Memoire Online - à‰tude comparative d'un Test de Diagnostic Rapide du paludisme (TDR) avec la Goutte Epaisse (GE) a l'hôpital régional de Bafoussam au Cameroun

Selon l'Institut Nationale (Français) de Santé et de Recherche Médicale (INSERM) le paludisme est en 2007 le problème de santé publique le plus grave malgré l'existence des mesures préventives et curatives. L'ampleur du problème que pose cette parasitose mondiale est régulièrement l'objet de publications de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS). C'est ainsi qu'en 2009, la directive OMS sur le paludisme dans le Monde estime qu'entre 300 à 500 millions de cas sont enregistrés chaque année, causant entre 1,5 et 2,7 millions de morts ; soit un rythme d'un mort toutes les 30 secondes. C'est un véritable fléau des régions tropicales chaudes d'Afrique, d'Amérique et d'Asie où la maladie sévit de façon quasi-permanente. Selon l'OMS, en 2009, le paludisme est endémique dans 109 pays. Ces pays se trouvent également être parmi les plus pauvres de la planète «Ceinture de la pauvreté » (Gentilini et al, 1995). Quarante-cinq (45) de ces 109 pays sont situés en Afrique sub-saharienne et concentrent à eux seuls près de 90% de l'incidence palustre total (OMS, 2009). Le paludisme représente un lourd fardeau économique pour les populations des régions affectées et par conséquent, constitue un obstacle au développement de ces pays. Le plus lourd tribut de cette maladie toujours selon l'OMS (2006) est payé par les enfants de moins de 5 ans (environs un million de décès annuel).

Au Cameroun, cette maladie demeure un problème majeur de santé publique. En effet, en 2010, il était encore responsable de 40,1% de la morbidité hospitalière générale et de 40% de mortalité chez les < 5ans. Deux millions de cas sont enregistrés dans les formations sanitaires chaque année mais on estime que 80% de ces cas n'arrivent pas dans les formations hospitalières (MSP, 2010). Elle représentait 40% des dépenses des ménages pour la santé et 1,3% de perte sur le taux de croissance en 2007, selon le Ministère de la santé publique (MSP). Ici, plus de 90 % des cas de paludisme, sont dus à P. falciparum, (MSP, 2007). Dans la région Ouest du pays, où la transmission du paludisme est certes permanente mais inconstante, on estime qu'entre 91,5% et 96% des cas sont dus à P. falciparum (www.impact-malaria.com). La stratégie de prise en charge du paludisme est calquée sur les recommandations de l'OMS. A l'origine, elle s'appuyait essentiellement sur un diagnostic basé avant tout sur les symptômes cliniques, notamment la fièvre même si la confirmation au laboratoire restait souhaitée (Lallo et Naraqi, 1992 ; Zurovac et al, 2006). Mais cette stratégie étale ses limites avec l'apparition de la chloroquino-résistance dans la plupart des pays où sévit P. falciparum dont le Cameroun. Au début des années 2000, avec l'introduction des combinaisons thérapeutiques à base d'arthémisinine (ACT) plus chères et la part de plus en plus croissante des affections fébriles non palustres (Sayang et al, 2009 ; Munier et al, 2009), l'OMS revoit sa stratégie. Dans ses directives 2006 et 2010, elle recommande la confirmation parasitologique rapide de tout cas clinique avant mise sous traitement sauf là où cela n'est pas possible. Cette confirmation au laboratoire devient une exigence alors même que la difficulté à rendre disponible une microscopie de qualité (examen de référence) demeure. En effet, cette microscopie de qualité est relativement contraignante. Ce qui en limite l'accès (Msellen et al, 2009) comme par exemple au Cameroun où plus de la moitié des cas déclarés ne sont pas confirmés biologiquement et où on note une forte tendance des populations à l'automédication (MSP, 2010). Par ailleurs des études faites par Durrheim et al (1997) ont montré que quand bien même les laboratoires sont correctement équipés et les techniciens bien formés, les résultats des examens microscopiques diffèrent de façon significative. Mais, avec le développement des tests de diagnostic rapides (TDR) au début des années 90, l'OMS recommande dans certaines circonstances particulières, leur usage comme alternative crédible à la microscopie classique (WHO, 2004 ; WHO, 2006 ; Wonsrichanalai et al, 2007 ; WHO, 2008 ; Lubell et al, 2008)

A ce jour, de nombreuses études ont été publiées sur l'évaluation des performances des TDR à travers le monde avec des résultats très variables selon les fabricants, les contextes, les régions et les populations d'études. Pour ne prendre que le cas des TDR ciblant la HRP2, le tableau en annexe 8 résume une série de résultats d'études des performances du TDR-Paracheck®-Pf dans différentes conditions de terrain. La dispersion des résultats publiés pour ces tests pourtant produits par une seule et même firme en dit long sur la complexité qu'il y a à faire le choix d'un TDR du paludisme parmi des très nombreux existants produits par différentes firmes. En effet, les performances de ces tests sont outre les conditions environnementales influencées par la variabilité génétique de la HRP2 utilisée dans sa mise au point (Baker et al, 2005). La HRP2 présente chez différentes souches de P. falciparum est polymorphe et donc pas identiques dans toutes les régions. Par exemple, dans l'étude réalisée par Koïta en 2000, 2,5% des espèces de P. falciparum présentes au Mali n'ont pas la HRP2 ciblée par le TDR-Parasight® (AMOS, 2005). D'autres raisons telles que la présence des facteurs rhumatoïdes, la présence des certains anticorps (Ac) peuvent influencer les résultats de ces tests.

De la dizaine de TDR en circulation sur le marché Camerounais, celles ciblant la HRP2, à l'instar du Diaspot®-Malaria-pf sont les plus disponibles par rapport à ceux ayant pour cible la pLDH (spécifique à toutes les espèces plasmodiales). S'ils ont le défaut majeur de ne pouvoir détecter que P. falciparum seul, ils sont en général réputés relativement plus sensibles et moins coûteux (Swartout et al, 2007 ; WHO, 2006) que ces derniers.

Quelques études sont disponibles sur l'évaluation des TDR au Cameroun par rapport au « gold standard » qu'est la GE. Bechem et al en 1999 ont trouvé une sensibilité de 98% et une spécificité de 88,8% par rapport à la goutte épaisse (GE) dans une étude ayant évalué un TDR (HRP2) sur une population d'enfants. Une autre étude réalisée à Yaoundé par Sayang et al (2009) a attribué au Diaspot®-Malaria-Pf (HRP2) une sensibilité de 71,12% et une spécificité de 82,2% avec des Valeurs prédictives positives (VPP) et négatives (VPN) de 73,8% et 80,4% respectivement. Quant à l'étude menée par Wanji et al en 2008 au Mont-Cameroun, elle a établi que Hexagon®-(pLDH) avait une sensibilité de 85,3% et une spécificité de 95,5%. Il faut noter que ces études ont généralement évalué des TDR produits par différentes firmes avec des antigènes (Ag) cibles différents, tout comme les populations cibles et les tailles d'échantillon utilisées. A notre connaissance, aucune étude évaluant les performances d'un TDR (HRP2) en l'occurrence le Diaspot®-Malaria-Pf n'a encore été menée à Bafoussam.

La présente étude a été conçue pour comparer les performances du Diaspot®-Malaria-Pf dans le diagnostic biologique du paludisme à Bafoussam par rapport à la GE classique réalisée dans les conditions standards. Une sensibilité > 95% est exigée par l'OMS (2000) pour juger un TDR satisfaisant.

- Faire une comparaison opérationnelle des deux méthodes de diagnostic (GE et Diaspot®-Malaria-Pf)

- Déterminer les caractéristiques intrinsèques du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la GE à savoir : la sensibilité (Se) et spécificité (Sp)

- Déterminer les caractéristiques conditionnelles du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la GE savoir : la valeur prédictive positive (VPP) et la valeur prédictive négative (VPN).

REVUE DE LA LITTERATURE

II. REVUE DE LA LITTERATURE

1. Définition et historique

Le paludisme (du latin Paludis = « Marrais » en français) encore appelé malaria (anglo-saxons) est la maladie infectieuse à transmission vectorielle la plus rependue et la plus meurtrière au monde (Poinsignon, 2008). Elle est essentiellement présente dans les régions chaudes tropicales d'Afrique, d'Amérique latine et d'Asie où les conditions climatiques et environnementales sont favorables au développement des moustiques, notamment les anophèles femelles, uniques vecteurs du Plasmodium spp. C'est avant tout une affection humaine. Cependant, les Plasmodium infectent également les oiseaux, les reptiles, les singes, les chimpanzés et les rongeurs (animaux à sang chaud) (Escalante et Ayala, 1994 ; Cox-Sigh et al, 2008).

La cause de la maladie a été découverte en 1880 à Constantine ( Algérie) par un médecin de l'armée française, Alphonse Laveran, qui reçut le prix Nobel de médecine et de physiologie en 1907 (Petithoty et Ardoin-Guidon, 2001). L'anglais Ronald Ross prouva en 1897 que les moustiques anophèles étaient les vecteurs de la malaria (jusqu'à cette date, le mauvais air émanant des marécages était tenu responsable de la propagation de la maladie) (Petithoty et Ardoin-Guidon, 2001 ; INSERM, 2007).

2. Epidémiologie

Le Plasmodium, agent du paludisme est un protozoaire très petit (1 à 2 uL selon les formes). Après coloration au Giemsa, il se présente sous la forme d'un cytoplasme bleu pâle entourant une vacuole nutritive incolore et contenant un noyau rouge la plupart du temps annulaire (Bague de chaton). Des espèces à ce jours responsables du paludisme humain, P. knowlesi ; de découverte assez récente, est en fait une espèce simienne capable cependant d'infester l'Homme (Escalante et Ayala, 1994). Les 5 espèces de Plasmodiums humains sont :

§ Plasmodium falciparum ; premier agent causal du paludisme à être découvert. Il est également l'espèce la plus rependue dans les régions chaudes et humides seulement et surtout le plus redoutable et le seul véritablement meurtrier. Des grands singes d'Afrique centrale, notamment certains Gorilles en seraient des réservoirs (Liu et al, 2010)

§ Plasmodium malaria, agent de la fièvre quarte, a une distribution clairsemée et coexiste souvent avec P. falciparum sous les tropiques.

§ Plasmodium ovale est responsable de la fièvre tièrce bénigne, très proche de P. vivax avec lequel il a été longtemps confondu.

§ Plasmodium vivax est plus largement rependue que P. falciparum mais moins en densité (OMS.2006)

§ P. knowlesi, affectant originellement les singes, il est responsable de fièvre quartane chez l'homme avec des manifestations relativement graves du fait de son cycle de développement court. Sa ressemblance avec P. malariae justifie le fait qu'il ait été longtemps confondu avec ce dernier et que sa découverte en Asie du Sud-est (Malaisie, Thaïlande, Philippines, etc.) soit assez récente (Cox Singh et al, 2008).

Au Cameroun, la distribution des différentes espèces de Plasmodium varie selon les faciès épidémiologiques (Tableau 1). P. falciparum domine le tableau (plus de 90%) alors que P. malariae et P. ovale se rencontrent dans moins de 10% des cas. (MSP, 2008 ; Impact-malaria).

