à‰tude comparative de l'hémoglobine glyquée et du glucose sanguin chez les hyperglycémies diabétiques

RÉPUBLIQUE DU BÉNIN


MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPÉRIEUR ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITÉ D'ABOMEY-CALAVI

ECOLE POLYTECHNIQUE D'ABOMEY-CALAVI


DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)
Option : Analyses Biontecical~s

POUR L'OBTENTION DU

DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE

ETUDE COMPARATIVE DE L'HEMOGLOBINE GLYQUEE
ET DU GLUCOSE SANGUIN DANS LES
HYPERGLYCEMIES DIABETIQUES

Présenté et Soutenu par : Faoziath C. BAKARY & Parfait M. DOFFON

Tuteur de stage : Superviseur :

M. KASSEHIN C. Urbain Pr LOKO S. Frédéric

Ingénieur biologiste des hôpitaux. Pharmacien Biologiste

Maître de conférences

Aititeie/ Acadeirnique/ 2008 -2009
2ème Promotion

REPUBLIQUE DU BENIN
&&&&&&

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE (MESRS)

&&&&&&
UNIVERSITE D'ABOMEY CALAVI (UAC)
&&&&&&
ECOLE POLYTECHNIQUE D'ABOMEY CALAVI (EPAC)

DIRECTEUR : Pr Marc KPODEKON

DIRECTEUR ADJOINT : Dr Daton MEDENOU

CHEF DU DEPARTEMENT : Dr Hospice SECLONDE

LISTE DES ENSEIGNANTS DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE (GBH)
Option : Analyses Biomédicales

A- Enseignants permanents

Nom et prénoms	Matières
AHOYO T. Angèle	Microbiologie Générale
ANAGONOU Sylvère	Education Physique et Sportive
ATCHADE Pascal	Parasitologie
AVLESSI Félicien	Chimies Générales et Chimies Organiques
DOSSOU Cyriaque	Technique d'Expression et Méthode de Communication
HOUNSOSSOU Hubert	Biométrie
LOKO S. Frédéric	Biochimie Clinique et Générale
LOZES Evelyne	Immunologie Générale et Immuno- Hématologie
SECLONDE Hospice	Immunologie et Transfusion Sanguine
SEGBO Julien	Biologie Moléculaire
SOCLO Henri	Chimie Organique
SOUMANOU Mohamed	Biochimie Générale
TOPANOU Adolphe	Hématologie, Hémostase et Pharmacologie
YANDJOU Gabriel	Technique d'Expression et Méthode de Communication
YOVO S.P. Kokou	Toxicologie, Pharmacologie et Physiologie
BANKOLE Honoré	Microbiologie Générale et Bactériologie Appliquée

B- Liste des enseignants vacataires

Nom et prénoms	Matières
ADISSODA Cyrille	Anglais
ADOMOU Alain	Physiques
AKOGBETO Martin	Entomologie Médicale
BINAZON Claude. César	Soins Infirmiers
DAN Sadeler	Education Physique et Sportive
DARBOUX Raphaël	Histologie
DOSSEVI Lordson	Techniques Instrumentales et Anatomie Physiologie
FOURN Léonard	Santé Publique
HOUNON Hyppolite	Mathématiques
AGBANGLA Clément	Génétique Moléculaire
AMETONOU François	Technique d'Expression et Méthode de Communication
MONNOTE Edmond	Informatique
DEDICACES

Dédicaces

+ Au Seigneur,

Pour ses innombrables bienfaits !

+ A mon père Clément DOFFON

Dont la bravoure, la persévérance, la patience et l'amour ont su planter en moi l'arbre dont l'un des fruits est le présent travail !

+ A ma mère Justine DOFFON née HOUSSA GANSI

Pour ses immenses qualités de mère et son souci permanent de la réussite de ses enfants.


·. A ma grande soeur Léonie L.

Aimante, dévouée et attentive à la moindre difficulté, tu as su me donner l'élan dont j'ai besoin. Puisse l'Eternel te combler de toutes ses grâces.

+ A mes frères et soeurs, Puissiez-vous continuer l'oeuvre entamée par votre grand frère

+ A tous mes amis.

+ A tous les Scientifiques qui oeuvrent pour la santé humaine, la sécurité alimentaire et le bien- être social.

Merci à tous.

DOFFON Parfait M.

Dédicaces


·
· Au Tout Puissant qui a su guider nos pas

+ A mes parents chéris : Toujours soucieux de l'avenir de vos enfants, vous n'avez ménagé aucun effort pour nous voir réussir

· . A WaidiSabiratou

Tu as su me donner toute l'affection et l'attention dont un enfant a besoin. Reçois ce travail en signe de reconnaissance.

Puisse l'Eternel t'accorder la santé, la joie et la grâce de jouir du fruit de tes efforts

+ A BAKARY Gafarou

Tu m'as enseigné la rigueur et la persévérance dans le travail. Ce travail est le tien. Puisse l'Eternel t'accorder ses grâces pour que pendant longtemps, tu nous vois réussir.

+ A FRAICETTE ; FRANCK et BERNADETTE

Je n'aurais pu espérer de meilleurs compagnons de route que vous.

· . A mon frère et à ma soeur

J'espère vous avoir montré le bon exemple.

+ A mes oncles et tantes, sincères remerciements

FoaziathAnaïce A. C.BAKARY

REMERCIEMENTS


·
· Au professeur Frédéric LOKO, qui malgré ces multiples préoccupations n'a ménagé aucun effort pour nous encadrer. Daigner recevoir l'expression de nos sentiments déférents.


·
· Au Docteur Hospice SECLONDE, sincères remerciements pour avoir contribuer à la réussite de notre stage. Votre rigueur, vos conseils, votre sérieux au travail ont été d'un grand concours pour ce travail. Recevez ici notre profonde gratitude.


·. A Monsieur KASSEHIN Urbain, vous avez contribué de par vos apports et conseils à la réalisation de ce travail. Profonde gratitude.


·
· Au personnel de la Clinique Polyvalente MAHOUNA, nous resterons longtemps touchés par la chaleur de votre accueil, votre efficacité et votre sens du travail bien fait.


·
· Au Professeur André BIGOT pour l'accueil chaleureux qu'il nous a offert et d'avoir laissé à notre disposition son service, le laboratoire de la Clinique Polyvalente MAHOUNA, nos sincères remerciements.

Enfin nous remercions :

.. Tous les enseignants du département de Génie de la Biologie Humaine et les autorités de l'EPAC. Vous nous avez donné une formation soutenue riche en savoir, savoir faire et en savoir être. Que ce travail soit pour nous l'élément propulseur qui nous permet de suivre vos traces.

Hommages

A tous nos professeurs de l'EPAC (Ecole Polytechnique d'Abomey Calavi) En reconnaissance de la qualité de vos enseignements, recevez ici l'expression de nos profondes gratitudes.

Au président du jury :

Nous sommes très honorés que vous acceptiez de présider notre jury. Vos recommandations seront effectivement prises en compte.

Déférentes considérations

Aux honorables membres du jury

C'est un insigne honneur que vous nous faites en acceptant de juger ce travail. Vos apports nous aideront à en améliorer la qualité.

Hommages respectueux

Liste des abréviations

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

HbA1c: Hémoglobine glyquée

DCCT: Diabetes Control and Complications Trial

UKPDS: United Kingdom Prospective Diabetes Study

CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance

CLBP : Chromatographie Liquide Basse Pression

HbF : Hémoglobine Foetale

CNAMTS : Caisse Nationale de l'Assurance Maladie des Travailleurs Salariés.

