0,04711266	0,015
	2423985	7	12630465	6,79E-04	8,09E-04	0,03748743	0,02
	2286025	6	28256270	7,04E-04	8,09E-04	0,04639861	0,06
bi2013	1094325	3	8838123	7,84E-04	8,09E-04	0,03669901	0,01
	1353437	4	3363345	7,84E-04	8,09E-04	0,03669901	0,01
	1714510	5	4963571	7,84E-04	8,09E-04	0,03669901	0
	2735134	8	12294229	7,84E-04	8,09E-04	0,03669901	0,025
	2899405	8	21356043	7,84E-04	8,09E-04	0,03669901	0
	2382827	7	9502032	8,09E-04	8,09E-04	0,04560325	0,075
	52997	1	3498650	8,25E-09	2,78E-04	0,50281522	0,015
	696292	2	5494791	8,25E-09	7,16E-04	0,50281522	0,035
	803171	2	17358860	8,25E-09	8,15E-04	0,50281522	0,015
	1196231	3	17218787	8,25E-09	8,46E-04	0,50281522	0,04
	2813701	8	16935578	8,25E-09	8,73E-04	0,50281522	0,115
	2815604	8	17107616	8,25E-09	9,18E-04	0,50281522	0,02
	2899197	8	21349210	8,25E-09	9,18E-04	0,50281522	0
	1558694	4	17443049	1,89E-08	9,18E-04	0,53080555	0,03
	1770396	5	10669796	2,42E-08	9,18E-04	0,52588876	0,155
	391616	1	32764095	2,90E-08	9,18E-04	0,52222462	0,025
	744018	2	12465179	2,97E-08	9,30E-04	0,52171637	0,025
bi2014
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	2332591	7	4196554	5,12E-08	2,71E-07	0,51047768	0,03
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1444348	4	8536825	4,73E-04	3,90E-05	0,27808425	0,11
1448326	4	8770920	6,67E-04	1,11E-04	0,26740025	0,115
1448757	4	8786462	6,67E-04	2,47E-04	0,26740025	0,21
1476872	4	10441340	8,97E-04	2,78E-04	0,20715948	0,04
770829	2	14961919	9,10E-05	2,96E-04	0,32696978	0,075
1558694	4	17443049	5,57E-04	3,37E-04	0,27301238	0,03
1770396	5	10669796	8,15E-04	3,91E-04	0,26115504	0,155
52997	1	3498650	8,65E-04	4,18E-04	0,2082637	0,015
696292	2	5494791	8,65E-04	4,28E-04	0,2082637	0,035
803171	2	17358860	8,65E-04	4,84E-04	0,2082637	0,015
1196231	3	17218787	8,65E-04	5,42E-04	0,2082637	0,04
2813701	8	16935578	8,65E-04	7,10E-04	0,2082637	0,115
2815604	8	17107616	8,65E-04	8,46E-04	0,2082637	0,02
2899197	8	21349210	8,65E-04	8,46E-04	0,2082637	0
742544	2	12373117	7,42E-05	9,42E-04	0,22527927	0,005
2361655	7	7731551	1,72E-04	2,95E-04	0,20507033	0,015
2370914	7	8608039	5,62E-04	7,63E-04	0,1758604	0,01
1180834	3	16305937	6,77E-04	9,30E-04	0,21281667	0,06
2404023	7	10975779	9,24E-04	9,30E-04	0,20473881	0,155
2022061	6	7407760	2,37E-05	9,30E-04	0,25210697	0
1949989	6	2325676	6,15E-04	9,30E-04	0,21527478	0,045
1608554	4	23895658	1,74E-04	9,30E-04	0,25668574	0,005
1421121	4	7073409	5,11E-04	9,30E-04	0,22442783	0,07
1489018	4	11144134	5,11E-04	9,30E-04	0,22442783	0,015
1450117	4	8839810	7,55E-04	9,30E-04	0,26352906	0,225
1611282	4	25099459	8,66E-04	2,78E-04	0,25923895	0,08
1386477	4	5093158	9,00E-04	3,65E-04	0,25800601	0,01
1118675	3	11400133	9,28E-04	7,66E-04	0,25703776	0,095
233024	1	21443209	1,82E-04	8,46E-04	0,24600794	0,075
2209184	6	24202531	2,43E-04	9,53E-04	0,19658217	0,01
1870608	5	16331707	2,73E-04	1,11E-04	0,23591621	0,105
230787	1	21295573	3,63E-04	8,13E-04	0,22875751	0,18
2050820	6	9961695	3,99E-04	3,66E-04	0,22635181	0,015
87107	1	5954602	4,79E-04	7,30E-04	0,22168589	0,29
1847228	5	14947169	8,22E-04	7,30E-04	0,20776974	0,065
1091732	3	8593936	8,72E-04	9,18E-04	0,16487056	0,055
1108050	3	10555410	8,99E-04	9,30E-04	0,20544958	0,015
929219	2	24508541	8,10E-04	9,42E-04	0,20816243	0,135

	1213858 949911	3 2	18351878 25603517	8,62E-04 8,80E-04	9,53E-04 3,75E-04	0,20655097 0,20598936	0,01 0,125
sevmoy13	2209184 2750694	6 8	24202531 13420876	1,44E-04 4,85E-04	4,38E-04 4,69E-04	0,20942599 0,17954497	0,01 0,055
	233024	1	21443209	4,95E-04	5,82E-04	0,2208589	0,075
	230787	1	21295573	5,22E-04	6,07E-04	0,21947982	0,18
	2750694	8	13420876	2,45E-05	7,12E-04	0,25132413	0,055
	973687	3	199885	3,28E-04	9,30E-04	0,23130356	0,015
	339535	1	29927087	5,41E-04	9,32E-04	0,21855987	0,08
	230787	1	21295573	6,45E-04	9,42E-04	0,21404287	0,18
SevReglog13	2209184	6	24202531	6,49E-04	9,30E-04	0,17226678	0,01
	2856653	8	19148623	7,60E-04	9,30E-04	0,20980649	0,055
	1184668	3	16465701	8,18E-04	9,37E-04	0,2078881	0,035
	14849	1	890550	9,01E-04	9,42E-04	0,20537402	0,125
	2574030	7	21044552	9,86E-04	9,92E-04	0,20302481	0,07

Annexe IX : ACP sur l'ensemble des variables mesurées en 2014 sur rameaux et feuilles sur 76 accessions du panel de Ressources Génétique ré-séquencées - A : nuage des individus selon les 2 axes principaux. B : Représentation des variables selon les 2 axes principaux