Tableau 1. Distribution et fréquence des 3 espèces de Plasmodium au Cameroun

Faciès épidémiologiques	*P. falciparum* *(%)*	*P. malariae* *(%)*	*P. ovale* *(%)*
Faciès sahélien	100	0	0
Adamaoua	93,6 - 98,7	0 - 6,4	0 - 1,3
Transition savane - forêt	89,8 - 100	4,3 - 8,4	0 - 1,8
Faciès forestier	62,0 - 96,3	0,6 - 3,0	1,1 - 35,0
Faciès d'altitude	91,5 - 96,0	1,7 - 7,0	0 - 6,8
Faciès littoral	97,7 - 100	0 - 0,7	0 - 2,30

Le paludisme est transmis par un arthropode du genre Anophelus (Figure 1), dont la classification anatomique selon Amos (2005) est la suivante :

Plus de 500 espèces dont une soixantaine ont la capacité de transmettre le paludisme humain. Elles sont dites « compétentes ». (www.impact-malaria.com). Les espèces les plus redoutables sont anthropophiles. La reproduction des anophèles exigent du sang, de l'eau et de la chaleur. Leur cycle gonotrophique (qui va du repas sanguin à la ponte puis à la recherche d'un nouvel hôte) dure 48 à 72 heures en moyenne dans les régions tropicales. Seules les femelles sont hématophages et mènent une activité nocturne avec pour certain des pics de piqures entre 23 heures et 3 heures du matin (Poinsignon, 2009). Leur distribution spatiale dépend des facteurs environnementaux ou artificiels. Elle se superpose très logiquement à la distribution du paludisme dans le monde. Tous n'ont pas la même capacité vectorielle (capacité à transmettre l'agent causal du paludisme). Il existe des espèces endophages et endophiles (ont la préférence de piquer dans les maisons). Les principaux anophèles vecteurs rencontrés dans les régions de forte endémicité palustres et au Cameroun en particulier sont : An. gambiae ss, An. arabiensis, An. funestus, An. moucheti, An. nili et An. pharoensis. Ils sont responsables de la grande majorité des transmissions palustres. (www.impac-malaria.com)

Le principal mode de transmission du paludisme est le fait du vecteur biologique (Anophèle femelle infesté) qui inocule par piqure (Figure 1.) et ce, pendant son repas sanguin les Plasmodiums (sporozoïtes) à une personne saine.

D'autres formes de transmissions moins importantes mais suffisantes pour être signalées existent notamment :

- Par transfusion du sang d'un donneur infesté à un receveur sain. Les manifestations cliniques ici surviennent assez rapidement car la phase hépatique est shuntée !

- La transmission verticale par voie trans-placentaire d'une mère impaludée vers son enfant. On parlera dans ce cas de paludisme congénital.

- Les autres formes notamment par accident d'exposition au sang (AES) ainsi que chez les toxicomanes sont exceptionnelles (Petithory et Ardoin-Guidon, 2001)

C'est un cycle qui comporte trois étapes dont deux chez l'Homme et une chez l'Anophèle femelle (CDC, 2010) www.dpd.cdc.gov (Figure 2)

Le stade tissulaire ou schizogonie hépatique ou cycle exo-érythrocytaire : ici le moustique va injecter les sporozoïtes contenus dans ses glandes salivaires dans le système circulatoire de l'Homme. Ceux-ci vont se développer dans le foie jusqu'au stade mérozoïtes.

Le stade sanguin ou Schizogonie érythrocytaire : Les mérozoïtes libérés par hépatolyse vont infecter les hématies, se transformant alors en trophozoïte lesquels se multiplieront dans les globules rouges (GR) en passant par plusieurs stades (Schizontes, rosaces) rouges jusqu'à éclatement de ces derniers. C'est d'ailleurs l'éclatement synchrone des hématies bourrées (Rosaces) qui explique l'aspect fébrile et les frissons à ce stade. Après plusieurs cycles, il y a formation des gamétocytes (formes sexuées qui infesteront le moustique).

En prenant son repas sanguin chez l'Homme infesté par les gamétocytes mâle et femelle, l'anophèle ingère avec ses GR et les autres formes parasitaires, les formes infestantes de Plasmodium spp. Seuls ces derniers poursuivront leur développement dans l'intestin de celui-ci jusqu'au stade sporozoïte infestant pour l'Homme en 18 jours.

Le paludisme est une affection cosmopolite, Cependant, c'est une endémie majeure dans les zones tropicales chaudes et humides de l'Afrique, d'Amérique et d'Asie (Gentillini et al, 1995). La figure 3, représente la cartographie de la distribution globale du paludisme dans le monde en 2006 selon l'OMS.

3. Clinique du Paludisme.

Cliniquement, on distingue de façon globale le paludisme simple et le paludisme grave ou compliqué.

Le type classique est celui décrit dans la physiopathologie du paludisme simple avec la triade successive frissons - chaleur - sueur accompagnés de fièvres périodiques. (Tierce ou quarte). En absence de traitement deux évolution sont possibles : Splénomégalie et anémies ou alors en cas de P. falciparum, le passage vers un tableau critique : le paludisme grave. (ANOFEL, 2002).

Dans la pratique, le paludisme simple ne manifeste pas toujours de façon classique. Ses principaux signes en plus de la fièvre sont :

Selon l'OMS (2006), On parle de paludisme grave lorsqu'un malade avec une parasitémie des formes asexuées de P. falciparum, présente une ou plusieurs caractéristiques cliniques ou biologiques suivantes

Manifestations cliniques	Signes biologiques
o Prostration o Troubles de conscience o Détresse respiratoire (Acidose) o Convulsions multiples o Collapsuscardio-vasculaire o OEdème pulmonaire o Saignement anormal o Ictère o Hémoglobiurie	o Anémie sévère o Hypoglycémie o Acidose o Insuffisance rénale o Hyperlactatémie o Hyperparasitémie.

Le paludisme viscéral évolutif ; de la fièvre bilieuse hémoglobinurique sont des formes particulières assez graves de Paludisme à P. falciparum mais non classées comme paludisme grave (ANOFEL, 2002). La néphrite quartane est une néphropathie glomérulaire chronique d'origine palustre survenant chez l'enfant avec syndrome néphrotique. Elle est le fait de P. malariae, (ANOFEL, 2002)

Les enfants < 5ans et les femmes enceintes sont les deux groupes les plus vulnérables au paludisme en zone d'endémicité palustre. Ceci s'explique pour les premiers par le fait que le paludisme profite de la disparition de la protection du nouveau-né par les anticorps maternels vers l'âge de 3 mois. L'enfant doit alors se défendre avec ses propres armes. Il lui faut alors du temps pour élaborer ces armes et pendant ce temps la maladie fait des dégâts. S'il ne meurt pas, il acquiert progressivement une immunité labile et incomplète, au prix de nombreux accès palustres graves. Le traitement de cette tranche d'âge est urgent et vital (OMS, 2006).

En ce qui concerne la femme enceinte, elle est exposé au risques de paludisme grave surtout vers le 3^ème trimestre de la grossesse avec des risques sérieux d'avortement, d'accouchements prématurées, de mort in utéro et de bébé de faible poids à la naissance.

Le paludisme et l'infection à VIH/SIDA sont deux problèmes majeurs de santé publique, notamment en Afrique subsaharienne. L'infection par le VIH augmente l'incidence des accès palustres d'autant que l'immunodépression est profonde (OMS, 2006)

Pour souligner l'importance de cette partie, rappelons cette citation d'un imminent spécialiste des maladies tropicales, le Professeur Pierre Aubry (2010) : « Nos connaissances sur le paludisme doivent être simples mais leur application doit être rigoureuse. Il n'existe pas de signe pathognomonique du paludisme. Il n'existe pas de manifestations cliniques du paludisme sans parasitémie. ». C'est dire si le diagnostic de certitude du paludisme est avant tout parasitologique !

Les arguments indirects basé sur les variables cliniques (fièvre...) et biologiques (anémie, hyperleucocytose, thrombopénie, hypoglycémie ...), n'ont qu'une valeur orientative même si dans certains cas (enfants < 5ans et cas graves en région de forte endémicité), on doit s'y fier (WHO, 2004 : WHO, 2006 ; WHO, 2008)

Le diagnostic du paludisme commence d'abord et avant tout par une symptomatologie clinique fortement évocatrice qui conduit vers la recherche de l'agent causal qui est le Plasmodium.

Cinq méthodes ou techniques sont aujourd'hui utilisées dans le domaine de la recherche ou en diagnostic de routine pour la détection des différentes espèces de Plasmodium dans le sang.

C'est la méthode de référence selon l'OMS. Elle implique la réalisation de 2 techniques complémentaires dans l'idéal à savoir la Goutte épaisse (GE) et le Frottis mince (FM). Dans les deux cas, une goutte de sang est étalée sur une lame (goutte plus fine pour le FM). Les étalements sont colorés ensuite selon des méthodes codifiées et validées et après séchage, ils sont examinés au microscope à fort grossissement. Différentes espèces de Plasmodium peuvent ainsi être identifiées et quantifiés à différents stades de leur développement (trophozoïtes, schizontes, gamétocytes) par un microscopiste formé (OMS, 1994)

Elles sont basées sur la détection des antigènes (Ag) spécifiques de Plasmodium spp dans le sang à partir des anticorps (Ac) monoclonaux spécifiques d'une ou plusieurs espèces de Plasmodium. Trois protéines spécifiques de certaines formes parasitaires de plasmodium appelées Ag pour la circonstance sont détectées par les TDR avec en général apparition de deux bandes rouges (P. falciparum seul) ou trois bandes rouges (P. falciparum et autres Plasmodiums) selon les tests, témoignant ainsi de la présence d'une ou de plusieurs espèces de plasmodium dans le sang à tester.

Ces tests ont l'avantage d'être simple d'usage, permettent de rendre les résultats dans un délai relativement court (moins de 20 minutes), permettent une meilleure standardisation des résultats. Leur sensibilité varie selon fabricants et les études mais certains ont une sensibilité et une spécificité que l'OMS (2006) juge acceptables (> 95%). Mais ils ne sont pas quantitatifs et ont des caractéristiques liées aux types d'Ag ciblés dont on devrait tenir compte au moment du choix du type de TDR.

Les exemples les plus connus sont le QBC® (Quantity Buffy Coat) et plus récemment le Cyscope®.

Le QBC® fonctionne sur le principe suivant : Le sang est prélevé dans un tube micro-hématocrite contenant un fluorochrome (acridine orange) et un flotteur. L'acridine se fixe alors sur l'ADN des différents Plasmodiums. Après une centrifugation à grande vitesse, ce flotteur qui se trouve dans la zone de densité correspondant à celle des hématies parasitées ne laisse qu'un film d'hématies entre lui-même et la paroi du tube, ce qui permet d'examiner cette zone à l'aide d'un dispositif adapté comme le microscope à fluorescence

Sa sensibilité est bonne ; elle permet de poser le diagnostic d'espèce. Mais il nécessite un appareillage (microscopes et réactifs) coûteux et demande un certain entrainement du technicien.

Elle consiste à amplifier l'ADN du Plasmodium spp à partir d'un échantillon de sang prélevé afin de le rendre détectable. Ce sont donc des méthodes très sensibles et très spécifiques mais leur mise en place est limitée par leur coût élevé et la nécessité des compétences particulières des techniciens (Snounou et al, 1993).

Elles consistent à rechercher les anticorps spécifiques des espèces plasmodiales par différentes techniques telles que l'ELISA, l'Immunofluorescence Indirecte (IFI) etc. Elles peuvent avoir un intérêt épidémiologique dans les régions où le paludisme est sporadique mais ne sont pas d'usage dans les régions d'endémicité où la plupart des habitants sont relativement immunisés.