AC : Anticorps

ELISA : Enzyme Linkage Immuno Sorbent Assay

Liste des figures

Figure 1:Réaction de glycosylation non enzymatique des protéines ;

Figure 2 : Méthode d'inhibition de l'agglutination sur latex ;

Figure 3 : Diagramme représentant la répartition selon les tranches d'âge des patients diabétiques représentant notre cohorte ;

Figure 4: Présentation DCA Vantage Analyzer ;

Figure 5:Kit de réactifs de l'hémoglobine A1c DCA Systems ou DCA 2000® ;

Figure 6 : Cartouche de réactif.

Liste des tableaux

Tableau I : Principales fractions de l'hémoglobine et principaux termes utilisés caractérisant l'hémoglobine glyquée.

Tableau II : Valeurs moyennes de la glycémie des patients diabétiques de notre population d'étude.

Tableau III : Valeurs moyennes des taux d'hémoglobine glyquée des patients diabétiques de notre population d'étude.

Tableau IV : Corrélation entre la glycémie et le taux d'hémoglobine glyquée des patients diabétiques de notre cohorte.

Tableau V : Répartition selon le sexe des hyperglycémies diabétiques ayant fait l'objet de notre étude.

Sommaire

Introduction . 24

I- Généralités . 27

II- Cadre, matériel et méthode d'étude 40

III- Résultats etDiscussion 52

Conclusion et Suggestions.. 58

Références bibliographiques.. .61

Annexe . 67

INTRODUCTION

La maladie diabétique est définie comme étant un état permanent ou quasi permanent d'hyperglycémie liée à une insuffisance de sécrétion et/ou d'action de l'insuline. L'insuline est une hormone pancréatique aux nombreux effets métaboliques, destinée notamment à moduler l'utilisation et la mise en réserve du glucose apporté par l'alimentation [1]. Cette augmentation prolongée et permanente de la glycémie est à l'origine d'un grand nombre de complications, concernant différents organes (oeil, coeur, peau, etc.). L'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a estimé à plus de 1,125 millions les cas de décès liés au diabète sucré en 2005 [2] et prévoit que la prévalence du diabète sucré va doubler dans les vingt ans à venir, passant de 150 millions actuellement à près de 300 millions de cas à l'horizon 2025 [3]. Il s'agit là d'un sérieux problème de santé publique.

La surveillance biologique du diabète est un élément essentiel dans la prise en charge médicale d'un patient diabétique. La mesure de l'hémoglobine glyquée, et plus spécifiquement de l'hémoglobine glycosylée (HbA1_c), est devenue pratique courante dans le suivi du patient diabétique et une aide à l'ajustement de son traitement. Le bilan biologique spécifique du diabète a donc pour objectif de vérifier le bon contrôle glycémique du diabète, qui peut être apprécié à l'aide de différents paramètres. Différents tests biochimiques pourront être mis en oeuvre pour effectuer un diagnostic et un dépistage précoce du diabète, mais aussi pour surveiller celui-ci : la glycémie, l'épreuve d'hyperglycémie provoquée, la recherche des corps cétoniques urinaires, l'hémoglobine glyquée ou hémoglobine glycosylée (l'HbA1c).Cette dernière est le témoin de la moyenne des glycémies, minute après minute, jour après jour, sur une période de deux mois. [4] Des études ont démontré que les valeurs cliniques obtenues par le dosage régulier de l'HbA1_c permettent d'adapter le traitement du diabète et d'améliorer le contrôle du métabolisme. [5,6]. La détermination de l'hémoglobine

glyquée est pratiquée dans peu de laboratoire sur le plan national. Ceci est ^düprobablement au coût de cet examen largement au-dessus des moyens de nos

populations au pouvoir d'achat effondré. Cette situation nous a suggéré comme
alternative de voir si la détermination de la glycémie isolée pourrait être suffisante
pour une surveillance thérapeutique du diabétique. Notre hypothèse est qu'on pourrait

définir une bonne corrélation entre la glycémie et les taux d'hémoglobine chez ces patients. Si cette hypothèse est vérifiée, nous pourrions définir les conditions d'une extrapolation de la glycémie au taux d'hémoglobine glyquée. C'est dans cette optique que nous avons entrepris d'effectuer une étude comparative de l'hémoglobine glyquée et de la glycémie à travers notre travail qui s'intitule : étude comparative de l'hémoglobine glyquée et du glucose sanguin dans les hyperglycémies diabétiques.

Les objectifs assignés à ce travail sont : Objectif général


· Faire l'étude comparative de l'hémoglobine glyquée et du glucose sanguin dans les hyperglycémies diabétiques.

Objectifs spécifiques

> Déterminer le sexe et les tranches d'âge les plus exposés au diabète.

> Evaluer la corrélation entre la glycémie et le taux d'HbA1c dans notre échantillon d'étude ;

Ce travail est structuré en quatre parties. Après avoir abordé les généralités dans la première partie, nous décrirons le cadre d'étude, le matériel et la méthode d'étude dans la deuxième partie. Dans la troisième, nous présenterons les résultats et la discussion. Enfin, nous terminerons par une conclusion assujettie de nos suggestions.

I- GENERALITES

1-Données générales sur le diabète

1-1- Le glucose

Parmi les composés naturels que leur saveur particulière avait groupé sous le nom de sucre, il en est un, le glucose, qui intéresse en premier lieu médecins et biologistes. Il peut être considéré en effet comme le sucre physiologique par excellence. Universellement répandu dans la nature, c'est surtout celui que l'on rencontre notamment dans le sang de l'homme et des vertébrés. C'est celui qui, en dernière analyse constitue la source principale de l'énergie musculaire. Des troubles de son métabolisme peuvent être à l'origine d'affections graves parfois fatales telles que le diabète.

1-2- Définition du diabète

Le diabète sucré se définit par une élévation anormale et chronique de la glycémie. Le diabète est une maladie chronique qui apparaît quand le pancréas ne sécrète pas assez d'insuline ou quand l'organisme utilise mal l'insuline qu'il produit. L'insuline est une hormone qui régule la concentration du sucre dans le sang. L'hyperglycémie, soit une trop grande concentration du sucre dans le sang, est un effet courant du diabète qui, avec le temps, provoque de graves lésions affectant de nombreuses parties du corps.

1-3- Différents types de diabètes

Plusieurs mécanismes physiopathologiques distincts peuvent aboutir au syndrome biologique commun à tous les types de diabète sucré : l'hyperglycémie. Ce sont ces entités physiopathologiques qui permettent de définir le type de diabète. Selon l'OMS il existe quatre formes de diabètes [7].

· Le diabète de type 1 ;

· Le diabète de type 2 ;

· Autres diabètes spécifiques (diabètes « secondaires ») ;

· Le diabète gestationnel.

1-3-1- Le diabète de type 1 (ou diabète insulinodépendant) :

Défini par une disparition profonde ou totale de l'insulinosécrétion endogène pancréatique d'origine auto-immune, il nécessite un traitement substitutif définitif par apport d'insuline exogène (insulinothérapie).

1-3-2- Le diabète de type 2 :

Il se caractérise par une insulinorésistance hépatique et périphérique, associée à une insulinopénie relative et progressive. La persistance d'une insulinosécrétion endogène a conduit à appeler ce diabète « non insulinodépendant » car l'insulinothérapie n'est pas indispensable à la survie du patient. Elle peut cependant faire partie intégrante du traitement dans diverses situations intercurrentes et après un certain temps d'évolution.

1-3-3- Les diabètes secondaires :

Résultant d'une pathologie ou d'un traitement associé directement, responsable de l'hyperglycémie, ils sont majoritairement liés à l'existence de :

· Pancréatopathies : pancréatites, néoplasies, mucoviscidose, hémochromatose, exérèse chirurgicale.

