Memoire Online - Hépatite virale B: intérêt de l'utilisation des échantillons de sang séché dans l'extraction de l'ADN viral

INTERET DE L'UTILISATION DES ECHANTILLONS DE SANG SECHE DANS L'EXTRACTION DE L'ADN VIRAL

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Soins Infirmiers

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Bactériologie-Virologie

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Soins Infirmiers

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Hygiène du milieu

Soins Infirmiers

En présence des Maîtres de cette école, de mes chers Condisciples, devant l'effigie d'Hippocrate, je promets et je jure, au nom de l'Être Suprême, d'être fidèle aux lois de l'honneur et de la probité dans l'exercice de la Médecine.

Je donnerai mes soins gratuits à l'indigent et n'exigerai jamais un salaire au-dessus de mon travail. Je ne participerai à aucun partage clandestin d'honoraires.

Je dirigerai le régime des malades à leur avantage selon mes forces et mon jugement, et m'abstiendrai de tout mal comme de toute injustice.

Admis à l'intérieur des maisons, pour l'utilité des malades, mes yeux ne verront pas ce qui s'y passe, ma langue taira les secrets qui me seront confiés, regardant la discrétion comme un devoir en pareil cas, et mon état ne servira pas à corrompre les moeurs ni à favoriser le crime.

Je passerai ma vie et exercerai mon art dans l'innocence et la pureté. Je ne permettrai pas que les considérations de religion, de race, de parti ou de classe sociale viennent s'interposer entre mon devoir et mon patient.

Même sous la menace, je n'admettrai pas de faire usage de mes connaissances médicales contre les lois de l'humanité.

Respectueux et reconnaissant envers mes Maîtres, je rendrai à leurs enfants l'instruction que j'ai reçue de leurs pères.

Si je remplis ce serment sans l'enfreindre, qu'il me soit donné de jouir heureusement de la vie et de ma profession, honoré à jamais parmi les hommes.

DEDICACES

Trouves ici le fruit de tes sacrifices consentis pour mon éducation, l'expression de mon amour et de ma gratitude pour l'affection avec laquelle tu m'as toujours entouré ;

Tu as cultivé et transmis en moi les meilleures valeurs qui soient. En tout tu es un exemple.

La souffrance de ta disparition précoce m'a ouvert les yeux et je crois que si tu étais là, tu devrais être fier de ton petit garçon. Tu me manques papa !

A mes frères et soeurs, Dominique, Bonaventure, Pacifique, Jean Paul, Fulbert, Corneille, Fabien et Paulette, pour les fous rires et les pleurs de cette enfance heureuse à la maison comme à l'école. Que Dieu vous donne une longue vie et une bonne santé.

REMERCIEMENTS

Pour toutes ces années ensemble en exil ; ta confiance et ton appui inestimable m'ont toujours accompagné.

Soucieux de ma réussite, vous n'avez jamais manqué une occasion de me manifester votre amour, votre soutien et votre confiance en moi. Tout cela a servi à me forger comme je peux et voici le résultat.

A Pacifique, Olivier, Céline, Marie Aimée, Juvénal et Emmanuel Séraphin ;

Que l'exemple donné par l'aboutissement de ces 7 ans d'études supérieures soit pour vous une source d'encouragement. Je sais que vous ferez mieux.

A mes amis de l'association des étudiants rwandais au Congo, notamment : Augustin, André, Jean Louis, Jean Pierre, Pierre Claver et Jean d'Amour;

François HIGIRO, Emmanuel BAGARAGAZA, Egide RWAMATWARA, Diego P. HATEGEKIMANA, Casimir NTEZIRYIMANA, Augustin RWAMUCYO, J.D. Mandela, Jean de Dieu NTEZIMANA et Cyprien HABYARIMANA;

Pour votre soutien moral et financier. Que nos liens d'amitié, de solidarité et de fraternité soient toujours la priorité dans nos relations.

Eliot, Jisca, Prince, Judy, Akim, Raïssa, Leticia, Céleste, Jean Paul, Axel, Cyrille, Patricia, Arnaud, Mita ;

En souvenir de la bonne humeur et des encouragements réciproques qui ont marqués ces moments inoubliables.

Jean Marc BUTOYI, Armel IBAMBA, Armel MAPOUKOU, Gaston EKOUYA, Bernice SITOU, Darius MBOU ESSIE, Engoba MOYEN, Vincent NSABIMANA, Sixbert ILYIVUZE, Tey NKANGA et Nelly MPANZOU ;

Vos remarques et votre contribution à ma formation se passent de tout commentaire.

Ataboho EBATETOU, Freddy POUKI, Jysses KOKOLO, Boris OTOUANA, Lysette NGOUA, Alain NGABOGO, Estina AKOKO, Autis GOMO KOMBO, Ange BIMANGOU, Karen OBONDZO, Pamela BODZONGO, Yvette GAJOU, Erica AKOBANDE, Ngala ITOUA-NGAPORO, Eric NDAYISHIMIYE et Béranger NDZON.

Nous avons eu le privilège de bénéficier de vos enseignements et nous avons particulièrement apprécié vos qualités pédagogiques et humaines.

A tous les chefs des services cliniques de l'Hôpital Général de LOANDJILI, en particulier les Docteurs Omer NKODIA, Firmin BOSSALI, Godefroy KOUBEMBA, Bona KIMBEMBE, Jean Bertin NTSIBA et Alain BIKINDOU ;

La très bonne humeur et l'ambiance du groupe m'ont permis de mener mon travail de façon agréable. Les discussions, les remarques et les commentaires ont été sources d'idées et ont contribué au développement et l'amélioration de ce travail.

A toute l'équipe du laboratoire et à tous les médecins de l'HGL, notamment ; les Docteurs Mireille YAWENDA, Anicet MAVOUNGOU, Serge KATENDE, Joseph KESENGUE, Stéphane GNIUNDOU, Guy MALANDA, Junior WOLPH et Monsieur Anicet MAPAKOU ;

Vous avez disposé de votre temps et de votre expérience pour construire en moi cette passion pour l'exercice de notre métier.

A toute l'équipe de recherche du service de virologie/UPRES EA 3610 Faculté de médecine, Université Lille II, CHRU Lille, Centre de Biologie Pathologie et Parc EURASANTE, notamment Famara SANE, Stéphanie FRONVAL, Pierre SAUTER, Anne GOFFARD et Delphine CALOONE ;

Pour m'avoir accueilli chaleureusement parmi vous. J'espère avoir été à la hauteur de votre confiance dans la réalisation de ce travail qui n'aurait pu être effectif sans votre précieuse contribution.

Au Docteur Donatien MOUKASSA, Directeur des affaires médicales de l'HGL, chef de service de laboratoire de l'HGL et co-directeur,

Pour m'avoir accueilli au sein de votre équipe, pour avoir initié et codirigé ce travail, pour les nombreuses discussions que nous avons eues, pour votre sensibilité, votre égard, le respect et la sympathie dont je fus témoin et pour m'avoir intéressé au travail de laboratoire. Veuillez trouver, cher maitre, l'expression de ma profonde gratitude.

Pour votre aide logistique dans l'aboutissement de ce travail. Votre sens d'ouverture et votre logique de travail resteront pour moi un exemple à suivre.

Au Professeur Didier HOBER, Chef de service de Virologie au Centre de Biologie Pathologie au CHRU de Lille et co-directeur,

Pour avoir accepté de travailler avec nous, pour la confiance que vous m'avez accordée et votre encadrement durant mon séjour à Lille, en me faisant partager votre enthousiasme pour la recherche et votre grande expérience.

Nous vous sommes reconnaissant d'avoir accepté de diriger ce travail. La richesse de vos enseignements et votre rigueur dans le travail ont constitué une source d'instructions et d'admiration.

Au Professeur Ange Antoine ABENA, Doyen de la faculté des sciences de la santé,

Etre votre élève est un grand privilège. Nous avons découvert un homme de grande droiture et plein d'humanisme. Votre calme et votre simplicité font de vous un homme au delà du maitre auquel nous aimerions ressembler. Veuillez agréer, cher maitre, l'expression de notre profond attachement.

Veuillez agréer, cher maitre, l'expression de notre profonde gratitude et notre respect, pour la bienveillance que vous avez toujours manifesté à notre égard.

Vous nous faites un grand honneur en acceptant de présider le jugement de ce travail. Qu'il nous soit permis de vous remercier très respectueusement.

Nous sommes très honorés de vous compter parmi les juges de ce travail. Vos remarques et contributions permettront, sans doute, d'améliorer ce travail.

A mon pays natal, le RWANDA, tu as dirigé mes premiers pas. Mon souhait est que tu sois toujours un havre de paix.

A mon pays d'accueil, le CONGO, tu es et tu resteras ma deuxième patrie. J'ai été émerveillé par ton hospitalité. Que Dieu bénisse le CONGO.

LISTE DES ABREVIATIONS

LISTE DES TABLEAUX

Tableau II : Différentes situations sérologiques rencontrées au cours de l'infection

Tableau III: Tableau récapitulatif des caractéristiques épidémiologiques de la

Tableau VII : Répartition de la quantité d'ADN total en fonction du statut VHC

Tableau IX: Répartition des résultats de la PCR du VHB des sujets du groupe I

Tableau X: Répartition des résultats de la PCR du VHB des sujets du groupe II

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Ultra structure du virus de l'hépatite B en représentation schématique

Figure 3. Répartition de la Prévalence de l'infection à VHB dans le monde

Figure 5. Cinétique des marqueurs sériques au cours d'une hépatite virale B chronique

Figure 8.Comparaison des rendements d'ADN total obtenu apres extraction par le

Figure 9: Courbe standard de la quantité d'ADN extrait pour le témoin non connu

Figure 10. Courbe standard de la quantité d'ADN total extrait pour l'ensemble de la

SOMMAIRE

INTRODUCTION..........................................................................1

I. GENERALITES..........................................................................4

1. Généralités sur l'infection à VHB.................................................. 5

2. Génotypes du VHB....................................................................32

II. MATERIELS ET METHODES.......................................................40

1. Cadre de l'étude.......................................................................41

2. Types et Période de l'étude...........................................................43

3. Méthodes...............................................................................43

III. RESULTATS.............................................................................50

1. Fréquences..............................................................................51

2. Paramètres épidémiologiques........................................................51

3. Paramètres biologiques...............................................................53

4. PCR du VHB...........................................................................58

IV. DISCUSSION............................................................................62

1. Analyse de la Méthodologie..........................................................63

2. Fréquences..............................................................................64

3. Structure de la population..............................................................65

4. PCR DU VHB..............................................................................66

C0NCLUSION ET PERSPECTIVES........................................................70

RESUME.......................................................................................72

ABSTRACT...................................................................................74

REFERENCES................................................................................76

ANNEXES............................................................................................................................81

INTRODUCTION

Les hépatites virales sont des infections systémiques atteignant préférentiellement le foie et entrainant des altérations hépatocytaires, des lésions inflammatoires et une élévation des transaminases sériques. Outre l'Epstein Barr Virus, le cytomégalovirus et certains arbovirus qui n'atteignent que secondairement ou occasionnellement le foie, six virus répondent à cette définition : le Virus de l'Hépatite A (VHA), Virus de l'Hépatite B (VHB), Virus de l'Hépatite C (VHC), Virus de l'Hépatite Delta (VHD), Virus de l'Hépatite E (VHE) et le TTV (Transfusion Transmitted Virus) [1].

Parmi ces virus hépatotropes, seuls le VHB, le VHC et le VHD associé au VHB peuvent entrainer une hépatite virale chronique, pouvant se compliquer de cirrhose et de Carcinome Hépatocellulaire (CHC).

Dans le monde, 2 milliards de personnes sont infectées par le VHB [2] et environ 360 millions de personnes sont porteuses chroniques. Selon un rapport de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) paru en 2000 environ 520 000 décès chaque année seraient dus à une hépatite à VHB [2]. Il s'agit d'un problème mondial de santé publique. Au Congo, la prévalence de l'hépatite B est différente selon les études. Elle varie entre 6,5 et 15% [3, 4, 5].

Dans les pays en voie de développement, notamment le Congo où les structures de biologie moléculaire sont rares, seule la sérologie est utilisée, notamment la recherche de l'Ag HBs qui permet de détecter le virus mais sans préjuger de sa réplication. La détection de l'ADN viral par la réaction de polymérisation en chaine (PCR) représente un important progrès technique, permettant de mettre en évidence la présence de l'acide nucléique viral dans le sérum des sujets infectés par le virus de l'hépatite B, même lorsque celui- ci est en très faible quantité.

Certains auteurs ont signalé que l'aptitude à détecter l'ADN du VHB dans le sérum a une valeur pronostique en ce qui concerne l'évolution des infections aiguës et chroniques dues au VHB [6, 7]. La méthodologie peut permettre la détection de l'ADN du VHB après clairance de l'AgHBs [8] ou la détection du VHB en l'absence de marqueur sérologique [9]. Cependant, on n'a pas encore établi de relation entre les marqueurs sérologiques et les taux d'ADN du VHB.

