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àƒ??°valuation du diagnostic par PCR directe et PCR-élisa sur les ITS des trypanosomes pathogàƒÂ¨nes du bétail( Télécharger le fichier original )par Bachir SOULEY KOUATO Université Cheikh Anta Diop de Dakar - Doctorat dà¢â‚¬â„¢état en médecine vétérinaire 2005 |
Chapitre 3 : Résultats et discussion1. Résultats1-1. Méthodes parasitologiquesPour les techniques parasitologiques, nous ne disposons que des résultats des prélèvements sanguins de bovins (buffy coat). Sur les 311 buffy coat analysés, 308 résultats ont été fournis. Cette méthode totalise 106 cas positifs, soit 31,41 (#177;5,30) % d'infection par les trypanosomes (T. vivax et T. congolense type savane). Ainsi pour T. vivax 25 cas d'infections ont été détectés, soit 8,11 (#177;3,05) %. 81 se sont révélés positifs à T. congolense type savane, soit un taux d'infection de 26,30 (#177;4,96) %. La méthode de buffy coat n'a pu identifier aucune infection en dehors de ces deux taxons, et aucune infection mixte n'a été mise en évidence. (Tableau IV, page 82) 1-2. PCR classiqueSur les 425 échantillons de terrain, la PCR monospécifique a identifié au total 168 signaux positifs, soit 39,53 (#177;4,65) %. Parmi ces échantillons positifs, 51 signaux positifs sont rapportés à T. vivax, ce qui correspond à une prévalence de 12 (#177;3,09) %. La prévalence de T. congolense type savane est de 23,29 (#177;4,02) %, soit 99 échantillons positifs. Pour T. congolense type forêt et T. brucei, on a observé respectivement 5 cas positifs (1,17 %) et 4 cas positifs (0,94 %). Les infections mixtes détectées sont au nombre de 9, dont 6 infections mixtes à T. vivax et T. congolense type savane, 2 infections mixtes à T. vivax et T. brucei et un cas d'infection par les 3 espèces de trypanosomes (T. vivax, T. congolense type savane et T. brucei). (Tableau VII, page 84)
Figure 17 : Résultats obtenus avec les amorces monospécifiques T v : T. vivax, T c s : T. congolense type savane, T c f : T. congolense type forêt, T b : T. brucei 1-2-1. Echantillons sanguins de bovins L'analyse en PCR classique de la couche des globules blancs du sang des bovins utilise 3 couples d'amorces spécifiques à 3 espèces de trypanosomes pathogènes (T. vivax, T. congolense type savane, T. brucei). Sur les 311 buffy coat testés, la PCR monospécifique a détecté 129 cas positifs, soit un taux d'infection de 41,48 (#177;5,47) %. Pour T. vivax on a 27 signaux positifs soit 8,68 (#177;3,12)%; avec les amorces classiques de T. congolense type savane on a 94 cas positifs, soit une prévalence de 30,22 (#177;5,10) % ; 1 seul cas (0,32 %) d'infection à T. brucei a été observé. On note en plus 6 cas d'infections mixtes à T. vivax et T. congolense type savane et 1 cas de triple infection parasitaire (à T. vivax, T. congolense type savane et T. brucei). (Tableau IV, page 82). 1-2-2. Organes de mouches La PCR classique a révélé sur les 114 organes de mouches, 39 cas positifs, soit 34,21 (#177;8,71) %. Parmi ces organes, on compte 71 proboscis dont 26 ont donné des signaux positifs (soit 38,03 % du nombre de proboscis et 23,68 % de l'ensemble des organes de mouches). Sur les 32 intestins moyens, 12 sont révélés positifs et parmi les 11 glandes salivaires, 1 cas est détecté positif (tableau III). Pour T. vivax, la PCR classique a identifié 24 cas positifs qui correspond à 21,05 (#177;7,48) % sur les 114 organes de mouches, dont 19 cas positifs dans les proboscis et 5 cas d'infections intestinales. On observe 5 signaux positifs à T. congolense type savane, dont 4 au niveau des proboscis et 1 dans les intestins moyens. Pour T. congolense type forêt et T. brucei, il y a respectivement 5 cas positifs (4,38 %) et 3 cas positifs (2,63 %). Deux cas d'infections mixtes (à T. vivax et T. brucei) ont été observés sur les mouches. Tableau III : Résultats positifs obtenus avec les organes de mouches en PCR classique
