Memoire Online - Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes du raisinier bord de mer (Coccoloba Uvifera l.) le long d'un gradient de salinité en forêt littorale

Analyse de la diversité des champignons ectomycorhiziens et des
ectomycorhizes du Raisinier bord de mer (Coccoloba uvifera L.) le
long d'un gradient de salinité en forêt littorale

Laboratoire de Biologie et Physiologie Végétales (LSTM-UMR113), UFR Sciences Exactes et
Naturelles, Université des Antilles et de la Guyane, BP. 592, 97159, Pointe-à-Pitre,
Guadeloupe

Ce stage s'est déroulé au Laboratoire de Biologie et de Physiologie Végétales (LSTM-UMR113) de l'Université des Antilles et de la Guyane. Ce travail de recherche a pu se réaliser gr%oce au soutien de personnes que je tiens à remercier en particulier :

Monsieur Amadou B%o , professeur à l'UAG, d'avoir encadré ce travail avec enthousiasme et de m'avoir fait découvert le monde fascinant des symbioses ectomycorhiziennes.

Mademoiselle Isabelle Boulogne, technicienne au laboratoire, pour son soutien moral mais aussi pour son amabilité et son aide.

Mademoiselle Sandrine Bessard, doctorante au laboratoire, surnommée grande sÏur, pour son aide.

Madame Clémence Chaintreuil, ingénieure de recherche à l'IRD de Montpellier, d'avoir bien voulu nous apporter son aide pour le séquençage de l'ADN.

Mademoiselle Fadul Ra
·ma, stagiaire en M1 au laboratoire, pour ses encouragements, sa gentillesse et son amitié.

Mes camarades de promotion, Lisa Vidil, Pierre-Antoine Faddoul et Anaël Ssosse, pour leur accueil, leur amitié et leur encouragement.

Monsieur Harry-Ozier Lafontaine, directeur de recherche à l'INRA, d'avoir bien voulu faire un rapport sur mon mémoire de stage.

Toute l'équipe du laboratoire de Biologie Marine pour son accueil, en particulier Madame Soazig Lemoine, maître de conférences à l'UAG, qui a aimablement mis à ma disposition l'équipement de biologie moléculaire.

L'AUF Cara
·be pour son soutien financier à travers la bourse de mobilité sans laquelle ce travail n'aurait pas vu le jour. Que les responsables trouvent, ici, l'expression de ma reconnaissance, particulièrement Mme Katty Saint-Louis, pour son attention et son dévouement.

Figure 1. Principaux types d'associations symbiotiques entre des champignons 5

Figure 2. Représentation schématique de l'ITS (ITS1, ITS2 et 5.8S) de l'unité 9

Figure 5. Coccoloba uvifera en bordure de mer sur la plage de Bois Jolan 15

Tableau 3. Champignons ectomycorhiziens associés à C. uvifera aux Antilles 16

Figure 6. Plantules de Coccoloba uvifera et sporophores de Russula cremeolilacina 16

Figure 7. Représentation schématique (vue de profil) des six arbres -mères de Coccoloba 17

uvifera échantillonnés le long d'un gradient de salinité sur la plage de Bois Jolan

Figure 8. Représentation schématique (vue de face) de la position des six 18

Figure 9. Fructifications de Scleroderma bermudense matures ouvertes en étoile .23

Figure 10. Nombre de sporophores récoltés sous Coccoloba uvifera pendant 24

Tableau 4. Description des neuf morphotypes ectomycorhiziens sur quelques .25

Figure 11. Morphotypes des arbres-mères et de leurs plantules en milieu peu salé 25

Figure 12. Fréquence des morphotypes des arbres-mères et leurs plantules en milieu peu saléÉ 26

Figure 14. Produits de l'amplification par PCR de la région ITS de l'ADNr des morphotypesÉ 27

Figure 15. Produits de digestion par HinfI de la région ITS de l'ADNr des morphotypes 28

Tableau 5. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de la région ITS .29

Figure 16. Fréquence des six ribotypes (F, E, A, B, D et C) des arbres-mères et de leurs 30

Figure 17. Fréquence de trois ribotypes (A, B et F) des arbres en milieu salé 31

Figure 18. Arbre phylogénétique basé sur le séquençage de l'ITS des huit taxons 32

fongiques (I à VIII en rouge) de C. uvifera, comparé à des séquences de référence

INTRODUCTION

La symbiose ectomycorhizienne, une association mutualiste entre les racines fines des arbres et des champignons du sol, se traduit par la formation d'un organe mixte dénommé ectomycorhize (ECM), et par l'apparition d'organes sporofères appelés sporophores ou carpophores visibles à proximité de la plante hôte (Smith & Read, 2008). L'ECM assure une bonne alimentation en eau, macroéléments (p.ex. P, N, K) et oligo -éléments (p.ex. Zn, Cu) de la plante hôte (Diédhiou et al., 2004; Bandou et al., 2006; Quoreshi & Khasa, 2008). Elle développe, pour ce faire, un réseau mycélien qui explore un grand volume de sol, au-delà de la zone d'épuisement, et mobilise ainsi les nutriments essentiels. En retour, la plante autotrophe fournit au champignon hétérotrophe des photosynthétats nécessaires à son métabolisme.

La symbiose ectomycorhizienne est surtout localisée sous les latitudes tempérées et boréales, et concerne environ 90% des espèces d'arbres de ces régions (Smith & Read, 2008). Beaucoup d'arbres appartenant à la famille des Pinaceae, Fagaceae, Betulaceae, Tiliaceae et Salicaceae sont associés à une diversité d'environ 15000 espèces de champignons ectomycorhiziens appartenant à des Basidiomycota et Ascomycota. En revanche, beaucoup moins d'arbres sont associés à des ECM dans les régions tropicales et subtropicales (B%o et al., 2008; B%o et al., 2009). Il s'agit de familles d'arbres originaires d'Australie (p. ex. Myrtaceae, Casuarinaceae, Acaciaea), d'Afrique (p.ex. Caesalpinioideae, Phyllanthaceae), d'Asie (p. ex. Dipterocarpaceae, Caesalpinioideae) et d'Amérique du Sud (p.ex. Caesalpinioideae, Nyctaginaceae, Polygonaceae).

Dans les écosystèmes forestiers, des champignons sont capables de coloniser à la fois les racines des plantules et des arbres-mères de la même espèce ou d'espèces différentes, et d'établir ainsi des réseaux ectomycorhiziens communs (Read & Smith, 2008). Par le biais des réseaux ectomycorhiziens, les arbres établis peuvent aider les plantules de deux façons : (1) les champignons déjà nourris par les adultes représentent un inoculum peu couteux en photosynthétats pour les plantules dont ils assurent la régénération et la survie (Onguene & Kuyper, 2002; McGuire, 2007), (2) des transferts d'eau, de substrats carbonés et azotés sont possibles entre arbres matures et plantules en régénération (Tedersoo et al., 2007 ; Warren et al., 2008) ; de tels échanges sont bien établis chez certaines plantes de sous-bois non chlorophylliennes dites mycohétérotrophes ou des plantes mixotrophes qui, en plus de leur photosynthèse, s'alimentent en C et N issus de plantes photosynthétiques (Julou et al., 2005 ; Selosse et al., 2006 ; Tedersoo et al., 2007).

Parmi les arbres des forêts néotropicales, Coccoloba uvifera (L) est l'une des rares espèces à ECM qui fait l'objet de plantations ornementales (p.ex. haies -vives) en bordure de route et de plage sur les côtes atlantiques, caribéennes et pacifiques de l'Amérique tropicale et subtropicale (Parrota, 1994; Bandou, 2005). Cet arbre appartient à la famille des Polygonaceae et doit son nom de Raisinier bord de mer (en anglais Ç seagrape È) à son fruit comestible ressemblant à des grappes de raisins. Il pousse souvent sur des sols salés et pauvres en éléments minéraux. Il est associé à plusieurs espèces de champignons ectomycorhiziens (Pegler, 1983 ; Miller et al., 2000 ; Guzman et al., 2003; Bandou, 2005 ; Bessard et al., 2008) avec lesquels ses racines forment des ECM, une association symbiotique vitale pour la nutrition des plantes (Bandou et al., 2006). En effet, les ECM jouent un rôle majeur sur la croissance et l'adaptation des plantules de C. uvifera aux stress salin et hydrique (Bandou et al., 2006). Un inventaire des sporophores fructifiant sous le houppier de C. uvifera a été réalisé en Guadeloupe (Bandou, 2005). Cet inventaire mycologique devait être complété par un inventaire des ECM pour avoir une bonne image de la diversité des communautés de champignons ectomycorhiziens de C. uvifera. De plus, sous le houppier des arbres-mères de cette espèce prolifèrent des plantules issues de semis qui pourraient se lier aux réseaux ectomycorhiziens préexistants. L'existence de réseaux ectomycorhiziens communs aux arbres - mères et plantules pourrait contribuer à la régénération naturelle par semis.