L'efficacité du traitement antiviral utilisé pour les patients porteurs du VHB peut aussi être évaluée grâce aux marqueurs sérologiques ou par une mesure de la fonction enzymatique du foie. Néanmoins, le dosage quantitatif de l'ADN viral du VHB dans le sérum ou le plasma est considéré comme la mesure la plus directe et la plus fiable de la réplication virale [10]. On a montré qu'une chute rapide et persistante des taux d'ADN du VHB chez des patients recevant un traitement à base d'interféron alpha, de lamivudine ou de Ganciclovir^® est un facteur prédictif d'évolution favorable sous traitement [11].

La surveillance des taux d'ADN du VHB permet de prédire le développement d'une résistance à la lamivudine. Par conséquent, un test quantitatif offrant un dosage de l'ADN du VHB est un outil utile que l'on peut utiliser en association avec d'autres marqueurs sérologiques lors de la prise en charge d'une infection par le VHB.

Le cout élevé de l'acheminement des échantillons vers les pays qui disposent des structures de biologie moléculaire, est l'un des facteurs qui limitent le diagnostic virologique et par conséquent le suivi des malades ayant une hépatite chronique B au Congo.

Le but de cette présente étude est d'évaluer l'utilisation des échantillons de sang séché sur les papiers buvards en vue d'une élution de l'ADN viral, afin de réaliser l'amplification des acides nucléiques du Virus de l'Hépatite B.

Ø Evaluer les avantages de l'utilisation des échantillons de plasma et de sang total séchés sur papier buvard ;

Ø Mettre au point l'acheminement de prélèvements biologiques de patients pour rechercher l'ADN viral par PCR.

GENERALITES

1. GENERALITES SUR L'INFECTION à VHB

En 1964, Baruch Samuel BLUMBERG, médecin et biochimiste américain, travaillant pour le National Institute of Health, s'intéresse à la variabilité antigénique entre les individus et au sein des différentes populations. Il émet l'hypothèse selon laquelle des patients ayant reçu un grand nombre de transfusions sanguines doivent avoir développé des anticorps contre les antigènes qu'ils ne possèdent pas. Il met en présence des échantillons de sang de patients polytransfusés avec des sérums de personnes indemnes de toute transfusion. Il observe alors, en immuno-diffusion, une ligne de précipitation pour chaque système antigène-anticorps révélé.

Ensuite, il remarque qu'un échantillon sanguin d'un patient hémophile polytransfusé présente la caractéristique de former une ligne de précipitation originale avec un seul sérum, celui d'un Aborigène australien. Ce sérum contient donc un antigène qui n'existe pas dans les autres lots ; BLUMBERG le baptise : « Antigène Australia ». Ses travaux consistent alors à établir la répartition de cet antigène dans diverses populations : un sérum sur 1000 est positif en Amérique du Nord contre 15 sérums sur 100 dans certaines îles du Pacifique ; il existe donc une variabilité dans la distribution de cet antigène. Reste à trouver l'origine de ce portage antigénique.

En 1966, le changement de statut sérologique d'un patient initialement dépourvu d'antigène Australia renforce l'hypothèse d'une infection par un agent viral et ce patient a présenté une hépatite pendant la période de séroconversion. Ceci conduit à tester de nombreux échantillons de sang de patients aux antécédents d'hépatite. A la fin de l'année 1966, la preuve est faite que le portage de l'Antigène Australia est lié à une hépatite virale. BLUMBERG établit un protocole de dépistage du sang destiné aux transfusions, éliminant tous les lots porteurs de l'antigène; rapidement une nette diminution du nombre d'hépatite post-transfusionnelle est constatée [12].

L'observation au microscope électronique du sérum contenant l'Antigène Australia révèle la présence de particules de 42 nanomètres de diamètre dont l'antigène Australia constitue une partie. La structure de ce virus aujourd'hui appelé VHB est vite élucidée. L'antigène Australia est aujourd'hui connu sous le nom d'antigène de surface du VHB (AgHBs).

Par la suite, des découvertes provenant du monde entier n'ont cessé d'accroitre les connaissances sur le virus, notamment depuis l'avènement de la biologie moléculaire :

· En 1971, DANE découvre la particule qui porte son nom, d'un diamètre de 40 à 42 nm et qui correspond au virion. Il apparait sous la forme de petite sphère ou de petit tube correspondant à des fragments de l'enveloppe du virus lui-même ;

· En 1972, MAGNIUS découvre l'antigène HBe soluble qui est le témoin de la multiplication virale.

Le VHB appartient à la famille des hepadnaviridae, avec le virus de l'hépatite de la marmotte, le virus de l'hépatite du canard et quelques autres variantes aviaires et mammifères. Tous les virus de la famille sont hépatotropes et ont le même cycle de réplication chez l'hôte [13].

L'observation en microscopie électronique de sérum infecté par le VHB met en évidence trois types de particules (Figure1) correspondant aux différentes formes virales [14] :

· La particule de DANE ou virion complet, sphère de 42 nm de diamètre, constituée d'une enveloppe entourant la capside virale, à l'intérieur de laquelle se trouvent la molécule d'ADN viral et 2 enzymes (une ADN polymérase et une protéine kinase) : c'est la particule infectante du VHB ;

· Des particules filamenteuses de longueurs variables, non infectantes, correspondant à des protéines d'enveloppe synthétisées en excès.

Figure 1. Ultra structure du virus de l'hépatite B en représentation schématique [14]

Le génome du VHB est une molécule circulaire bicaténaire sur les trois quarts du cercle et monocaténaire sur un quart, constitué d'environ 3200 paires de bases (Figure 2) [15].

· Un brin négatif de 3200 bases, maintenu sous forme circulaire par son extrémité 5' où se fixe l'ADN polymérase virale ;

L'organisation génomique de cette molécule d'ADN est compacte. Elle comprend quatre (4) cadres de lecture ou régions se chevauchant, permettant la transcription et la traduction des gènes viraux, pour aboutir à la synthèse de 7 protéines différentes. Il s'agit de :

· La région pré-S/S, codant pour trois protéines de surface : la protéine L (Large), la protéine M (Middle) et la protéine S (Small). Celle-ci détermine l'antigénicité HBs.

Cette région est organisée en une région S, précédée en amont par une région pré- S₂, elle-même précédée d'une région pré-S₁. A chaque région correspond un codon permettant la lecture des 3 gènes [15] :

Ø La protéine L correspond à l'expression du gène pré-S₁ + pré- S₂+S ;

· La région pré-C/C, codant pour 2 protéines : l'antigène HBe, un peptide de 25 kDa qui, après maturation dans les membranes du réticulum endoplasmique de l'hôte, aboutit à la sécrétion d'un peptide soluble de 15 kDa dans le plasma des patients infectés et l'antigène HBc, protéine cytoplasmique de 21 kDa encore appelée protéine de core, détectable dans les hépatocytes infectés mais non sécrétée dans le plasma.

· La région P, codant pour l'ADN polymérase, une enzyme permettant la synthèse d'ADN viral. Cette région est formée de 3 domaines fonctionnels et d'un domaine non fonctionnel dans l'ordre suivant :

Ø Un domaine N-terminal, lié à la partie 5' du brin négatif de l'ADN viral, il sert également d'amorce à l'initiation de la synthèse de ce brin négatif par son activité primase ;

Ø Un domaine intermédiaire non essentiel, espaceur (spacer), dont la taille et le repliement permettent l'interaction des différents domaines avec le génome ;

· La région X, codant pour la protéine X qui a un rôle important dans la transactivation de la transcription virale (augmentation des ARN messagers) et dans l'augmentation de l'activité de gènes de la croissance cellulaire(c-myc et c-fos), contribuant ainsi au processus d'oncogenèse de la cellule infectée [17].

Il n'existe pas de modèle cellulaire permettant la culture virale, ce qui complique la compréhension du cycle viral dans la cellule humaine. Seuls certains primates, dont le chimpanzé, constituent des modèles de choix pour l'étude du VHB.

Le VHB a un tropisme essentiellement hépatocytaire, mais l'ADN viral peut être retrouvé dans les cellules de la moelle osseuse, les cellules mononucléées du sang périphérique (lymphocytes B et T, monocytes), les cellules pancréatiques, rénales et cutanées. Cependant les formes réplicatives sont exceptionnelles en dehors des hépatocytes.

Le cycle viral débute par l'entrée dans la cellule. Après décapsidation cytoplasmique, le génome viral pénètre dans le noyau cellulaire. Le brin positif est complété, donnant naissance à un ADN bi caténaire circulaire refermé sous forme super enroulée (supercoiled). C'est le ccDNA (covalently closed circular DNA).

La transcription s'initie dans le noyau à partir du brin négatif, produisant un ARN prégénomique de 3,5 kb et des ARN messagers subgénomiques de 2,4 à 2,1 kb et 0,5 kb, qui codent pour les protéines de surface, de la capside, mais aussi pour la protéine transactivatrice X et l'ADN polymérase.

Après l'encapsidation de l'ARN prégénomique dans le cytoplasme, la transcriptase inverse virale produit un brin d'ADN négatif, qui sert de matrice pour la synthèse partielle du brin positif, alors que l'activité RNaseH virale dégrade l'ARN prégénomique. Le virus finit sa maturation dans le réticulum endoplasmatique cellulaire par acquisition de son enveloppe, puis quitte la cellule par un phénomène de bourgeonnement membranaire [17].

La synthèse des ccDNA à l'intérieur du noyau cellulaire joue un rôle important dans l'évolution de l'infection. En effet, cette forme génomique extrêmement stable, parfois qualifié de mini chromosome, persiste sous forme épisomale au sein de la cellule hépatique et probablement au sein d'autres cellules permissives. Cela est à l'origine du portage chronique du VHB, des phénomènes de réactivation et explique que l'on puisse détecter l'ADN viral après disparition de l'AgHBs sérique [17].

L'implication de la transcriptase inverse dans le cycle réplicatif est à l'origine des mutations dont le nombre est plus élevé que celle rencontrées dans la réplication des virus à ADN classiques et explique l'apparition de variants du VHB. En effet la demi-vie moyenne du VHB dans le sang est de 1 à3 jours et le taux de production des virions serait proche de 10-11 par jour ; d'autre part, la transcriptase inverse aurait un taux d'erreur estimé à 10-` par base et par cycle, sans système de correction des erreurs. Cette combinaison d'une réplication quotidienne élevée et d'un nombre important d'erreurs non corrigées explique la survenue des variants génétiques du VHB [18].

L'hépatite B est une maladie ubiquitaire. On estime que 2 milliards de personnes dans le monde ont eu un contact avec le VHB et environ 360 millions ont développé une infection chronique. Celles-ci ont un risque accru de développer une cirrhose hépatique, puis un carcinome hépatocellulaire [19].

La prévalence de l'infection et le mode de transmission varient en fonction des régions du globe (Figure 3). On distingue :

o Les régions de forte endémicité, définies par une prévalence de l'infection virale chronique supérieure à 8%. Il s'agit de l'Afrique subsaharienne et des pays asiatiques. La contamination est essentiellement périnatale à partir d'une mère infectée ou survient tôt dans l'enfance ; or l'infection de l'enfant devient plus volontiers chronique, expliquant la forte prévalence dans ces régions.

o Les régions d'endémicité intermédiaire ont une prévalence de l'infection chronique à VHB comprise entre 8 et 1% ; il s'agit des pays méditerranéens et des pays de l'Europe de l'Est. La contamination est familiale, sexuelle, périnatale et nosocomiale.

o Les régions de faible endémicité ont une prévalence de l'infection chronique à VHB inférieure à 1% ; il s'agit de l'Europe du Nord, de l'Ouest, de l'Amérique du Nord et de l'Australie. La transmission se fait essentiellement par voie sexuelle ou par échange d'aiguilles contaminées chez les utilisateurs de drogues.

Figure 3. Répartition de la Prévalence de l'infection à VHB dans le monde [19]

Le VHB est très contagieux, environ 100 fois plus que le VIH et 10 fois plus que le VHC [17]. Le réservoir viral est humain et la transmission inter humaine. On distingue essentiellement quatre modes de transmission.

Elle est fréquente partout dans le monde, mais c'est un mode important de transmission dans les zones de faible endémie.

Elle résulte de l'injection ou de contact avec des produits sanguins ou des dérivés sanguins infectés, de l'utilisation de matériel médico-chirurgical souillé (chirurgie, hémodialyse, odontologie, acupuncture et mésothérapie), de toxicomanie intraveineuse, les tatouages et le piercing [23].

La transmission survient chez les femmes enceintes présentant une hépatite aigue au deuxième et surtout au troisième trimestre de la grossesse et chez les porteuses chroniques du virus. Pour ces dernières, le risque de transmission est faible (environ 20% en dehors de tout traitement) chez les porteuses de l'AgHBs sans réplication virale détectable dans le sérum. A l'inverse, il est élevé (de l'ordre de 80%) chez les porteuses chroniques présentant les marqueurs de réplication virale [23].

Dans tous les cas, la transmission est périnatale soit lors de l'accouchement par contact avec les sécrétions maternelles infectées dans la filière génitale, soit dans les mois suivant l'accouchement par contact avec les sécrétions maternelles infectées (lait, sueur, larmes).

