ANNEXES
Annexe 1 :
Les souches de trypanosomes utilisées
|
Espèces
|
Code souches utilisées
|
Hôte et lieu d'isolement
|
|
T. vivax
|
TV. Folonzo/02/CIRDES/02
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
TV. Zaria 486
|
Bovin, Nigeria
|
|
TV. Sat/87/CRTA/133.3
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
T V. Kanfiala
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
T. congolense
Type savane
|
TCS Kigoni/ILRAD/776
|
Bovin, Kenya
|
|
TCS Sat/87/CRTA/125.1
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
TCS Folonzo/02/CIRDES/01.2
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
TCS Kar 83/CRTA/66
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
T. congolense type forêt
|
TCF Komoé/87/CRTA/153
|
Bovin, Burkina Faso
|
|
T. brucei
|
T B Folonzo*
|
Bovin, Burkina Faso
|
* T B folonzo est dilué au 1/10e avec de
l'eau distillée.
Annexe 2: Amorces
monospécifiques utilisées dans la PCR classique
|
Nom
|
Séquences
|
Nombre de bases
|
Taille des
Produits PCR (pb)
|
Spécificité
|
Référence
|
|
TVW1
|
5'CTGAGTGCTCCATGTGCCAC-3'
|
20
|
150
|
T. vivax
|
Masiga et al.
(1992)
|
|
TVW2
|
5'CCACCAGAACACCAACCTGA-3'
|
20
|
|
TCS1
|
5'CGAGCGAGAACGGGCAC-3'
|
17
|
316
|
T. congolense
Type savane
|
Masiga et al.
(1992)
|
|
TCS2
|
5'GGGACAAACAAATCCCGC-3'
|
18
|
|
TCF1
|
5'GGACACGCCAGAAGGTACTT-3'
|
20
|
350
|
T. congolense
Type forêt
|
Masiga et al.
(1992)
|
|
TCF2
|
5'GTTCTCGCACCAAATCCAAC-3'
|
20
|
|
NRP1
|
5'CGAATGAATATTAAACAATGCGCAGT-3'
|
26
|
177
|
Trypanozoon
(T. brucei)
|
Moser et al.
(1989)
|
|
NRP2
|
5'AGAACCATTTATTAGCTTTGTTGC-3'
|
24
|
Source : Desquesnes et Davilà
(2002)
Annexe 3 :
Caractéristiques des amorces Tryp 4R et Tryp 4S
|
Amorce
|
Nbre
De base
|
Séquences
|
Tm
°C
|
Taille des produits PCR en pb
|
|
|
|
|
T. vivax
|
T. brucei
T. evansi
T. equiperdum
|
T. congolense type
|
|
savane
|
forêt
|
Kilifi
|
|
Tryp
4R
|
18
|
5'GCTGCGTTCTTCAACGAA-3'
|
46,60
|
|
|
|
|
|
|
Tryp
4S
|
16
|
5'AAGTTCACCGATATTG-3'
|
39,47
|
250
|
480
|
620
|
680
|
720
|
|
Source : Desquesnes et al.