· Endocrinopathies responsables d'une hypersécrétion d'hormone hyperglycémiante (cortisol, hormone de croissance, glucagon, hormones thyroïdiennes, phéochromocytome).

· Causes iatrogènes : corticoïdes, interférons, antirétroviraux

· Ils sont liés à des défauts génétiques de la fonction des cellules bêta pancréatiques. (Ex. : mutation du gène de la glucokinase) et surviennent généralement durant l'adolescence ou chez l'adulte jeune.

1-3-4- Le diabète gestationnel :

Trouble de la tolérance glucidique, de sévérité variable, débutant ou diagnostiqué pendant la grossesse quel que soit le traitement et l'évolution dans le postpartum.

2- Historique du dosage de l'hémoglobine glyquée.

L'histoire de l'HbA1_cremonte à la fin des années 60 [8]. On a en effet mis en évidence, à cette époque, une hétérogénéité structurale insoupçonnée de l'hémoglobine humaine, due à la fixation de résidus glucidiques simples.

Différentes fractions ont été alors isolées, et nommées en fonction de leur comportement en chromatographie d'échange cationique faible. La plus abondante, l'HbA1c, a été isolée et caractérisée. Cette découverte a suscité un intérêt croissant lorsqu'on a démontré un parallélisme entre l'augmentation de cette forme d'hémoglobine dans le sang des patients diabétiques et le degré de l'hyperglycémie

[8,9]. L'hypothèse qu'un dosage d'HbA1_c pouvait constituer un marqueur de l'équilibre glycémique a été émise, puis vérifiée [9]. Par la suite, les études cliniques, dont celles du Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) puis celles de l'UKPDS (UK Prospective DiabetesStudy), ont confirmé l'intérêt de ce test dans le suivi du diabète, aussi bien de type 1 que de type 2. La corrélation entre la qualité de l'équilibre glycémique, évaluée par l'HbA1_c, et l'apparition de diverses complications dégénératives a été établie [10, 11].

3- Définition de l'hémoglobine glyquée.

Le dosage de l'hémoglobine glyquée reflète le niveau moyen de la glycémie (taux de sucre dans le sang) au cours des deux derniers mois. Il est obtenu à l'aide d'une prise de sang ou en technique capillaire pour laquelle il n'est pas nécessaire d'être à jeun. C'est le dosage de référence pour juger de l'équilibre du diabète. C'est avec cet indice qu'il a été démontré qu'en améliorant l'équilibre, il était possible de prévenir ou de stopper l'évolution des complications oculaires, rénales et neurologiques.

Un des objectifs du traitement dans le diabète est de normaliser la glycémie.

L'objectif optimal est d'obtenir une _HbA1C inférieure à 6,5%. A ce niveau, en l'absence d'effets secondaires le traitement est adapté.

Si sur deux dosages consécutifs l'HbA1c est comprise entre 6,6 et 8% une modification du traitement peut être envisagée. Pour une HbA1c supérieure à 8%, une modification du traitement est recommandée. Ces objectifs doivent être individualisés en fonctions de nombreux facteurs : âge, présence de complications, état psychologique du patient, grossesse en cours...

Plus le niveau de l'HbA1_c est élevé, plus le risque de développer des complications est important. Quel que soit le niveau de départ, toute amélioration de l'HbA1c, même minime, réduit le risque de développer ou d'aggraver ces mêmes complications.

La survenue des complications ne dépend pas que du déséquilibre glycémique, d'autres facteurs (tabagisme, pression artérielle, lipides...) ont une grande importance.

4- Différentes formes de l'hémoglobine A

La molécule d'hémoglobine (MM = 64500 dalton) est composée d'un noyau "l'hème" et de quatre chaînes polypeptidiques. Il existe quatre types de chaînes différentes par leur composition en acides aminés (chaînes, a,f3, ö, y). Leur combinaison conduit à différentes formes d'hémoglobines, cependant les hémoglobines normales contiennent toujours deux chaînes a.

Chez l'adulte sain l'hémoglobine est donc constituée d'un mélange dont la composition moyenne est la suivante

- hémoglobine A (a2 f3 2)

97 % environ

- hémoglobine A2 (a2 ö2)

2,5 % environ

L'hémoglobine A de structure moléculaire (a2 f32) présente une hétérogénéité structurale mise en évidence après séparation chromatographique ou électro phorétique. On distingue :


· Une forme majeure ou HbAo

Cette forme comprend également de l'hémoglobine glyquée sur des sites qui ne modifient pas le phi de la molécule.


· Plusieurs formes mineures ou "rapides"(fast -haemoglobins) répertoriées sous le terme HbA1.

Ces dernières formes correspondent à des formes glyquées de l'hémoglobine pour lesquelles la réaction de glycation s'est effectuée sur l'extrémité N-Terminale (valine) des chaînes â. La réaction de glycation, à ce niveau, modifie suffisamment les propriétés physico-chimiques (phi) des formes rapides (HbA1) pour permettre leur séparation par chromatographie d'échange cationique ou par isofocalisation :

> Les Hémoglobines _A1a1 ^et _A1a2 qui résultent respectivement de la liaison

de fructose-1,6-disphosphate (hexoses diphosphates) et de glucose-6-

phosphate (hexoses mono phosphates) sur la valine N-terminale des

chaînes â de l'hémoglobine.

Ces deux formes représentent en moyenne environ 0,5 % de l'hémoglobine.

> L'hémoglobine _A1b qui correspond à la fixation du pyruvate (hexoses nonphosphorylés) à l'extrémité N-terminale des chaînes â de la globine (environ 0,8 % de l'hémoglobine en moyenne).

> L'hémoglobine _A1c qui est la fraction la mieux caractérisée et qui constitue la forme majeure de l'hémoglobine A1 (environ 80 %) soit 4 à 6 % de l'hémoglobine totale. L'hémoglobine _A1c résulte de la condensation d'une molécule de glucose avec le groupement N-Terminal de résidus valine de chacune des deux chaînes â de l'hémoglobine A. Elle possède une fonction cétoamine stable, contrairement à l'Hb préA1c qui est une forme labile de _l'HbA1c caractérisée par une fonction almidine (base de Schiff). [12]

5- Phénomène de glycation

La glycation, réaction initialement décrite par L.C.Maillard en 1912, est la condensation de la fonction aldose du glucose (et plus généralement des oses) avec le radical aminé libre des protéines (et plus généralement de macromolécules, acides nucléiques,

lipides complexes...). Elle est une réaction chimique survenant in vitro et in vivo. Elle est une réaction non enzymatique et s'oppose à la "glycosylation" qui correspond à un mécanisme enzymatique de la biosynthèse protéique.

La première étape de la réaction aboutit à la formation d'une base de Schiff instable qui soit se redissocie en amine et en ose, soit subit une translocation de la double liaison (réarrangement d'Amadori) pour aboutir à une cétoamine stable et quasiment irréversible dont la vitesse de formation est 60 fois moins rapide que celle de la première étape. (Figure 1)



Figure 1:

Réaction de glycosylation non enzymatique des protéines

L'intensité de la glycation est fonction de la protéine (concentration et demivie), de la nature et d

e la concentration de l'ose réactionnel et du temps de contact entre l'ose et la protéine. Le glucose, ose peu réactif mais le plus abondant de l'organisme humain réagit sous sa forme non cyclique, mais c'est la forme cyclique

qui est présente dans la cétoamine conférant à la molécule glyquée une fonction cisdiol. Toutes les protéines peuvent être glyquées mais l'exemple le mieux connu est celui de l'hémoglobine. On sait depuis les travaux de Rabhar en 1969 et de Trivelli en 1971 que les sujets diabétiques possèdent une fraction d'hémoglobine migrant plus rapidement que l'hémoglobine A à l'électrophorèse (d'où sa première dénomination de fasthemoglobin) [13]. L'hémoglobine glyquée résulte de la fixation d'oses sur les chaînes de globine. Différents sites peuvent être affectés (Valine N - terminale des chaînes á et â groupement å - aminés des résidus lysine intra chaînes) donnant lieu à la formation de plusieurs formes d'hémoglobines glyquées. (Tableau I).