Ce mode de contamination est présent dans le monde entier, mais prédomine dans les régions de forte endémicité [23].

Elle se fait par contact direct interindividuel. Elle semble particulièrement fréquente en Afrique sub-saharienne où le contage a souvent lieu entre les enfants en bas âge à la maison familiale, dans les crèches ou à l'école. Les vecteurs de la transmission sont alors de très petites quantités de sang ou de salive à la faveur d'excoriations cutanées ou muqueuses [23].

La physiopathologie de l'infection à VHB est complexe. En effet, la réplication virale n'est pas directement cytopathogène pour l'hépatocyte, mais c'est la réaction de l'hôte vis-à-vis du virus qui est déterminante dans la physiopathogénie. Il s'agit d'une réponse à la fois humorale et cellulaire, responsable des lésions hépatiques et des symptômes [16].

La réponse humorale est fondée sur les propriétés des récepteurs d'immunoglobulines des cellules, qui reconnaissent les antigènes viraux à la surface des hépatocytes infectés ou sous leurs formes solubles dans le sérum. La réponse cellulaire fait intervenir les lymphocytes T et les cellules présentatrices d'antigène, essentiellement les macrophages.

A la surface des hépatocytes infectés, les molécules HLA de classe 1 présentent des fragments antigéniques, le plus souvent l'AgHBc, métabolisé dans le cytosol de l'hépatocyte. Le couple HLA de classe 1-AgHBc est reconnu par les lymphocytes T CD8 cytotoxiques via un récepteur spécifique. Ceci induit un processus de lyse cellulaire médié par la protéine Fas, des cytokines et des perforines. La capacité des molécules HLA de classe 1 à présenter l'antigène dépend de la variabilité du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) et du répertoire des récepteurs des lymphocytes T de l'hôte. L'intensité de la réponse va donc varier d'un individu à l'autre [13].

Dans les tissus, les macrophages vont phagocyter les virions libres circulants. Après protéolyse dans leurs compartiments d'endocytose, les antigènes viraux sont associés aux molécules HLA de casse 2 et présentés aux lymphocytes T CD4+Helpers. La résultante en est une augmentation de la synthèse de cytokines activatrices de la prolifération des lymphocytes T et une augmentation de la présentation antigénique par les molécules HLA de classe 1 à la surface des hépatocytes, tendant à la clairance virale.

La nature et la qualité de la réponse immune obéit à un déterminisme multifactoriel, notamment génétique et aboutit à quatre types de relation hôte-virus [13]:

Ø La réaction immune de l'hôte est forte, aboutissant à l'élimination des virus circulants et des hépatocytes infectés ; c'est l'hépatite aigue guérie. Dans l'hépatite aigue fulminante, cette réaction est suraiguë, aboutissant à une nécrose hépatocellulaire massive ;

Ø La réaction immune de l'hôte est faible mais adéquate. L'infection reste asymptomatique et évolue vers la guérison ;

Ø La réaction de l'hôte est faible et inadéquate. Il s'installe une tolérance partielle combinant la réplication virale prolongée (AgHBs persistant) et une destruction tissulaire hépatique à bas bruit. Cette situation d'hépatite chronique peut se prolonger plusieurs mois, voire des années et aboutir à la cirrhose. Au cours de cette période et sous la dépendance de cofacteurs alimentaires et toxiques, peut se produire la transformation hépatocellulaire conduisant au cancer primitif du foie ;

Ø La réaction immune de l'hôte est nulle. Il existe une tolérance totale à la réplication virale. C'est la situation du portage chronique asymptomatique ou portage inactif.

On distingue l'hépatite virale aiguë et l'hépatite virale chronique. Dans les deux cas, l'infection peux être symptomatique ou non.

La durée d'incubation est de 50 à 100 jours, 10 semaines en moyenne. Dans 90% des cas l'infection reste asymptomatique d'autant plus que le sujet est jeune.

La forme classique de l'infection aiguë à VHB est la forme ictérique, observée dans 10% des cas. Elle évolue en 3 phases :

Ø La phase pré-ictérique qui dure 3 à 7 jours, elle est absente dans 20% des cas. Elle est caractérisée par des signes non spécifiques : céphalées, asthénie, anorexie, fièvre, plus rarement les arthralgies, myalgies, nausées, pesanteur de l'hypochondre droit, foie sensible à la palpation et rash cutané ;

Ø La phase ictérique qui dure 2 à 6 semaines, caractérisée par un ictère cutanéo-muqueux, rarement accompagné de prurit. Lorsque l'ictère apparait la fièvre disparait. Les urines sont brun acajou, les selles incomplètement décolorées. L'asthénie est constante et dure tout au long de la phase ictérique ;

Ø La phase de convalescence voit la disparition de l'ictère et des signes généraux

Biologiquement la cytolyse est l'élément primordial avec des taux supérieurs à dix fois la normale, prédominant sur l'Alanine Amino-Transférase (ALAT). Il n'y a pas d'insuffisance hépatocellulaire. Le taux de prothrombine(TP) reste supérieur à 60%, sauf dans les formes sévères (TP< 50%), imposant une hospitalisation pour la surveillance. Il existe une cholestase avec élévation de la bilirubine totale et surtout la fraction conjuguée. Enfin, les marqueurs de l'inflammation sont perturbés avec élévation de la vitesse de sédimentation et des bêta et gamma globulines.

Dans un cas sur 1000, l'hépatite est suraiguë. Elle met en jeu le pronostic vital car en l'absence de la transplantation hépatique en urgence, la mortalité est d'environ 90%. Les signes d'alerte à la phase initiale sont une encéphalopathie hépatique caractérisée par une inversion du rythme nycthéméral, un astérixis et un syndrome confusionnel, associés à une diminution du TP (TP< 30%) et du facteur V, ayant comme conséquence des hémorragies cutanéo- muqueuses. La cytolyse est très importante et il existe une hypoglycémie en rapport à une insuffisance hépatocellulaire.

Lorsqu'il y a une évolution favorable, le passage à la chronicité est exceptionnel [19].

L'infection chronique par le VHB est définie par le portage pendant plus de six mois de l'AgHBs. Elle survient chez 5 à 10% des adultes infectés immunocompétents, plus fréquemment chez les immunodéprimés et chez 90% des nouveaux nés infectés.

Elle est caractérisée par un polymorphisme, incluant les patients atteints d'hépatite chronique et les porteurs inactifs de l'AgHBs.

Elle concerne environ deux tiers des porteurs de l'AgHBs. Elle est définie par l'association du portage chronique de l'AgHBs et de la présence des lésions hépatiques notamment la nécrose hépatocytaire, l'inflammation et la fibrose [24].

Sur le plan clinique, elle est généralement asymptomatique et découverte à l'occasion d'un bilan systématique, parfois même au stade de cirrhose. Lorsque les signes cliniques sont présents, ils sont peu évocateurs : asthénie, anorexie, gène sous costale et plus rarement un prurit et un ictère dans les formes choléstatiques [23].

Sur le plan biologique, une cytolyse est le plus souvent retrouvée mais moins importante que dans les formes aiguës (entre une et cinq fois la normale), prédominant sur les ALAT. Les autres marqueurs hépatiques sont normaux en dehors des formes choléstatiques. Il peut exister un syndrome inflammatoire avec élévation des immunoglobulines prédominant sur les IgG [23].

Sur le plan histologique, une biopsie hépatique permet de poser le diagnostic de certitude. Elle renseigne sur 3 éléments fondamentaux :

Ø L'activité hépatique avec des lésions de nécrose et d'inflammation portales, péri-portales et lobulaires ;

Ø La fibrose en fonction des lésions cicatricielles, désorganisant progressivement la structure parenchymateuse, jusqu'à aboutir à la cirrhose;

Ø Les lésions éventuellement associées comme la stéatose, la surcharge en fer ou des lésions d'hépatite alcoolique.

L'infiltrat inflammatoire est souvent intense, constitué de cellules mononuclées, typiquement lymphocytaires, les cellules CD4+ sont plus volontiers présentes dans les espaces portes, alors que les CD8+ prédominent au niveau parenchymateux, dans les zones de nécrose.

L'évaluation de l'activité cellulaire et de la fibrose se fait au moyen de scores histologiques tels que le score de KNODELL ou le score de METAVIR, plus récent et mieux reproductible (Tableau I).

Il est à souligner que deux méthodes récentes non invasives permettent d'évaluer la fibrose hépatique. Il s'agit de :

· Dosage des marqueurs biochimiques des maladies hépatiques, Fibrotest et Actitest, permettant des estimations de la fibrose et de l'activité nécrotico- inflammatoire en fonction du dosage de 5 marqueurs hépatiques : alpha 2 macroglobuline, haptoglobine, apolipoprotéine A1, bilirubine totale et gamma GT [23].

· Fibroscan qui estime la fibrose hépatique par mesure de l'élasticité du foie (kPA) en utilisant une nouvelle technique qui est l'élastométrie impulsionnelle. Les résultats sont exprimés en kPA avec les valeurs limites suivantes : 7,5 kPA correspondent à F=2.

La séroconversion dans le système HBe marque classiquement la transition vers la phase de latence, mais dans 1 à 5% des cas persistent les activités biologique et histologique avec un haut niveau de réplication virale. Cette situation est due à deux types de mutation :

Ø Mutants pré-core, qui ont une substitution de la guanosine en position 1896 par une adénosine (G1896A) qui crée un codon stop en position 28. Cette mutation entraine un arrêt de l'expression de l'AgHBe ;

Ø Mutant Basal Core Promoteur (mutant BCP), présentant une double substitution au niveau du gène X, avec remplacement de l'adénosine en position 1762 par une thymidine et de la guanosine en position 1764 par une adénosine (A1762T/G1764A). cette double mutation entraine une réduction de 70% de la sécrétion de l'AgHBe.

Ces variants viraux coexistent initialement avec les souches sauvages, qui perdent progressivement leur avantage sélectif aux dépend des souches virales mutées émergentes [1].

Le portage chronique inactif de l'AgHBs associe : la présence pendant plus de 6 mois de l'AgHBs ; l'absence de signes cliniques ; l'absence d'anomalies biologiques ; l'absence d'infection par le VHD ou le VHC ; la présence d'anticorps anti-HBe et la charge virale inférieure à 10⁵ copies/ml.

Cette définition regroupe des patients dont l'infection n'est pas active mais sans préjuger de l'évolutivité antérieure et des éventuels retentissements hépatiques qu'elle aurait pu causer.

La cirrhose est un événement crucial dans l'histoire de l'infection à VHB, car ses complications propres, de l'hypertension portale et de l'insuffisance hépatocellulaire sont en grande partie responsables de la morbidité et de la mortalité de cette infection.

L'incidence annuelle de la cirrhose chez les patients atteints d'hépatite chronique AgHBe positif est de 2 à 5,5% et de 8 à 10% chez les patients avec une hépatite chronique AgHBe négatif [1].

La fréquence annuelle de CHC varie en fonction des populations : chez les porteurs chroniques sans cirrhose, le taux annuel est inférieur à 0,2% dans les pays occidentaux contre 0,6% en Asie et l'Afrique. Chez les cirrhotiques ce chiffre s'élève à 2% [1].

Les patients atteints d'une hépatite chronique B à AgHBe négatif, mutant BCP ont un risque accru de développer un CHC par rapport à l'ensemble des porteurs chroniques de l'AgHBs [24].

L'hépatite chronique B peut s'accompagner des manifestations extra-hépatiques liées à la formation des complexes immuns [23] :

· La périarthrite noueuse, observée chez 1 à 2% des porteurs chroniques du VHB. Elle est due à la présence de complexe AgHBs-anticorps anti-HBs circulants et une diminution du complément sérique [23] ;

· La glomérulonéphrite membrano-proliférative, dont le diagnostic se fait par la mise en évidence en immunofluorescence de l'AgHBs au sein des dépôts glomérulaires de complexes immuns [23].

Le diagnostic définitif de l'infection à VHB repose sur l'utilisation des marqueurs sérologiques, associée à l'étude des marqueurs de réplication du VHB et aux stades histologiques hépatiques.

Ø Le système HBs : l'AgHBs est le marqueur sérologique nécessaire à tout diagnostic d'infection par le VHB. Il apparait dans le sang pendant la phase d'incubation, 1 à 6 semaines avant les signes cliniques ou biochimiques. Il disparait pendant la phase de convalescence des hépatites aigues qui guérissent. Sa disparition signe l'évolution favorable et sa persistance pendant plus de 6 mois définit le passage à la chronicité.

La présence de l'anticorps anti-HBs permet d'affirmer la guérison de l'hépatite aiguë B ; il apparait en général 2 à 8 semaines après la disparition de l'AgHBs et le plus souvent après amendement des signes cliniques. L'anticorps anti-HBs persiste au moins 10 ans. C'est un anticorps neutralisant dont la présence permet d'affirmer l'efficacité d'un vaccin [23].