1-3. PCR (ITS) avec les amorces Tryp 4R et Tryp 4S La PCR utilisant le couple d'amorces Tryp 4R et Tryp 4S, vise la mise en évidence de 4 espèces de trypanosomes qui sont T. vivax, T. congolense type savane, T. congolense type forêt et T. brucei. Sur le total des échantillons de terrain analysés, la PCR plurispécifique a permis l'identification de 127 signaux positifs, soit donc 29,88 (#177;4,35) %. Pour T. vivax, on totalise 97 cas positifs soit 22,82(#177;3,99) % ; 23 échantillons sont révélés positifs à T. congolense type savane, soit 5,41 (#177;2,15) % de prévalence ; 1 signal positif a été observé pour T. congolense type forêt ; et pour T. brucei on compte 3 signaux positifs. On a également observé 3 cas d'infections mixtes, dont 1 infection à T. vivax et T. congolense type forêt et 2 infections à T. vivax et T. congolense type savane. (Tableau VII, page 84) 1-3-1. Echantillons sanguins de bovins Parmi les 311 buffy coats de bovins, la PCR-ITS a révélé toutes espèces de trypanosomes confondues 90 cas positifs, soit 28,94 (#177;5,04) %. Les infections à T. vivax détectées par les amorces Tryp 4R et Tryp 4S sont de 66 cas, soit une prévalence de 21,22 (#177;4,54) %. Ces amorces ont permis l'identification de 21 échantillons positifs à T. congolense type savane, soit 6,75 (#177;2,78) % de l'ensemble des buffy coats ; une seule infection à T. brucei a pu être détectée ; aucune infection à T. congolense type forêt n'a pu être révélée dans ces prélèvements sanguins de bovins. En revanche, 2 cas d'infections mixtes (à T. vivax et T. congolense type savane) ont été identifiés. (Tableau IV, page 82)
Figure 18 : Résultats obtenus avec les amorces Tryp 4R et Tryp4S
Figure 19 : Cas d'infections à T v et à T c s détectées par les 3 tests de diagnostic 1 : Méthodes Parasitologiques, 2 : PCR classique, 3 : PCR-ITS 1-3-2. Organes de mouches Les amorces Tryp 4R et Tryp 4S ont révélé sur les 114 organes de mouches, 37 cas positifs, soit 32, 45 (#177;8,59) %. Parmi les 71 proboscis, on observe 30 signaux positifs ; 7 cas se sont révélés positifs parmi les 32 intestins moyens ; aucun signal n'a été observé parmi les 11 glandes salivaires avec la PCR -ITS. On note une seule infection mixte à T. vivax et à T. congolense type forêt. Pour T. vivax, on a 31 cas détectés, soit 27,19 (#177;8,16) % de prévalence, dont 27 signaux avec les proboscis et 4 cas d'infection intestinale. Pour les trypanosomes du genre Nannomonas, la prévalence est respectivement de 1,75 % pour T. congolense type savane (2 cas positifs), et de 0,32 % pour T. congolense type forêt. Pour le genre Trypanozoon (T. brucei), on a 2 signaux positifs (1,75 %). (Tableau V) Tableau IV : Prélèvements sanguins de bovins positifs aux tests de diagnostic
* Différences significatives (p<0,01) Tableau V : Résultats obtenus avec les organes de mouches en PCR-ITS
Tableau VI : Organes de mouches positifs en PCR classique et PCR-ITS
Tableau VII : Récapitulatif des résultats obtenus en PCR classique et en PCR-ITS
1-4. Analyse comparative des résultats PCR classique / PCR-ITS 1-4-1. Cas d'infections à Trypanosoma vivax 1-4-1-1. Buffy coat de bovins Sur les 25 cas d'infections à T. vivax détectés par les méthodes parasitologiques, 12 échantillons sont révélés positifs à la fois en PCR monospécifique, et en PCR-ITS. La PCR classique a permis la confirmation de 13 échantillons parasitologiquement positifs à T. vivax ; les amorces Tryp 4R et Tryp 4S en ont confirmé 14, dont 2 identifiés en infection mixte avec T. congolense type savane en PCR classique. Ces amorces polyspécifiques ont identifié 52 signaux positifs à T. vivax parmi les échantillons négatifs par les techniques parasitologiques ; les amorces monospécifiques en ont détecté 10 échantillons (associés à 5 cas d'infections mixtes avec T. congolense type savane et 1 cas d'infection mixte avec T. congolense type savane et T. brucei) et enfin 6 de ces échantillons ont été révélé positifs à la fois en PCR classique, et en PCR-ITS. Sur les 27 infections du type Duttonella (T. vivax) identifiées en PCR classique, 18 ont pu être confirmées avec les amorces Tryp 4R et Tryp 4S. Parmi les 6 cas d'infections mixtes détectés en PCR classique, on a en PCR-ITS 3 signaux positifs à T. vivax ; 1 signal positif à T. congolense type savane et 2 négatifs. En outre, parmi les échantillons négatifs à T. vivax avec les amorces TVW 1 et 2, la PCR-ITS a révélé 45 signaux positifs (mis à part les infections mixtes) à cette espèce, cependant en PCR classique, 19 d'entre eux étaient positifs à T. congolense type savane. 