Tableau I. Principales fractions de l'hémoglobine et principaux termes utilisés pour caractériser l'hémoglobine glyquée.

HbA	Tétramère á2â2
HbA0	Composant majeur de l'hémoglobine A séparée par échange d'ions ou électrophorèse Comprend l'hémoglobine glyquée sur les sites ne modifiant pas son pH
HbA1	Hémoglobine(s) rapides en échange d'ions ou électrophorèse Comprend HbA1a1+HbA1a2+HbA1b+HbA1c
HbA1c	Fraction cétoamine stable formée par fixation du glucose sur la valine N-terminal de la chaine â de l'HbA
HbpréA1c	Forme labile de l'HbA1c caractérisée par une fonction aldimine (base de Schiff)
Hb glyquée	Hémoglobine formée par fixation du glucose et d'autres oses sur les fonctions amines libres et accessibles des chaines á et â

La forme la plus abondante est l'hémoglobine _A1c définie par la fixation du glucose sur la valine N-terminale de la chaîne â, mais qui ne représente que 60% de l'ensemble des hémoglobines glyquées. Les 40% restant étant répartis entre les formes où le glucose est fixé sur la valine N terminale de la chaîne á et les formes où le

glucose est fixé sur les lysines intra chaînes. Le principe de la glycation est utilisé pour mesurer l'imprégnation glucidique chez les diabétiques à l'aide de marqueurs dont la détermination va refléter les moyennes glycémiques selon un temps plus ou moins long en fonction de la protéine étudiée : de quelques jours pour les lipoprotéines à plusieurs années pour les protéines de structure [12].

6- Quelques méthodes de dosages de l'HbA1_c

Elles peuvent être réparties en deux groupes : Les méthodes dosant l'hémoglobine glyquée totale et les méthodes dosant spécifiquement l'HbA1c.

6-1- Méthodes dosant l'hémoglobine glyquée totale.

> Chromatographie d'affinité

Les groupements 1-2 cis-diol des molécules d'hexoses fixées sur l'hémoglobine forment un complexe avec l'acide phénylboronique immobilisé sur une matrice d'agarose. Une première solution tampon élue la fraction non glyquée, une deuxième solution contenant du sorbitol ou de l'acide citrique élue la fraction glyquée fixée sur la colonne [14]. Ces techniques peuvent être sensibles à la concentration du ligand d'un lot de colonne à l'autre. Seules les hémoglobines normales ou anormales ayant fixées irréversiblement le glucose sont dosées, la fraction labile d' Hb n'interférant pas. La température et les hémoglobines carbamylées ou acétylées sont sans influence.

Cette méthode a été appliquée à des techniques automatisées. Après hémolyse du sang, l'Hb glyquée est fixée sur un réactif d'affinité poly -anionique, puis le complexe est capté par une matrice cationique.

La détection utilise une réaction d'inhibition par l'hème, de la fluorescence d'un fluorophore[15].

Les résultats sont corrigés par rapport à une courbe d'étalonnage mémorisée qui a été titrée en HbA1c par une méthode CLHP. Ces techniques qui dosent l'hémoglobine glyquée totale, fournissent des résultats corrigés exprimés en HbA1_c.

6-2- Méthodes dosant spécifiquement l'HbA1_c

6-2-1 Méthodes immunologiques

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-HbA1_c utilisés sont spécifiques à la liaison du glucose avec l'extrémité N terminale de la chaîne â.

Différents systèmes sont commercialisés

- Techniques immunoturbidimètriques en phase homogène adaptée à différents analyseurs de biochimie [16].

Après hémolyse manuelle le pourcentage d'HbA1c est calculé par rapport à l'Hb totale dosée en parallèle.

- Technique d'immunoinhibition sur analyseur (BAYER DCA 2000 ou DCA Vantage).

- Technique ELISA sur microplaques avec des anticorps monoclonaux.

La spécificité de ces méthodes dépend de l'épitope reconnu qu'il convient de connaître pour déterminer leurs limites d'utilisation. Les fractions d'hémoglobines labiles ou modifiées ne sont pas dosées, mais les hémoglobines anormales et leurs dérivées glyquées peuvent ou non être pris en compte en fonction de la séquence glyquée reconnue et de sa longueur. En cas de présence d'une HbF ou d'une Hb anormale, la glycation de ces formes n'étant pas reconnue, il s'en suit des résultats par défaut puisque le dosage de l'hémoglobine totale inclut des formes non glyquées. Ce type de méthode ne permet pas d'identifier les hémoglobines anormales.

6-2-2 Electrophorèse

- L'électrophorèse en gel d'agarose ou acétate de cellulose (électro-endosmose) permet la migration en bloc de toutes les fractions d'HbA1. Certains systèmes peuvent également séparer spécifiquement la fraction HbA1c. Cette technique permet de mettre en évidence la plupart des Hb anormales sauf les hémoglobines modifiées (Hbcarbamylées). L'obtention de résultats reproductibles exige une transparisation homogène du gel pour permettre une

lecture correcte. Ces techniques délicates fournissent en général des résultats plus élevés.

- L'isoélectrofocalisation permet une très bonne séparation des fractions.

C'est cependant une technique délicate, qui nécessite un appareillage très spécialisé. Elle n'est pas utilisée en pratique courante.

6-2-3 Chromatographie d'échange d'ions

La séparation est fondée sur le fait que la charge nette des hémoglobines glyquées sur l'extrémité N-terminale des chaînes â est plus négative que celle de l'HbAo, à pH neutre. Cette méthode a été mise au point par Trivelli [17] en 1971. L'hémolysât est déposé sur une colonne remplie de résines chargées négativement. On élue d'abord les hémoglobines rapides : HbA1a, HbA1b, HbA1c puis la fraction principale HbAo.

Le pourcentage de ces différentes fractions est déterminé par mesure spectrophotométrique.

Cette méthode est utilisée dans différentes techniques :

- mini colonnes remplies de résines échangeuses d'ions pour les techniques manuelles,

- Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP). De nombreux appareils de CLHP spécialisés pour le dosage de l'HbA1c sont commercialisés. Ils utilisent une colonne d'échange ionique et permettent un dosage automatisé,

- Chromatographie Liquide Basse Pression (CLBP). Des systèmes automatisés de CLBP ont également été proposés par différents industriels. D'utilisation réputée moins coûteuse, ces appareils doivent fournir une bonne séparation HbF/HbA1_c.

7 Intérêts du dosage de l'hémoglobine glyquée.

L'évaluation de l'hémoglobine _A1c (HbA1c) est utilisée en pratique quotidienne au cours de la surveillance du diabète sucré [18,19]. Marqueur rétrospectif et objectif

de l'équilibre glycémique à moyen terme, l'HbA1c est devenue un paramètre quasiment obligatoire dans le suivi du sujet diabétique quel que soit le type de diabète. Un rapport de la CNAMTS fait ressortir qu'en 1994 seul un diabétique sur trois avait un dosage régulier d'HbA1c et qu'en 1999 il y en avait 41 %. L'objectif pour 2000 étant d'obtenir 61 % de diabétiques de type 2 ayant un contrôle régulier de l'HbA1c. Longtemps sous utilisée par les cliniciens du fait de l'hétérogénéité des formes et des valeurs usuelles, l'HbA1c est devenue un paramètre à prendre en compte dans le suivi du diabétique grâce à deux études prospectives: le Diabetes Control and Clinical Trial(DCCT) portant sur les diabétiques de type 1 et l'United Kingdom Prospective DiabetesStudy (UKPDS) portant sur les diabétiques de type 2 [20,21]. Ces deux études ont en effet clairement établi une relation entre l'équilibre glycémique objectivé par l'HbA1c et les cinq complications micro et/ou macro-angiopathiques.