Ø Le système HBc : la recherche de l'AgHBc ne se fait pas en routine clinique. En effet, il est présent à la surface des hépatocytes infectés où il est la cible de la réponse immunitaire, responsable de la destruction cellulaire. Il est détectable en immuno-histochimie à des fins expérimentales. Par contre l'anticorps anti-HBc dirigé contre la capside du VHB est le marqueur de choix pour témoigner d'un contact avec le VHB. En effet, on le retrouve à la fois dans les infections actives et guéries.

Les IgM anti-HBc apparaissent 1 à 2 semaines après l'apparition de l'AgHBs, signant la primo-infection et peuvent persister plusieurs mois. Puis apparaissent les IgG anti-HBc, que l'infection ait été aiguë et guérie ou qu'elle ait évolué vers la chronicité. Ceux-ci persistent quasiment à vie [23].

L'anticorps anti-HBc est un meilleur marqueur sérologique d'infection ancienne que l'anticorps anti-HBs, car il n'est pas produit par la vaccination. Il est présent lors de la fenêtre sérologique où il y a absence de l'AgHBs et de l'anticorps anti-HBs.

Ø Le système HBe : l'AgHBe est sécrété sous forme soluble dans le sang. Sa présence signe une réplication active du VHB. Elle est généralement parallèle à la présence d'ADN viral dans le sang. Cette présence est un élément important en faveur de la contagiosité du patient.

La disparition de l'AgHBe est plus précoce que celle de l'AgHBs. Associée à l'apparition d'anticorps anti-HBe, elle définit la séroconversion dans le système HBe. Cette séroconversion n'est pas un signe formel de guérison, mais un élément pronostique favorable, généralement associé à l'arrêt de la réplication virale. Dans 1 à 2% des cas de séroconversion dans le système HBe, l'ADN viral reste détectable dans le sérum, définissant le groupe des hépatites B chroniques à AgHBe négatif [23].

Les figures 4 et 5 illustrent la cinétique des marqueurs virologiques dans le sérum au cours de l'hépatite B aiguë et chronique, alors que le tableau 2 récapitule l'ensemble des situations sérologiques qu'il est possible de rencontrer au cours de l'infection chronique par le VHB.

Figure 4. Cinétique de marqueurs sériques de l'Hépatite virale B aiguë [17]

Figure 5. Cinétique des marqueurs sériques au cours d'une hépatite virale B chronique [17]

	ANTIGÈNES		ANTICORPS			DNA
	Ag HBs	Ag HBe	Ac anti HBs	Ac anti HBc	Ac anti HBe	DNA du virus
Hépatite aiguë au début	+	+	-	-	-	+
Hépatite aiguë phase d'état	+	+	-	+ (IgM)	-	+
Hépatite aiguë phase post-ictérique	V	-	V	+ (IgM)	+	V
Guérison	-	-	+	+ (IgM)	+	-
Hépatite chronique avec virus circulant	+	+	-	+	-	+
Hépatite chronique sans virus circulant	+	-	-	+	+	-
Porteur asymptomatique avec virus circulant	+	+	-	+	-	+
Porteur asymptomatique sans virus circulant	+	-	-	+	+	-

Tableau II : Différentes situations sérologiques rencontrées au cours de l'infection à

La recherche de l'ADN viral dans le sang est la méthode de référence pour détecter la présence de virion. Il existe :

Ø des techniques basées sur le principe d'hybridation de l'ADN avec amplification du signal (bDNA). Les résultats sont exprimés de façon quantitative. La limite est le manque de standardisation des kits de dosage et de l'unité de mesure de l'ADN du VHB. Les tests ont des sensibilités et des gammes de linéarité différentes ;

Ø des techniques basées sur le principe de la PCR (Polymerase Chain Reaction) classique ou en temps réel. La sensibilité est meilleure avec des seuils de détection à 200 copies par ml, voire à 64 copies par ml pour les techniques de PCR en temps réel (Cobas Taqman).

Il y a actuellement très peu de données pour trouver une signification clinique aux différents niveaux des charges virales. Cependant, de nombreuses études anciennes laissent penser que le niveau de 105 copies/ml, seuil de sensibilité des techniques n'utilisant pas la PCR, représente le seuil au dessous duquel l'hépatite serait non progressive et inactive [1].

La Ponction Biopsie Hépatique (PBH) permet de confirmer le diagnostic d'hépatite chronique B, de détecter les autres causes de maladie hépatique, de juger la sévérité de l'activité nécrotico-inflammatoire, ainsi que de la fibrose [1].

L'infection par le VHB peut être associée à une maladie du foie active ou inactive. Une maladie active secondaire à l'infection par le VHB se définit par un taux de transaminases élevé et/ou une inflammation à l'histologie hépatique qui ne peut être expliquées par une autre cause que l'infection par le VHB. Une maladie inactive du foie est définie par un taux de transaminases normal et ou l'absence ou une minime inflammation à l'histologie [1].

A la phase aiguë de l'hépatite virale B, le traitement antiviral spécifique est inutile. Seules des mesures symptomatiques peuvent être prises, associées à l'éviction de l'alcool et des médicaments métabolisés par le foie. Une transplantation hépatique d'urgence est nécessaire dans la forme fulminante.

Le traitement antiviral spécifique trouve sa place dans l'hépatite chronique B, l'objectif étant d'obtenir l'arrêt de la réplication virale, afin de prévenir l'évolution naturelle de la maladie vers les complications.

Ø La première phase marquée par une diminution de la réplication virale, traduite par une diminution de l'ADN viral sérique. L'activité de l'hépatite chronique régresse, la fibrose se stabilise et peut même diminuer ;

Ø La deuxième phase intervient lorsque l'activité antivirale est suffisamment forte et prolongée, accompagnée d'une réponse immunitaire adaptée avec la clairance des hépatocytes infectés. Une séroconversion HBe peut intervenir et le risque de réactivation est faible ;

Ø La troisième phase marquée par une réplication virale complètement interrompue (l'ADN indétectable). La séroconversion HBe est stable, l'AgHBs disparait avec ou sans apparition des anticorps anti-HBs. Le risque de réactivation spontanée est nul et l'activité disparait.

Actuellement en France, trois molécules ont l'autorisation de mise sur le marché dans le traitement de l'hépatite virale chronique B. il s'agit de l'interféron, de la lamivudine et de l'adénofovir.

Les interférons sont des glycoprotéines de la famille des cytokines endogènes sécrétées par les lymphocytes et les macrophages activés, en réponse à de nombreux stimuli en particulier les infections virales. Il en existe deux types d'activités biologiques différentes. Ce sont : l'interféron standard et l'interféron alpha 2a sous forme pégylée.

· Inhibition de la transcription des ARNm et de l'encapsidation du génome viral ;

· Stimulation des lymphocytes TCD8+ cytotoxiques et augmentation de l'expression des molécules HLA de classe1 membranaires, aboutissant à une présentation plus efficace des antigènes viraux aux lymphocytes T cytotoxiques ;

On distingue : l'interféron alpha 2a (Roféron A®) et l'interféron alpha 2b (Intron A®).

L'interféron entraine une réponse virologique prolongée (séroconversion stable 24 semaines après l'arrêt du traitement) dans 20 à 40% des cas [23].

Les posologies recommandées à l'heure actuelle sont 5 millions d'unités par jour ou 10 millions d'unités trois fois par semaine, par voie sous cutanée.

La durée du traitement est de 24 semaines dans les cas d'hépatite chronique B AgHBe positif et au moins 48 semaines en cas d'AgHBe négatif [23].

Les effets secondaires de l'interféron sont fréquents et nombreux, mais peu graves et réversibles à l'arrêt du traitement ; le plus fréquent est le syndrome grippal, habituellement modéré. D'autres sont plus rares mais peuvent être graves ; tels que : le syndrome dépressif, la décompensation d'une psychose préexistante et la dysthyroidie. Sont également possibles : asthénie, amaigrissement, alopécie, troubles du sommeil, troubles de la concentration, troubles de l'humeur, sécheresse cutanée et biologiquement une neutropénie et une thrombopénie.

L'interféron pégylé est l'interféron standard, conjugué à une molécule de polyéthylène glycol (PEG). Cette conjugaison permet de diminuer la clairance rénale de l'IFN, augmentant ainsi la demi-vie plasmatique de la molécule. La concentration plasmatique est donc plus stable, permettant une seule injection par semaine.

L'IFN PEG administré en une injection par semaine est plus efficace, dans le traitement de l'hépatite chronique B AgHBe positive, que l'IFN standard en trois injections par semaine.

Il existe sous le nom d'interféron alpha 2a sous forme pégylée (Pegasys®) [23].

La lamivudine est un analogue nucléosidique qui inhibe directement l'ADN polymérase du VHB par intermédiaire de son métabolite triphosphorylé (lamivudine 5'-triphosphate). Elle agit également par effet terminateur de chaine.

Initialement, elle avait été développée comme inhibiteur de la transcriptase inverse du VIH, puis elle s'est révélée efficace à faible concentration contre le VHB. Elle est commercialisée sous le nom de Zeffix® dosée à 100 mg.

Les avantages de la lamivudine sont la prise orale par comprimé à 100 mg, une excellente tolérance, un effet anti viral rapide.

Son inconvénient majeur est l'apparition de souches résistantes à la lamivudine par sélection de mutants dans la région YMDD de la polymérase. Le taux de résistance dépend de la durée du traitement : 24% à 1 an, 38% à 2 ans, 50% à 3 ans et 67% à 4 ans, selon LIAW [24].

Une élévation d'un log (facteur 10) de l'ADN sérique sous traitement par lamivudine doit faire évoquer la survenue d'une résistance et introduire l'adénofovir en poursuivant la lamivudine jusqu'à ce que l'adénofovir ait provoqué une réponse virologique [23].

La molécule administrée est l'adénofovir dipivoxil, commercialisée sous le nom de Hepsera®, précurseur de l'adénofovir, analogue nucléosidique de l'adénosine mono phosphate.

« In vivo », l'adénofovir dipivoxil est métabolisé en adénofovir, lui-même phosphorylé en adénofovir diphosphate, métabolite actif, inhibiteur compétitif de l'ADN polymérase qui bloque la synthèse de l'ADN du VHB [23].

Peu d'études sont actuellement disponibles concernant l'adénofovir dipivoxil, mais une résistance a été récemment décrite, par sélection d'un virus mutant au niveau du domaine D de la polymérase en position 236, par remplacement d'une asparagine par une thréonine (rtN236T). Ce mutant reste sensible à la lamivudine.

De nouvelles molécules sont en cours d'étude pour le traitement de l'hépatite chronique B : la ténofovir, l'entécavir, l'emtricitabine, la telbuvidine et la clévudine [23].

La ténofovir et l'emtricitabine sont déjà utilisés dans le traitement anti VIH et sont entrain d'être testés dans le traitement anti VHB.

L'interféron standard est actuellement la molécule recommandée en première intention dans le traitement de l'hépatite chronique B [1]. En pratique il est supplanté par l'INF PEG, étant donné son efficacité et sa meilleure maniabilité [23].

En cas d'échec ou de contre-indication au traitement par interféron, la lamivudine ou l'adénofovir doivent être utilisés.

La durée du traitement par la lamivudine et l'adénofovir est mal connue. En cas de séroconversion HBe, la règle est de poursuivre le traitement pendant 3 à 6 mois, afin de réduire le risque de, réactivation. En l'absence de séroconversion dans l'hépatite chronique B AgHBe positif ou dans le cas d'hépatite chronique AgHBe négatif, le traitement doit être poursuivi tant qu'il est efficace, c'est-à-dire tant qu'il n'y a pas de réactivation due à une résistance [24].

Le traitement antiviral ne s'envisage que dans le cadre des hépatites B chroniques. Le principal facteur à prendre en compte est la gravité de la maladie hépatique, déterminée par la PBH.

Le traitement est indiqué chez les patients ayant une activité modérée ou sévère (activité METAVIR= A2) et/ou une fibrose sévère (fibrose METAVIR=F2).

Les patients ayant une activité hépatique minime et/une fibrose minime ne doivent pas être traités, mais surveillés de façon régulière, afin d'instaurer un traitement en cas d'apparition d'une activité modérée ou sévère.

Les patients AgHBs positifs avec des manifestations extra hépatiques doivent être traités si la multiplication est active et jugée responsable de ces manifestations.

Le traitement préventif de l'infection à VHB repose sur les mesures d'hygiène, l'immunisation passive et la vaccination.

Les mesures d'hygiène visent à éviter la survenue de l'infection à VHB. Les mesures les plus pertinentes sont : l'utilisation des préservatifs, l'éviction du don de sang des échantillons positifs pour l'AgHBs, pour les anticorps anti-HBc ou ayant les transaminases élevés, l'utilisation du matériel médico chirurgical et dentaire à usage unique ou correctement stérilisé, le port de gants lors des soins, programmes de réduction de drogues illicites par voie veineuse et la proscription absolue du partage interindividuel du matériel pouvant être en contact avec le sang (brosse à dents, rasoirs,...) [21].