1-4-1-2. Organes de mouches Sur les 19 échantillons positifs à T. vivax au niveau des proboscis en PCR classique, 17 ont été confirmés positifs avec les amorces Tryp 4R et Tryp 4S. La même observation est faite pour les intestins moyens, car sur les 5 échantillons positifs à T. vivax avec les amorces monospécifiques, 3 ont également donné des signaux positifs en PCR-ITS. Parmi les échantillons négatifs à T. vivax en PCR classique, 10 sont révélés positifs en PCR-ITS. Par contre, 4 échantillons ont donné des signaux positifs avec les amorces spécifiques à T. vivax, tandis qu'ils sont négatifs en PCR sur les ITS. On a observé en PCR classique, 2 cas d'infections mixtes (à T. vivax et T. brucei), en PCR-ITS l'un a donné un signal positif à T. vivax et l'autre un signal positif à T. brucei. Un seul échantillon présentant une infection mixte (à T. vivax et à T. congolense type forêt) avec les amorces polyspécifiques, a été identifié positif à T. congolense type forêt en PCR monospécifique. 1-4-2. Cas d'infections au genre Nanomonnas (Trypanosoma congolense) 1-4-2-1. Buffy coat de bovins Dans les cas d'infections à T. congolense type savane, parmi les 81 identifiés par la technique de buffy coat, 10 échantillons ont été confirmés positifs en PCR classique et en PCR-ITS. Sur ces mêmes échantillons positifs par les tests parasitologiques, 48 ont donné des signaux positifs avec les amorces TCS 1 et 2 , contre 12 avec les amorces Tryp 4R et Tryp 4S. Parmi les échantillons négatifs à T. congolense type savane par la méthode de buffy coat, 41 sont testés positifs en PCR classique (sur ces échantillons, 12 sont positifs à T. vivax avec les amorces Tryp 4R et Tryp 4S) ; 9 en PCR-ITS et 7 à la fois en PCR classique et en PCR-ITS. Les 2 cas d'infections mixtes (à T. congolense type savane et T. vivax) observés en PCR-ITS, sont identifiés positifs à T. congolense type savane en PCR classique et par les méthodes parasitologiques. Les amorces spécifiques de T. congolense type savane ont identifié 94 échantillons positifs à cette espèce de trypanosome, seulement 17 parmi ces échantillons ont également donné des signaux positifs en PCR plurispécifique. Parmi les échantillons qui n'ont donné aucun signal à T. congolense type savane en PCR classique, seulement 2 sont positifs en PCR-ITS. Inversement, parmi les échantillons négatifs à T. congolense type savane1(*)' en PCR-ITS, les amorces TCS 1 et 2 ont identifié 72 signaux positifs. Aucune infection à T. congolense type forêt n'a été détectée dans les prélèvements sanguins de bovins lors de cette étude. 1-4-2-2. Organes de mouches Sur les 5 infections à T. congolense type savane révélées par la PCR monospécifique, aucune d'entre elles n'a été confirmée par les amorces polyspécifiques. Il en est de même pour les 5 signaux positifs à T. congolense type forêt. Toutefois, un cas d'infection mixte (à T. congolense type forêt et T. vivax) identifié par les amorces Tryp 4R et Tryp 4S a donné un signal positif à T. congolense type forêt en PCR classique. 1-4-3. Cas d'infections au genre Trypanozoon (T. brucei) Seulement 2 échantillons de terrain de bovins ont été différemment testés positifs à T. brucei, l'un par les amorces spécifiques au genre Trypanozoon et l'autre par les amorces polyspécifiques. En revanche, parmi les 3 organes de mouches, qui ont donné des signaux positifs à T. brucei en PCR classique, 1 a été confirmé par les amorces Tryp 4R et Tryp4S. Par ailleurs, sur les 2 cas d'infections mixtes (à T. brucei et T. vivax) identifiés par les amorces monospécifiques, 1 échantillon (organe de mouche) a donné un signal positif à T. brucei en PCR-ITS.