Notre étude avait pour but (i) d'évaluer l'impact de la salinité sur les communautés de champignons ectomycorhiziens des arbres-mères et des plantules de C. uvifera, (ii) de déterminer à quel point les arbres-mères et leurs plantules partagent un cortège ectomycorhizien commun.

Le terme de mycorhize vient de l'association de deux mots grecs, Ç mykes È qui signifie champignon et ÇrhizaÈ qui signifie racine (Gagné, 2005). Il fut créé par Franck en 1885 pour définir l'organe mixte plante-champignon. Les mycorhizes se définissent comme des associations durables impliquant des échanges à bénéfices réciproques, au sein de structures spécifiquement mises en place par les partenaires de la symbiose au niveau des racines des végétaux (Smith & Read, 2008). Elles favorisent l'absorption par les racines des éléments minéraux de la mycorhizosphère et améliorent ainsi la nutrition de la plupart des espèces végétales. En retour, le végétal fournit le carbone nécessaire sous forme de sucres issus de la photosynthèse, à son partenaire fongique hétérotrophe (Gagné, 2005). Dans la nature, l'état de mycorhization est la règle et celui de la nonmycorhization est l'exception (Strullu, 1991).

Les mycorhizes à arbuscules (MA) et les ECM sont les principaux types de mycorhizes des écosystèmes forestiers et cultivés (B%o, 2008). Elles se distinguent par leur structure et leur morphologie (Tableau 1; Figure 1). Les MA ne sont pas visibles à l'oeil nu. Elles sont éclaircies et colorées pour révéler deux structures typiques observées en microscopie photonique : les vésicules et les arbuscules. Les vésicules sont un lieu de stockage des lipides nécessaires au métabolisme du champignon alors que les arbuscules sont le lieu d'échanges entre les deux partenaires de la symbiose. Les vésicules peuvent être intraracinaires et extraracinaires. Les arbuscules sont intraracinaires logées dans l'espace périplasmique de la cellule. Les ECM sont, en revanche, visibles à l'oeil nu gr%oce à la couleur du manteau fongique qui recouvre la racine (Figure 1). Les hyphes pénétrent entre les cellules corticales pour former le réseau de Hartig, lieu d'échanges bidirectionnels entre les deux partenaires.

Les MA, apparues en même temps que les végétaux terrestres, concernent plus de 80% des taxons végétaux. Les champignons sont des symbiotes obligatoires, ubiquistes et rattachés au phylum des Glomeromycota. Les ECM, d'apparition plus récente, sont associées à environ 5% des plantes vasculaires. Les champignons sont des Basidiomycota et des Ascomycota apparus plusieurs fois indépendamment à partir des phylums de saprophytes (Hibbett et al., 2000). En général, les forêts boréales sont dominées par les arbres à ECM, les forêts tempérées par les arbres à MA et

ECM, et les forêts tropicales humides par les arbres à MA. Cependant, on trouve des peuplements d'arbres à ECM dominants dans les forêts tropicales humides d'Asie du Sud-Est, d'Afrique et d'Amérique du Sud (Torti et al., 2001 ; McGuire, 2007 ; Rivière et al., 2007). Ces arbres sont des légumineuses (Caesalpinioideae) associées également aux MA. Les ECM, à cause de leur origine saprophyte, participeraient à la décomposition de la matière organique et seraient donc plus efficaces que les MA pour mobiliser les nutriments des sols pauvres (Smith & Read, 2008).

	MA	ECM Ectendo- mycorhizes	Mycorhizes arbuto ·des	Mycorhizes monotropo ·des	Mycorhizes érico ·des	Mycorhizes orchido ·des
Champignons Hyphes
cloisons	-	+ +	+	+	+	+
Arbuscules	+	- -	-	-	-	-
Vésicules	+ ou -	- -	-	-	-	-
Pelotons	-	- +	+	+	+	+
Manteau	-	+ + ou -	+ ou -	+	-	-
Réseau de Hartig	-	+ +	+	+	-	-
Taxonomie	Glom.	Basidio. Basidio.	Basidio.	Basidio.	Asco.	Basidio.
		Asco. Asco.				Asco.
		Zygo.
Plantes hôtes	Bryo.	Gymno. Gymno.	Erica.	Monotropa.	Erica.	Orchida.
	Pterido.	Angio. Angio.			Bryo.
	Gymno.
	Angio.

MA= Mycorhizes à arbuscules; ECM= Ectomycorhizes; - = absent; + = présent; + ou - = présent ou absent; Glom.= Glomeromycota; Basidio.= Basidiomycota; Asco.= Ascomycota; Zygo. = Zygomycota; Bryo. = Bryophyte; Pterido. = Pteridophyte; Gymno. = Gymnosperme; Angio. = Angiosperme; Erica. = Ericaceae; Monotropa. = Monotropaceae; Orchida. = Orchidaceae. (Smith & Read, 2008).

Figure 1. Principaux types d'associations symbiotiques entre des champignons (en bleu) du sol et des racines de végétaux; (A) racine sans mycorhize, (B) endomycorhizes à vésicules et à arbuscules, (C) endomycorhizes à pelotons, (D) ectendomycorhizes, (E) ectomycorhizes chez les Angiospermes, (F) ectomycorhizes chez les Gymnospermes (Duhoux & Nicole, 2004).

2.1. Diversité des champignons ectomycorhiziens

Les champignons ectomycorhiziens sont présents dans le sol sous forme de propagules de conservation et de dissémination (p.ex. spores, vieilles mycorhizes, cordons mycéliens) (Bâ et al., 1991). C'est sous ces différentes formes que les champignons se maintiennent dans le sol à l'état de vie ralentie en période sèche notamment. Quand les conditions sont favorables en période humide, les propagules produisent des hyphes qui poussent et se ramifient pour donner un mycélium capable de coloniser le système racinaire pour former des ECM. La germination des propagules marque le début du cycle de développement des Basidiomycota auxquels appartient la plupart des champignons ectomycorhiziens. Ce cycle se résume en deux phases principales: une phase végétative comprenant la formation et le développement du mycélium ou thalle à partir de la germination des spores, et une phase fructifère marquée par l'apparition de sporophores épigés ou hypogés, et la production de spores.

Chez les champignons supérieurs, le sporophore est la partie visible de l'organisme que l'on appelle couramment Ç champignon È. Il est constitué de filaments ou d'hyphes groupées en amas ou mycélium. La présence de sporophores est associée automatiquement à la présence de mycélium à la base du pied, mais l'absence de sporophores ne signifie pas nécessairement l'absence de mycélium dans le sol. Le sporophore, constitué d'un chapeau et d'un pied, est un organe éphémère oü se déroule la reproduction sexuée.

Les champignons ectomycorhiziens sont des symbiotes obligatoires qui bouclent leur cycle de développement en fructifiant notamment grâce aux ECM qu'ils contractent avec la plante hôte. La formation de sporophores requiert donc la présence d'ECM alors qu'à l'inverse on peut observer des ECM sans sporophores correspondants. En effet, des champignons comme Thelephora et Cenoccocum forment des ECM avec peu ou pas de fructifications et sont souvent dominants sur les racines de leurs plantes hôtes (Henkel et al., 2002 ; Diédhiou et al., 2004). La fructification des champignons est un processus complexe et coüteux en énergie pour la plante, qui dépend de l'espèce de champignon, de facteurs climatiques, de l'âge des peuplements et de traitements sylvicoles (p.ex. fertilisation, éclaircies). La formation de sporophores, difficile à obtenir en conditions contrôlées, dépend du champignon impliqué, de la qualité du substrat, des conditions de culture (p.ex. humidité, lumière, température) et de la production de métabolites par la plante hôte.

Hebeloma cylindrosporum en symbiose avec Pinus pinaster, fructifie in vitro sur un milieu de culture approprié et dans des conditions de lumière et de température bien définies (Débaud & Gay, 1987).