L'immunisation passive repose sur l'injection d'immunoglobulines spécifiques anti-HBs obtenues à partir de sujets immunisés contre le VHB. Elle confère une protection immédiate mais transitoire (environ 6 semaines) et permet de réduire de 75% le risque d'hépatite B chez les patients ayant eu un contage pour le VBH [21] :

Ø Contamination accidentelle par piqûre ou blessure par des produits sanguins contenant l'AgHBs dans les 48 heures suivant ;

Ø Sujet à risque élevé d'infection par le VHB (hémodialysés) pour couvrir la période précédent la protection par la vaccination ;

Ø Transplantation hépatique chez un porteur chronique de l'AgHBs, en dehors de toute virémie détectable avant la transplantation ;

Les posologies recommandées sont : 500 UI en cas de contage accidentel, 30 UI/Kg chez le nouveau-né et 10 000 UI tous les mois chez les greffés hépatiques infectés par le VHB et pendant une durée prolongée afin de maintenir un taux d'anticorps supérieur à 500 mUI/ml.

La vaccination est pratiquée de façon courante depuis les années 80 et repose sur l'injection de l'AgHBs destinée à induire la production d'anticorps anti-HBs neutralisants. Les vaccins actuellement disponibles sont produits par génie génétique et contiennent de l'AgHBs recombinant et éventuellement d'autres sous unités de l'enveloppe virale.

Ø GENHEVAC B®constitué d'une suspension inactivée et purifiée de l'AgHBs contenant les protéines S et pré-s ;

Ø INFANRIX HEXA, est un vaccin combiné hexavalent contre la diphtérie, le tétanos, la coqueluche, la poliomyélite et l'haemophilus influenzae b.

La vaccination est indiquée chez tous les nouveau-nés, tous les sujets à risque d'infection par le VHB (toxicomanes, sujet avec multiples partenaires sexuels, acteurs des soins médicaux) et les femmes enceintes des pays où la vaccination anti-VHB n'est pas pratiquée [23].

Les vaccins sont administrés par voie intramusculaire selon un schéma classique de 3 doses (0, 1 et 6 mois). Au-delà de ces 3 injections, il n'est plus nécessaire d'effectuer des rappels systématiques, la diminution du titre des anticorps anti-HBs sous le seuil de 10 mUI/ml ne signant pas l'absence de protection.

Historiquement, la variabilité du VHB a été évaluée par des techniques sérologiques utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre l'AgHBs, aboutissant à une classification sérologique. Celle-ci est définie par un déterminant antigénique « a » commun aux différents sous types et deux paires de déterminant exclusifs d/y, w/r. Après des divisions en 4 types majeurs (adw, adr, ayw et ayr), un total de 9 sous-types a été identifié (adw1, adw2, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, adwyq+ et ayr), en fonction des différents déterminants liés à des mutations nucléotidiques d'une région immunologiquement compétente de l'AgHBs [26].

Grâce aux techniques de séquençage complet de l'ADN viral, un système de classification génétique du VHB a été établi. On dénomme par VHB un groupe complexe de virus relativement proches ayant une spécificité d'hôte et caractérisés par la présence d'au moins un des critères suivants :

· Une divergence intergroupe de 8% ou plus de la séquence nucléotidique dans tout le génome ;

· Une divergence de 4,1% ou plus dans le gène de surface (pré-S1, pré-S2 et S) [26].

A l'heure actuelle, on définit chez l'homme 8 génotypes du VHB, dénommés A, B, C, D, E, F, G et H. bien qu'il existe de nombreuses corrélations entre sous-types et génotypes. C'est le génotype qui est maintenant utilisé pour étudier la variabilité génétique.

La variabilité génétique du VHB peut être expliquée par la résultante d'un équilibre entre plusieurs facteurs [26] :

Ø Les erreurs d'incorporation de la polymérase non corrigées par l'absence d'activité 3'-5' exonucléase, le nombre total d'erreurs étant de 10¹⁰ paires de bases par jour ;

Ø L'espace de la réplication virale, correspondant à la capacité d'intégration par les hépatocytes de nouveaux ADN superenroulés ;

Ø Le fitness, c'est-à-dire le pouvoir infectieux propre à chaque souche virale.

La majorité des particules virales ainsi formées sont défectives et ne peuvent pas se répliquer. Certains variants viraux sont, par contre, capables d'infecter de nouvelles cellules, de se multiplier et d'être sélectionnés.

L'accumulation des mutations, la sélection des séquences virales les mieux adaptées, la transmission des virus correspondants au sein d'aires géographiques ou de groupes épidémiologiques déterminés ont conduit à la divergence progressive à partir de leur ancêtre viral commun selon un processus darwinien classique [26].

Il existe actuellement 4 méthodes principales pour déterminer les génotypes du VHB. Les deux plus souvent utilisées sont l'étude du polymorphisme de restriction (RFLP pour Restriction Fragment Length Polymorphisms) et le LiPA (Line Probe Assay).

L'ADN viral est extrait du sérum du patient, puis amplifié par une méthode de PCR utilisant des amorces dans des régions spécifiques. Le séquençage est réalisé sur les produits de la PCR et les séquences sont comparées aux séquences correspondant connues pour chaque génotype. C'est une méthode très sensible, actuellement considérée comme référence en termes de génotypage du VHB.

Ses limites sont un coût élevé et la nécessité d'un travail intense, limitant son utilisation à grande échelle en clinique [26].

Comme lors du séquençage direct, l'ADN viral est extrait du sérum et amplifié en utilisant une méthode de PCR. Les produits de la PCR, contenant des régions spécifiques du génotype viral sont ensuite digérés par des enzymes de restriction et migrent par électrophorèse sur gel d'agarose. Après coloration, les profils de migration sont comparés aux profils de migration connus spécifiques de chaque génotype.

L'étude du polymorphisme de restriction est plus simple à mettre en évidence que le séquençage direct. Elle est donc plus largement utilisée, notamment lors des études épidémiologiques [26].

C'est une méthode immunologique qui utilise un anticorps fixe, dirigé contre le déterminant commun a de l'AgHBs, afin de capturer l'AgHBs dans le prélèvement. On ajoute ensuite un anticorps monoclonal spécifique du génotype recherché, afin de typer le génotype viral contenu dans l'échantillon.

Il existe une étroite corrélation entre le niveau de détection de l'AgHBs et la capacité de déterminer le génotype par ELISA. Bien que les kits ELISA soient simples d'utilisation et peu couteux, il est possible que les patients avec de faibles taux d'AgHBs circulant ne puissent bénéficier de cette méthode pour déterminer le génotype de leur virus [26].

C'est une technique d'hybridation après amplification par PCR. Des séquences spécifiques des génotypes sont connues dans les régions du gène de l'AgHBs. Des sondes complémentaires de ces régions spécifiques sont synthétisées et fixées sur un support. Les produits de la PCR du gène S sont mis en présence des bandelettes réactives et vont s'hybrider en fonction de leur complémentarité avec les sondes. On peut ainsi déterminer les génotypes viraux en comparant les profils d'hybridation avec des abaques références. C'est une technique fiable et disponible [26].

Les génotypes du VHB sont retrouvés de façon ubiquitaire dans le monde, mais il est maintenant établit que leur distribution varie en fonction des données géographiques. Ainsi, on peut établir une cartographie (Figure 5) reflétant la distribution des génotypes prédominants dans chaque région du globe [27].

Différentes études se sont intéressées aux mutations du VHB et à leur éventuelle corrélation avec le génotype viral. Ce sont les mutations pré-core et BCP responsables de l'hépatite chronique AgHBe positif, qui ont fait l'objet du plus grand nombre d'études.

Dans la séquence d'ADN du VHB, la guanosine en position 1896 s'apparie avec le nucléotide en position 1858 (codon 15) pour former une structure circulaire hautement conservée, signal d'encapsidation du virus.

Chez les souches sauvages du VHB de génotypes B, C, D, E et G, ce nucléotide en position 1858 est une thymidine qui forme, avec la guanosine en position 1896 de la séquence d'encapsidation, une structure circulaire peu stable. La mutation (G A) en position 1896 crée un codon stop responsable de l'arrêt de l'expression de l'AgHBe, mais stabilise la structure circulaire de l'encapsidation du virus par appariement (T-A), ce qui favorise la multiplication virale.

Inversement chez les souches sauvages de VHB de génotypes A, F, H et quelques C, le nucléotide en position 1858 est une cytidine qui s'apparie de façon stable avec la guanosine en position 1896 (C-G). La mutation (G A) en position 1896 déstabilise la structure et, est rarement observée chez les patients infectés par les génotypes A, F et H, à moins qu'elle ne survienne de façon concomitante avec une autre mutation comme C1858T [28].

Chu et al ont montré que sur les 694 patients de leur étude aux Etats Unis en 2003, 27% présentaient des mutations pré-core. Ces mutations étaient plus fréquentes chez les patients porteurs de virus de génotypes D (73%) et B (46%) et rares chez les porteurs de virus de génotype A (3%) [29].

Les mutations BCP présentent une double substitution nucléotidique A1762T et G1764A. Elles ont une sécrétion de l'AgHBe réduite de 70%. Ces mutations n'affectent pas la transcription des ARN prégénomiques ni la traduction des protéines de core ou de la polymérase. Au contraire, elles contribuent à accroitre la réplication virale, d'une part, en levant l'effet inhibiteur de l'AgHBe sur la réplication virale, d'autre part, en supprimant la synthèse des ARN messagers pré-core et core, au profit de la synthèse des ARN prégénomiques [4].

La coexistence des mutations pré-core et BCP est possible chez un même individu, notamment en cas d'infection par un virus de génotype D [29].

Actuellement, peu d'études sont informatives sur les conséquences cliniques du génotypage du VHB. Des analyses comparant un grand nombre de patients infectés par les principaux génotypes et soumis aux mêmes protocoles thérapeutiques et de surveillance, sont nécessaires pour prouver l'utilité du génotypage du VHB en pratique clinique. Fréquemment, les études asiatiques comparent les génotypes B et C, alors que les études occidentales comparent le plus souvent les génotypes A et D.

Il est clairement établi que tous les génotypes viraux sont potentiellement infectants pour les individus et peuvent conduire à une hépatite aiguë ou chronique, à la cirrhose, au CHC et à la mort. Le taux de progression de la maladie et l'importance des lésions hépatiques pourraient varier en fonction des génotypes viraux, mais aussi être influencés par des facteurs environnementaux et par l'hôte [28].

Wai et al ont démontré que l'infection par un virus de génotype C est associée à une maladie hépatique plus sévère que celle observée au cours de l'infection par un virus de génotype B. Ainsi, dans le cas d'un génotype C, les taux de transaminases et de l'ADN viral sont plus élevés. De même, l'histologie hépatique est plus sévère et le risque de cirrhose et plus élevé [26]. Par ailleurs, une étude réalisée à Hong Kong révèle que le taux de séroconversion HBe est plus important dans le cas d'un génotype B que C [30].

Sanchez-Tapias et al ont montré que l'infection chronique due au virus au génotype A aurait un meilleur pronostic que celles dues aux génotypes D et F. Les réponses biochimiques et virologiques se rencontrent plus fréquemment chez les sujets infectés par un virus au génotype A que chez ceux infectés par le virus au génotype D ou F [31].

En France, une étude récente concernant 308 patients co-infectés par le VIH révèle que le fait d'être infecté par un virus au génotype G est un facteur d'évolution rapide vers la fibrose hépatique [32].

Il existe des différences dans la réponse à l'INF en fonction du génotype viral. Les données disponibles comparent les génotypes A et D en rapport avec la distribution géographique.

En effet, le taux de réponse au traitement par l'INF est meilleur chez les patients infectés par un virus au génotype A que ceux infectés par un virus au génotype D. De même, la réponse au traitement par l'INF est meilleure chez les patients infectés par un virus au génotype B que ceux infectés par un virus au génotype C [33].

A ce jour, peu d'études comparent l'efficacité de la lamivudine en fonction du génotype. Ces études ne sont pas comparables compte tenu du faible nombre de patients et des différents protocoles thérapeutiques adoptés et les résultats sont contradictoires [34].

Il est donc impossible d'affirmer qu'il existe des différences dans la réponse au traitement de l'hépatite chronique B par la lamivudine en fonction du génotype viral.

La résistance à la lamivudine en fonction du génotype viral est également restreinte à quelques études qui ne permettent pas de conclure à un rôle du génotype à la survenue de mutants YMDD [34].

La réponse virologique au traitement par adénofovir ne semble pas être influencée par le génotype du virus responsable de l'hépatite chronique B, comme en témoignent les résultats de Westland et coll. Concernant 694 patients traités par 10 mg d'adénofovir pendant 48 semaines [35].

1. CADRE D'ETUDE

Les données épidémiologiques ont été collectées d'une part par l'intermédiaire d'une fiche d'enquête standardisée (annexe1), élaborée spécifiquement pour notre étude; d'autre part, par l'intermédiaire des registres au Centre inter départemental de Transfusion Sanguine (CIDTS) de Pointe-Noire.

Les prélèvements ont été analysés d'une part au laboratoire de l'Hôpital Général de Loandjili (HGL) et d'autre part au laboratoire de virologie/UPRES EA 3610, Faculté de Médecine, Université Lille II, CHRU Lille, Centre de Biologie Pathologie et Parc EURASANTE.