Figure 20 : Résultats comparés PCR classique / PCR-ITS Série 1 : PCR classique, Série 2 : PCR-ITS 1-5. PCR-ELISA La PCR-ELISA n'a pas fait l'objet d'une évaluation à grande échelle comme la PCR directe. Par conséquent, ces résultats sont essentiellement ceux de l'évaluation des sondes aussi bien sur des ADN de référence des principaux trypanosomes pathogènes que sur des échantillons de terrain. 1-5-1. Résultats de l'évaluation des sondes 1-5-1-1. Sur des ADN purifiés Le test préliminaire pour le choix des sondes a porté surtout sur la sensibilité des sondes à révéler les produits d'amplification par la technique ELISA. Par contre, la première évaluation de ces sondes sur des ADN de référence a mis en évidence outre la sensibilité, la spécificité de ces oligonucléotides. C'est ainsi que les 10 échantillons d'ADN purifiés ont été révélés de façon spécifique par les 5 sondes choisies (fig. 22). Néanmoins, à des températures d'hybridation inférieures à 56°C des réactions croisées sont observées entre les sondes dessinées pour le genre Nannomonas (T. congolense). Ces hybridations non spécifiques se traduisent par le fait que des sondes de T. congolense type savane donnent des signaux positifs avec l'ADN de T. congolense type forêt et réciproquement, la sonde de T. congolense type forêt donne des résultats positifs avec les ADN de T. congolense type savane. Aucune réaction non spécifique n'a été observée avec les sondes de T. vivax et de T. brucei. A1 & A2 : blanc, B1 & B2 : Tv Kanfiala, C1 & : T v Sat 87 /CRTA, D1 & D2 : T v Folonzo, A5 & A6 et D7 & D8 : T c s Sat 87/ CRTA, B5 & B6 et E7 & E8 : T c s : Kigoni C5 & C6 et F7 & F8 : T c s Kar 83/CRTA /66, D5 & D6 et G7 & G8 : T c s B 317 E9 & E10 : T c f Komoé, C11 & C12 : T b Folonzo Figure 21 : révélation sur gel d'agarose des produits PCR des échantillons d'ADN de référence
Figure 22 : révélation ELISA des échantillons d'ADN de référence
1-5-1-2. Sur des échantillons de terrain L'évaluation de la performance des sondes sur des échantillons de terrain a été comparativement à la précédente moins satisfaisante. En effet, la sensibilité de détection des trypanosomes dans les prélèvements sanguins de bovins et les organes de mouches s'est avérée inférieure au taux de détection par révélation sur gel d'agarose . La sensibilité de la PCR-ELISA sur les ITS est selon les résultats des tests relative à l'espèce de trypanosome. Les plus faibles taux de révélation ont été obtenus avec des échantillons positifs à T. vivax, les échantillons de T. congolense sont moyennement révélés positifs par l'ELISA, la sonde STB2 de T. brucei donne régulièrement des signaux positifs (avec des densités optiques élevées) avec les échantillons de T. brucei testés. Enfin, on note la capacité des sondes à détecter des cas d'infections mixtes. Par ailleurs, les sondes se sont révélées très sensibles à des cas de contaminations des échantillons. Ainsi, au cours de nos manipulations, une contamination de l'échantillon négatif par T. vivax observée par le biais de la révélation sur gel d'agarose a conduit à un signal du témoin négatif avec la sonde STV2 spécifique à T. vivax. La spécificité des sondes sur les échantillons de terrain a été comme sur les ADN de référence améliorée en augmentant la température pendant l'étape d'hybridation du protocole de révélation ELISA. Une température de 60°C (pour toutes les sondes) associée aux autres conditions de l'optimisation a en effet fournit des résultats satisfaisants. * 1' Parmi ces échantillons, on a 20 signaux positifs à T vivax et 1 signal positif à T. brucei avec les amorces Tryp4RS |
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