Dans la nature, les sporophores épigés sont la manifestation visible de la présence d'une espèce donnée en symbiose avec une ou plusieurs plantes hôtes. Dans la plupart des cas, les sporophores sont d'apparition fugace de quelques heures à quelques jours, rarement davantage. Leur apparition fluctue d'une année à une autre selon l'état hydrique du sol et l a périodicité des cycles biologiques des champignons souvent méconnus. L'inventaire des sporophores hypogés pose davantage de problèmes que les épigés dans la mesure oü ils sont souterrains et non visibles. Ils sont en général sous -évalués dans les inventaires mycologiques. Pour avoir un inventaire exhaustif de la fonge d'un biotope donné, il faut compter plusieurs récoltes étalées sur 7 à 10 ans au moins (Guinberteau & Courtecuisse, 1997).

Dans les régions boréales et tempérées, de nombreuses communautés de champignons ectomycorhiziens ont été décrites sur la base d'inventaires de sporophores (Ferris et al., 2000). L'avantage de cette approche réside dans la simplicité d'échantillonnage avec peu de perturbation du milieu et dans l'identification de l'espèce fongique à partir de la description du sporophore. Elle a cependant l'inconvénient de nécessiter plusieurs récoltes dans l'année, et d'une année à une autre pour prendre en compte les champignons résupinés peu visibles dans les écosystèmes forestiers (Erland & Taylor, 1999). Malgré tout, on estime que la diversité des sporophores de champignons ectomycorhiziens est comprise entre 10000 et 15000 espèces (Smith & Read, 2008). Ce chiffre est loin d'être exhaustif car il ne prend pas en compte la diversité encore peu connue des champignons des régions tropicales. Les champignons sont le plus souvent des Basidiomycota (p.ex. Russules, Lactaires, Amanites, Bolets, Girolles) et plus rarement des Ascomycota (p.ex. Truffes, Cenoccocum). Certains champignons sont comestibles et à forte valeur ajoutée (p.ex. Truffes, Matsutake).

2.2. Diversité des ECM

L'inventaire des ECM est une approche qui permet aussi d'accéder à la composition des communautés fongiques (Agerer, 1991). Basée uniquement sur des caractères morphologiques, anatomiques et histologiques, l'identification des ECM reste très aléatoire. En effet, la couleur du manteau peut changer en fonction de l'âge de la plante hôte ou de l'environnement (Thoen & Bâ, 1989; Wurzburger et al., 2001 ; Diédhiou et al., 2004). Les clés d'identification des ECM

proposées jusqu'ici se sont avérées dans l'ensemble insuffisantes pour identifier un champignon à partir d'une ECM à l'exception des ECM typiques du genre Cenococcum (Agerer, 1991).

Les caractères macroscopiques et microscopiques des ECM s'avèrent peu concluants pour remonter aux sporophores. De plus, un champignon peut former des ECM dont la morphologie change selon l'hôte ou quelquefois en fonction de l'âge de l'hôte. Des champignons différents peuvent former des ECM morphologiquement similaires. Tout compte fait, l'abondance des sporophores renseigne peu sur la fréquence des ECM. Des champignons comme Suillus fructifient abondamment et forment peu d'ECM. Ë l'inverse, Thelephora forment jusqu'à 40 % des ECM en fructifiant peu ou pas (Diédhiou et al., 2009).

Il est rarement possible d'observer des connexions entre le mycélium à la base du pied des sporophores et celui des ECM (Thoen & Bâ, 1989; Rivière et al., 2007). On suppose, souvent à juste raison, que les sporophores, fructifiant au voisinage des arbres, sont potentiellement ectomycorhiziens. Encore faut-il établir un lien formel entre sporophores et ECM car on peut aussi trouver des champignons parasites ou saprophytes à proximité des arbres à ECM. C'est le cas de quelques russules saprophytes facultatives ou parasites (p.ex. Russula parasitica) en Afrique tropicale (Buyck et al., 1996). Pourtant, le genre Russula est souvent ectomycorhizien. L'obstacle principal est l'identification de la composante fongique des ECM, qui peut être surmonté par des méthodes d'écologie moléculaire (p.ex. amplification et séquençage de l'ADNr).

2.3. Caractérisation moléculaire de la diversité fongique

Différentes techniques de biologie moléculaire (p.ex. PCR-RFLP, séquençage), basées sur l'analyse de l'ADNr, ont été développées ces dernières années pour étudier la diversité génétique des sporophores, identifier la composante fongique des ectomycorhizes et suivre la persistance des souches fongiques introduites en pépinière et en plantation (Gardes et al., 1991; Martin et al., 1991 ; Selosse et al., 1999; Diédhiou et al., 2004; Rivière et al., 2007; Sanon et al., 2009). La technique PCR est utilisée pour amplifier différentes parties du génome en ayant pour cibles l'ADN total, l'ADNr nucléaire ou l'ADNr mitochondrial. L'ADN total est analysé par des techniques comme l'AFLP (Ç Amplified Fragment Length Polymorphism È), l'ISSR (Ç Inter Simple Sequence Repeat È), la RAPD (Ç Random Amplified Polymorphism DNA È) ou les microsatellites pour accéder au polymorphisme de larges portions d'ADN (Jacobson et al., 1993 ; Redecker et al., 2001 ; Zhou et al., 2001). L'ADNr mitochondrial possède des entités qui sont en plusieurs copies indépendantes du génome nucléaire et utilisées pour des études sur la structuration des

communautés de champignons. Le gène de la grande sous-unité de l'ARNr mitochondrial (<< mtLSU rRNA È) en particulier le fragment d'environ 450 pb amplifié par les amorces ML5/ML6, est souvent utilisé en phylogénie des champignons ectomycorhiziens (Bruns et al., 1998 ; Stendell et al., 1999 ; Rivière et al., 2007). Bien que cette région soit peu évolutive au niveau de l'espèce, elle permet néanmoins de différencier sans ambigu
·té les familles voire les genres (p.ex. Russula, Amanita, Cantharellus, Thelephora, Tricholoma). De plus, il existe sur cette région une base de données de plus d'une centaine de séquences référencées dans NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). L'ADNr nucléaire existe en plusieurs copies (50 à 100 copies par cellule) et se trouve donc déjà préamplifié dans les extraits d'ADN. Il comprend des régions codantes pour les ARNr (18S, 5.8S, 25S et 5S) très conservées au niveau spécifique et des espaceurs intergéniques, soit transcrit (ITS, <<Internal Transcribed Spacer È), soit non transcrit (IGS, <<Intergenic Spacer È), moins conservés évolutivement. L'espaceur transcrit ITS (ITS1 et ITS2) conjointement amplifié avec le gène 5.8S, est un bon marqueur spécifique, mais très rarement au sein de l'espèce. L'espaceur ITS, d'environ 600 à 1000 pb, est amplifié par des amorces universelles (ITS1/ITS4), spécifiques aux champignons (p.ex. ITS1f/ITS4) ou spécifiques au Basidiomycota (p.ex. ITS1f/ITS4b) (White et al., 1990; Gardes et al., 1991). L'amplification de l'ITS est souvent couplée à l'étude du polymorphisme de longueurs des fragments de restriction (RFLP) et son utilisation en identification repose sur le séquençage nucléotidique. Il existe une importante base de données sur les séquences des ITS des champignons dans NCBI et UNITE ( http://unite.ut.ee/). Actuellement, la plupart des études d'écologie et de taxonomie moléculaires sur les champignons ectomycorhiziens sont basées sur l'analyse des régions ITS (Tedersoo et al., 2007 ; Sanon et al., 2009).

Figure 2. Représentation schématique de l'ITS (ITS1, ITS2 et 5.8S) de l'unité répétée de l'ADN ribosomique chez les champignons. Les flèches représentent les sites de fixation des amorces les plus utilisées en écologie moléculaire des champignons (Tedersoo et al., 2007).

2.4. Les ECM en milieu salé

La salinité affecte environ 7% des terres dans le monde (Munns & Tester, 2008). Elle peut avoir une origine naturelle (p.ex. degradation de la roche mere, intrusion de lÕeau de mer) ou anthropique (p.ex. fertilisation, irrigation avec de lÕeau saum%otre). Elle provoque un double stress hydrique et ionique sur les plantes. Pour faire face à ce double stress, les plantes, en particulier les halophytes, développent trois mécanismes dÕadaptation : (i) un mécanisme lie au stress osmotique qui consiste à ajuster la pression osmotique des cellules pour assurer leur alimentation en eau (épictese), (ii) un mécanisme lie au stress ionique qui consiste à exclure les ions toxiques, (iii) un mécanisme lie au stress ionique qui consiste à compartimenter les ions toxiques (Munns & Tester, 2008). Comme les mycorhizes font partie intégrante des plantes, les champignons font face aux memes contraintes dans les sols sales. Le manteau fongique des ECM limite le passage des ions toxiques de la solution du sol aux racines (Tian et al., 2004). Les hyphes résistantes sont en effet capables de compartimenter les sels dans les vacuoles, préservant ainsi les voies métaboliques. Elles peuvent aussi abaisser suffisamment leur potentiel osmotique pour créer un flux dÕeau du sol vers les racines et ainsi améliorer lÕalimentation en eau des plantes (Bogeat-Triboulot et al., 2004 ; Bandou et al., 2006 ; Yamato et al., 2008).