Ø Le traitement du paludisme simple au Cameroun comme dans la plupart des pays touchés par le paludisme, notamment celui à P. falciparum est calqué sur les recommandations de l'OMS (2006). Il préconise l'utilisation des différentes combinaisons d'Artemisinin based Combination Therapy (ACT) en trois jours de prise en association avec un antipyrétique (Paracétamol® ou Aspirine®) à des doses convenables (OMS, 2006 ; MSP, 2007). Quatre ACT sont actuellement recommandées.

Ø La prise en charge du paludisme grave est une urgence. Le traitement de choix ici l'administration de la quinine par voix parentérale (généralement en perfusions de glucosée 5% ou 10%). Les dérivés de l'artémisinine (Paluther®) par voie injectable aussi sont recommandés surtout quand le patient est allergique à la quinine.

Il faut noter que les monothérapies antipaludéennes à base de chloroquine, de Sulfadoxine-Pyriméthamine (n'est pas considéré par l'OMS comme une bi-thérapie), et bien d'autres restent d'usage dans certaines régions.

Ø Faute de vaccins disponibles, la prophylaxie antipaludéenne associe à la fois des actions individuelles et collectives notamment, la lutte anti-vectorielle, l'utilisation des moustiquaires imprégnées d'insecticides (MII) et des répulsifs, le traitement préventif intermittent (TPI), réservé aux femmes enceintes, l'assainissement de l'environnement y compris la destruction des gîtes larvaires et la prévention chez les voyageurs par une chimio-prophylaxie appropriée et l'utilisation des répulsifs. (OMS, 2006 ; MSP, 2007).

Les deux méthodes en usage pour le diagnostic parasitologique du paludisme sont l'examen au microscope optique classique et les tests de diagnostic rapide (TDR) (Wongsrichanalai et al, 2008).

L'examen microscopique a l'avantage d'être peu coûteux, très sensible et très spécifique lorsqu'il est utilisé par un personnel rompu à son usage et dans les conditions idéales.

Les TDR qui servent à la détection des antigènes parasitaires sont généralement plus coûteux, mais les prix de certains de ces produits ont récemment baissé dans des proportions qui font que leur déploiement est rentable dans certaines situations. Leur sensibilité et leur spécificité sont variables et leur vulnérabilité aux températures élevées et à l'humidité est un inconvénient important (WHO, 2008)

Le prélèvement doit se faire au moment de l'acmé thermique dans la mesure du possible soit par ponction capillaire (Pulpe du doigt, gros orteil etc.) avec confection immédiate du frottis mince (FM) et de la goutte épaisse (GE), soit par ponction veineuse sur anticoagulant approprié (par exemple l'EDTA) et réalisation secondaire des étalements sur lames. C'est acte de soins et à ce titre sa pratique doit respecter les règles de bonnes pratiques de prélèvements notamment en ce qui concerne les mesures à prendre pour éviter tout accident d'exposition au sang (AES) . Les plus importantes sont le port équipements de protection personnelle (gant et blouse) et l'utilisation d'un matériel à usage unique.

La lecture de la GE se fait à l'objectif 100 et à immersion. Les hématies ayant été presque toutes détruites, on observe surtout les plaquettes et les leucocytes ratatinés. Les différentes formes plasmodiales (trophozoïtes surtout) auront l'aspect de points rouges plus ou moins entourés de demi-anneaux bleus ! (Figure 5 ; au centre). C'est une technique de concentration pour la recherche de parasites dans le sang.

En routine, il faut lire au moins 100 champs (MSP, 2006) ; mais en cas de négativité, l'idéal voudrait qu'on aille jusqu'à 400 champs (OMS, 1991), ce qui est vraiment fastidieux. La lecture des GE prend du temps et comme le FM une expertise est requise. (20 minutes sont recommandées par l'OMS pour la lecture par un microscopiste expert d'un frottis avant de le rendre négatif).

Elle est qualitative (permet de faire difficilement le diagnostic d'espèce) et quantitative. La parasitémie peut s'estimer ici alors en pourcentage de parasites comptés par rapport aux globules blancs (GB). Ce qui permet par simple règle de trois de déterminer la parasitémie/uL, si l'on connait le nombre de GB/uL (Numération Formule Sanguine).

Mais en général de nombreuses littératures s'accordent à calculer cette parasitémie sur la base de 8000GB/uL pour les adultes (Moody, 2002 ; WHO, 2008). La valeur sera alors moins précise que celle obtenue sur FM.

§ La lecture de la GE exige un effort de concentration et un minimum d'expertise technique car la confection de la GE a entrainé la destruction de la quasi-totalité des GR ainsi que la déformation des plaquettes, des GB et des Plasmodiums. Tout ce qui complique un peu le diagnostic d'espèce. De plus, la coloration des cellules sur GE dépend du pH du liquide de dilution du Giemsa qui doit être de préférence neutre. Ainsi, à l'observation microscopique à l'objectif x100, on peut observer sur fond légèrement bleu des leucocytes, des plaquettes éventuellement et surtout des trophozoïtes de Plasmodium spp. se présentant sous la forme de noyaux rouges pourpre entourés chacun d'un cytoplasme bleu (Figure 5, au centre). Un liquide de dilution acide, favorise la domination des colorants acidophiles (figure 5, à gauche) tandis qu'un liquide basique, favorise la domination des colorants basophiles (Figure 5, à droite).

§ La durée d'exécution des GE est plus longue en absence de dispositif de séchage

Figure 5 : Différents aspects microscopiques d'une GE en fonction du pH de l'eau de dilution du Giemsa. (obj.x100)

§ Pour de diagnostic du paludisme, la lecture durera 20 minutes au minimum (OMS)

§ Elle permet d'observer tous les éléments figurés du sang (hématies, leucocytes, Plaquettes) y compris les éventuelles hémoparasites comme les Plasmodiums (forme trophozoïte surtout ; mais aussi gamétocytes ...). A l'observation microscopique (Objectif x100), les trophozoïtes sont intra-érythrocytaires et se présentent en bague de chaton (Noyau rouge excentré et cytoplasme bleu) (Figure 6.)

§ On peut déterminer la charge parasitaire en estimant la proportion des globules rouges (GR) parasités pour 1000 GR si on connaît le nombre de GR/uL de sang.

§ Si cette estimation donne par exemple 20 GR parasités pour 1000. et que le patient a 4000 000 de GR/uL (NFS), La parasitémie pour le plasmodium en cause sera = 4000 000x20 /1000= 80 000/uL.

Le fait que les hématies soient restées intactes permet d'observer les différentes formes parasitaires ainsi que caractéristiques des hématies parasitées qui orienteront le diagnostic d'espèce.

Il est basé sur la détection d'antigènes (Ag) ou d'anticorps (Ac) de Plasmodium sp dans le sang (hématies ou plasma) du sujet examiné (WHO, 2000).

En général, il s'agit de membranes en plastique sur lesquelles ont été fixés les Ac spécifique des Ag à détecter (zone de réaction). Les Ag lorsqu'ils sont présents dans le sang, se fixent sur des Ac combinés à une poudre colorée (Conjugué) avant d'être entrainée grâce à un tampon le long de la membrane en plastique. Au passage sur la zone de réaction (T), les complexes Ag-Conjugué se fixent aux Ac spécifiques. D'où l'apparition d'un trait rouge. L'excédent de conjugué poursuit son parcours jusqu'à la zone contrôle(C) où, il se fixe formant un deuxième trait rouge (Figure 8).

Trois (03) groupes d'antigènes plasmodiaux détectés par les TDR disponibles dans le commerce:

- la protéine HRP2 (histidine-rich protein 2), spécifique de P. falciparum ;

- la pLDH (Plasmodium Lactate Déshydrogenase), enzymes spécifiques des 4 espèces plasmodiales (P. falciparum et les 3 autres à l'exception de P. knowlesi)

6.2.2. Matériel et réactifs (En général, il est fourni avec le coffret de tests)

o Matériel de prélèvement pour recueillir du sang veineux prélevé sous EDTA ou sang capillaire. (aiguilles, tubes-EDTA, tampon d'alcool, gants, garrot)

Si les tests sont au freezeur, les ramener à température ambiante. Mais en général, les TDR disponibles se conservent entre 15 et 30°C (température ambiante en général). Le test peut se réaliser sur le champ ou en différé de 2 jours maximum (sauf si conservation à 2-8°).

§ Déballer le TDR et le déposer sur une surface plane, horizontale et propre.

§ En général, le mode opératoire diffèrera un peu selon les fabricants. (Dans tous les cas, se référer à la notice du fabricant à l'intérieur du coffret !).

Il faut savoir que l'interprétation des TDR dépend du type (détection d'une ou plusieurs espèces) :

§ S'il est capable d'identifier une seule espèce, en général, il s'agira de P. falciparum, il y a un seul trait rouge possible à la zone de réaction (T) et un trait dans la zone contrôle (C), soit 2 traits au total en cas de positivité. Seul le trait (C) apparait en cas de négativité.

§ Si le test est capable de détecter au moins 2 espèces plasmodiales, il y a 2 traits possibles à la zone de réaction (T) et par conséquent 3 traits possibles (dont un trait dans la zone (C) en cas de positivité.

v RESULTAT NEGATIF

Apparition d'un trait rouge seulement à la zone de contrôle(C)

v RESULTATS INVALIDES

Pas de trait rouge à la zone contrôle (C) :

Refaire le test en utilisant une autre savonnette ou cassette.

Figure 9. : Interprétation des résultats d'un TDR (HRP2) identifiant P. falciparum seul

Les TDR ont l'avantage d'être simple d'usage, permettent de rendre les résultats dans un délai relativement court (moins de 20 minutes), permettent une meilleure standardisation des résultats et surtout, chacun peut interpréter le résultat (patient, prescripteur, technicien de laboratoire) ; ce qui renforce la crédibilité du résultat. Leur sensibilité varie selon fabricants et les études mais certains ont une sensibilité et une spécificité que l'OMS juge acceptables (> 95%). Mais ils ne sont pas quantitatifs et ont des caractéristiques liées aux types d'Ag ciblés dont on devrait tenir compte au moment du choix du type de TDR (WHO, 2009)

§ Les TDR (HRP2) sont en général plus sensibles que les TDR (pLDH) et les TDR (Aldolase). De plus, ils sont relativement moins coûteux (Swartout et al, 2007). Par contre, ils ne sont pas adaptés au suivi du traitement des patients en raison de la persistance de la HRP2 dans le sang jusqu'à 35 jours après le traitement (OMS, 2005) et ne peuvent détecter que P. falciparum. D'autres paramètres tels que le respect des procédures opératoires, le respect des conditions d'emballage, de transport et de conservation et les caractéristiques propres au test (sensibilité, spécificité), conditionnent les performances des TDR. En général et des TDR(HRP2) en particulier.

III. METHODOLOGIE :

Notre étude a été menée à Bafoussam, chef-lieu de la région de l'Ouest ; plus exactement dans l'unité de laboratoire de l'Hôpital Régional (HRB).

Située en plein centre de la région, la ville de Bafoussam comprend 03 communes ou arrondissements à savoir : Bafoussam I ; Bafoussam II et Bafoussam III. Sa population constituée essentiellement de l'ethnie Bamiléké est estimée en 2008 à environs 347 000 habitants avec une densité de 128,5Hbts/km² (BUCREP, 2010). Cette population est majoritaires constituée de personnes exerçant les activités agro-pastorales et le petit commerce ( http://www.bafoussam.fr/bafoussam_geographie.htm).