L'étude du DCCT a porté sur 1441 sujets suivis pendant une période moyenne de 6,5 ans et classés en deux groupes, comparables sur le plan de leur HbA1c initiale, selon des critères cliniques basés sur la présence ou non de rétinopathies et/ou néphropathies. La moitié des sujets a reçu un traitement conventionnel alors que les autres ont reçu un traitement intensif soit par pompe à insuline soit par un minimum de trois injections d'insuline par 24 heures. Parallèlement au contrôle de l'évolution de la rétinopathie et de la néphropathie, l'HbA1c a été mesurée 1 fois par mois. Au terme de cette étude, il a été observé un ralentissement de l'évolution de la rétinopathie et une diminution de la microalbuminurie chez les sujets recevant un traitement intensif par rapport à ceux recevant un traitement conventionnel. Dans le même temps, l'HbA1c a diminué de façon significative de 3 points passant de 11,6 % à 8,3 % dans le groupe diabétique ayant un traitement intensif alors qu'elle est restée à la même valeur dans l'autre groupe. Les résultats de l'UKPDS, qui ont porté sur des diabétiques de type 2 suivis pendant 15 ans et traités par antidiabétiques oraux associés ou non à l'insuline, ont montré qu'un bénéfice clinique caractérisé par une diminution du nombre d'infarctus du myocarde est corrélée à une diminution de l'HbA1c.

On accorde, en effet, une grande importance aux modifications des valeurs d'HbA1c pour adapter le traitement, et à un échelon plus large, pour apprécier le risque de survenu de complications dégénératives.

8 Limites du dosage de l'hémoglobine glyquée.

Le glucose se fixe sur l'hémoglobine. La durée de vie d'une hématie est de 120 jours, lors d'une prise de sang il y a un mélange de jeunes et de vieux globules rouges.

Les valeurs de l'hémoglobine glyquée ne sont plus interprétables lorsque la durée de vie des globules rouges est diminuée (<120 jours) ou que leur ancienneté moyenne chute (<60 jours). Dans les cas d'anémie, de saignement aigu etde transfusion, la baisse du taux d'HbA1c ne reflète pas celle, éventuelle, de la glycémie.

Le taux baisse naturellement de 1 à 1.5% en début de grossesse sans refléter un meilleur contrôle de la glycémie.

Des affections comme l'anémie hémolytique, la polycitémie et les états homozygotes HbS et HbC peuvent entrainer une diminution de la vie des hématies. Les résultats d'hémoglobines A1c obtenus sont alors inférieurs à ceux escomptés et ceux, indépendamment de la méthode de dosage utilisée. Ils ne doivent donc pas être corrélés au contrôle glycémique lors de l'utilisation de plages de référence publiées.

Enfin, la comparaison des résultats successifs nécessite que la technique de dosage utilisée par le laboratoire soit bien identifiée, de telle sorte qu'un éventuel changement de celle-ci, soit intégré dans leur interprétation.

II- CADRE,

MATERIEL ET

METHODE D'ETUDE

1- Présentation de la structure :

La Clinique Polyvalente MAHOUNA est une structure ayant plus de 18 ans d'expérience. Elle est érigée dans deux locaux situés dans le douzième arrondissement de Cotonou. Elle offre des prestations médicales en externe et en hospitalisation avec un total de 25 lits. Elle dispose d'un bloc opératoire, d'une unité de soins intensifs, des salles de soins, d'une pharmacie interne très fournie, des salles d'hospitalisation climatisées, des suites d'hospitalisation personnelles et d'un laboratoire moderne d'analyses biomédicales.

Les services disponibles sont :

1- ANESTHESIE-REANIMATION dirigée par le professeur Dominique ATCHADE ;

2- GYNECOLOGIE-OBSTETRIQUE dirigée par le professeur René-Xavier PERRIN ;

3- PEDIATRIE dirigée par le professeur Blaise AYIVI ;

4- CHIRURGIE (Maxillo-faciale, Générale, traumatologique et orthopédique) dirigée par le Maître-assistant des Universités, Dr Aristote HANS-MOEVI ;

5- MEDECINE PHYSIQUE et READAPTATION FONCTIONNELLE dirigée par le Professeur Agrégé Toussaint KPADONOU ;

6- CARDIOLOGIE : dirigée par le Professeur Agrégé colonel Martin HOUENASSI ;

7- RADIOLOGIE : dirigée par Dr Stéphane SAVI de TOVE ;

8- MEDECINE GENERALE assurée par les Dr BOURGEOIS Dimitri, AKPITI Akim, AGAVOEDO Gypsie et BELLO Kéfilath ;

9- Un LABORATOIRE POLYVALENT D'ANALYSES BIOMEDICALES dirigé par le Professeur André BIGOT.

1-1- Description du laboratoire

Le laboratoire est situé dans les premiers locaux de la clinique polyvalente MAHOUNA. En entrant par le grand portail, le laboratoire se situe à la fin de la clôture.

1-1-1- Description des locaux

Le laboratoire comporte plusieurs compartiments.

- Une salle de prélèvement séparée de la salle de manipulation ; - Une véranda qui sert de salle d'attente;

- Une grande salle de manipulation ;

- Une seconde salle de manipulation reliée directement à la première ;

- Une salle de garde qui donne directement sur la salle de manipulation ; - Un magasin qui est relié à la salle de prélèvement.

1-1-2- Description du matériel

Le laboratoire de la Clinique Polyvalente MAHOUNA dispose d'un plateau technique composé d'appareils modernes tel que :

- 03 mini vidas dont deux sont utilisés fréquemment pour réaliser assez rapidement des examens de :

· La sérologie infectieuse (toxoplasmose- rubéole-cytomégalovirus etc.)

· Des hormones thyroïdiennes (TSH- FT4- FT3 etc.)

· Des hormones de la reproduction (FSH- LH- OEstradiol, HCG etc.)

· Des marqueurs tumoraux (PSA total- FPSA- ACE etc.)

· Des marqueurs cardiaques (CK-MB, Troponine I etc.)

· Des marqueurs hépatiques etc....

- Deux automates pour l'Hématologie (KX-21 et XS-1000i)

- Un automate Flexior junior capable de réaliser les examens biochimiques courants ;

- 04 Spectrophotomètres pour la Biochimie dont un est fréquemment utilisé

- Un automate COBAS MIRA capable de réaliser presque tous les examens biochimiques courants

- Un automate Axsym capable de faire de l'immuno-analyse

- Un Minicap pour l'électrophorèse de l'hémoglobine et des protéines

- 01 turbitimer pour la CRP et les protéines spécifiques (D-dimères etc....) - Un coagulomètre pour l'hémostase

- Deux Easylytes pour faire les Ionogrammes sanguins et urinaires - Deux microscopes

- Deux centrifugeuses de table

- Une centrifugeuse à hématocrite

- Un bain marie

- Deux agitateurs vortex

- 5 réfrigérateurs utilisés pour conserver les réactifs.

- Un ordinateur qui sert à saisir les résultats

Par ailleurs le laboratoire de la Clinique Polyvalente MAHOUNA grâce à son partenariat avec un laboratoire de référence en Belgique et en France réalise des examens biologiques complexes qui ne peuvent se faire sur place au BENIN.