1.1. Laboratoire de l'HGL

L'Hôpital Général de Loandjili (HGL) est situé dans l'arrondissement 4 de Pointe-Noire. Il dispose de quatorze (14) services cliniques et de trois (3) services médico-techniques, parmi lesquels le laboratoire, où notre étude a été réalisée.

Le Laboratoire comporte 7 unités (anatomo-pathologie, virologie, hématologie, biochimie, parasitologie-mycologie, séro-immunologie et l'unité de bactériologie). Il est dirigé par le Docteur Donatien MOUKASSA, anatomo-pathologiste.

1.2. Centre inter départemental de Transfusion Sanguine de Pointe Noire

Le centre inter départemental de transfusion sanguine de Pointe Noire est situé dans l'arrondissement 1(LUMUMBA) de Pointe-Noire, dans l'enceinte de l'Hôpital Général Adolphe CISSE. Il dessert la totalité des 2 départements à savoir Pointe-Noire et Kouilou, couvrant ainsi une superficie d'environ 13.500 Km² pour une population de 900.870 Habitants [36].

Ce centre comprend 6 services essentiels : Accueil, Consultation, Prélèvement, Laboratoire, Production et Distribution. Il est dirigé par le Docteur Alphonse SAMBA, biologiste, secondé par 3 médecins pour le service de Consultation et de 5 techniciens supérieurs de Laboratoire.

1.3. Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille

Le site du CHRU de Lille s'ouvre sur l'environnement de l'agglomération lilloise. Il est implanté sur 170 hectares. C'est un pôle de référence dans le domaine de la qualité et de la sécurité des soins.

Le CHRU regroupe 11 hôpitaux, 27 cliniques et instituts, un centre de soin dentaire et un nouveau centre de Biologie pathologie. C'est dans ce dernier que sont réalisées les activités diagnostiques du Laboratoire de Virologie.

Le Laboratoire de virologie

Le Laboratoire de Virologie du CHRU de Lille est composé de 4 Unités Fonctionnelles Communes de Moyens (UFCM) :

- 1 UFCM de Virologie : Recherche, Développement, Innovation, Expertise et Formation (UF 9711) dans laquelle s'inclut l'EA 3610 de l'université de Lille 2.

Jusqu'en 1988, le Laboratoire de Virologie était situé à l'Institut Pasteur de Lille. Son transfert s'effectua à l'Institut Gernez Rieux au CHRU de Lille. En mai 2001, le laboratoire s'est installé dans le bâtiment Paul Boulanger à l'hôpital Albert Calmette.

Actuellement, les activités de l'UFCM de Virologie : Recherche, Développement, Innovation, Expertise et Formation, sont réalisées dans le laboratoire de virologie/EA3610 qui se trouve depuis Juin 2008 sur le Parc EURASANTE, tandis que les UFCM du Laboratoire de Virologie impliquées dans les activités diagnostiques ont été transférées les 6 et 7 juin 2007 dans le Centre de Biologie et Pathologie.

Depuis septembre 2003, le chef du service du Laboratoire de Virologie est le Professeur Didier HOBER qui a créé en 2002 l'UPRES EA 3610 « Pathogenèse virale du diabète de type 1 » ainsi que l'UFCM Virologie : Recherche, Développement, Innovation, Expertise et Formation.

2. TYPE ET PERIODE D'ETUDE

Il s'agit d'une étude transversale, comparative à recueil des données prospectif allant de Novembre 2007 à Mai 2008, soit une période de 6 mois.

3. POPULATION DE L'ETUDE

Ont été inclus, les sujets ayant un résultat positif de l'AgHBs parmi les donneurs de sang du CIDTS de Pointe Noire et ayant accepté de participer volontairement à l'étude, en signant la fiche de consentement personnel.

Ont été exclus, les sujets perdus de vu, après un résultat positif au CIDTS et ceux ayant refusé de participer à l'étude.

4. Echantillonnage

Un échantillon de 20 sujets a été constitué sur l'ensemble des donneurs de sang ayant l'Ag HBs positif. La méthode utilisée est l'échantillonnage par méthode aléatoire simple. C'est-à-dire par tirage au sort.

5. METHODES

5.1. Variables étudiées

Les variables épidémiologiques sont : le sexe, l'âge, facteurs de risque de contamination par le VHB et les antécédents.

Les variables biologiques sont : l'Ag HBs, la coïnfection (VIH et VHC), l'ADN total et l'ADN viral.

5.2. Analyses sérologiques

5.2.1. Ag HBs

L'Ag HBs a été réalisé avec la technique de MONOLISA test HBs ultra (BIO-RAD, France). C'est une technique immuno-enzymatique de type « sandwich » en un temps utilisant des anticorps monoclonaux et des anticorps polyclonaux sélectionnés pour leur capacité à se lier aux différents sous-types de l'Ag HBs et la plupart des souches variantes de l'hépatite B.

Tous les 20 échantillons ont été traités avec le même protocole (annexe 2) et les résultats interprétés de la manière suivante :

Ainsi les échantillons dont le ratio est inférieur à 1 sont considérés négatifs et les échantillons dont le ratio est supérieur ou égal à 1 ont été considérés comme initialement positifs avant d'être retestés en double pour l'interprétation finale.

La spécificité de ce test est estimée à 99,94% et la sensibilité à 100%.

Pour l'interprétation, 3 groupes ont été constitués en fonction du taux de ratio de l'Ag HBs, en intervalle de 1]1 - 2] ; ]2 - 3] et ]3 - 4].

5.2.2. VIH

Le test utilisé pour la recherche du VIH est le « MUREX HIV Ag/AB Combination » (Murex Biotech Limited, Angleterre), selon les instructions du fabricant.

5.2.3. VHC

Pour rechercher le VHC nous avons utilisé le MUREX anti-HCV version 4.0 pour la détection d'anticorps anti VHC.

5.3. Recueil et conservation des échantillons

Les patients sélectionnés ont été convoqués et un prélèvement sur le tube EDTA a été réalisé. D'abord, le sang total a été déposé sur un papier buvard selon le protocole ci-après, et puis le reste a été centrifugé pendant 10 minutes à 2500 tours/ minute. Enfin, le plasma recueilli a été également déposé sur un papier buvard, selon le protocole ci-après. Il s'agit du papier buvard utilisé pour le test de Guthrie (Figure 7).

Sur 5 spots, nous avons déposé 30 ul de sang total chacun et sur 4 spots 30 ul de plasma chacun. Puis la carte a été séchée à température ambiante sous ventilateur.

La conservation a été réalisée selon deux protocoles : pour chaque patient, une carte comportant 5 spots de sang total et 4 spots de plasma a été conservée à une température de - 20° C et une autre comportant 5 spots de sang total et 4 spots de plasma conservée à une température ambiante.

Ø Groupe I : Echantillons constitués de sang total et de plasma conservés à -20°C avec 2 sous groupes :

Ø Groupe II : Echantillons constitués de sang total et de plasma conservés à température ambiante, avec 2 sous groupes :

5.4. Transport

Les cartes conservées à température ambiante (Groupe II) ont été transportées à température ambiante dans les enveloppes papiers et les cartes conservées à - 20° C (Groupes I) ont été transportées dans des sacs plastiques, contenus dans un pack de camping contenant la glace pilée. Le transport a duré 8 heures. Les échantillons conservées à - 20°C sont restés 32 heures hors de leurs conditions initiales.

5.5. Protocoles d'élution et d'extraction d'ADN

A l'arrivée au laboratoire de Virologie/EA3610 de Lille, les cartes initialement conservées à - 20°C ont été remises dans les mêmes conditions, tandis que celles gardées à température ambiante ont été gardées comme telle.

Dans le but d'obtenir une méthode d'extraction de l'ADN total à partir des échantillons séchés sur les papiers buvards, 2 protocoles ont été réalisés dans les premières semaines de ce travail. Le premier protocole, utilisant le kit QIAGEN (QIAGEN S.A, Coutrabeuf, France), décrit par Jardi et al [37]. Le deuxième protocole a été décrit par Vauloup-Fellous et al [38]. Il a été utilisé avec quelques modifications. C'est une méthode dite « chimique », utilisant le Phenol Chloroforme.

Une première phase expérimentale a précédé notre étude. Il s'est agi d'une extraction réalisée sur un sujet, dont le statut VHB n'est pas connu, qui a été soumis aux mêmes conditions de prélèvement et de traitement que nos patients, en utilisant les 2 méthodes d'extraction afin de pouvoir les comparer.

Une deuxième phase expérimentale a consisté à l'extraction des plasmas de deux sujets connus VHB positif (ADN viral positif) en utilisant les 2 méthodes.

L'extraction de l'ADN de l'ensemble des sujets de l'étude a été réalisée en utilisant le protocole décrit par Vauloup-Fellous et al.

5.6. Dosage de l'ADN total

L'ADN total a été dosé en utilisant le Kit Quant-iT DNA Assay (Terner Biosystems, Sunnyvale Californie, USA) selon le protocole suivant : 10 ul d'extrait d'ADN et 1ul pour chacun des 8 points de la gamme étalon ont été ajouté à 200 ul de la solution de travail dans un puits d'une plaque de micro-titration. La plaque est ensuite centrifugée brièvement et l'évaluation de la quantité de l'ADN total s'est faite sur le STRATAGENE Mx 3000p. Cette évaluation est basée sur le principe de la quantification absolue par étalonnage avec un standard : les cinétiques sont mesurées pour différentes concentrations des échantillons. On en déduit une courbe du Ct en fonction de la quantité d'ADN et une mesure du coefficient d'efficacité E (qui doit être le plus proche de 2). La courbe d'étalonnage ainsi constituée permet de déduire la concentration à partir de la mesure du Ct.

Pour l'analyse statistique, 4 intervalles ont été définies en fonction de la quantité de l'ADN total en ng/ul, avec un pas de 2 :] 5-7] ; ]7-9] ; ]9-11] et ]11-13].

5.6.1. Polymerase chain reaction du VHB

La PCR du VHB a été réalisé par le COBAS^® Taq Man^® HBV test (Roche, France) utilisant le nécessaire « Acide nucléique viral high Pure system » pour la préparation manuelle des échantillons et l'analyseur COBAS Taq man 48 pour la détection et l'amplification automatisée. Il s'agit d'une technique de PCR en temps réel utilisant les amorces complémentaires spécifiques du VHB et la détection par sondes oligonucléotidiques doubles ou clivées, à marquage fluorescent, qui permettent la quantification du produit cible VHB amplifié (amplicons) et de l'ADN du standard de quantification VHB, qui est traité, amplifié et détecté simultanément avec l'échantillon. Les résultats ont été interprétés à l'aide du logiciel AMPLILINK version 3.2.

5.6.2. Critères de jugement

Il s'agit des paramètres évalués dans le but de vérifier l'hypothèse de recherche selon laquelle, pour éluer et extraire l'ADN du papier buvard, la conservation et le transport à température ambiante des échantillons séchés ont plus d'avantages que la conservation et le transport à - 20°C d'une part et le plasma séché a plus d'avantages que le sang total séché d'autre part.

- La charge virale, obtenue après PCR du VHB, elle a permis de confirmer que l'ADN total élué contient l'ADN du VHB.

5.6.3. Analyse statistique

Les P-values ont été calculées avec le programme de comparaison de données qui utilise le test de Mann et Whitney. La P-value nous permet d'affirmer qu'il existe bien une différence significative entre deux moyennes. Dans ce cas, sa valeur doit être inférieure à 0,05.

Nous avons utilisé le programme de corrélation-régression qui utilise le test de Spearman afin de déterminer s'il existe une corrélation entre les rendements du plasma séché et du sang total d'un même patient.

Le programme de comparaison de valeurs appariées a également été nécessaire pour observer les différences entre 2 échantillons d'un même patient, ayant subi divers traitements (conservation et transport).

RESULTATS

1. Fréquences

Durant les 6 mois de l'étude, nous avons identifié 1086 sujets ayant l'AgHBs positif sur les 9270 donneurs de sang, soit une fréquence de 11,71%.

Les sujets de sexe masculin ont représenté 83,04% et ceux de sexe féminin 16,96%.

L'échantillon utilisé a été de 20 sujets ce qui représente 1,81% des 1086 sujets, AgHBs positif, dont 17 hommes (85%) et 3 femmes (15%).