De par son faciès épidémiologique dit d'altitude et des hauts plateaux, la transmission du paludisme ici est permanente tout au long de l'année avec cependant des variations saisonnières (www. Impact-malaria.com)

Au niveau de la pyramide sanitaire du pays, l'HRB se situe au niveau intermédiaire. Il est la structure de référence pour toutes les autres formations sanitaires de la Région de l'Ouest; notamment tous les hôpitaux de District et les CMA y compris les formations sanitaires privées. Il est dirigé par un Directeur assisté d'un Conseiller médical. Cette structure d'après les sources de la Direction emploie à ce jour (Novembre 2010) plus de 300 personnels dont 10 médecins spécialistes, 01 pharmacien et une quinzaine de médecins généralistes, répartis dans les différents services administratifs et techniques. Comme services techniques on a les services de Médecine A, B et C, de Chirurgie A et B, de Gynécologie, de maternité, de Pédiatrie, de néonatologie, d'Ophtalmologie, d'Oto-rhino-laryngologie (ORL), de Stomatologie de la morgue et l'unité de Laboratoire.

L'unité de laboratoire de l'HRB avec un plateau technique unique en son genre à l'Ouest emploie à temps plein plus de 25 professionnels de laboratoire. Elle a à sa tête un Médecin-Biologiste (Chef d'unité), assisté d'un Ingénieur des Techniques Médico-Sanitaires (Bactériologiste, chef de service).

Le nombre moyen de patients reçu par jour dans cette unité est de 60, avec une moyenne par patients de 4 examens, pour environs 240 examens par jour. Le poste de Parasitologie exécute en moyenne de 10 recherches d'Hémoparasites (Gouttes épaisses) par jour (moyenne calculée à partir des chiffres de l'année 2010)

· Avoir été reçu en consultation à l'HRB par un médecin ou un infirmier et envoyé au laboratoire pour confirmation du paludisme (Goute épaisse) durant la période allant du 14 juillet au 13 Septembre 2011.

· Avoir accepté de participer à l'étude (pour les enfants, l'accord des parents ou accompagnateur majeur sera nécessaire).

Ø Critères de non inclusion : N'ont pas été inclus dans la présente partie de cette étude :

- les patients venus au laboratoire pour contrôle post traitement de paludisme ;

- les patients dont l'état général est très altéré et les patients se sachant atteints d'une affection chronique (TB, Diabète, etc...) ;

- les malades ayant commencé un traitement antipaludéen y compris la une cycline (Antibiotique) au plus 24 heures avant la consultation.

Nous avons procédé à un échantillonnage par convenance. En effet, nous avons systématiquement recruté, tous les patients qui remplissaient les critères d'inclusion pendant la durée de collecte. Soit au total 336 personnes des deux sexes âgées d'au moins un an.

Les patients en consultation externe ont été reçus au service de prélèvement du Laboratoire tandis que ceux hospitalisés ont été reçus par les infirmières de service concernés.

Après avoir pris connaissance de la demande d'examen formulée par un consultant de l'Hôpital Régional (carnet de consultation ou bulletin d'examen), le technicien-préleveur ou l'infirmière de service s'est chargé d'expliquer à chaque patient (ou accompagnateur) les buts et objectifs de l'étude, il lui a été ensuite remis un formulaire de consentement éclairé (Pour les mineurs, leur ayant droit était sollicité). Après accord de celui-ci manifesté par la signature du formulaire de consentement, Si le patient remplissait alors les conditions requises, un numéro d'identification lui était alors attribué et le cas échéant et la fiche de collecte était remplie suivi du recueil au niveau du pli du coude de 2,5 ml de sang sous tubes EDTA (anticoagulant) comme d'ailleurs c'est le cas en routine dans ce laboratoire. Le respect strict des règles de bonnes pratiques des prélèvements sanguins (OMS, 1994) était de rigueur.

Les données sociodémographiques et cliniques recueillis ont été acheminées en même temps que les échantillons collectés au Laboratoire de l'Hôpital Régional (Poste de parasitologie) dans les 10 minutes suivant la collecte. Les échantillons de sang ont aussitôt été analysés simultanément mais en aveugle par 2 techniciens différents. La Goutte épaisse (GE) sera considérée comme « gold standard ». Les performances du Diaspot®-Malaria-Pf seront alors évaluées par rapport à elle.

Pour réaliser la présente étude, nous avons au préalable sollicité et obtenu auprès de Madame la Directrice de l'HRB (Annexe 1), l'autorisation de réaliser nos travaux de recherche au laboratoire de l'Hôpital Régional, notamment le recrutement des patients et la réalisation des différentes analyses. Par la suite nous avons sollicité et obtenu la clairance éthique (Annexe 2) auprès du comité national d'éthique (CNE). Nous avons aussi sollicité et obtenu par signature, le consentement éclairé de Chaque participant ou mandataire qui, par ailleurs était libre de participer à l'étude. Le questionnaire auquel chacun était soumis était anonyme et les examens ont été exécutés selon les règles de bonnes pratiques de laboratoire (OMS, 1994). Les positifs confirmés ont tous été pris en charge conformément à la procédure en vigueur à l'HRB.

8.2. Variables cliniques (5) : Céphalées, courbatures, frissons, fatigue généralisée et fièvre (T° axillaire > 37,5° ou > 37° pour la T° rectale) ont été recueillies par questionnaire soit par interrogatoire, soit à partir du carnet de consultation. Il s'est agi des signes/symptômes présentes au moment du prélèvement ou dans la semaine précédant la consultation.

La lame porte objet était étiquetée du numéro patient ; identique à celui inscrit à la fois sur le tube de sang et dans les fiches questionnaires. Une goutte de sang était déposée au centre. A l'aide d'une seconde lame, on procède à la défibrination mécanique par des mouvements circulaires de sorte à avoir un diamètre d'environ 1 cm.(Figure 4). Les lames étaient ensuite séchées à l'abri des poussières et des mouches.

Dans une éprouvette en plastique de 100 ml: ajouter 5 ml de Giemsa-Rapide pour 45 ml d'eau distillée tamponnée (quantité suffisante pour 25 lames). Agiter le mélange très doucement. Cette quantité de 50 ml permet de colorer un nombre important de lames.

Recouvrir chaque lame sèche de Giemsa fraichement préparé et laisser agir 30 minutes

Rincer délicatement à l'eau du robinet puis sécher à l'abri des poussières. Dans les pays anglosaxons, le Giemsa est souvent remplacée par le Colorant de Wright (Annexe 6)

La lecture des gouttes a été effectuées au poste de parasitologie du laboratoire de l'HRB à l'aide d'un microscope optique (Nikon Eclipse E400, Japon ; Olympus Optical co, Japon) à l'objectif 100 (à immersion) et selon les procédures recommandées (OMS, 1994) par le responsable du poste, un technicien expérimenté avec 17 ans d'expériences (Figure 10)

La parasitémie a été quantifiée selon la formule suivante (Moody, 2002 ; WHO, 2005 ; Payne, 1988): P = (X / Y) 8000 parasites par mm3 de sang où X est le nombre de parasites comptés au microscope, Y le nombre de leucocytes comptés en même temps (200 leucocytes) et 8000, le chiffre consensuel du nombre de GB/mm3 chez l'Homme . La lecture de 200 champs microscopiques était nécessaire pour rendre une rendre un résultat négatif.

Les résultats des GE ont notés en même temps dans le cahier de paillasse et dans la fiche des résultats. Les densités parasitaires étaient groupées en 3 classes : < 500/ul (faiblement positif) ; 501 - 5 000/ul (positif) ; > 5000/ul (Fortement positif (Figure 11)).

NB. : La réalisation d'un frottis n'a été nécessaire qu'en cas de difficulté réelle à confirmer un diagnostic d'espèce sur GE. Leur réalisation (confection frottis, coloration et lecture) a été faite comme indiquée au paragraphe 6.1.)

En fin de journée, le Médecin-Biologiste Chef de laboratoire choisissait au hasard 02 lames positives (éventuellement) et 02 lames négatives pour valider les résultats de la microscopie

Sans consulter les registres de paillasse, l'investigateur a réalisé sur les mêmes échantillons de chaque journée un TDR (Diaspot®-Malaria-Pf), dans le respect strict des procédures dictées dans la notice contenue dans le coffret (Annexe 7).

Le Diaspot®-Malaria-Pf se présente sous forme d'un coffret blanc contenant 40 tests unitaires en forme de savonnettes emballées individuellement avec un dessicant ; 2 flacons d'1 ml chacun de tampons (buffer) ; 40 pipettes compte-gouttes et une notice du test. Tant que l'emballage individuel n'est pas altéré, il peut être conservé entre 8 et 30° et donc à température ambiante, jusqu'à la date d'expiration indiquée sur le coffret et sur chaque emballage de même que le numéro de lot. Pour la présente étude, nous avons eu besoin de 9 coffrets de de Diaspot®-Malaria-Pf, soit 360 tests unitaires.

C'est un test immunochromatographique qui permet de détecter la HRP2 de P. falciparum dans le sang total d'un patient à l'aide d' anticorps monoclonaux spécifique fixés sur une membrane en plastique.

Outre le sang prélevé sous EDTA, Nous avons eu besoin des cassettes de Diaspot®-Malaria-Pf, la solution tampon (buffer), des pipettes compte-goutte (10 uL), tous fournis par le fabricant.

Figure 12 : Echantillons sanguins prélevés sur EDTA, prêts à être analysés avec Diaspot®-Malaria-Pf (laboratoire HRB, 2011)

· Respecter les précautions universelles en matière de manipulation des produits biologiques (port des gants, blouses...) (OMS, 1994)

· Mélanger le sang par retournement du tube et, à l'aide de la pipette compte-goutte ou d'une micropipette, prélever environ, 10ul de sang total puis verser dans le puis (S).

· Ajouter aussitôt 3 gouttes (environs 120 ul) de tampon en maintenant le tube verticalement. (éviter la formation des bulles d'air)

· Attendre au plus 15 minutes la migration du mélange le long de la membrane du test, puis lire la réaction et interpréter le résultat.

- Test Positif (+): En plus du trait (C) apparition d'un trait intensité (faible à fort) dans la zone (T) ; soit 2 traits (Figure 13 : 264/24 et 263/11)

- Test Négatif (-): seulement le trait (C) apparait (Figure 13 : 279/28 et 279/21)

- Résultats invalides : Pas de trait rouge à la zone contrôle (C) quel que soit ce qui se passe dans la zone (T) : Refaire le test en utilisant une autre cassette.

· N'est pas conseillé pour les régions où il existe de fortes proportions de cas de paludismes à P. non falciparum.

· Peut ; même si c'est rare, être faussement positif (facteurs rhumatoïdes, post traitement)

· Peut-être faussement négatif (délétion possible de HRP2 chez certaines souches de P. falciparum, Ig anti-HRP2 chez le patient, [HRP2] < seuil du test)

Les résultats des Diaspot®-Malaria-Pf ont été consignés quotidiennement sur la fiche de collecte et dans un registre particulier.

- les données cliniques (Fièvre, courbatures, céphalées, frissons et fatigue)

- les données biologiques (résultats de TDR et GE) ont été enregistrées quotidiennement dans un ordinateur jusqu'à la fin de la période de collecte.