2.5. Importance des réseaux ectomycorhiziens

En general, les champignons ectomycorhiziens sont peu spécifiques vis-à-vis des plantes hTMtes (Smith & Read, 2008). Autrement dit, ils ont un large spectre dÕhTMtes et peuvent coloniser plusieurs especes dÕarbres. Par exemple, dans une hetraie, on peut trouver jusquÕà 150 especes de champignons ectomycorhiziens. Les champignons établissent un réseau mycélien liant les racines (réseau ectomycorhizien) de la meme espece ou dÕespeces différentes (He et al., 2004). Des transferts de minéraux du sol et de photosynthétats sont alors possibles entre arbres et plantules via les réseaux ectomycorhiziens (Simard et al., 1997 ; He et al., 2004). En situation de stress hydrique, les arbres-meres redistribuent lÕeau aux plantules par le biais des réseaux ectomycorhiziens (Warren et al., 2008). Des plantules, liées aux arbres-meres de la meme espece ou dÕespeces différentes par des réseaux ectomycorhiziens, peuvent améliorer leur croissance et leur survie (Newbery et al., 2000 ; Onguene & Kuyper, 2002 ; McGuire, 2007).

Les réseaux ectomycorhiziens constituent aussi une source dÕinoculum pour la régénération naturelle par semis ou rejets de souches (Onguene & Kuyper, 2002 ; Diédhiou et al., 2009). Connell & Lowman (1989) ont suggéré que la predominance des Dipterocarpaceae dans les forets humides dÕAsie du Sud-Est serait liée à la capacité de leurs semis à former des ECM via les réseaux

ectomycorhiziens préétablis des arbres-meres. La presence ou lÕabsence dÕECM sur les plantules depend de la distance à lÕarbre-mere. Ainsi, des plantules qui poussent en dehors de la rhizosphere des arbres-meres ont des taux de mycorhization et de survie tres faibles, alors que des plantules sous le houppier ont des taux de mycorhization et de survie élevés. Ë LÕevidence, les réseaux ectomycorhiziens influencent fortement la régénération naturelle et la survie des plantules dans les écosystèmes forestiers (Booth, 2004 ; McGuire, 2007).

3.1. Classification et description botanique

C. uvifera est un arbre de la famille des Polygonaceae (Tableau 2). Il est couramment appelé Raisinier bord de mer ou Ç rezinie bod lanmè È en creole et « Seagrape » en anglais. C'est un arbre pouvant atteindre une dizaine de metres de hauteur, mais présente généralement des dimensions plus modestes dans les zones exposées au vent en bordure de mer. CÕest une plante avec des branches étalées ou tentaculaire et à racines ligneuses. Ses tiges sont dressées ou étalées, glabres ou pubescentes distalement. Les feuilles du C. uvifera sont persistantes, caulinaires, alternées, pétiolées, ocrées souvent caduques, membraneuses à coriaces et pouvant mesurer jusqu'à une vingtaine de centimetres de largeur (Portecop & Petit Le Brun, 2003). Les feuilles présentent une base cordiforme et sont rondes à transversalement elliptiques, de longueur equivalente ou inférieure à la largeur (Figure 3). C. uvifera possède des fleurs unisexuées; certaines plantes ont uniquement des fleurs m%oles, et dÕautres seulement des fleurs femelles (Figure 4). Le périanthe est blanc ou blanc verd%otre, campanulé, glabre. La floraison est étalée de janvier à mai et les fruits arrivent en maturité en juillet-aofit. Les fruits de 1 à 2 cm de diamètre sont sphériques à ovo
·des et disposes en grappe (Figure 3). Ë maturité, ils prennent une couleur rouge violacé et sont comestibles.

Tableau 2. Classification botanique de Coccoloba uvifera (Bush et al., 1969)

3.2. Origine et aire de distribution

Dans la famille des Polygonaceae, largement distribuée à lÕéchelle de la planète, le genre Coccoloba reste exclusivement néo-tropical et regroupe plus de 400 espèces (De Mélo, 2000). Les plus hauts niveaux de diversité spécifique à lÕintérieur du genre Coccoloba ont été décrits en Amazonie avec 44 espèces (De Mélo, 2004). Coccoloba est un genre, compose dÕespèces tropicales et arboricoles qui prédominent en Amérique

du Sud, le plus grand nombre étant au Brésil. Dans la Cara
·be, dix espèces de Coccoloba ont été répertoriées, dont C. uvifera, lÕespèce la plus connue. C. uvifera est originaire des Antilles, de la cTMte est de l'Amérique Centrale et de la cTMte nord-est de l'Amérique du Sud . Cependant, il a été introdu it dans le monde entier (p.ex. Asie du Sud-Est, Afrique, Océanie) en plantation ornementale. C. uvifera occupe naturellement les cordons sableux des forets littorales du bassin caribéen (Portecop & Petit Le brun, 2003). LÕarbre est réputé resistant aux embruns marins et à la sécheresse (Figure 5).

Figure 5. Coccoloba uvifera en bordure de mer sur la plage de Bois Jolan. Limite de la zone de balancement des marees (fleche)

3.3. Quelques usages de C. uvifera

Les fruits de C. uvifera sont comestibles crues ou sont utilisés pour fabriquer des produits de gelée, du vin ou du rhum (EL Little Jr. et al. 1969). La sève rouge obtenue en découpant l'écorce a été utilisée dans le commerce pour le tannage et la teinture. Le bois est utilisé comme bois de feu ou pour la fabrication du charbon de bois. Le bois rouge veiné est aussi apprécié en ébénisterie (Parrotta, 1994). En pharmacopée traditionnelle, un extrait aux propriétés astreignantes est obtenu

par décoction de feuille et d'écorce et commercialisé sous le nom de « Caribbean kino » ou « Jamaican kino ». La décoction de feuille et d'écorce est indiquée pour traiter la dysenterie (Portecop & Petit Le Brun, 2003).

C. uvifera est utilisé comme plante d'ornement dans les jardins publics en ville, en bordure des route, dans l'aménagement du littoral notamment comme brise-vent pour fixer les dunes mobiles ou pour protéger la ponte des tortues marines dans le Golfe du Mexique, aux Antilles, en Afrique et en Océanie (Moreno-Casasola & Espejel, 1986 ; Tuxbury & Salmon, 2005).

3.4. C. uvifera et ses symbiotes

C. uvifera est associé à quinze especes de sporophores ectomycorhiziens récoltés à l'échelle des Antilles (Tableau 3). Six especes sont présentes en Guadeloupe. En revanche, on ne dispose pas de données publiées sur la diversité des ECM de C. uvifera. Or, comme on l'a mentionné dans la partie introductive, il est indispensable d'explorer la diversité des ECM pour avoir une bonne image du cortège ectomycorhizien associé aux arbres.

Scleroderma bermudense , un champignon tres répandu en forêt littorale, a un effet bénéfique sur la croissance et l'adaptation des plantules de C. uvifera en situation de stress salin et hydrique (Bandou et al., 2006).