2. Paramètres épidémiologiques de la Population de l'étude

Tableau III: Tableau récapitulatif des caractéristiques épidémiologiques de

	AGE (ans)	SEXE	PROFESSION	FACTEURS DE RISQUES
1	42	M	Commerçant	TRANSFUSION
2	49	M	Fonctionnaire	AUCUN
3	46	M	Ouvrier	AUCUN
4	46	M	Ouvrier	TRANSFUSION
5	38	M	Ouvrier	SEXUEL*
6	28	M	Sans emploi	AUCUN
7	24	F	Etudiant	AUCUN
8	33	M	Sans emploi	AUCUN
9	32	M	Ouvrier	AUCUN
10	34	M	Ouvrier	AUCUN
11	37	M	Fonctionnaire	AUCUN
12	26	M	Ouvrier	AUCUN
13	50	F	Fonctionnaire	AUCUN
14	42	M	Sans emploi	AUCUN
15	20	F	Etudiant	AUCUN
16	32	M	Ouvrier	AUCUN
17	26	M	Etudiant	AUCUN
18	18	M	Etudiant	AUCUN
19	43	M	Fonctionnaire	AUCUN
20	42	M	Fonctionnaire	AUCUN

*Sexuel : défini comme facteur de risque ; il s'agit d'un sujet ayant avoué avoir plusieurs partenaires sexuels

2.1. Age et Sexe

Tableau IV : Répartition de la population étudiée en fonction de l'âge en années et

Les extrêmes d'âge sont 18 et 50 ans avec une moyenne d'âge de 35,40 #177;9,60

2.2. Facteurs de risque et antécédent

Quatre vingt cinq pour cent des sujets de la population étudiée n'avaient pas de facteurs de risque d'infection à VHB. Deux sujets ont l'antécédent de transfusion sanguine comme facteur de risque et un le comportement sexuel à risque (multiples partenaires sexuels).

3. Paramètres biologiques

3.1. Ag HBs

	STATUT Ag HBs		STATUT VIH		STATUT VHC
1		3,644	Neg	Neg
2		3,134	Neg	Neg
3		1,927	Neg	Neg
4		2,7	Neg	Neg
5		3,472	Neg	Neg
6		2,204	Pos	Neg
7		2,47	Neg	Pos
8		2,045	Neg	Neg
9		2,618	Pos	Pos
10		2,247	Neg	Neg
11		1,997	Neg	Neg
12		2,314	Neg	Neg
13		2,482	Neg	Neg
14		2,186	Neg	Pos
15		1,824	Neg	Neg
16		2,058	Neg	Neg
17		1,923	Neg	Neg
18		2,048	Neg	Neg
19		3,377	Neg	Neg
20		3,686	Neg	Neg

Tous les sujets sélectionnés avaient le résultat positif à l'Ag HBs c'est-à-dire le ratio supérieur à 1. La valeur du ratio moyenne est de 2,5#177;0,6 et les extrêmes sont 1,82 et 3,69.

Dix huit sujets ont été testés négatifs au VIH, soit un taux de 90,00% et 2 sujets positifs, soit un taux de 10,00%. Ces 2 sujets ont un taux de ratio de l'Ag HBs compris entre 2 et 3, soit un taux de 18,18% des sujets ayant un taux compris entre 2 et 3.

Dix sept sujets ont été testés négatifs au VHC, soit un taux de 85,00% et 3 sujets positifs soit un taux de 15,00%.

Soit : deux (2) sujets ayant à la fois le VHB et le VHC, un sujet ayant le VHB et le VIH et un sujet ayant les 3 infections recherchées.

3.2. ADN total

3.2.1. ADN total des sujets témoins

Figure 8. Comparaison des rendements d'ADN total obtenu apres extraction par le Qiagen et la méthode au Phenol Chlorophorme.

La figure suivante montre les résultats du dosage de l'ADN total obtenus après extraction utilisant les 2 protocoles pour un sujet testé non connu Ag HBs:

Figure 9: Courbe standard de la quantité d'ADN extrait pour le témoin dont le statut VHB n'est pas connu.

3.2.2. ADN total de la population de l'étude

GROUPE I GROUPE II Is Ip IIs IIp
1	7,01	7,01	7,01	7,01
2	7,39	7,39	7,39	7,39
3	7,63	7,63	7,63	7,63
4	7,71	7,71	7,71	7,71
5	7,74	7,74	7,74	7,74
6	9,73	9,73	9,73	9,73
7	6,99	6,99	6,99	6,99
8	8,56	8,56	8,56	8,56
9	8,94	8,94	8,94	8,94
10	8,47	8,47	8,47	8,47
11	8,22	8,22	8,22	8,22
12	6,4	6,4	6,4	6,4
13	7,8	7,8	7,8	7,8
14	11,86	11,86	11,86	11,86
15	5,68	5,68	5,68	5,68
16	7,52	7,52	7,52	7,52
17	7,04	7,04	7,04	7,04
18	6,52	6,52	6,52	6,52
19	7,21	7,21	7,21	7,21
20	9,59	9,59	9,59	9,59

La moyenne de l'ADN total extrait est de 7,90 ng/ul pour chaque groupe, avec des extrêmes de 5,68 et 11,86 ng/ul

Figure 10. Courbe standard de la quantité d'ADN total extrait pour l'ensemble de la population.

3.2.2.1. ADN total et âge

3.2.2.2. ADN total et coïnfection

Tableau VII : Répartition de la quantité d'ADN total en fonction du statut VHC

GROUPE I GROUPE II Is Ip IIs IIp
1	Neg	Neg	Neg	Neg
2	Neg	Neg	Neg	Neg
3	Pos	Pos	Pos	Pos
4	Pos	Pos	Pos	Inh
5	Pos	Pos	Pos	Pos
6	Pos	Pos	Pos	Pos
7	Pos	Pos	Neg	Pos
8	Neg	Neg	Neg	Neg
9	Pos	Pos	Pos	Pos
10	Pos	Neg	Pos	Pos
11	Neg	Neg	Neg	Neg
12	Pos	Pos	Pos	Pos
13	Inh	Neg	Inh	Neg
14	Inh	Inh	Pos	Pos
15	Neg	Neg	Neg	Neg
16	Neg	Neg	Neg	Neg
17	Neg	Neg	Neg	Neg
18	Inh	Pos	Neg	Neg
19	Neg	Neg	Neg	Neg
20	Neg	Neg	Neg	Neg

3.3. Résultats de PCR en fonction du mode de conservation

Tableau IX : Répartition des résultats de la PCR du VHB en fonction des sujets du

Tableau X: Répartition des résultats de la PCR du VHB en fonction des sujets du

3.4. Résultats de la PCR en fonction du type de prélèvement

Nous avons trouvé 5 patients ADN viral positif et 9 patients ADN viral négatif sur les 4 groupes, c'est-à-dire le même profil (Positif ou négatif) quelque soit le mode de conservation et le type de prélèvement.

Par ailleurs, 6 patients ont des profils différents selon les conditions de conservation et de prélèvement, soit :

· Un patient positif dans les groupes Is, Ip, IIs mais avec la présence d'inhibiteurs dans le groupe IIp ;

· Un patient positif dans les groupes Is, Ip, IIp, mais négatif dans le groupe IIs ;

· Un patient positif dans les groupes Is, IIp, IIs, mais négatif dans le groupe Is ;

· Un patient négatif dans les Groupes Ip et IIp, mais avec la présence des inhibiteurs dans les groupes Is et IIs ;

· Un Patient positif dans les groupes IIs et IIp, mais ayant présenté les inhibiteurs dans les groupes Is et Ip ;

· Un patient Négatif dans les groupes IIs et IIp, mais positif dans le groupe Ip, avec la présence des inhibiteurs dans le groupe Is.

Le caractère prospectif de cette étude assure une qualité optimale aux résultats, le recueil d'informations étant contemporain au prélèvement.

La comparaison des groupes constitués des mêmes patients a permis d'éviter le biais lié à la différence des critères de sélection des patients.

La durée de la période d'étude a été définie par la nécessité d'obtenir un échantillon statistiquement significatif, cependant la faible taille de l'échantillon, limitant l'interprétation des données épidémiologiques, s'explique par le fait que les moyens financiers que nous avons eu étaient faibles pour réaliser une étude fondamentale, comportant plusieurs patients.

Le seul critère d'inclusion à l'étude a été établi dans le but d'éviter le biais dans l'interprétation des résultats. Il s'agit de la positivité à l'AgHBs. Ce critère a été également utilisé par Khelifa F. et al, dans une étude visant à déterminer les génotypes du VHB circulant en Algérie [39]. Ce choix s'explique par le fait que seule la recherche de l'Ag Hbs est réalisée dans les centres de transfusion sanguine au Congo, dans le cadre du dépistage du VHB. Cependant, la présence de l'Ag HBs ne signifie pas toujours la présence de l'ADN viral. Seule l'Ag HBe est considérée comme témoin indirect de la présence de l'ADN viral [23].

Les critères définis ont permis de comparer les 2 protocoles de traitement des échantillons de sang séchés, sans tenir compte de la présence ou non de l'Ag HBe. Les résultats de la quantification de l'ADN total ont été repartis en 4 groupes pour pouvoir évaluer le rendement des protocoles utilisés, car l'ADN total était considéré comme l'ensemble de l'ADN humain et de l'ADN viral du VHB y compris les autres virus.

Les résultats de la PCR du VHB ont été exprimés en positif ou négatif au lieu de valeurs quantitatives car le protocole utilisé pour l'extraction de l'ADN a permis d'obtenir 50ul d'extrait et que 10ul ont été utilisés pour la quantification de l'ADN total. Ainsi, pour la PCR du VHB, nous avons utilisé 40ul d'extrait au lieu de 50ul, tel que prévu par le protocole du kit COBAS Taq Man test. Cette erreur ne met pas en cause la qualité de l'étude, car la PCR du VHB permet de détecter l'ADN viral même pour des volumes plus faibles. Cependant les valeurs quantitatives doivent être considérées avec précaution.

Le rendement, après 3 essais, a montré que la méthode utilisant le kit QIAamp DNA mini kit, décrite par Jardi et al [37] donne moins d'ADN que la méthode au phénol chloroforme, décrite par Vauloup-Fellous et al [38]. Ceci a justifié l'utilisation de la méthode au phénol chloroforme pour l'extraction et l'élution des échantillons de l'ensemble des patients.

Au cours de notre étude nous avons obtenu une séroprévalence de 11,71%. Cette séroprévalence n'a pas changé depuis 2 décennies car elle est similaire à celle trouvée par J. Miehakanda et al [40] chez les donneurs de sang du centre de transfusion sanguine de Brazzaville entre 1986 et 1987(11,6%). Elira-Dockekias A. et al [41] ont trouvé en 2002 une séroprévalence de 7,20%. Par ailleurs, dans les autres pays d'Afrique les études sont divergentes à ce sujet, au Cameroun, Mbanya DN et al [42] ont trouvé une séroprévalence du VHB de 10,7% alors que Batina [43] a trouvé 4,7% en République Démocratique du Congo.

Notre séroprévalence est toute fois proche de celle fixée par l'OMS qui place le Congo dans la zone de forte endémie, dont la prévalence est supérieure à 8% [2].

La population étudiée est constituée de 85% des sujets de sexe masculin pour 15% de sexe féminin. Cette proportion est similaire à celle retrouvée par Batina et al [43] soit 75% de sexe masculin. Cependant, cela ne veut pas dire que le sexe masculin est prédominant chez l'ensemble des porteurs de l'Ag HBs. Ceci s'explique par le fait que la population des donneurs de sang est constituée en grande partie des hommes, soit 83,05% pour notre étude et 91,17% pour Miehakanda et al [40]. Par ailleurs, dans une population autre que les donneurs de sang, la différence entre les deux sexes n'est pas significative car Makuwa et al [44] ont trouvé un sex-ratio de 0,83 dans une population hospitalisée à Brazzaville.

La majorité des sujets avaient un âge compris entre 25 et 34 ans, soit 35%, suivi de la tranche de 35 et 44ans avec un âge moyen de 35,40 #177; 9,60ans. Il n'y a pas eu de différence significative entre les résultats obtenus (p>0,05). L'âge moyen est similaire à l'âge trouvé par Batina et al [43], soit 35 #177; 1,24 ans.

Notre étude a concerné la population des donneurs de sang et le don de sang est autorisé à partir de 18 ans jusqu' à 60 ans. Il est donc peu probable que l'âge soit un facteur susceptible d'influencer la qualité des résultats.

Aucun antécédent n'a été retrouvé chez 75% de la population étudiée. Ceci s'explique par le fait que l'interrogatoire réalisé au cours du recrutement des donneurs de sang, portant sur les antécédents, les facteurs de risque d'infection à VHB, permet d'écarter les sujets à risque. Par ailleurs, nous avons trouvé 2 sujets avec les antécédents de transfusion sanguine ; cependant dans les 2 cas, la transfusion remontait à plus de 30 ans (31 ans pour un sujet et 36 ans pour l'autre).

Aucun sujet n'a reçu le vaccin contre le VHB, ceci témoigne de la faible couverture vaccinale encore remarquable au Congo. Miehakanda et al [40] ont évoqué une couverture vaccinale de 4,2% chez les sujets à risque à Brazzaville.

Dans notre étude, l'extraction de l'ADN a été réalisée à partir d'un spot comportant, d'une part 30 ìl de sang total et d'autre part 30 ìl de plasma. L'extraction des cartes de référence (sujet témoin non connu VHB positif et sujet connu VHB+) a montré une sensibilité supérieure de l'extraction au phénol chloroforme après traitement par la protéinase K, par rapport par le kit Qiagen. La détection semble inchangée quelque soit le mode de conservation et de transport (conservation à température ambiante ou à -20°C).