Les données biologiques (résultats de GE et des Diaspot®-Malaria-Pf), nous ont permis d'obtenir des variables tels que les Vrais Positifs (VP)= Positifs en GE et au Diaspot® -Malaria-Pf ; les Faux Positifs (FP)= Positifs uniquement au Diaspot®-Malaria-Pf ; les Vrais Négatifs (VN)= Négatifs au Diaspot®-Malaria-Pf et à la GE ; et les Faux Négatifs (FN)= négatifs uniquement Diaspot®-Malaria-Pf. Ces variables mises dans un tableau 2x2 nous ont permis de calculer les caractéristiques du Diaspot®-Malaria-Pf tels que la sensibilité, la spécificité et les valeurs prédictives (positives et négatives).

Les analyses ont été réalisées avec les logiciels Epi-Info version 6.04 (Centers for Disease Control and Prévention, Atlanta, USA) et Excel 2010. Le seuil de significativité pour comparer deux proportions a été fixé à une valeur P <0,05.

· Prévalence (P) : Proportion des malades(M) dans une population (N) à un moment donné.

Avec M= Total des cas confirmés positifs et N= Total des cas testés (population d'étude)

· Sensibilité (Se) : Capacité du Diaspot®-Malaria-Pf à pouvoir détecter les sujets atteints de paludisme (Sujets GE+) dans notre population d'étude. Elle mesure ainsi l'aptitude du test à éliminer les faux négatifs (FN).

· Spécificité (Sp): Capacité Diaspot®-Malaria-Pf à détecter des sujets indemnes de Paludisme (GE-) dans notre population d'étude. Elle mesure ainsi l'aptitude du test à éliminer les faux positifs (FP).

· Valeur Prédictive Positive (VPP) : Probabilité qu'un patient ait réellement le paludisme (GE+) lorsque son test Diaspot®-Malaria-Pf est positif.

· Valeur Prédictive Négative (VPN) : Probabilité pour qu'un patient soit vraiment indemne lorsque son test Diaspot®-Malaria-Pf est négatif.

IV. RESULTATS.

La présente étude a vu la participation de 336 patients. Nous avons réalisé en tout 336 gouttes épaisses (GE) contre 377 Diaspot®-Malaria-Pf en effets, les 2 méthodes ayant été exécutées parallèlement et en aveugle sur les mêmes échantillons, nous avons dû reprendre 1 TDR sur un échantillon initialement invalide, et qui par la suite a été confirmé négatif.

La présente étude a impliqué 56% (187/336) de sujets de sexe féminin contre 44% (149/336) de sexe masculin; soit un sex-ratio (F/M) de 1,3

Les participants étaient âgés entre 1 à 79 ans avec une moyenne d'âge des participants qui était de 26,0 #177;37,2 ans. Par ailleurs, 25% de notre population d'étude avaient moins de 9 ans ; La tranche d'âge la plus représentée était celle de 1 - 5 ans avec 54 sujets sur 336 ; soit 16,1 %, et la tranche la moins nombreuse était celle des plus de 65 ans avec 4 personnes/336 soit 1,2 %.

La tranche pédiatrique (= 15 ans) représentait plus du tiers de l'effectif avec 124 sujets/336 (37%).

Excepté les tranches d'âge [6-10] et [31-35], les patients de sexe féminin étaient majoritaires dans toutes les tranches comme on peut le voir ci-dessous.

Le tableau ci-dessous représente les prévalences du paludisme selon chaque test.

Tableau 2 : Prévalence du paludisme d'après chaque test. (GE et Diaspot®-Malaria-Pf)

	Nombre de positifs (n)	Prévalences	IC95%
Goutte épaisse	94(336)	28,0%	[23,3 - 33,2]
*Diaspot®-Malaria-Pf*	100(336)	29,8%	[25,0 - 35,0]

La prévalence du paludisme confirmé par la GE était de 28,0% (94/336) alors qu'avec le Diaspot®-Malaria-Pf elle a était de 29,8% (100/336).

Le tableau qui suit représente les prévalences par tranche d'âge dans la population d'étude.

Tableau 3 : Prévalences par sexe et par tranche d'âge pour chacun des deux tests.

Classe d'âge			Prévalences du paludisme (n)
		Goutte épaisse (GE)					*Diaspot®-Malaria-Pf*
	Masculin(n)			Féminin(n)		Mixte(n)	Masculin(n)	Féminin(n)	Mixte(n)
[1-5] ans		70(20)			47,1(34)	55,5(54)	70(20)	47,1(34)	55,5(54)
[6-10] ans		25(24)			50(18)	35,7(42)	25(24)	44,4(18)	33,3(42)
[11-15] ans		23,1(13)			40(15)	32,1(28)	23,1(13)	46,7(15)	35,7(28)
> 15 ans		17,4(92)			20(120)	16,5(212)	20,7(92)	22,5(120)	19,8(212)
Total		24,8(149)			27,8(187)	28(336)	28,2(149)	31(187)	29,8(336)

o Par rapport à la GE, la prévalence maximale (70%) se retrouvait chez les garçons de la tranche [1-5] ans alors que la minimale (17,4%) se retrouvait dans la tranche > 15 ans toujours chez les garçons.

o Par rapport au Diaspot®-Malaria-Pf, la prévalence maximale (70%) se retrouvait chez les garçons de la tranche [1-5] ans alors que la minimale (20,7%) se retrouvait dans la tranche > 15 ans toujours chez les garçons.

o Les prévalences ont été dans l'ensemble plus élevées avec les Diaspot®-Malaria-Pf qu'avec la GE.

- Par rapport à l'association avec les principaux signes/symptômes cliniques du paludisme

Tableau 4 : Association entre les résultats de GE/ Diaspot®-Malaria-Pf et la fièvre

	Goutte épaisse		*Diaspot®-Malaria-Pf*
	Positive (%)	Négative(%)	Positif (%)	Négatif(%)
Fièvre
Oui	61(64,9)	146(60,3)	64(64,0)	143(60,6)
Non	33(35,1)	96(39,7)	36(36,0)	93(39,4)
Total	94(100)	242(100)	100(100,0)	236(100)

Nous avons pu dire que l'état fébrile des patients n'était ni lié au résultat de la goutte épaisse (p= 0,44), ni lié à celui du Diaspot®-Malaria-Pf (p = 0,56).

Tableau 5 : Association entre résultats (GE/ Diaspot®-Malaria-Pf) et céphalées.

	Goutte épaisse		*Diaspot®-Malaria-Pf*
	Positive (%)	Négative(%)	Positif (%)	Négatif(%)
Céphalées
Oui	63(67,0)	146(60,3)	68(68,0)	141(59,7)
Non	31(33,0)	96(39,7)	32(32,0)	95(40,3)
Total	94(100)	242(100)	100(100,0)	236(100)

Nous avons pu dire que la présence des céphalées chez les patients n'était ni liée au résultat de la goutte épaisse (p= 0,26), ni liée à celui du Diaspot®-Malaria-Pf (p = 0,15).

Tableau 6 : Association entre résultats (GE/ Diaspot®-Malaria-Pf) et courbatures

	Goutte épaisse		*Diaspot®-Malaria-Pf*
	Positive (%)	Négative(%)	Positif (%)	Négatif(%)
Courbatures
Oui	60(63,8)	148(61,2)	62(62,0)	146(61,9)
Non	34(36,2)	94(38,8)	38(38,0)	90(38,1)
Total	94(100)	242(100)	100(100,0)	236(100)

Nous avons pu dire que la présence des courbatures chez les patients n'était liée au résultat de la goutte épaisse (p= 0,65), ni liée à celui du Diaspot®-Malaria-Pf (p = 0,98).

Tableau 7 : Association entre résultats (GE/ Diaspot®-Malaria-Pf) et fatigue

	Goutte épaisse		*Diaspot®-Malaria-Pf*
	Positive (%)	Négative(%)	Positif (%)	Négatif(%)
Fatigue
Oui	57(60,6)	146(60,3)	61(61,0)	155(65,7)
Non	37(39,4)	84(34,3)	39(39,0)	81(34,3)
Total	94(100)	242(100)	100(100,0)	236(100)

Nous avons pu dire que la présence de la fatigue généralisée chez les patients n'était pas lié au résultat de la goutte épaisse (p= 0,38). De même qu'à celui du Diaspot®-Malaria-Pf (p = 0,41).

Tableau 8 : Association entre résultats (GE/ Diaspot®-Malaria-Pf) et frissons.

	Goutte épaisse		*Diaspot®-Malaria-Pf*
	Positive (%)	Négative(%)	Positif (%)	Négatif(%)
Frissons
Oui	48(51,1)	88(36,4)	48(48,0)	88(37,3)
Non	46(48,9)	154(63,6)	52(52,0)	148(62,7)
Total	94(100)	242(100)	100(100,0)	236(100)

Nous avons pu dire que la présence des frissons chez les patients était liée au résultat de la goutte épaisse (p= 0,01). Par contre, la présence des frissons n'est pas liée au résultat du Diaspot®-Malaria-Pf (p = 0,06).

3. Performances diagnostiques du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la GE (gold)

Tableau 9 : Résultats croisés du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la GE

TESTS		Goute Epaisse (Gold)
*Diaspot®-Malaria* Pf		Positif	Négatif	Total
	Positif	89	11	100
	Négatif	5	231	236
	Total	94	242	336

Par rapport à la GE considérée comme référence, nous avons observé 11 FP (Diaspt®+/GE-) et 5 FN (Diaspot®-Malaria-Pf -/GE+).

Paramètres de performance du Diaspot®-Malaria-Pf	Formules	Résultats	IC 95%
· Sensibilité (Se)	89*100/94	94,7%	[88,0-98,3]
· Spécificité (Sp)	231*100/242	95,5%	[92,0-97,7]
· Valeur Prédictive Positive (VPP)*	89*100/100	89,0 %	[81,2-94,4]
· Valeur Prédictive Négative (VPN)*	231*100/236	97,9%	[95,1-99,3]

Les caractéristiques propres au Diaspot®-Malaria-Pf sont respectivement de 94,7% et de 95,5% pour la sensibilité et la spécificité et les valeurs prédictives positives et négatives sont respectivement de 89,0% et 97,9%. Toutes fois, pour la capacité du Diaspot®-Malaria-Pf à détecter de P. falciparum seul, sa sensibilité est de 97,8% (89/91) IC.95% [91,4-99,7]

Tableau 11 : Sensibilité du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la parasitémie de la GE

	Diaspot®-Malaria-Pf
Parasitémie GE	Positif GE	Positifs Diaspot®	Sensibilité (%)	IC95%
< 500/ul	27	23	85,2	[72,2-98,2]
500-5000/ul	28	27	96,4	[89,5-100]
>5000/ul	39	39	100	[98,2- 100]
Total	94	89	94,7	[88,0-98,3]

A une parasitémie < 500/ul, la sensibilité du Diaspot®-Malaria-Pf était de 85,2% ; entre 501 et 5000/ul, elle était de 96,4% alors qu'à plus de 5000/ul, elle a atteint 100%

DISCUSSIONS ET LIMITES

I. DISCUSSIONS

Cette étude comparative du Diaspot®-Malaria-Pf avec la GE (référence) est la première réalisée à Bafoussam dans la région de l'Ouest du Cameroun, Elle fait néanmoins suite à celle réalisé par Sayang et al (2009) à Yaoundé qui a comparé le même Diaspot®-Malaria-Pf avec la GE mais sur une population pédiatrique. Nous avons tenu à réaliser cette étude ici compte tenu du fait que Yaoundé et Bafoussam abritent des faciès épidémiologiques différents. De plus, avec la diversité génétique de la HRP2 chez le Plasmodium, ainsi que d'autres contraintes opérationnelles (WHO, 2009 et Sayang, 2010), il n'est pas évident qu'un TDR (HRP2) évalué et validé ailleurs garde sa validité diagnostique ici. Or pour aller dans le même sens que l'OMS qui recommande les TDR dans les situations particulières, il faut être sûr de ses performances sur le terrain et donc, il faut l'évaluer.