Tableau 3. Champignons ectomycorhiziens associés à C. uvifera aux Antilles

Familles	Espèces	Pays	Auteurs
Amanitaceae	Amanita cystidiosa	Anguilla, Guana (Iles vierges), Porto Rico	(Miller et al., 2000)
	Amantita antillana	Martinique, Trinidad	(Pegler, 1983)
	Amanita arenicola	Porto Rico, Guadeloupe	(Miller et al., 2000; Bandou, 2005)
	Amanita microspora	Porto Rico	(Miller et al., 2000)
Cantharellaceae	Cantharellus cinnabarinus	Martinique, Guadeloupe	(Pegler, 1983 ; Bandou, 2005)
Cortinariaceae	Inocybe littoralis	Martinique, Guadeloupe	(Pegler, 1983 ; Bandou, 2005)
	Inocybe xerophitica	Guadeloupe	(Pegler, 1983 ; Bandou, 2005)
Russulaceae	Lactarius coccolobae	Anguilla, Guana (Iles vierges), Porto Rico	(Miller et al., 2000)
	Lactarius ferrugineus	Martinique, Porto Rico	(Pegler, 1983)
	Lactarius nebulosus	Martinique, Iles Vierges, Porto-Rico	(Pegler, 1983)
	Russula cremeolilacina	Iles Vierges, Porto Rico, Guadeloupe	(Pegler,1983; Bandou, 2005)
Sclerodermataceae	Scleroderma bermudense	Proto-Rico, Guadeloupe	(Guzman et al., 2004; Bandou et al., 2006)
Xerocomoideae	Xerocomus coccolobae	Martinique	(Pegler, 1983)
	Xerocomus cuneipes	Martinique	(Pegler, 1983)
	Xerocomus guadelupae	Martinique, Dominique, Guadeloupe	(Pegler, 1983)

1. Description du site

La plage de Bois Jolan (16°14' Nord 61°23' Ouest ; altitude <1 m) est localisée environ 3 km du Chef-lieu de la commune de Saint Anne, au milieu de la côte Sud de Grande-Terre en Guadeloupe. Cette plage, située sur le littoral sableux, présente une strate herbacée et une végétation haute. On y trouve une flore diversifiée constituée d'arbres (p.ex. Thespesia populnea, C. uvifera, Hippomane mancinella, Cocos nucifera), d'arbustes (p.ex. Acacia tortuosa, Suriana maritima), d'herbacées (p.ex. Stachytarpheta jama
·censis, Stylosanthes hamata, Ricinus communis) et de plantes rampantes (p.ex. Ipomoea pes-capreae, Vigna luteola, Stenotaphrum secundatum). C. uvifera et T. populnea dominent la strate arborescente du littoral sableux. C. uvifera est la seule espèce qui possède des ECM. Sous le houppier de cet arbre, prolifère une importante régénération naturelle par semis qui pousse sur sol sableux, calcaire et pauvre en matière organique (Figure 6). Les précipitations annuelles sont comprises entre 1000 et 1250 mm. Le site est l'objet d'une forte pression anthropique. Le balayage quotidien de la plage par les employés communaux et le piétinement des plantules par les baigneurs empêchent la végétation de régénérer.

Le choix du site était justifié par l'importance des peuplements à C. uvifera (247 arbres) relativement bien préservés par endroits. Le coté Est du site est beaucoup plus préservé que le coté Ouest très anthropisé. Dans la partie préservée du site, la zone d'échantillonnage des sporophores et des ECM était située le long d'un transect nord-sud (30 m de long et 15 m de large). Les figures 7 (vue de profil) et 8 (vue de face) sont des représentations schématiques de l'allure et de la position des Coccoloba échantillonnés sur le transect dont la composition du sol est relativement homogène (sable blanc, calcaire, pauvre en matière organique). Le gradient de salinité était compris entre 15% et 2%. Chaque point est la moyenne de 5 mesures effectuées avec un salinomètre (Portable refractometer) sous le houppier de chaque arbre dans les vingt premiers cm du sol lors de l'échantillonnage des racines en période pluvieuse. Les individus (numérotés 1, 4 et 6), situés à 1-3 m au-delà de la zone de balancement des marées, sont de petites tailles (1 à 2 m de haut), rabougris et multicaules. On n'a quasiment pas observé de plantules en régénération sous le houppier de ces arbres exposés au sel (15%), aux embruns marins et au vent. En revanche, quelques mètres en aval de la zone salée, les individus (numérotés 3, 5 et 2) sont de grands arbres (6 à 10 m de haut), multicaules avec un houppier bien développé sous lequel poussent des plantules

Figure 7. Représentation schématique (vue de profil) des six arbres-mères de Coccoloba uvifera échantillonnés le long d'un gradient de salinité sur la plage de Bois Jolan.

Figure 8. Représentation schématique (vue de face) de la position des six arbres-mères de Coccoloba uvifera échantillonnés le long d'un gradient de salinité sur la plage de Bois Jolan.

2. Plan d'échantillonnage

Nous avons échantillonné six arbres-mères et leurs plantules le long du gradi ent de salinité en période pluvieuse (janvier et février 2009). Les arbres-mères ont été inventoriés et cartographiés sur le transect (Figure 7 ). Dix plantules, à peu près du même %oge avec deux cotylédons plus une feuille (Figure 6), ont été échantillonnées sous le houppier de chaque arbre-mère, à une distance de 1 m autour du tronc. Dix carottages de sol (15 cm de diamètre et 20 cm de profondeur) ont été également réalisés autour du tronc pour échantillonner des racines de chaque arbre-mère. Les échantillons ont été ensachés séparément, transportés et conservés au réfrigérateur à 4°C en laboratoire.

Parallèlement, des récoltes de sporophores ont été réalisées sous le houppier des arbres- adultes une fois par semaine pendant 7 mois (aoüt 2008 à février 2009) le long du transect. Les sporophores ont été décrits, photographiés, séchés, identifiés, dénombrés au laboratoire et mis en herbier à l'Université de Lille (Laboratoire du Pr. Régis Courtecuisse).

L'ADN total a été extrait des ECM ou d'un sporophore à l'aide du kit de purification d'ADN Dneasy de QIAGEN dans les conditions décrites par le fournisseur. L'extraction a été réalisée à partir d'une ECM ou d'un morceau de sporophore. L'extraction comprend plusieurs étapes:

- Prérégler une étuve à 65°C, y mettre les 2 flacons de solution d'élution AE;

- Broyer les échantillons à sec avec une pincée de sable de Fontainebleau à l'aide d'un piston en plastique dans un tube à microcentrifuger (2 ml);

- Ajouter 400ul de tampon de lyse (AP1) et 4 ul de RNase (100 mg/ml), broyer et vortexer vigoureusement (pour éliminer éventuellement la masse de tissu et avoir une suspension liquide) ;

- Incuber 10 min à 65°C puis faire 2 à 3 inversions des tubes. C'est l'étape de la lyse des cellules;

- Ajouter 130 ul de tampon de déprotéinisation (AP2), vortexer et incuber 5min dans la glace. C'est l'étape de la précipitation des solvants, des protéines et des polysaccharides;

- Transférer le surnageant dans une colonne de filtration QIAshredder et centrifuger 2 min à 1400 0 rpm;

- Transférer soigneusement le filtrat dans un nouveau tube eppendorf de 1,5 ml sans le culot. Noter le volume de filtrat;

- Ajouter 0,5 volume de tampon AP3 et 1 volume d'éthanol absolu. Mélanger en pipettant ; - Déposer 650 ul de mélange dans une colonne Dneasy ;

- Centrifuger 1min à 8000 rpm. Jeter le filtrat et répéter avec ce qui reste de mélange; - Placer la colonne Dneasy dans un nouveau tube;

- Ajouter 500 ul de tampon de lavage (AW), centrifuger 1min à 8000 rpm et jeter le filtrat;

- Ajouter à nouveau 500 ul de tampon de lavage (AW), centrifuger 2 min à 14000 rpm et jeter le filtrat;

- Centrifuger 30 sec à 14000 rpm la colonne à vide disposé dans un nouveau tube pour bien sécher la membrane et jeter le filtrat+tube. La colonne doit être bien sèche avant de procéder à l'élution de l'ADN;

- Ajouter 50 ul de Tampon AE préchauffé à 65°C dans la colonne. Déposer le tampon au milieu de la colonne;

- Répéter une fois les étapes 17, 18 et 19 dans un nouveau eppendorf (Ne pas faire pour les ECM); - Mélanger ou non les 2 filtrats;

Le protocole utilisé pour l'amplification de l'ITS est celui du kit PCR Master Mix PROMEGA recommandé par le fournisseur. Pour chacun des échantillons, le volume réactionnel final est de 25 ul et comprend 9,5 ul de Nuclease-Free water, 12,5 ul de PCR master Mix (cf. annexe), 1 ul de chaque amorce ITS1 (5'-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GCG-G-3') et ITS4 (5'- TCC-TCC-GCT-TAT-TGA-TAT-GC-3'), et 1 ul d'extrait d'ADN.

La réaction PCR a été effectuée dans une mini thermocycleur Applied Biosystems (GeneAmp PCR system 2700, version 2.07) dans les conditions suivantes: 95°C pendant 5 min (étape de dénaturation), 35 cycles de dénaturation à 94°C pendant 30s, 55°C pendant 30s (étape de l'hybridation), 72°C pendant 1min 30s (étape de polymérisation), et 72°C pendant 7 min (polymérisation finale). Chaque série d'amplification comprend un témoin négatif sans ADN fongique afin de détecter d'éventuels contaminants dans les tampons et réactifs.