1-1-3- Personnel de laboratoire

Le laboratoire dispose de neuf (09) agents répartis de la manière suivante :

· Sept (07) ingénieurs des travaux en Biologie Médicale ;

· 02 techniciens biologistes.

1-1-4- Fonctionnement du laboratoire

Les techniciens du laboratoire travaillent sous la coordination d'un responsable. Ils sont répartis en deux groupes ; le premier groupe se charge de la permanence pendant la journée du lundi au vendredi puis de la garde dans le week-end. Le deuxième groupe se charge de la garde de nuit.

Le calendrier est fait de sorte qu'il y a trois heures d'arrivée pour chaque technicien qui assure la permanence du lundi au vendredi :

· 7h 30 pour le premier qui rentre à 16 h ;

· 8h pour le second qui rentre à 18h ;

· 10h pour le troisième qui rentre après l'arrivée de celui qui fait la garde ;

Le technicien chargé de la garde de nuit vient à 18H.

Le laboratoire fonctionne 24H/24. Les prélèvements se font à tout moment de la journée dans la salle de prélèvement. C'est le technicien qui effectue les prélèvements

pour des malades hospitalisés dans la clinique. Le laboratoire effectue aussi des analyses sur des échantillons provenant d'autres centres de santé et d'autres laboratoires pour des contrôles de qualité.

Les manipulations sur ces échantillons se font systématiquement et les résultats sont rendus à tout moment de la journée. Certains examens dont les résultats sont suspects sont repris par un autre laboratoire avec lequel la clinique est en partenariat sur le terrain pour un contrôle avant leurs remises.

En ce qui concerne les examens qui sont réalisés par le laboratoire situé en Belgique, les échantillons sont collectés et conservés au frais pendant une période donnée puis envoyés en lot. Les résultats de ces examens sont renvoyés par e-mail ou par fax. Les prélèvements spécifiques se font le jour de l'expédition dans le strict respect des conditions de transport.

1-2 Quelques examens réalisés au laboratoire

> Hématologie

- Numération Formule Sanguine et numération des plaquettes ; - Temps de Céphaline Activé (TCA)

- Vitesse de sédimentation ;

- Le taux de réticulocytes

> Parasitologie

- Coprologie parasitaire

- Goutte épaisse

- Toxoplasmose (IgG et IgM)

- Test biologique de grossesse sérique

- VDRL (Veneral Desease Recherch Laboratory)

- TPHA (Tréponéma Pallidum Hagglutination Assay)

> Examens sur VIDAS

- Rubéole (IgG et IgM)

- Toxoplasmose (IgG et IgM)

> Sérologie

- Test biologique de grossesse sérique

- TPHA (Tréponéma Pallidum Hagglutination Assay)

- VDRL (Veneral Desease Recherch Laboratory)

> Biochimie

- Urée

- CPK (Créatine PhosphoKinase) - Ionogramme

- Transaminases

- Triglycéride

- Cholestérol total plus HDL - Amylase

- Glycémie

- HbA1c (Hémoglobine Glyquée)

2- Méthode d'étude

Notre étude est une étude prospective qui s'est déroulé du 03 août au 12octobre 2009 au laboratoire de la Clinique Polyvalente MAHOUNA.

2-1- Population d'étude

L'étude a porté sur des sujets diabétiques adultes sans distinction de sexe, de race et d'ethnie. La méthode d'échantillonnage utilisée est un échantillonnage systématique de tous les patients suivi à la Clinique Polyvalente MAHOUNA. On a dosé chez ces patients la glycémie et l'hémoglobine glyquée.

Notre échantillonnage s'est arrêté à trente échantillons de sang obtenus par prélèvement veineux.

2-2- Réalisation du dosage de l'hémoglobine glyquée

2-2-1 Réactifs

Anticorps-latex :

Anticorps monoclonal de souris spécifique de l'hémoglobine A1c adsorbé sur les particules du latex. Anticorps latex à 2,5% (m/V) dans un tampon glycine 10mMol, ingrédients non réactif à 16% (m/V) (10 uL, état sec dans chaque cartouche de réactif). Agglutinants : polymère poly (acide aspartique) à 0,005% (m/V) lié par des liaisons de covalence à l'haptène de l'HbA1c dans un tampon citrate de sodium 20mMol

contenant de l'albumine sérique bovine à 0,1% (m/V) et des ingrédients non réactifs à 1% ( m/V) (10uL, état sec dans chaque cartouche)

Oxydant : ferricyanure de potassium à 1,5% (m/V) dans de l'eau avec des ingrédients non réactifs à 1% (m/V) (10mL, état sec dans chaque cartouche).

2-2-2- Prélèvements

L'échantillon de sang est obtenu par prélèvement veineux sur un tube EDTA. Le sang total conservé sur EDTA peut être stocké pendant une semaine à 25°c.

2-2- 3- Principe du dosage

La concentration spécifique en HbA1c et la concentration en Hb total sont mesurées séparément. Le rapport est exprimé sous forme de pourcentage de l'HbA1c. Pour le dosage de l'Hb total on utilise le ferricyanure de potassium pour oxyder l'Hb de l'échantillon en méthémoglobine. Cette dernière se fixe alors au thiocyanate et forme un complexe associant thiocyanate et méthémoglobine. C'est ce complexe qui est mesuré. L'augmentation de l'intensité de la coloration à 531 nm est proportionnelle à la concentration en Hb totale dans l'échantillon.

Pour le dosage spécifique de l'HbA1c, on utilise une méthode d'inhibition de l'agglutination sur latex (figure 2).

Un agglutinant (polymère synthétique contenant des copies multiples de la partie immuno réactive de l'HbA1c) provoque l'agglutination au latex recouvert d'un Anticorps monoclonal de souris spécifique de l'HbA1c. Cette réaction d'agglutination entraine une diffusion de la lumière plus importante qui se traduit par une augmentation de l'absorbance à 531 nm. Les molécules d'HbA1c présentes dans l'échantillon de sang total entrent alors en compétition pour se fixer sur les sites de liaison des complexes Ac latex dont le nombre est limité entrainant ainsi une inhibition de l'agglutination et une diminution de la diffusion de la lumière. Cette diminution peut être mesurée. Elle correspond à une diminution de l'absorbance à 531 nm. La concentration en HbA1c est alors quantifiée à l'aide d'une courbe d'étalonnage de l'absorbance établie par rapport à la concentration en HbA1c.

Le pourcentage de l'HbA1c dans l'échantillon est calculé de la manière suivante :

[HbA1c]<100

HbA1c (%) = [hernogiobine totale]

Principe du dosage

Anticorps- latex ?



??? Diffusion élevée (augmentation de l'absorbance)

Agglutinant Agglutination

? ? ? ?

? Hémoglobine A1c dans le sang du patient?



. Diffusion faible

(Diminution de l'absorbance)

Inhibition ?

Agglutination inhibée

Figure2

2-2-4- Matériel nécessaire

· Kit de réactifs de l'hémoglobine A1c DCA Systems ou DCA 2000®

· Échantillon patient

· Kit de contrôle ou autre contrôle

· Mouchoir en papier non pelucheux

· Horloge ou chronomètre

· Un sachet de conditionnement en aluminium qui contient : > Languette flexible,

> Cartouche de réactif,

> Agent desséchant, > fenêtre optique.