Notre population d'étude était constituée par un échantillon exhaustif de 336 patients. Cette taille était semblable à celle des études similaires réalisées en RDC par Swarthout (2007) ; soit 358 patients. Par contre cette taille est largement en deçà de celle des études faites par Tarekegn (2008) au Kenya soit 78 454 patients. Cependant, au Cameroun, Sayang (2010) réalisa son étude sur 153 patients. Notre étude s'est déroulée en pleine saison des pluies mêmes, changements climatiques oblige, cette pluviométrie n'atteint plus aujourd'hui les niveaux connus dans la littérature. Pour être plus complet, une pareille étude aurait pu se tenir également en saison sèche pour observer l'impact des saisons sur la prévalence du paludisme et sur les performances du test Diaspot®-Malaria-Pf. Paradoxalement, il existe très peu de données sur la prévalence (microscopique) du paludisme au Cameroun en général. Les données disponibles au niveau du Programme National de Lutte contre le Paludisme (PNLP) et dans la délégation régionale de la santé de l'Ouest à Bafoussam concernant la morbidité palustre sont généralement recueillies sur la base d'un diagnostic avant tout clinique. Cette tendance est la même à l'échelle de tout le pays. Du coup, il ne nous a pas été possible de les exploiter pour calculer la taille de notre échantillonnage. Face à cette difficulté, nous avons choisi pour la présente étude de réaliser un échantillonnage par convenance. C'est une méthode non probabiliste avec l'inconvénient que les résultats obtenus ne peuvent pas de façon logique être extrapolés à l'échelle de la population cible. Pour l'analyse de la fréquence de la maladie dans notre population d'étude, nous avons expressément défini quatre (4) classes d'âges. La classe [1 - 5] ans qui est la plus vulnérable (OMS, 2008 ; OMS, 2009 ; MSP, 2007 et MSP, 2010) ; la classe [6 - 10] , la classe [11 - 15] (toutes les 3 classes précédentes appartiennent à la tranche pédiatrique) et la classe > 15 qui regroupe adolescents et adultes .

Dans cette étude, 56% (187/336) de sujets étaient de sexe féminin contre 44% (149/336) de sexe masculin; soit un sex-ratio (Féminin/Masculin) de 1,3 (Figure 14). Contrairement à une étude similaire faite par Amos (2006) au Mali où le sex ratio (H/F) était de 1,05. La tranche d'âge la plus représentée était celle de [1-5] ans avec environs 15% (54/336) alors que la moins représentée était celle de >65 ans. Plus du tiers de l'effectif (124/336) était constitué des < 15 ans (Consultations pédiatriques). Cette sur représentativité de la tranche pédiatrique dans cette étude pourrait s'expliquer par le fait que les parents seraient plus enclin à les amener dès l'apparition des symptômes en consultation, par contre, ils préfèreraient se tourner vers d'autres solutions (automédication...) pour les plus grands et eux même. D'autre part, excepté dans les classes d'âge [6-10] et [31-35], les filles étaient majoritaires dans toutes les classes d'âge (Figure 15). Ces caractéristiques de notre population d'étude notamment en ce qui concerne les < 5ans et les femmes ont généralement été observées dans les études similaires à l'instar de celles de Bechem et al (1999) et Wanji et al (2008).

Rappelons-nous que notre population d'étude était constituée uniquement de cas suspects de paludisme venus au laboratoire pour un diagnostic de confirmation. Il s'est agi donc ici de prévalence hospitalière. En effet nous savons aujourd'hui que la majorité des cas de paludisme en Afrique n'arrivent pas à l'hôpital pour des raisons diverse (OMS, 2003 ; MSP, 2005). Au final, seulement 94 cas de paludisme ont été confirmées par la GE soit une prévalence de 28%, tandis que le Diaspot®-Malaria-Pf a confirmé 100 cas pour une prévalence estimée à 29,8% (Tableau 2). En considérant la GE comme référence, la vraie prévalence était la première (28%) encore que la différence entre celle-ci et celle avec Diaspot®-Malaria-Pf n'a pas été jugée statistiquement significative (P=0,75). Ce qui revient à dire que 242 personnes auraient donc eu une parasitémie nulle malgré la présomption clinique. Personnes qui non seulement devraient suivre un traitement abusif à base d'ACT, mais dont le diagnostic réel des motifs de consultation serait retardé (Shillcutt et al, 2007 Tarekegn et al, 2008 et WHO, 2008). En tant que test de référence, nous avons considéré que la spécificité de la GE était par définition absolue. Cette référence est valide en ce qui concerne la comparaison avec les TDR (WHO, 2008). Elle peut être discutée pour affirmer le diagnostic de paludisme, en raison de l'existence de porteurs asymptomatiques de P. falciparum (Munier et al, 2009). Compte tenu du fait que notre étude s'est déroulée au mois de juillet, (période de haute transmission), il est possible que cette prévalence soit encore plus faible en saison sèche (période de faible transmission.). Il serait intéressant d'envisager une étude de ce genre pendant les deux périodes (saison sèche et saison des pluies) afin de mieux apprécier les variations saisonnières du paludisme et leur impact sur les TDR.

P. falciparum a été retrouvé chez 91 sujets parmi les 94 testés positifs à la GE soit 96,8%. Par contre P. malaria a été rencontré seulement 3 fois, soit 3,2%. Et malgré que P.ovale n'aie pas été détecté dans notre population d'étude, ces chiffres sont en concordance avec les données d'Impact-malaria et du MSP (2010) qui estiment les proportions des différentes espèces plasmodiales dans le faciès d'altitude au Cameroun entre 91,5 % et 96% pour P. falciparum ; 1,7% et 7,0% pour P. malaria et entre 0 et 6,8% pour P. ovale. Cette forte proportion de P. falciparum dans notre population d'étude crédibilise d'avantage le choix que nous avons porté sur le TDR Diaspot®-Malaria-Pf qui est un TDR(HRP2) détectant P. falciparum seul. D'autant plus qu'il a l'avantage sur les autres types de TDR d'être plus sensible, plus stable aux variations de température et moins coûteux (OMS, 2003).

- Prévalences par rapport au sexe et aux classes d'âge pour les deux tests (Tableau 3)

Dans la tranche [1-5] ans, on a remarqué une parfaite concordance entre les valeurs de prévalences selon la GE et le Diaspot®-Malaria-Pf et ceci tant dans la population mixte (55,5%), que dans chacun des deux sexes (70% chez les garçons contre 47,5% chez les filles). Cette absence de discordance nous suggère qu'il n'y aurait eu ni de faux positifs, ni de faux négatifs dans cette tranche. L'absence des faux positifs ici s'expliquerait par un suivi plus rigoureux des parents qui s'abstiendraient de pratiquer l'automédication de leurs enfants et quand ce serait le cas, ils l'avoueraient plus volontiers en consultation. D'autre part, la présence des facteurs rhumatoïdes responsables de certains FP est exceptionnelle dans cette tranche d'âge (Meyer , 1989). L'absence des FN serait le fait d'un système immunitaire encore jeune, par encore à même de produire des Ac monoclonaux anti-HRP2 (Lee et al, 2006). Par ailleurs, ces résultats montrent que dans cette tranche d'âge, les garçons sont de loin plus affectés que les filles. Simple coïncidence ou particularité établie ? La littérature n'est pas prolifique pour expliquer cela.

Dans toutes les autres classes d'âge on a noté que de légères discordances commençaient à apparaitre entre les prévalences à la GE et au Diaspot®-Malaria-Pf . En général, les prévalences au Diaspot®-Malaria-Pf étaient plus élevées que celles données par la GE ; sauf dans la classe [6-10] où cette prévalence était estimée à 35,7% pour la GE contre 33,3% pour le Diaspot®-Malaria-Pf . Une prévalence par rapport au Diaspot®-Malaria-Pf supérieure celle à la GE comme dans la tranche d'âge > 10 ans, suggère l'existence de faux positifs dans cette tranche. Par contre, les faux négatifs de notre population d'étude ont été répertoriés dans la classe [6-10] ans. Par ailleurs, on a remarqué que dans la tranche des > 5 ans, les filles étaient plus touchées que les garçons. Alors que c'est exactement l'inverse dans la tranche < 5 ans. Des études ultérieures devraient être menées pour essayer d'expliquer ce constat.

En général pour les deux tests la prévalence diminuait avec l'âge (tableau 3) passant de 55% chez les [1-5] ans pour la GE et le Diaspot®-Malaria-Pf à 16,5% et 19,8% chez les > 15 ans pour la GE et le Diaspot®-Malaria-Pf respectivement. Ces observations ont été faites dans plusieurs études similaires notamment celle de Wanji et al ( 2008), dans la région du Sud-Ouest-Cameroun qui montrait que la classe d'âge de 0 à 9 ans était la plus infectée avec 51% de prévalence contre 15% seulement chez les sujets de plus de 20 ans. Seulement, il faut signaler qu'il s'agissait d'une population de personnes cliniquement asymptomatique. Cette baisse de la prévalence avec l'âge pourrait s'expliquer par la mise en place graduelle chez les populations exposées en permanence aux infections palustres à répétition, d'une certaine immunité (Aubry et Jaffar-Bendjee, 2001 ; McKenzie et al, 2003).

v Comparaison des deux méthodes de diagnostic (GE et Diaspot®-Malaria-Pf)

ü Les deux méthodes de diagnostic n'exploraient pas les mêmes caractéristiques du Plasmodium. L'une (la GE) a consisté en la détection par observation microscopique des caractéristiques morphologiques du Plasmodium et l'autre (TDR) agissant par réaction immunochromatographique détectait la HRP2, Ag libéré pendant le développement de P. falciparum dont il est spécifique.

ü La GE nous a permis de pouvoir identifier deux espèces Plasmodiales. Permettant à la même occasion de détecter chez deux patients une association de formes parasitaires (trophozoïtes + gamétocytes). Elle nous a permis également d'estimer avec une relative précision la parasitéme.

Contraintes rencontrées : Un entretien quotidien rigoureux du microscope au était de mise car sa performance en dépendait. Ce microscope servait également pour le diagnostic des autres maladies infectieuses et parasitaires. Il n'était pas toujours évident de confirmer certains cas malgré l'expérience du technicien microscopiste (17 ans). En effet, pour 13 lames, nous avons dû re confectionner et re colorer les GE alors que pour 2 lames, un frottis mince a été nécessaire pour trancher sur l'espèce parasitaire. Le temps minimum pour réaliser une GE était d'environ 45 minutes quand la lame était fortement positive alors que le maximum était d'environ 120 minutes (lames mal colorées et/ou avec parasitémie très faible). Ce délai de réalisation ne tient pas compte des éventuelles coupures d'électricité assez fréquentes au laboratoire pendant notre étude. Le tout sans oublier l'expertise du Médecin-Biologiste pour le contrôle de qualité journalier.