(2002)
|
Annexe 4:
Caractéristiques des sondes retenues candidates pour le test ELISA
|
Espèce
|
Nom
|
Séquences
|
Taille
en nbre de bases
|
T m
°C
|
|
|
T. vivax
|
STV1
|
5'-bTCGCGCCCGTCTCCCGGCCA-3'
|
21
|
73
|
|
STV2
|
5'-bGGCCACCGGGGCGGGACAGCA-3'
|
21
|
73
|
|
STV3
|
5'-bCCGCGCCCCGCGCGCAGGTGGA-3'
|
23
|
80
|
|
T. congolense
Type savane
|
STCS1
|
5'-b TTGTGTGCTCGTGTGCGTACGGT -3'
|
23
|
62
|
|
STCS2
|
5'-bCCGCACGTGGTGGGGTGCT-3'
|
19
|
66
|
|
STCS3
|
5'-bCCGCCCGACGCTTATTGTGT-3'
|
20
|
64
|
|
T. congolense
Type forêt
|
STCF1
|
5'-bACGCGTCTCCATGTCGCTG-3'
|
19
|
62
|
|
STCF2
|
5'-bGTGTGCGCACCGGCTCGGCTCA-3'
|
22
|
71
|
|
STCF3
|
5'-bGTGTTGGGAGAGGACAGAGGGCA-3'
|
23
|
61
|
|
T. brucei
|
STB1
|
5'-bGCCGTTTGACATGGGAGATGAG-3'
|
22
|
58
|
|
STB2
|
5'-bTATTTTCTCCCTGTTGACCACGGCT-3'
|
25
|
61
|
|
STB3
|
5'-bTGTATGTGTTTCTATATGCCGT-3'
|
23
|
47
|
Annexe 5: Concentrations et volumes des
réactifs pour la PCR classique
|
Réactifs et
Echantillon
|
Volume
Individuel (ul)
|
Concentration
|
Concentration
Finale
|
|
Eau distillée
|
6,81
|
-
|
-
|
|
Tampon (10 mM Tris,
1,5 Mm Mgcl2,
50 mM cl)
|
1,10
|
10 X
|
1X
|
|
DNTP
|
0,88
|
2500 uMoles
|
200 uM
|
|
Amorce 1
|
0,55
|
20 uM
|
1 uM
|
|
Amorce 2
|
0,55
|
20 uM
|
1 uM
|
|
Taq polymérase
|
0,11
|
5 UI / ul
|
0,5 UI / ul
|
|
Volume
Master mix
|
10
|
|
|
|
Echantillon / ADN
|
1
|
|
|
|
Volume final
|
11
|
|
|
Annexe 6 : Concentration et volumes des
réactifs pour la PCR avec les amorces Tryp 4R
et Tryp 4S
|
Réactifs et échantillon
|
Volume individuel (ul)
|
Concentration
|
Concentration finale
|
|
Eau distillée
|
7,28
|
-
|
-
|
|
Tampon (10 Tris, 1,5 mM Mgcl2, 50 Mm Kcl)
|
1,40
|
10X
|
1X
|
|
DNTP
|
1,12
|
2500 uMole
|
200 uM
|
|
Amorce 1 (Tryp 4R)
|
0,21
|
20uM
|
0,3 uM
|
|
Amorce 2 (Tryp 4 S)
|
0,21
|
20uM
|
0,3 uM
|
|
DMSO
|
0,70
|
Pur
|
5%
|
|
Taq Polymérase
|
0,08
|
5 UI / ul
|
0,4 UI / 10ul
|
|
Volume Master mix
|
11
|
|
|
|
Echantillon
|
3
|
|
|
|
Volume final
|
14
|
|
|
Annexe 7 : Concentration et volume des
réactifs pour la PCR ELISA
|
Réactifs et échantillon
|
Volume individuel (ul)
|
Concentration
|
Concentration finale
|
|
Eau distillée
|
24,8
|
-
|
-
|
|
Tampon (10 Tris, 1,5 mM Mgcl2, 50 Mm Kcl)
|
4
|
10X
|
1X
|
|
dNTP(DIG-Labeling mix)
|
4
|
2500 uMole
|
200 uM (dATP, dCTP et dGTP)
190 uM (dTTP)
10 uM (DIG-dUTP)
|
|
Amorce 1 (Tryp 4R)
|
0,5
|
20uM
|
0,3 uM
|
|
Amorce 2 (Tryp 4 S)
|
0,5
|
20uM
|
0,3 uM
|
|
DMSO
|
2
|
Pur
|
5%
|
|
Taq Polymérase
|
0,2
|
5 UI / ul
|
0,4 UI / 10ul
|
|
Volume Master mix
|
36
|
|
|
|
Echantillon
(ADN)
|
4
(2)
|
|
|
|
Volume final
|
40
|
|
|
Annexe 8 : Epreuve ELISA pour la
révélation des produits d'amplification
Sensibilisation des
microplaques :
ü Préparer une solution de 1 ug / ul par dilution
de la streptavidine dans le tampon de sensibilisation (35 mM de Na H
CO3, 15 mM de Na2CO3 à pH = 9,6);
ü Introduire dans chaque puits de la plaque
Maxisorp® 100 ul de cette solution;
ü Agiter et incuber la plaque à 37°C pendant
deux heures ou laisser en chambre froide jusqu'au lendemain;
ü Vider le contenu des puits et conserver à
4°C pour une utilisation rapide et à - 20°C pour une longue
conservation.