Jardi et al [37] ont effectué cette extraction à partir du papier buvard, en utilisant la méthode par le kit Qiagen. D'autres ont effectué l'extraction de l'ADN à partir du papier buvard, mais dans le but de rechercher d'autres infections virales. Comme c'est le cas de Vauloup-Felloup et al [38], dans la recherche du Cytomégalovirus. Il s'agissait d'une étude comparative entre la méthode au Phénol chloroforme, le kit Qiagen et l'extraction par la chaleur. Les résultats sont en faveur de la méthode au Phénol Chloroforme.

Fischer A. et al ont également utilisé cette méthode dans la recherche du VIH.

Nos patients ont été choisis pour leur positivité de l'Ag HBs et la charge virale étant imprévisible chez ces patients, nous avons donc retenu les conditions d'extraction les plus sensibles, soit une extraction classique au phénol- chloroforme à partir d'un spot du papier buvard.

Les analyses des échantillons de sang total et de plasma ont révélé une étroite corrélation entre les résultats de l'ADN viral, car nous avons obtenu les mêmes résultats lorsqu'il s'agit du plasma. Par ailleurs, pour le sang total, nous avons observé la présence de quelques inhibiteurs de la PCR, mais la différence n'est pas significative.

La présence des inhibiteurs de la PCR du VHB est faible quelques soit le mode de conservation et quelques soit le type de prélèvement, car dans les 4 groupes la différence n'est pas significative. Cette constatation indique que le tampon d'élution de l'ADN du VHB sur du papier buvard, est pur, et ne présente pas de pertes importantes mesurables au cours d'élution.

La conservation à température ambiante n'a pas d'incidence sur les niveaux d'ADN du VHB ou l'intégrité d'ADN, car les résultats sont similaires à ceux des échantillons qui ont été conservés à -20°C. Cette constatation nous fait penser que la conservation à température ambiante présente plus d'avantages en ce sens qu'elle ne nécessite pas un équipement frigorifique important. Il faut surtout s'assurer que le prélèvement est bien sec et isolé pour éviter toute contamination.

Le type de prélèvement semble n'est pas avoir de conséquences, car dans notre étude, le rendement d'ADN viral est similaire que ce soit le plasma ou le sang total. Cette constatation nous fait remarquer que même une goutte épaisse peut permettre d'extraire de l'ADN du VHB et donc permettre de poser le Diagnostique moléculaire de l'infection à VHB.

L'absence de disparité dans les groupes (tous les groupes 40% des sujets VHB positif) nous fait penser que la méthode d'extraction utilisée est fiable. Cependant, la sensibilité de notre méthode n'a pas été évaluée, car une comparaison avec une technique de routine avec les échantillons de sang non séché n'a pas été possible au cours de notre étude. En revanche, Vaulaup-Fellout et al [38] ont trouvé une sensibilité de l'ordre de 10-3, en comparant la méthode d'extraction à partir du papier buvard par le phénol chloroforme, après traitement par la protéinase K et l'extraction des échantillons de sang total non séché.

Dans tous les groupes, nous avons eu 40% de sujets VHB positif sur l'ensemble des 20 sujets AgHBs positif. Ceci peut s'expliquer par le fait de la présence de l'AgHBs ne signifie pas toujours la présence de l'ADN viral, d'où une recherche de l'Ag HBe serait intéressante. Cependant, l'hypothèse des variants non amplifiés par la PCR est à évoquer.

Notre étude a porté sur la population des donneurs de sang, qui sont tous asymptomatiques. L'évolutivité antérieure de l'infection et des éventuels retentissements hépatiques qu'elle aurait pu avoir n'ont pas été évalué. Par conséquent, nous pensons que les sujets ADN positif sont repartis en 2 groupes :

Le premier groupe, des porteurs sains, chez lesquels on trouve une réplication virale résiduelle. Ces sujets sont soumis aux risques théoriques de réactivation, de surinfection par le VHD ou le VHC. Cependant Pol et al [23] ont démontré que ces risques sont très faibles en l'absence d'immunodépression.

Le deuxième groupe, des sujets ayant une réplication intermittente, vus en phase de latence clinique et qui peuvent avoir des lésions histologiques.

En pratique, il faut surveiller ces sujets, au moins de façon annuelle, pour distinguer les différents cas de figure. Pol et al [23] ont proposé un dosage des transaminases, un dépistage du CHC par le dosage de l'alpha foeto-protéine, l'échographie hépatique et l'utilisation des tests non invasifs de fibrose hépatique tels que le fibroscan, le Fibrotest et l'Actitest.

Cette technologie de biologie moléculaire avancée, de quantification d'ADN du VHB n'est pas disponible dans tous les pays en développement, et souvent, ces analyses sont effectuées dans les centres de référence, situés dans les pays développés et impliquent une série de problèmes, principalement en ce qui concerne la stabilité des acides nucléiques, le traitement, et les conditions de transport. L'utilisation des échantillons de sang séché a été considérée comme une alternative. La collecte de sang sur papier buvard nécessite une petite quantité de l'échantillon ; elle est peu invasive et produit un échantillon qui est peu coûteux à expédier, et ne nécessite pas de traitement spécial ou des conditions de conservation particulières.

Cependant, les conditions de transport d'un pays à l'autre, sans risque de contamination doivent être bien précisées dans une étude plus importante. Fischer A. et al [45], ont proposé des conditions de transport des échantillons de sang séché sur papier buvard dans le diagnostic de l'infection à VIH : chaque papier buvard doit être bien sec et protégé (pochette plastique ou film cellophane) afin d'éviter tout contact entre les échantillons lors du transport. Un système d'acheminement au laboratoire doit être mis en place. Des partenariats avec les Postes et les services de courrier express doivent être envisagés.

CONCLUSION ET

PERSPECTIVES

En conclusion, l'essaie d'extraction de l'ADN du VHB à partir du sang séché sur papier buvard a permis le développement une nouvelle méthode simple et appropriée pour l'évaluation de la réplication du virus de l'hépatite B. Le sang séché sur papier buvard représente un moyen idéal pour les tests de diagnostic du virus de l'hépatite B dans les pays où les structures biologie moléculaire, la conservation frigorifique et le transport vers les laboratoires spécialisés sont problématiques. L'élution de l'ADN du VHB à partir d'une seule goutte de sang séché permet de poser le diagnostic de réplication virale de l'infection à VHB. La conservation à température ambiante n'a pas d'effet néfaste sur le prélèvement et représente la méthode idéale et peu onéreuse.

Ø Des partenaires du développement scientifique, d'assurer le financement d'une :

§ Etude avec un échantillon plus important et comparative avec des échantillons non séchés afin d'en dégager la sensibilité quantitative de la charge virale ;

§ Etude permettant l'évaluation de l'utilisation des échantillons de sang séché sur papier buvard dans le génotypage virus de l'hépatite B et la détection des G1896A précoce mutants et des variantes dans le motif YMDD polymérase ;

Ø Des autorités sanitaires du pays, d'améliorer le plateau technique et d'équiper des structures de biologie moléculaire des laboratoires des principales villes, afin de réaliser, au niveau local, la PCR du VHB et que l'utilisation du papier buvard soit nécessaire quand il s'agit de centres de santé éloignés.

RESUME

Le virus de l'hépatite B (VHB) est l'un des différents virus responsables de l'hépatite virale. Dans le monde, plus de 2 milliards de personnes ont été infectées par le VHB et plus de 350 millions d'entre elles ont une infection chronique. Des marqueurs sérologiques sont couramment utilisés pour confirmer le diagnostic et/ou aider au pronostic d'une infection aiguë ou chronique par le VHB. Le principal marqueur de l'infection par le VHB est la présence de l'antigène d'enveloppe (AgHBs). Bien que les porteurs puissent éliminer l'AgHBs et développer des anticorps anti-HBs, il semble qu'il y ait toujours un risque ultérieur de complications hépatiques graves.

Par conséquent, l'utilisation de ce marqueur peut avoir un intérêt limité dans la surveillance de l'évolution de la maladie. L'ADN du VHB a une valeur pronostique pour ce qui concerne l'évolution des infections aiguës et chroniques. Cependant, dans les pays en développement, les structures de biologie moléculaire sont quasi inexistantes. C'est ainsi que nous avons entrepris cette étude dans le but d'évaluer l'utilisation des échantillons de sang séché sur papier buvard, en vu de réaliser la PCR du VHB.

Nous avons réalisé une étude transversale, à recueil des données prospectif, comparative entre d'une part les conditions de conservation des échantillons (température ambiante et -20°C) et d'autre part les types de prélèvements (sang total et plasma). Ces échantillons provenaient de 20 sujets Ag HBs positifs, sélectionnés parmi les donneurs de sang du Centre inter départemental de Pointe-Noire.

L'extraction par la méthode au Phénol chloroforme est plus sensible que celle utilisant le kit commercial Qiagen.

La différence n'était pas significative en ce qui concerne les rendements d'extraction par méthode au phénol chloroforme, quel que soit le type de prélèvement et quel que soit le mode de conservation des échantillons.

L'utilisation des échantillons de sang séché sur papier buvard représente une méthode efficace, simple et peu onéreuse dans le diagnostic moléculaire de l'infection à VHB.

ABSTRACT

The hepatitis B virus (HBV) is one of several viruses responsible for viral hepatitis. In the world, more than 2 billion people have been infected with HBV and more than 350 million of them have chronic infection. Serological markers are used to confirm the diagnosis and / or assist in the prognosis of acute infection or chronic HBV. The main marker of HBV infection is the presence of the envelope antigen (HBsAg). Although holders can eliminate the HBsAg and develop anti-HBs, it seems there is always a risk of serious liver complications. The antigen HBV e (HBeAg) is generally used as a marker and indicates a secondary active replication of HBV associated with a progressive liver disease. Therefore, this marker may have limited interest in monitoring the disease. The HBV DNA has a prognostic value with regard to the development of acute and chronic infections. However, in developing countries, the structures of molecular biology are almost nonexistent. Thus, we undertook this study to evaluate the use of dried blood spot, with a view to achieving PCR HBV.
We conducted a cross-sectional study, to prospective data collection, comparing the one hand the conditions of conservation of samples (room temperature and -20 ° C) and other types of samples (whole blood and plasma). These samples came from 20 subjects HBs Ag positive, selected among blood donors Center inter-departmental Pointe Noire.

The extraction method in Phenol chloroform is more sensitive than using the commercial Qiagen kit. The difference was not significant in regard to returns extraction method using phenol chloroform, whatever the type of sampling and whatever the method of preservation of samples.

The use of blood dried on blotting paper is a simple and effective method in molecular diagnosis of HBV infection.

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ANNEXES

Annexe1

Noms :.............................................Prénoms :..............................

Adresse :................................. Téléphone :............................

Annexe 2

· Pipettes automatiques ou semi automatiques réglables ou fixes, pouvant distribuer 50 ul, 100 ul, 1000 ul et 10ml ;

· Appareil de lecture pour microplaque équipé de filtres 450, 490 et 620-700nm,

· Réactif 2 (R2) : solution de lavage (concentration 20x) : diluer au 1/20^e la solution de lavage dans l'eau distillée. Préparer 800ml pour une microplaque de 12 barrettes.

· Conjugué (R6+R7) : Taper doucement le flacon du conjugué lyophilisé R7 sur la paillasse pour détacher toute substance pouvant adhérer au bouchon de caoutchouc. Ouvrir le flacon et y transvaser le contenu d'un flacon de diluant pour conjugué R6. Reboucher et laisser reposer 10 minutes en homogénéisant de temps en temps pour faciliter la dissolution.

· Solution de révélation enzymatique (R8+R9) : Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11^e (exemple : 1ml de réactif R9 dans 10ml de réactif R8). Cette solution reste stable 6 heures à l'obscurité. Homogénéiser.

· Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons

· Sortir de l'emballage protecteur le cadre support et le nombre de barrettes nécessaires (R1).

· Secouer la solution du conjugué avant l'utilisation. Homogénéiser. Distribuer rapidement 50 ul de la solution reconstituée de conjugué R6+R7 dans toutes les cupules. Homogénéiser le mélange réactionnel

· Recouvrir d'un film adhésif et incuber pendant 1 heure et 30 minutes à 37#177;1°C.

· Retirer le film adhésif, aspirer le contenu de chaque cupule et laver au moins 5 fois. Veillez à ce que le volume résiduel n'excède pas 10 ul (éventuellement, sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant).

· Distribuer rapidement dans toutes les cupules 100 ul de la solution de révélation de l'activité enzymatique (R8+R9). Laisser la réaction se développer è l'obscurité pendant 30 #177; 5 minutes à température ambiante (18 à 30°C). lors de cette incubation ne pas utiliser de film adhésif.

· Ajouter 100 ul de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de révélation. Homogénéiser le mélange réactionnel.

· Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt avant la lecture et dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.

· S'assurer avant la transcription des résultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d'identification des plaques et des échantillons.

INTERET DE L'UTILISATION DES ECHANTILLONS DE SANG SECHE DANS L'EXTRACTION DE L'ADN VIRAL.