Ë la fin de la réaction, 5 ul d'amplifiat addi tionnés à 6 ul d'un tampon de charge ont été déposés sur un gel horizontal d'agarose à 2% contenant 2 gouttes de bromure d'éthidium (BET) (0,625 mg/ml). Cinq ul de marqueur de taille moléculaire 1Kb ÇSmart LadderÈ ont été déposés dans un puit. La migration s'effectue dans une cuve d'électrophorèse Max Fill (Modèle HU10, Made in UK) contenant du tampon TAE 1x (cf. annexe) sous une tension de 90 volts pendant 1h 30 min.

Le bromure d'éthydium en s'intercalant entre les bases de l'ADN permet de visualiser l'ADN sous une lampe à UV d'une station d'imagerie (ChemiDoc BIO-RAD Laboratories, Segrate, Milan). Des photos numériques ont été prises au moyen de la caméra optique reliée à un ordinateur muni du logiciel Quantity One de BIO-RAD.

L'analyse du polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) s'effectue à partir des produits purifiés obtenus après amplification par PCR. Elle consiste en une digestion des amplifiats par des enzymes de restriction pour obtenir des profils électrophorétiques.

Pour un volume réactionnel de 20 ul, 15 ul d'amplifiat sont additionnés à 0,5 ul d'enzyme (HinfI), 2 ul d'un tampon 10 X et 2,5 ul d'eau ultrapure dans des tubes eppendorf de 1,5 ml. Le mélange réactionnel a été mis à incuber à 37° C pendant 2 h.

La totalité de la digestion, additionnée à 3 ul de bleu de charge, est déposée dans un puit d'un gel horizontal d'agarose de 3% contenant 2 gouttes de bromure d'éthidium. Un mélange d'un ul de marqueur de taille (100 pb DNA ladder PROMEGA, Madison, USA) et d'un ul de bleu PROMEGA a été déposé dans un puit. La migration des fragments de restriction dans le gel s'effectue sous une intensité de 35 mA et sous une tension de 90 volts pendant 1 heure dans une

cuve d'électrophorèse contenant du tampon TAE 1X. Après migration, les gels sont visualisés et photographiés dans les mêmes conditions que précédemment.

On a déterminé la fréquence des profils de restriction ou ribotypes (nombre de ribotypes/nombre total de ribotypes observés x 100).

Les données ont été transformées avec la fonction Arcsin vx et traitées par la procédure de l'analyse de variance à un facteur. Les moyennes ont été comparées à l'aide du test de Fisher-LSD (p<0,05) (Gagnon et al., 1989).

1. Diversite des sporophores

Au cours de la période de récolte (7 mois), nous avons identifié six espèces de champignons ectomycorhiziens : Inocybe littoralis, Inocybe xerophytica, Russula cremeolilacina, S. bermudense, Cantharellus cinnabarinus et Amanita arenicola. Les six champignons avaient déjà été répertoriés sous C. uvifera sur différentes plages en Guadeloupe (Bandou, 2005). Nous avons collecté 194 sporophores des six espèces fructifiant sous le houppier des 3 arbres sur sol peu salé (2%0) et 30 sporophores d'une espèce (S. bermudense) sous le houppier des 3 arbres en milieu salé (15%0) sur le transect. Parmi les 194 sporophores récoltés, on a trouvé 27 I. littoralis, 28 I. xerophytica, 32 R. cremeolilacina, 19 S. bermudense, 51 C. cinnabarinus et 37 A. arenicola. C. cinnabarinus appara»t le plus abondant et S. bermudense le moins représenté en milieu non salé (Figures 9A, 9B et 10). Par contre, on a trouvé que des sporophores de S. bermudense sous le houppier des 3 arbres poussant en milieu salé.

Figure 9. (A) Sporophores de Scleroderma bermudense matures ouvertes en &toile liberant la sporee (*) et immatures fermees (+). (B) Sporophores de Cantharellus cinnabarinus.

Les sporophores étaient inégalement distribués le long du gradient de salinité. S. bermudense serait plus tolérant au sel que les cinq autres espèces. L'aptitude de ce champignon à résister au sel a été démontrée en particulier lorsqu'il est en symbiose avec C. uvifera (Bandou et al., 2006). La faible diversité des sporophores sous C. uvifera pourrait s'expliquer en partie par les conditions stressantes du milieu. En effet, le spectre des champignons colonisant C. uvifera est plus étroit que celui de C. pubescens et C. swartzi, deux espèces de Coccoloba distribuées à l'intérieur des terres en Martinique (Bessard et al., 2008).

Figure 10. Nombre de sporophores récoltés sous Coccoloba uvifera pendant 7 mois en milieu peu salé.

2. Diversité des morphotypes

Afin de déterminer la diversité des ECM, nous avons inventorié les MT ectomycorhiziens sur les racines des six arbres-mères et de leurs plantules le long du gradient de salinité. L'inventaire avait porté sur 3537 et 5366 apex racinaires examinés respectivement sur des arbres-mères et des plantules et en milieu peu salé. En milieu salé, l'inventaire avait porté sur 2668 apex racinaires examinés sur trois arbres vu qu'il n'y avait pas de plantules.

Sur 3537 apex racinaires d'arbres-mères en milieu peu salé, 57% ont été mycorhizés alors que chez les plantules, le taux de mycorhization était à peu près le même pour 5366 apex comptés. Au total, 9 MT ( mcgs, bcc, bff, bcf, jpf, bp, bfp, jpp et bbl), répertoriés sur la base de quelques caractères macroscopiques et microscopiques, étaient différents par la texture et la couleur du manteau, la présence d'anses d'anastomose, de cordons mycéliens et de sclérotes (Tableau 4; Figure 11). Sur les 9 MT répertoriés, 3 (bcc, bfp et jpp) ont été présents sur les plantules et les 6 autres (mcgs, bff, bcf, jpf, bp et bbl) ont été communs aux arbres-mères et plantules (Figure 12). Globalement, la fréquence des MT communs a été à peu près la même sur les arbres -mères et leurs plantules (Figure 12). Elle a été supérieure à celle des 3 MT présents uniquement sur les plantules. Les arbres-mères et leurs plantules partagent un cortège ectomycorhizien commun. Ces résultats suggèrent l'existence de réseaux ectomycorhiziens potentiels entre arbres-mères et plantules.

Tableau 4. Description des neuf morphotypes ectomycorhiziens sur quelques caractères macroscopiques et microscopiques.

Figure 11. Morphotypes des arbres-mères et de leurs plantules en milieu peu salé. (a), bff ; (b), bcf ; (c), bfp; (d), bbl; (e), bp; (f), bcc; (g), mcgs; (h), jp ; (i) jpp (voir tableau 4 pour les abréviations).

Figure 12. Fréquence des morphotypes des arbres -mères et leurs plantules en milieu peu salé. Les valeurs assorties d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5%.

En milieu salé, on n'a pas observé de plantules au pied des arbres. Ceci suggère que les plantules seraient sensibles au sel. Seuls trois MT (bff, bbl et mgcs) ont été présents le long du gradient de salinité, ce qui laisse penser que les champignons impliqués seraient tolérants au sel (Figures 12 et 13). Comme pour les sporophores, la diversité des MT est affectée par le sel.

Le nombre de sporophores et de MT n'étaient pas le même. On a trouvé moins de sporophores que de MT le long du transect. De plus, il n'a pas été possible d'identifier les MT et de les relier au mycélium de la base des sporophores. Compte tenu des limites du morphotypage des ECM, l'utilisation d'outils moléculaires nous a paru nécessaire pour caractériser les sporophores et les MT (Diédhiou et al., 2004 ; Diédhiou et al., 2009).

3. Caractérisation moléculaire des MT et des sporophores

L'utilisation d'outils moléculaires (PCR -RFLP et séquencage) s'était avérée indispensable pour relier, d'une part les MT aux sporophores, et, d'autre part, identifier les sporophores aux MT.

Ë partir de 170 échantillons d'ECM collectées au niveau des arbres-mères et de leurs plantules le long du transect, l'amplification de l'ITS n'a été possible que pour 145 d'entre eux. Les tailles des régions ITS amplifiées sont comprises entre 600 et 1183 pb et s'avèrent peu variables pour discriminer les champignons (Figure 14).

Figure 14. Produits de l'amplification par PCR de la région ITS de l'ADNr de morphotypes. Puits: 1, 4 et 9= bcf ; 2 et 8= bff; 3= bbl ; 5= bcc; 6= pas d'amplifiat ; 7= bp; 10= témoin négatif; Mq, marqueur de poids moléculaire (1kb).