Blocage des sites
libres :
ü Sortir la plaque du réfrigérateur ou du
congélateur et laisser à la température ambiante;
ü Répartir 100 ul / puits le tampon de blocage;
ü Incuber à 37°C pendant 30 minutes sous
agitation permanente.
Etape d'hybridation :
ü Introduire dans un tube stérile de 250
ul :
· 5 ul de produit PCR
· 20 ul de la solution de dénaturation (NaOH 1 N),
agiter brièvement les tubes avec le vortex et laisser pendant 10 minutes
à 37°C.
· Faire le mélange sonde et tampon d'hybridation,
bien agiter cette solution d'hybridation avec le vortex, repartir 87 ul / puits
de ce mélange et enfin chauffer à 60°C pendant une dizaine
de minutes.
· Ajouter dans les puits de la plaque 12 à 13 ul
du mélange produits PCR et NaOH.
ü Incuber la plaque à 60°C pendant une heure
30 minutes.
Lavage :
ü Vider le contenu de la microplaque,
ü Laver 4 fois avec la solution de lavage,
ü Tapoter légèrement la microplaque sur un
linge sec et stérile afin d'absorber complètement le liquide de
lavage. Casser les bulles d'air formés et bien essuyer la plaque.
Etape du conjugué :
ü Repartir dans chaque puits de la plaque 100 ul de la
solution d'anticorps anti-DIG-POD,
ü Incuber à nouveau sous agitation à
37°C durant 30 minutes.
Lavage :
ü Verser le contenu de la plaque,
ü Laver comme précédemment.
Ajout du substrat :
ü Introduire dans chaque puits 100 ul de substrat
(solution à volume égal de TMB peroxydase et de
H2O2 ou une solution d'ABTS®),
ü Incuber à 37°C pendant 10 à 15
minutes à l'abri de la lumière et avec agitation.
Lecture :
ü Mettre le spectrophotomètre en marche 15 minutes
environ avant la lecture et sélectionner le programme de lecture.
ü Pour arrêter la réaction (non
indispensable), on reparti 100 ul / puits de l'acide sulfurique
(H2SO4 2 N),
ü La lecture se fait à 450 nm et à l'aide
du logiciel PROCOMM.
SERMENT DES VETERINAIRES DIPLOMES DE DAKAR
« Fidèlement attaché aux directives de
Claude BOURGELAT, fondateur de l'enseignement vétérinaire dans le
monde, je promets et je jure devant mes maîtres et mes
aînés :
- d'avoir en tous moments et en tous lieux le souci de la
dignité et de l'honneur de la profession
vétérinaire ;
- d'observer en toutes circonstances les principes de
correction et de droiture fixés par le code de déontologie de mon
pays ;
- de prouver par ma conduite, ma conviction, que la fortune
consiste moins dans le bien que l'on a, que dans celui que l'on peut
faire ;
- de ne point mettre à trop haut prix le savoir que je
dois à la générosité de ma patrie et à la
sollicitude de tous ceux qui m'ont permis de réaliser ma vocation.
Que toute confiance me soit retirée s'il
advient que je me parjure. »
LE (LA) CANDIDAT (E)
VU
LE PROFESSEUR RESPONSABLE
DE L'ECOLE INTER-ETATS DES SCIENCES ET MEDECINE
VETERINAIRES DE DAKAR
VU
LE DIRECTEUR
DE L'ECOLE INTER-ETATS
DES SCIENCES ET MEDECINE VETERINAIRES DE
DAKAR
LE PRESIDENT
DU JURY
VU
LE DOYEN
DE LA FACULTE DE MEDECINE
ET DE PHARMACIE
DE L'UNVERSITE CHEIKH ANTA DIOP
DE DAKAR
VU ET PERMIS D'IMPRIMER____________________
DAKAR, LE__________________________________
LE RECTEUR, PRESIDENT DE L'ASSEMBLEE
DE L'UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP
DE DAKAR
| 