2-2-5- Mode opératoire

· Allumez l'appareil et attendre qu'il soit prêt ;

· Ouvrez l'emballage en plastique du support de tube capillaire en le déchirant au niveau du bord présentant une flèche ;

· Scannez une cartouche d'analyse HbA1c ;

· Inspectez le support de capillaire ;

· Mélangez bien l'échantillon pour éviter la séparation des globules rouges et du plasma ;

· Retirez le bouchon du tube ;

· Positionnez le support de tube capillaire de biais ;

· Mettez uniquement en contact l'extrémité du tube capillaire avec l'échantillon sanguin ;

· Encliquetez délicatement le support de tube capillaire dans la cartouche de réactif ;

· Ouvrez la porte du compartiment de la cartouche ;

· Tenez la cartouche en orientant le code-barres vers la droite ;

· Encliquetez la cartouche dans son compartiment ;

· Retirez tout doucement la languette flexible de la cartouche de réactif ;

· Fermez la porte du compartiment et jetez la languette ;

· Un bip sonore est émis cinq secondes après la fermeture de la porte du compartiment pour signaler le début de l'analyse ;

· Identifiez l'échantillon sur l'écran de l'appareil ;

· L'écran Résultats s'affiche lorsque le système termine l'analyse de l'échantillon.

2-2-6- Résultats

Toutes les mesures et tous les calculs sont effectués automatiquement par l'analyseur DCA. L'écran affiche alors le pourcentage d'HbA1c à la fin du dosage.

Si l'écran affiche un résultat « < » (inférieur) cela indique que le pourcentage obtenu est inférieur à 2,5.

Si l'écran affiche un résultat « > » (supérieur) cela signifie que le pourcentage obtenu est supérieur à 14.

2-2-7- Contrôle de qualité

Pour assurer la qualité à la fois des procédures d'analyses et des résultats des patients relatifs au dosage de l'HbA1c, le système DCA effectue 48 contrôles systèmes (contrôles optiques, électroniques, mécaniques et concernant les réactifs) au cours du dosage de chaque échantillon. Ces contrôles incluent la vérification de l'étalonnage pendant chaque test. Si une erreur système ou une erreur relative au dosage survient au cours d'une mesure individuelle, le système affiche automatiquement un message d'erreur pour empêcher l'affichage d'un rapport de résultat erroné d'un patient.

2-2-8- Limites du dosage

Le dosage de l'HbA1c DCA ne permet pas de doser la fraction F de l'Hb glyquée si le taux d'hémoglobine F est inférieur à 10%, le système DCA indique de manière précise l'équilibre glycémique du patient. Cependant, si le taux d'Hb F est très élevé (> 10%), la quantité d'HbA1c est alors inférieure à celle escomptée car une proportion importante de l'Hb glyquée est sous forme d'Hb glyquée F.

La bilirubine jusqu'à une concentration de 20mg/dL n'interfère pas avec le dosage.

Les triglycérides jusqu'à une concentration de 1347mg/dL dans du sang total frais, n'interfère pas avec le dosage. Les échantillons de sang présentant une lipémie très élevée, stockée depuis très longtemps ou congelé, ne doivent pas être analysés à l'aide de cette méthode.

2-2-9- Valeurs de référence

Selon la méthode de dosage utilisée, le taux d'HbA1c est approximativement compris entre 3 et 6 % chez les sujets non diabétiques, entre 6 et 8 % chez les patients dont le diabète est équilibré. Il peut atteindre 20% ou plus si le diabète est mal équilibré. Cependant il est recommandé pour chaque laboratoire de déterminer les plages de mesures normales en conformité avec la population analysée.

2-3- Réalisation du dosage de la glycémie

La glycémie est le taux de glucose dans le sang. C'est une constante biologique par excellence mais qui présente des variations locales et temporelles. [22-23]

2-3-1- Prélèvement

L'échantillon de sang est prélevé dans un tube sec puis décanté automatiquement après centrifugation ou sur du fluorure de sodium. Le sérum ne doit pas être hémolysé.

2-3-2- Réactifs

· Tampon phosphate pH 7,4

· Le phénol

· Amino-4-antipyrine

· Glucose oxydase

· Peroxydase

2-3-3- Principe du dosage

La détermination du glucose se fait suivant les réactions suivantes :

Glucose oxydase

Glucose + O2 Acide gluconique + H2O2

Peroxydase



2H2O2 + Phénol + 4-AAP Quinonéimine + 4 H2O

4-AAP : Amino-4-Antipyrine

2-3-4 - Matériels

· Tubes à hémolyse

· Chronomètre

· Bain marie

· Micropipette de 1000 uL et de 50uL

2-3-5- Mode opératoire

	Blanc réactif uL	Etalon uL		Echantillon uL	Réactif
1000	1000	1000		Etalon
-	10	-		Sérum
-	-	10

Incuber pendant au moins dix minutes au bain marie à 37°C puis faire la lecture au spectrophotomètre à 500 nm.

2-3-6- Interférences

Selon les recommandations de la SFBC divers substances sont ajoutées en quantité croissante à un pool sérique humain de titre normale ou pathologique.

Ces tests montrent que les triglycérides, l'hémoglobine n'interfèrent pas aux concentrations testées (triglycérides jusqu'à 10g/L et l'hémoglobine jusqu'à 5g/L).

Les interférences les plus importantes sont celles de la bilirubine et de l'acide ascorbique : une sous-estimation d'environ 10% se produit pour des teneurs supérieures en bilirubine à 80 mg/L ou supérieures en acide ascorbique à 70mg/L.

III- RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats

Tableau II : Valeurs moyennes de la glycémie des patients diabétiques représentant notre population d'étude.

N Moyenne (g/L) Ecart type (g/L) Coefficient de variation (%)

30 2,32 1,93 83

On note une dispersion importante des valeurs de la glycémie chez nos patients diabétiques avec une moyenne relativement élevée (2,32 g/L).

Tableau III : Valeurs moyennes des taux d'hémoglobine glyquée des patients diabétiques représentant notre population d'étude.

N Moyenne (%) Ecart type (%) Coefficient de variation (%)

30 8,29 2,92 35

Nos patients diabétiques ont une moyenne du taux d'HbA1c de 8,29% avec une dispersion des valeurs relativement importante (CV=35%).

Tableau IV : Corrélation entre la glycémie et le taux d'hémoglobine glyquée des patients diabétiques représentant notre cohorte

Glycémies Taux d' HbA1c

Coefficient de corrélation 0,74

Test de student 8,65*

*p< 0,005

Il existe une corrélation significative entre la glycémie et le taux d'HbA1c chez les patients diabétiques ayant fait l'objet de notre étude.

Tableau V : Répartition selon le sexe des patients diabétiques ayant fait l'objet de notre étude

Sexe F M

Effectif 16 14

Dans notre cohorte, huit (8) femmes contre sept (7) hommes sont diabétiques soit des pourcentages respectifs de 53,33% et de 46,67%. Ce qui correspond à un sexe ratio proche de un.

Effectif

18		17

16 14
											12
											10 8
											6 4
	2										2
							1
					0						0

[30,40[ [40,50[ [50,60[ [60,70[ [70,80[ [80,90[

Tranche d'âge

Figure 3 : Diagramme représentant la répartition selon les tranches d'âge des patients diabétiques représentant notre cohorte.

Quatorze (14) patients sur vingt-cinq (25) ont un âge compris entre 40 et 50 ans soit 56,66% des patients ayant composé notre cohorte.

Discussion

Le diabète est une maladie aggravant l'invalidité, provocant la diminution de l'espérance de vie, et engendrant de forts coûts médicaux. Notre étude a porté sur trente patients diabétiques de type II suivi à la Clinique Polyvalente MAHOUNA.

Dans notre cohorte, les femmes représentent 53,33 % de notre effectif. Nous ne pouvons pas affirmer à partir de ce pourcentage une prévalence plus élevée des femmes comparée aux hommes. Ceci peut être dû à la taille relativement modeste de notre population. En effet, la prédominance du sexe féminin dans la population diabétique de type II au BENIN avait été rapporté par Glitho [24] en 2006. Cet état de chose peut être expliqué par le fait que les femmes ont une faible activité physique, une nourriture riche en lipides générant une obésité associée à un taux plasmatique et tissulaire élevé en acides gras libres.