Parmi les enzymes de restriction préalablement testées (TaqI, HaeIII et HinfI), l'enzyme Hinf I a été retenue parce qu'elle a généré plus de bandes de restriction (résultats non montrés). La digestion des amplifiats des différents MT par HinfI a généré entre un et trois fragments de restriction de tailles différentes (Figure 15). On a ainsi caractérisé 6 ribotypes (A, B, C, D, E et F) pour 9 MT décrits (Tableau 5). La diversité des MT ne correspond donc pas à celle des ribotypes.

Parmi les 6 ribotypes, 4 (A, B, C et D) ont présenté des profils RFLP identiques aux 4 espèces de sporophores récoltées. Les ribotypes A, B, C et D correspondent respectivement à S. bermudense, R. cremeolilacina, C. cinnabarinus et I. xerophytica. L'identification moléculaire, basée sur la comparaison des profils RFLP, a été confirmée par le séquençage de l'ITS des mêmes échantillons. Par contre, les ribotypes E et F n'ont pas été reliés aux sporophores. Ces deux ribotypes ont été, cependant, identifiés à deux espèces de Tomentella par séquençage de l'ITS. Ce résultat n'est pas surprenant car on sait par ailleurs que les Tomentella fructifient rarement (Diédhiou et al., 2004). On n'a pas trouvé de MT correspondant aux champignons I. littoralis et A. arenicola dont les sporophores ont été pourtant récoltés le long du gradient. Il est possible que ces deux champignons aient formé très peu d'ECM. Il existe en effet des champignons comme Suillus qui fructifient abondamment mais forment très peu d'ECM (Smith & Read, 2008).

Figure 15. Produits de digestion par HinfI de la région ITS de l'ADNr des morphotypes. Puits : 1, 2, 3, 5 et 10= ribotype E ; 4 et 9= ribotype F ; 6= ribotype A ; 7 et 8= ribotype D ; Mq, marqueur de poids moléculaire (100 pb).

Il appara»t que les MT bcc, bp et bcf correspondent à un mélange de ribotypes. Par exemple, le MT bp est un mélange de 4 ribotypes. Ë l'inverse, un même ribotype peut correspondre à des MT différents. C'est le cas notamment du ribotype B trouvé chez 4 MT (bcc, mgcs, jpf et bp). En revanche, les MT bbl et jpp ont été, dans tous les cas, rattachés respectivement au ribotype A de S. bermudense et au ribotype C de C. cinnabarinus. Cette étude montre les limites du morphotypage pour identifier sans ambigu
·té la composante fongique des ECM et pour évaluer la fréquence des champignons observés sur les racines. Il est en effet bien connu que la couleur du manteau fongique peut changer en fonction de l'âge des MT, de la plante hTMte et de l'environnement (Diédhiou et al., 2004 ; Pestana Nieto & Santolamazza Carbone, 2009 ; Diédhiou et al., 2009). Le cas des

Tomentella est bien documenté à ce propos. Ces champ ignons ont la particularité de former des MT brun clair qui deviennent brun foncé au cours du vieillissement des racines de la plante hôte (B%o et al., 1991 ; Diédhiou et al., 2004).

Tableau 5. Polymorphisme de longueur des fragments de restriction de la région ITS (digestion par HinfI) des sporophores et des morphotypes ectomycorhiziens d'arbres-mères et de plantules de Coccoloba uvifera. (*) E= Tomentella sp2 ; F= Tomentella sp1.

Morphotype/ Sporophore	Taille de l'I TS (pb)	Taille des fragments de restriction de l'ITS (pb)	Ribotype
bbl	689	100, 270, 311	A
bcc	689	100, 270, 311	A
bcc	718	313, 392	B
bcc	738	346, 392	D
mcgs	718	315, 392	B
jpf	718	315, 392	B
jpp	1183	217, 433, 533	C
bp	689	100, 270, 311	A
bp	718	315, 392	B
bp	738	346, 392	D
bp	633	346	E*
bcf	633	346	E
bcf	655	165, 211, 308	F*
bfp	633	346	E
bff	655	165, 211, 308	F
S. bermudense	689	100, 270, 311	A
R. cremeolilacina	718	313, 392	B
C. cinnabarinus	1183	217, 433, 533	C
I. xerophytica	738	346, 392	D
I. littoralis	700	300, 400	G
A. arenicola	600	300	H

Le calcul de la fréquence des MT (Figures 12 et 13) reste approximatif pour certains MT (bcc, bp et bcf) constitués dÕun mélange de ribotypes. CÕest pourquoi il nous a paru intéressant dÕévaluer la fréquence de 6 ribotypes (Figure 16 et 17) pour avoir une estimation plus précise des différents champignons sur les racines. Les fréquences des ribotypes A, E et F sont globalement supérieures à celles des ribotypes B, C et D quel que soit le stade de développement de Coccoloba (Figure 16). Ces résultats sont en accord avec les fréquences des MT (Figure 13). S. bermudense, Tomentella sp1 et Tomentella sp2 sont majoritairement presents sur les racines des arbres-mères et leurs plantules en milieu peu salé. Ces trois champignons pourraient constituer des réseaux ectomycorhiziens potentiels reliant les arbres-mères et leurs plantules.

Figure 16. Frequence des six ribotypes (F, E, A, B, D et C) des arbres-meres et de leurs plantules en milieu peu sale.

En milieu sale, il y a moins de ribotypes quÕen milieu peu sale. Le ribotype A, rattaché à S. bermudense, a été plus frequent que les ribotypes F et B rattachés respectivement à Tomentella sp1 et R. cremeolilacina (Figure 17). On a vu aussi que parmi les 3 ribotypes, seul S. bermudense avait fructifié en milieu sale. Le cycle de reproduction sexuée de ce champignon serait adapté à la salinité.

Figure 17. Fréquence de trois ribotypes (A, B et F) des arbres en milieu salé.

Nous avons confirmé, au moins au niveau du genre, l'identification morphologique des sporophores et identifié la composante fongique des MT par le séquençage des régions ITS de l'ADNr nucléaire (Figure 18). L'analyse des séquences de l'ITS nous a permis aussi de confirmer l'analyse RFLP et de relier des MT aux sporophores. Sur l'arbre phylogénétique, on a distingué 8 groupes fongiques: C. cinnab arinus, A. arenicola, I. xerophytica, I. littoralis, S. bermudense, R. cremeolilacina, Tomentella sp1 et Tomentella sp2. Parmi les huit groupes, deux (A. arenicola et I. littoralis) ne présentent pas de MT, quatre (C. cinnabarinus, I. xerophytica, S. bermudense et R. cremeolilacina) sont reliés à des MT, et deux (Tomentella sp1 et Tomentella sp2) ne présentent pas de sporophores. Il y a une forte homologie entre les séquences de chaque groupe phylogénétique. Par exemple, les séquences des MT (AM100, P131, P118 et P81) montrent une forte homologie (100%) avec la séquence du sporophore (C19) de S. bermudense (Figure 18). Tout compte fait, la diversité des sporophores ne reflète pas la diversité des MT comme c'est le cas dans la plupart des régions tropicales (Rivière et al., 2007 ; Sanon et al., 2009 ; Diédhiou et al., 2009). La composition physico-chimique du sol étant relativement homogène le long du gradient, il est fort probable que la salinité participe en partie à la structuration des communautés de champignons ectomycorhiziens de C. uvifera. En effet, sur 8 groupes de champignons inventoriés, seules 3 espèces (S. bermudense, Tomentella sp1 et R. cremelilacina) ont été présentes à proximité du bord de mer et pourraient contribuer à l'adaptation de Coccoloba à la salinité. Yamato et al. (2008) ont montré à cet égard le rTMle important des MA dans la structuration des herbacées et des plantes rampantes en bordure de mer.

Figure 18. Arbre phylogénétique basé sur le séquencage de l'ITS des huit taxons fongiques (I à VIII surlignés en jaune) de C. uvifera, comparé à des séquences de référence dans GenBank (en noir). Les valeurs de Ç bootstrap È sont indiquées au niveau des branches.

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES

Ce travail a permis de révéler un gradient de salinité sur la plage de Bois Jolan, qui semble avoir un impact négatif sur la croissance de C. uvifera. Ë proximité de l'eau de mer, les arbres sont de petites tailles et rabougris alors que les arbres éloignés sont de plus grandes tailles avec un houppier bien développé sous lequel prolifere une importante régénération à partir de semis.