ü L'outil pour la réalisation des Diaspot®-Malaria-Pf était simple (pas d'appareillage supplémentaire car tout était dans la trousse). Le test était relativement facile à exécuter (Annexe 7) et le temps de rendu des résultats variait entre 5 et 25 minutes.

Contraintes rencontrées : Nous avons dû reprendre un test dont le résultat était invalide.

- Par rapport à la recherche entre d'association entre les résultats des tests (Diaspot®-Malaria-Pf / GE) et chacun des cinq principaux symptômes du paludisme.

- L'état fébrile n'était associé, ni au résultat de la GE (P=0,44), ni au résultat du Diaspot®-Malaria-Pf (P=0,56) comme nous pouvons le voir dans le tableau 4. Et pourtant la fièvre est et a toujours été considéré comme signe majeur du paludisme. Sans être une contradiction, ceci nous permet de comprendre que le diagnostic de cette maladie ne saurait être basé sur ce seul signe, fusse - t - il une signe jugé majeur. Surtout que la fièvre est commune à de nombres autres pathologies dans notre contexte (Sayang et al, 2000 ; Dicko et al, 2005 et Lubell et al, 2007).

- Les associations entre chacun des deux tests (GE et Diaspot®-Malaria-Pf) et chacun des symptômes suivants à savoir : les céphalées, les courbatures et la fatigue (Tableaux 5, 6 et 7) n'ont pas été jugées significatives pour l'un comme pour l'autre test ; aucune des valeurs P n'ayant été inférieures à 0,05. Comme avec la fièvre, et dans un contexte de maladies émergentes et réémergences (SIDA, arboviroses, tuberculose, salmonelloses, etc...), tous ces signes/symptômes pris isolément ne suffisent plus pour prédire de façon isolée le paludisme. Cette thèse renforce encore plus s'il en était encore besoin, la nécessité d'un diagnostic biologique pour confirmer systématiquement tout paludisme clinique que ce soit par goutte épaisse ou par un TDR aux performances avérées. L'enjeu ici est double : Ne mettre sous traitement que des cas réellement confirmés (économies d'ACT et d'autres antipaludéens) et Prendre en charge correctement et rapidement tous les cas infirmés parce qu'on réoriente le diagnostic vers d'autres affections possibles. (OMS, 2006 ; Lubell et al, 2007 ; Drakeley et al, 2009 et Msllem et al, 2009)

- Par contre, nous avons pu trouver une association statistiquement significative (P=0,01) entre la GE et les frissons (Tableau 8) ce qui suggère qu'en présence des frissons, on a plus de chance d'avoir une GE positive (souffrir de paludisme). Mais cette association cesse d'être significative lorsqu'il s'agit du Diaspot®-Malaria-Pf (P=0,06) ! Cette légère discordance statistique peut à notre avis s'expliquer par le fait que par rapport à la GE, un nombre plus élevés de positif aurait été retrouvée chez les des personnes ne présentant pas de frissons, probablement des faux positifs.

v Performances diagnostiques du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la GE (gold)

Des données du tableau 9, deux ont retenu notre attention : Les 11 faux positifs et les 5 faux négatifs. Par ailleurs le tableau 10 nous donne avec leurs intervalles de confiance 95% les paramètres de validité du Diaspot®-Malaria-Pf par rapport à la GE.

· Sensibilité et Spécificité (valeurs intrinsèques du Diaspot®-Malaria-Pf )

Ces deux paramètres mesurent la validité intrinsèque d'un test par rapport à une référence. Si la sensibilité mesure la capacité d'un test à détecter les vrais positifs et par conséquent à exclure les faux négatifs, la spécificité (Sp) quant à elle mesure la capacité d'un test à détecter les vrais négatifs et donc à exclure les faux positifs.

La Sensibilité du Diaspot®-Malaria-Pf a été estimée dans la présente étude à 94,7% avec un intervalle de confiance à 95% (IC 95%) de [88,0 - 98,3]. Elle se situe donc entre les bornes d'acceptabilité recommandées par l'OMS pour un TDR (> 95%). Cette valeur indique que dans la pratique sur 100 GE positives, le Diaspot®-Malaria-Pf sera capable d'en confirmer environs 95 ! En d'autres termes il ne sera pas capable de confirmer 5 cas positifs à la GE. D'où les 5 faux négatifs obtenus sur les 98 GE positifs. Cette sensibilité est légèrement inférieure à celle trouvée à Yaoundé par Bechem et al (1999) qui était de 98%, avec le Paracheck® (HRP2). Par contre elle est supérieure à celle trouvée par Sayang et al en 2009 à Yaoundé (71,1%) avec le Diaspot®-Malaria-Pf. La variation des données de sensibilité obtenues des trois études précédemment citées ayant pourtant toutes été réalisées au Cameroun nous interpellent. Si la littérature s'accorde à reconnaitre qu'en général les TDR (HRP2) ont des meilleures sensibilités (WHO, 2003) et que par conséquent, ils donnent relativement moins de faux négatifs. Qu'est ce qui peut expliquer que sur le terrain on trouve parfois des sensibilités si variables pour des TDR ciblant pourtant le même Ag (la HRP2) ? Les essais d'explication évoquées sont : La possible variété génétique de la HRP2 (Kilian et al, 1997 ; Beker et al, 2005 et Amos, 2005), la production des anticorps anti-HRP2 qui chez certains patients seraient à l'origine de la neutralisation de la HRP2 produite par des Plasmodiums (Biswas et al, 2005 ; Lee et al, 2006), et enfin les très faibles parasitémies. Cette dernière option nous a semblé très peu plausible dans un contexte comme le nôtre où, avec l'exposition régulière aux infestations Plasmodiales, une franche importante de la population tolèrerait une certaine parasitémie (resterait asymptomatique). Il faudrait donc un taux de parasites sanguin plus élevé, généralement au-dessus du seuil de détection des TDR à base de HRP2 pour tomber malade (Munier et al, 2009). Sayang et al (2009) avaient déjà essayé de justifier le faible niveau de sensibilité du Diaspot®-Malaria-Pf évalué à Yaoundé (71,1%) par les conditions de température qui aurait été régulièrement supérieure à 30° (Son étude ayant été réalisée en saison sèche). Cela nous a semblé acceptable car, à Bafoussam, les températures au moment de notre étude (juillet) atteignaient exceptionnellement les 30° (température maximale recommandée pour la conservation des Diaspot®-Malaria-Pf). La concordance relative entre les sensibilités obtenues par Bechem et al (1999) avec la Paracheck® et dans la présente étude avec le Diaspot®-Malaria-Pf, dilue notre conviction par rapport à un problème de polymorphisme de la HRP2 à moins que les populations de Plasmodium de Yaoundé diffèrent génétiquement de celles de Bafoussam en ce qui concerne la HRP2. Par contre le problème d'existence d'Ac anti-HRP2 reste à éclaircir. Par ailleurs, nous avons noté dans la présente étude une augmentation de la Sensibilité de Diaspot®-Malaria avec la parasitémie (Tableau 11). Cette situation a été également retrouvée dans certaines études publiées (Iqball et al, 2000 ; Wanji et al, 2006 et Wonsrichanalai, 2007). Enfin, rappelons que le Diaspot®-Malaria-Pf n'a pu détecter que P. falciparum seul. Or dans la présente étude, nous avons pu identifier 3 fois P. malaria grâce à la GE. Ce qui revient à dire que la sensibilité spécifique de notre test par rapport à la détection de P. falciparum seul est de 97,8% (89/91) avec un IC95% de [91,4-99,7]. C'est dire que la sensibilité du Diaspot®-Malaria-Pf ainsi trouvée peut encore être améliorée avec la diminution de la proportion des autres espèces non P. falciparum dans la population.

La spécificité du Diaspot®-Malaria-Pf a été chiffrée dans la présente étude à 95,5% avec un IC95% de [92,0-97,7]. Ce qui signifie en d'autres termes que sur 100 sujets réellement négatifs (GE négatif), le Diaspot®-Malaria-Pf n'a pas été capable d'en confirmer entre 4 et 5 sujets. D'où les 11 faux positifs enregistrés sur les 242 négatifs à la GE. Cette valeur est supérieure aux 88,8% de spécificité qu'avaient obtenue Bechem et al (1999) lors de l'évaluation du Paracheck®(HRP2) à Yaoundé, ainsi qu'à celle trouvée par Sayang et al en 2009 (82,2%). Par contre cette spécificité est comparable à celles qu'avaient obtenues Grobusch et al (1999) pour deux TDR détectant la protéine HRP2 (ParaSight-F® et ICT Malaria®) et dont les spécificités étaient de 97,1% et 99,2% respectivement. Wanji et al (2006) avaient aussi trouvé une spécificité quasi-semblable (95,5%) avec Hexagon®, un TDR (pLDH) et pourtant, en général, ces TDR (pLDH) sont réputés en général plus spécifiques que les TDR(HRP2). De nombreuses explications sur cette propension des TDR(HRP2) à donner des taux relativement élevés de faux positifs vont de la présence des facteurs rhumatoïdes chez les malades, (Grobusch et al, 1999 ; Iqbal et al, 2000) à la persistance de la HRP2 dans le sang plusieurs jours après la clairance des Plasmodium (Wonsrichanalai, 2007 ; Rakotonirina, 2008 et WHO, 2008). Nous avons tenu compte de ce problème dans la présente étude en excluant systématiquement de notre échantillon tous les patients sous traitement antipaludique dans la semaine précédant la demande d'analyse. Seulement, dans un contexte d'automédication ambiant dans notre région, il n'est pas sûr que ce filtrage clinique des cas ayant commencé un traitement antipaludique avant la consultation ou ayant dans un passé assez récent traité à domicile un paludisme clinique ait été efficace à 100% ; les malades ne disant toujours pas la vérité pendant les consultations. Donc certains faux positifs retrouvés dans la présente étude pourraient bien malgré tout être le fait de la rémanence de la HRP2. Cette éventualité est plus plausible chez les > 11 ans où la prévalence selon Diaspot®-Malaria-Pf était toujours supérieure à celle donnée par la GE. L'hypothèse des faux positifs dus aux facteurs rhumatoïdes n'est pas à écarter aussi.

· Valeurs Prédictives Positive et Négatives (VPP et VPN) (valeurs dépendantes de la prévalence)

Les valeurs prédictives sont également les paramètres de performances d'un test mais ces valeurs sont étroitement liées à la prévalence de la maladie dans la région où le test est utilisé. Elles sont d'un intérêt plus important pour le clinicien/prescripteur ou l'utilisateur du résultat du test.

La valeur prédictive positive (VPP), qui mesure la probabilité qu'un patient testé au Diaspot®-Malaria-Pf ait le Paludisme (GE positive) quand le résultat est positif a été estimée dans la présente étude à 89,0% avec un IC95% de [81,2-94,4]. Cette valeur est relativement faible car, elle signifie en d'autre terme que 11 fois sur 100, dans la présente étude, une personne dont le Diaspot®-Malaria-Pf était positif n'avait pas le Paludisme (avait une GE négative). Ce qui est un problème assez préoccupant pour l'utilisateur des résultats (Prescripteur/Patient) qui en s'y fiant non seulement prendra la décision de traiter inutilement ledit patient (dépenses inutiles) mais aussi et surtout négligera un poursuite d'investigation qui aurait peut-être permis de diagnostiquer une autre maladie. Cette VPP était semblable à celle trouvée par Munier et al (2009) à Dakar lors d'une évaluation du Core® Malaria-Pf (HRP2) avec une VPP de 90%. Elle était encore meilleure que celle trouvée pour le même Diaspot®-Malaria-Pf à Yaoundé par Sayang et al en 2009 (73,8%).

La discussion sur les valeurs prédictives (VPP et VPN) est délicate à faire par ce que, ces valeurs dépendent toujours de la prévalence de la maladie dans la localité d'étude. En effet, pour un test ayant une sensibilité et une spécificité donnée, il y aura autant de valeurs prédictives (VPP et VPN) que les différentes prévalences dans la population d'étude (MacMarrow, 2008).

La Valeur Prédictive Négative (VPN) qui est la probabilité qu'un patient n'ait pas le Paludisme (GE négatif) quand le Diaspot®-Malaria-Pf est négatif, a été de 97,9% avec un IC95% de [85,1-99,3]. Cette valeur indique que sur 100 patients testés négatifs au Diaspot®-Malaria-Pf, environs 98 étaient effectivement indemne de Paludisme (GE négative). En d'autre terme, pour un clinicien/utilisateur se fiant aux résultats des Diaspot®-Malaria-Pf, sur 100 patients se présentant avec un résultat négatif, il sera induit en erreur 2 fois seulement, c'est-à-dire qu'il ne prescrira pas à tort d'antipaludéens chez deux patients seulement. Ceci est très intéressant pour le clinicien dans un contexte où dans la présente étude, sur les 336 patients suspects, 236 ne devraient pas d'après les résultats du Diaspot®-Malaria-Pf bénéficier d'un traitement antipaludéen dont 5 à tort. Autant de médicaments économisés avec des perspectives de recherche d'autres causes de maladies. Seulement, pour les 5 patients qui ne seront pas traités à tort, il y a un risque réel de décès dû au Paludisme qu'il faudrait chercher à éliminer en améliorant les performances du Diaspot®-Malaria-Pf .

Cette VPN de 97,9% était inférieure à celle trouvé par Sayang et al en 2009 à Yaoundé pour le même Diaspot®-Malaria-Pf qui était de 80,4% avec une prévalence dans la population d'étude estimée à 31,3%. A la même prévalence, notre VPN aurait été plus faible que celle que nous avons trouvée.

II. LIMITES

- Au fait qu'en prenant pour Gold-standard la GE, nous avons assumé d'emblée que les résultats de ce test concordent toujours avec la réalité (Absence ou présence du paludisme). Dans ce cas, ce serait alors un test parfait ! (Se=100% ; Sp=100%). Or des études ont prouvé que La PCR avait des performances diagnostiques supérieures à la microscopie (Berry et al, 2005). Par ailleurs, aucune méthode diagnostique n'est fiable à 100%.

- Au fait que compte tenue de la variation saisonnière des prévalences du paludisme, il aurait été souhaitable de réaliser cette étude sur deux périodes distinctes (Périodes de forte transmission et périodes de faible transmission). Ceci aurait aidé à avoir une idée plus vraisemblable de la prévalence palustre de notre population d'étude ainsi que des VPP et VPN. De plus, un échantillonnage de plus grande taille aurait crédibilisé d'avantage nos résultats. Or le coût relativement élevé des TDR ainsi que les contraintes académiques ne nous ont pas permis de faire face à ces insuffisances.

- Au fait qu'ayant réalisé un échantillonnage non probabiliste (échantillonnage de convenance) et avec les nombreux biais de sélection (patients sélectionnés sur la base d'un diagnostic de présomption), l'intervalle de confiance à 95% (IC95%) donné pour encadrer nos données à l'échelle la population générale ne peut qu'être très approximative.

- Au fait que Diaspot®-Malaria-Pf est conçu pour le diagnostic exclusif du Paludisme à P. falciparum (détection de l'Ag HRP2). Or deux autres espèces de Plasmodium (P. malaria et P. ovale) cohabitent de façon marginale dans la région d'étude même si la présente étude n'a pu mettre en évidence que l'une d'elles. Une meilleure étude comparative entre GE et TDR devrait donc impliquer ici, les TDR recherchant les autres espèces plasmodiales présentes (détection de pLDH et/ ou de l'Aldolase).

- Au fait qu'une évaluation des coûts du Diaspot®-Malaria-Pf est nécessaire pour vérifier leur accessibilité financière à la grande majorité des formations sanitaires au-delà de la validité de ses performances diagnostiques.

CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS

I. CONCLUSIONS

Au terme de la présente étude, nous avons trouvé que la prévalence du paludisme dans notre population d'étude était de 28% avec P. falciparum comme l'espèce ultra majoritaire rencontré dans 96,8% des cas. Les performances du Diaspot®-Malaria-Pf comparées à celles de la goutte épaisse ont été jugées satisfaisantes (d'après les critères OMS, Se > 95%) surtout avec une très bonne capacité à détecter P. falciparum (Se* : 97,8%), une Spécificité de 95,5% et une VPN de 97,9%. De plus, ils sont simples d'utilisation, d'interprétation relativement facile et surtout, un rendu des résultats est possible en moins de 25 minutes ! Vu sous cet angle, nous pouvons suggérer leur utilisation à l'Hôpital Régional de Bafoussam soit pour gérer les situations d'urgence, soit pour faire face à une surcharge d'activités au laboratoire. Les formations sanitaires périphériques où les conditions ne sont pas toujours optimales pour la réalisation d'un diagnostic microscopique fiable trouveront en ceux-ci une alternative crédible et salutaire. Mais, pour un meilleur rendement des Diaspot®-Malaria-Pf comme pour la plupart des TDR évalués, ils doivent être choisis, conservés et manipulés conformément aux directives spécifiques. De plus, ils doivent être accessibles financièrement.

II. RECOMMANDATIONS

La présente étude comparative réalisée à l'HRB a attesté l'efficacité du Diaspot®-Malaria-Pf sous réserve des meilleures conditions de sa mise en oeuvre ; d'où les recommandations suivantes que nous formulons à l'endroit :

v Des Fabricants/fournisseurs des Diaspot®-Malaria-Pf. (Diaspot(c) company Ltd, USA)

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

IX. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.

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ANNEXES

ANNEXE.1

J'ai l'honneur de venir auprès de votre service solliciter l'obtention d'une clairance éthique pour mes travaux de recherche en vue de la rédaction d'une thèse de Master en parasitologie. Est joint à cette demande un exemplaire du protocole de recherche.

Dans l'attente d'une suite favorable, veuillez agréer, monsieur l'expression de mon respect.

ANNEXE.2

J'ai l'honneur de venir auprès de votre bienveillance solliciter l'autorisation de mener une recherche dans le laboratoire de votre hôpital sur le thème `'Etude comparative de deux méthodes de diagnostic biologique du paludisme : TDR et GE. Cas des patients reçus à l'hôpital régional de Bafoussam'', en vue de l'obtention du Master of Science « parasitologie ».

Sont joints à la présente demande, un exemplaire du protocole de recherche et un exemplaire de la demande de clairance éthique.

Dans l'attente d'une suite favorable, veuillez agréer, madame le Directeur l'expression de mon profond respect

ANNEXE.3

· Titre : Etude comparative d'un Tests de Diagnostic Rapide (Diaspot®) avec la Goutte épaisse (GE) à l'Hôpital Régional de Bafoussam

· Clinique : (le même jour ou dans la semaine précédant le prélèvement)

Type d'analyses

Résultats

Espèce et forme

Parasitémie

estimée

(Pour 200 GB)*

(Pas de parasitémie estimée pour les TDR)*

TDR (Diaspot)

P. f

*Parasitémie GE/uL = Plasmodiums comptés x 8 000 / 200 (MSP, 2007 ; Moody, 2002).

ANNEXE.4

Indication : C'est la coloration par excellence des FM en vue d'examens de cyto-hématologie et de Parasitologie sanguine.

Matériel :
Lames étalées (FM), cuves et colorants (May-Grünwald et Giemsa), eau tamponnée, éprouvette

· Recouvrir entièrement le frottis de la solution de May-Grunwald et laisser agir 3 minutes.(Fixation du FM)

· Diluer en y ajoutant une égale quantité d'eau (tamponnée) et laisser agir 2 minutes

· Recouvrir le FM d'une solution de Giemsa dilué préparé extemporanément (1 vol. De Giemsa + 9 vol. d'eau tamponnée) et laisser agir 15 à 20 minutes

· Rincer abondamment à l'eau du robinet, égoutter et sécher à l'abri des poussières.

ANNEXE.5

Indications : Le Giemsa est en général utilisé dans la pratique pour la coloration des GE des FM fixés préalablement en vue d'examens parasitologiques et de cytohématologie.

Matériel : Lames à colorer, Giemsa-R (solution mère), eau tamponnée, éprouvette, pipettes compte-gouttes.

§ Recouvrir les lames à colorer de Giemsa (solution de travail) diluée extemporanément

§ Rincer délicatement à l'eau du robinet, égoutter et sécher à l'abri des poussières.

§ Dans le cas de frottis pour recherche de plasmodium, les noyaux leucocytaires sont violet foncé, la chromatine du plasmodium est rouge foncé et son cytoplasme bleu pâle.

Selon qu'on ait à faire au Giemsa Rapide ou au Giemsa Lent, la solution mère sera diluée au 1/10^e ou au 1/20^e de préférence dans de l'eau tamponnée (pH 7 - 7,2). Bien mélanger. A utiliser dans la même journée. En pratique, pour une dilution au 1/10, prendra 2ml de Giemsa pour 18 ml d'eau tamponnée ; soit 20 ml de Giemsa prêt à l'emploi. Ce qui correspond à la coloration de 5 lames.

ANNEXE.6

Fiche technique de préparation des Réactifs et Colorants pour Diagnostic Microscopique du Paludisme

§ Dans un flacon propre contenant des billes, introduire la poudre et le méthanol.

§ Mélanger pour dissoudre toute la poudre. Conserver le colorant à l'abri de la lumière, de la chaleur et de l'humidité en le mélangeant régulièrement. Noter la date de préparation : durée conservation : 2 semaines au moins

C'est un mélange de poudre d'azur II -éosine avec de petites quantités d'azur I et de bleu de méthylène dissous dans un mélange de méthanol et de glycérol servant à la fois de solvants et de conservateur. Sa dilution avec de l'eau entraine une dissociation partielle de ces colorants responsables des colorations basophiles et acidophiles des différents compartiments cellulaires. D'où sa préparation extemporanée et son instabilité après dilution à l'eau. Il existe 2 variantes du Giemsa : le Giemsa rapide (responsable d'une coloration intense en peu de temps) et le Giemsa lent qui colore moins rapidement.

· Commencer par verser le méthanol dans un flacon contenant des billes de verre (ou des petits galets très propres) puis ajouter la poudre et la laisser doucement se déposer au fond du flacon.

· Ajouter enfin le glycérol et mélanger de la même manière. Remuer ensuite, toujours de cette manière 3 fois par jour, pendant 4 jours consécutifs.

Une solution mère se conserve environs trois mois à l'abri de l'air (bien boucher), de la lumière (en flacon opaque) et de l'humidité.

C'est une variante semblable au Giemsa utilisée au Etats-Unis pour colorer les cellules.

NB. : Contrôler le pH à l'aide de papiers indicateurs et il doit être compris entre 7,0 et 7,2

à‰tude comparative d'un Test de Diagnostic Rapide du paludisme (TDR) avec la Goutte Epaisse (GE) a l'hôpital régional de Bafoussam au Cameroun

INTRODUCTION

I. INTRODUCTION