On a également noté une diversité de champignons ectomycorhiziens inféodés à C. uvifera le long du gradient de salinité. Cette diversité de champignons semble structurée par la salinité. En effet, 6 especes de sporophores (A. arenicola, I. littoralis, C. cinnabarinus, I. xerophytica, S. bermudense et R. cremeolilacina) ont été identifiés en milieu peu salé et seulement une espece (S. bermudense) en milieu salé. De même, neuf MT ont été répertoriés en milieu peu salé dont trois en milieu salé. L'étude de la diversité génétique des champignons à l'aide d'outils moléculaires (PCR- RFLP et séquençage de l'ITS) a permis de relier des sporophores aux MT et de montrer que des arbres-meres et leurs plantules partagent un meme cortège ectomycorhizien commun. Quatre sporophores (C. cinnabarinus, I. xerophytica, S. bermudense et R. cremeolilacina) ont été reliés à des MT, 2 sporophores (A. arenicola et I. littoralis) sont absents des racines de C. uvifera et 2 MT identifiés (Tomentella sp1 et Tomentella sp2) ne génerent pas de sporophores. La diversité des sporophores ne reflete donc pas celle des MT. Notre étude montre qu'il convient d'inventorier systématiquement les sporophores et les ECM pour avoir une bonne image de la diversité des champignons ectomycorhiziens de C. uvifera.

Les arbres-meres et leurs plantules ont en commun trois champignons ectomycorhiziens (S. bermudense, Tomentella sp1 et Tomentella sp2) majoritairement présents sur les racines échantillonnées le long du gradient de salinité. Ces trois champignons constituent des réseaux ectomycorhiziens potentiels reliant les arbres-meres et leurs plantules en milieu peu salé. Une hypothese que nous devrons démontrer est que certains champignons ectomycorhiziens permettraient aux arbres-meres « d'élever » leurs plantules en leur fournissant de l'eau et des nutriments (C en particulier) par le biais des réseaux ectomycorhiziens communs. De plus, ces réseaux fourniraient de l'inoculum nécessaire à l'établissement et à la survie des plantules. On pourrait considérer la forêt littorale à C. uvifera comme une « nursery » oti les plantules profiteraient des arbres-meres via les réseaux ectomycorhiziens commus.

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ANNEXES

Composition: 100 mM Tris HCl (pH 7,5 à 8); 1,4 M NaCl ; 20 mM Na₂EDTA ; 2 % CTAB. Pour 100 ml :

- Dissoudre 2 g de CTAB dans 50 ml d'eau ultrapure en mélangeant et en chauffant légèrement (45 à 50°C) si besoin pour faciliter la dissolution)

Ajuster le pH entre 7,5 et 8,0 avec HCl 37 % (environ 50 ml). Ajuster le volume à 1 l avec H O ultrapure et stériliser à l'autoclave.

Ajouter des pastilles de NaOH (environ 15) jusqu'à ce que la solution devienne transparente. Ajuster le pH à 8,0 avec NaOH 10 N.

Faire chauffer l'agarose dans le tampon TAE 1X à la micro-onde pour le dissoudre, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de BET de 0,624mg/ml (préparation solution BET: 312 jsl de solution-mere de BET à 10mg/ml sont ajoutés à 4688 jsl d'eau déminéralisée).

Faire chauffer l'agarose dans le tampon TAE 1X à la micro-onde pour le dissoudre, puis ajouter 1 ou 2 gouttes de BET de 0,624mg/ml (préparation solution BET: 312jsl de solution-mere de BET à 10mg/ml sont ajoutés à 4688 jsl d'eau déminéralisée).

Ajuster avec de l'eau jusqu'à 500ml. Le pH est ajusté à 8 avec des cristaux de soude NaOH, puis la solution est filtrée (0.2jsm) et stérilisée 20 min à 120°C.

Pour avoir une solution de 2,5 mM de dNTP pour la rection de PCR, il faut: 50ul de solution mere de dNTP dans 150ul d'eau ultrapure stérile

Pour avoir une solution de 20 pmoles/ul de ITS1 ou ITS4 pour la réaction PCR, il faut: 10ul de ITS1 ou ITS4 de solution mere dans 140ul d'eau ultrapure stérile.

Mettre une étiquette oü figure le nom de l'amorce, sa concentration et la date.

*Produits*	*Volume/ tube*	*Volume pour É.. tubes*
Nuclease Free-water	9,5ul
PCR master mix	12,5 ul
ITS1	1 ul
ITS4	1 ul
ADN total (extrait)	1 ul
Volume final	25 JAl

*Produits*	*Volume/ tube*	*Volume pour É.. tubes*
Enzyme (Hinf I)	0,5ul (10 unités/ul)
Tampon B	2 ul
Eau ultra-pure	2,3 ul
BSA	0,2 ul
Amplifiat d'ADN	15 ul
Volume final	20 JAl

Résumé

La diversite morphologique et genetique des champignons ectomycorhiziens et des ectomycorhizes de Coccoloba uvifera a ete etudiee le long dÕun gradient de salinite (15ä -2ä) sur la plage de Bois Jolan en Guadeloupe. Ë proximite de lÕeau de mer, les arbres sont de petites tailles et rabougris alors que les arbres eloignes sont de plus grandes tailles avec un houppier bien developpe sous lequel proliferent des plantules issues de graines. Six especes de sporophores (Amanita arenicola, Inocybe littoralis, Inocybe xerophytica Cantharellus cinnabarinus, Scleroderma bermudense et Russula cremeolilacina) ont ete repertoriees en milieu peu sale et seulement une espece (S. bermudense) en milieu sale. De meme, neuf morphotypes ectomycorhiziens (MT), correspondant à six ribotypes, ont ete repertories en milieu peu salé dont trois en milieu sale. Le polymorphisme de longueur des fragments de restriction et le sequencage de la region ITS de lÕADNr nucléaire ont permis de relier des sporophores aux MT et de montrer que des arbres -meres et leurs plantules ont partage un cortège ectomycorhizien commun. Quatre sporophores (C. cinnabarinus, I. xerophytica, S. bermudense et R. cremeolilacina ) ont ete relies à des MT, deux sporophores (A. arenicola et I. littoralis) etaient absents des racines de C. uvifera et deux MT identifiés (Tomentella sp1 et Tomentella sp2) nÕont pas genére de sporophores. Les arbres -meres et leurs plantules ont eu en commun trois champignons (S. bermudense, Tomentella sp1 et Tomentella sp2) presents en majorite sur leurs racines. Les résultats de cette etude ont montre que (i) la salinite a affecte la diversite des champignons ectomycorhiziens (ii) les sporophores ont ete de mauvais indicateurs de diversite (iii) des reseaux ectomycorhiziens potentiels pourraient relier les arbres -meres et leurs plantules.

Mots clés : Arbres-meres, Plantules, PCR-RFLP, Sequencage, ITS, Reseaux mycorhiziens communs

Abstract :

The morphological and molecular diversity of ectomycorrhizal fungi and ectomycorrhizae on Coccoloba uvifera were studied along a salinity gradient ranged from 15%o to 2ä at Bois JolanÕs Beach in Guadeloupe. Only mature trees with an abundant seedling recruitement were well developed within areas far from the sea. Six sporocarps (Amanita arenicola, Inocybe littoralis, Inocybe xerophytica, Cantharellus cinnabarinus, Scleroderma bermudense and Russula cremeolilacina) were collected within the low salinity levels, whereas one (S. bermudense) was collected where the salinity levels were high. Similarly, nine morphotypes (MT) of fungi, corresponding to six ribotypes, were sorted in low salinity levels and only three of them in high salinity levels. The restriction fragment length polymorphism and sequencing of the nuclear rDNA ITS region allowed identification of mycobionts in MT by corresponding sporocarp RFLP patterns and sequences. We determined four matched sporocarps (C. cinnabarinus, I. xerophytica, S. bermudense and R. cremeolilacina) with MT, two unmatched sporocarps (A. arenicola and I. littoralis) and two identified MT (Tomentella sp1 et Tomentella sp2) without corresponding sporocarp. Mature trees and seedlings of C. uvifera shared common mycorrhizal networks (CMN) with three fungi (S. bermudense, Tomentella sp1 and Tomentella sp2). The results of this study showed that (i) the salinity decreased the fungal diversity, (ii) the sporocar ps were a bad indicator for fungal diversity, (iii) there was a potential for the formation of CMN between mature trees and seedlings.

Key words : Mature trees, Seedlings, PCR-RFLP, Sequencing, ITS, Common mycorrhizal networks