La majorité des patients ont comme mentionné dans la littérature plus de quarante (40) ans. [25, 26,27]. Dans notre cohorte, l'âge moyen est de 48 ans. Ce résultat confirme bien le nom de la maladie : le diabète de la maturité.

La moyenne de l'hémoglobine glyquée chez ces diabétiques est de 8,29%. Ce résultat montre que ces patients ont un diabète équilibré. Cela s'explique par le fait qu'ils respectent les prescriptions hygiéno-diététiques et suivent correctement le traitement du diabétologue.

Les conséquences du diabète peuvent être lourdes pour la santé. Le diabète est un facteur de risque important de maladies cardiovasculaires, infarctus, insuffisance cardiaque, artérite, accident vasculaire cérébral, de neuropathie, ou encore de troubles micro-angiopathiques pouvant conduire à la cécité (rétinopathie), à une insuffisance rénale chronique (néphropathie).

Nos résultats ont montré qu'il existe une corrélation significative entre le pourcentage d'hémoglobine glyquée et la glycémie (r=0,74 et p< 0,005).

A priori, cela laisse penser que la détermination de la glycémie suffit pour préjuger de l'évolution de la maladie. Mais une glycémie isolée contrairement à

l'hémoglobine glyquée ne rend pas compte des pics d'hyperglycémie enregistrés les jours précédents. L'hémoglobine glyquée permet d'évaluer le risque d'exposition du patient aux complications.

Deux études randomisées réalisées par le DCCT et l'UKPDS ont clairement montré le lien entre l'augmentation de l'HbA1_c (reflet de la glycémie moyenne) et l'augmentation exponentielle du risque de complications. Grossièrement, pour chaque 1% d'élévation de l'HbA1c, on observe une augmentation relative de 30% des complications microvasculaires. [28,29].

Ces mêmes études ont établi que l'abaissement du taux d'hémoglobine glyquée, en comparant des patients traités de manière «intensive» par rapport à un autre groupe avec des objectifs moins stricts, permettait de réduire les complications liées au diabète. Dans l'étude UKPDS, une baisse d'environ 1% de l'HbA1_c a permis une réduction de 30% des complications micro vasculaires sur un suivi de dix ans (rétinopathie et albuminurie) [28,29].

Une étude multicentrique internationale menée entre avril 2006 et août 2007 afin d'établir de façon précise la relation existant entre la valeur d'HbA1c et la glycémie moyenne au cours des trois mois précédents a montré une corrélation significative entre la glycémie et le taux d'hémoglobine glyquée. [30]

A la différence de ces auteurs, nous n'avons déterminé qu'une seule valeur de glycémie chez ces patients. Par conséquent, nous n'avons aucune information sur les taux de glycémie les mois précédents. Dans ces conditions, la bonne corrélation relevée dans notre travail entre l'hémoglobine glyquée et le taux de glycémie pourrait être fortuite et de ce fait ne nous autorise pas à faire une extrapolation de la glycémie au taux d'hémoglobine glyquée.

CONCLUSION ET SUGGESTIONS

Conclusion

Notre travail qui s'est déroulée à la Clinique Polyvalente MAHOUNA de Cotonou avait pour objectif de faire une étude comparative de l'hémoglobine glyquée et de la glycémie dans une cohorte de trente (30) patients diabétiques de type II. Elle a permis d'observer qu'il existe une corrélation significative entre la glycémie et le taux d'hémoglobine glyquée (r=0,74 et p<0,005). Cependant, le nombre réduit des taux de glycémies déterminé (une seule glycémie) ne nous autorise pas à faire une extrapolation de la glycémie au taux d'hémoglobine glyquée.

Le dosage de l'hémoglobine glyquée prend de ce fait son importance, elle permet : > Une meilleure adaptation de la thérapeutique à l'équilibre du diabétique ;

> D'objectiver la mauvaise coopération du patient dans l'application de son

régime et de son traitement ;

> De prévenir les risques de complications.

L'importance de la détermination de l'hémoglobine glyquée n'est plus à démontrer ; ce dosage devrait donc être vulgarisé pour assurer la sauvegarde de la santé des populations eu égard à la prévalence sans cesse croissante du diabète dans nos pays.

Cependant le faible pouvoir d'achat de nos populations leur permettra-t-il un accès facile à cet examen ?

Suggestions

Au vu de tout ce qui précède, nous pouvons émettre les suggestions suivantes : > A l'endroit des cliniciens :

· Demander systématiquement le dosage de l'hémoglobine glyquée tous les deux mois chez les diabétiques.

> A l'endroit des autorités du ministère de la santé :

· Doter les laboratoires périphériques d'appareils et de réactifs pouvant permettre le dosage de l'hémoglobine glyquée ;

· Organiser un programme de lutte contre les maladies chroniques en général, contre la maladie diabétique et l'obésité en particulier ;

· Sensibiliser la population sur l'importance du dosage de l'hémoglobine glyquée.

· Subventionner le dosage de l'HbA1c qui est un examen très important de façon à le rendre accessible à nos populations aux pouvoirs d'achats très limités

> A l'endroit des populations

· S'adonner quotidiennement à des activités physiques notamment la marche et la gymnastique ;

· Avoir une alimentation saine et équilibrée.

REFERENCES
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Annexe

Echantillonnage

N° d'échantillon	sexe	Age	Diagnostic	Glycémie	HbA1c
1	F	45	DT2	1 ,46	6 ,1
2	M	44	DT2	4,96	>14
3	M	40	DT2	3	>14
4	F	42	DT2	1,51	08,8
5	M	41	DT2	1,48	10,2
6	F	44	DT2	1,01	5,6
7	F	40	DT2	1,38	5,6
8	F	45	DT2	1,27	6,8
9	F	45	DT2	1,26	6,3
10	F	40	DT2	0,95	6,5
11	M	43	DT2	2,07	11
12	F	51	DT2	1,16	6,6
13	F	50	DT2+ HTA	2,7	09
14	M	41	DT2+ HTA	0,97	6,2
15	M	40	DT2+ HTA	1,47	6,00
16	F	40	DT2+ HTA	1,66	7,5
17	M	41	DT2+ HTA	2,37	08,6
18	F	57	DT2	0,85	5,8
19	M	80	DT2	1,15	7,1
20	F	51	DT2	1,12	6,92
21	M	44	DT2	1,54	7,7
22	F	31	DT2	2,89	08,7
23	M	55	DT2	1,39	6,1
24	M	55	DT2	9,47	>14
25	F	67	DT2	2,15	7,6
26	M	52	DT2	1,36	7,2
27	F	48	DT2	5,47	11,3
28	M	65	DT2	2,31	8,1
29	F	51	DT2	3,21	09,9
30	M	39	DT2	6,02	09,48

Les données statistiques sont obtenues à partir des formules suivantes :

~




· x ? ~~

~

1
·

· Y= E )7/ N


·

S= _N¹ E(xi -- x)²

· cov(x, y) (N I--

E ^N-_₁ xiyi)- xy

· Coefficient de variation CV CV= 8

x

La recherche de corrélation entre les paramètres est réalisée par le calcul du coefficient de corrélation est « r ». Sa signification est déterminée avec le test de Student «t».

· r=		cov(x,y)

· t=	rAIN--2
	1--r^2

X= moyenne de l'HbA1c Y= moyenne de la glycémie 6x= écart type de l'HbA1c

sy= écart type de la glycémie N= effectif la population

r= coefficient de corrélation entre l'HbA1c et la glycémie

cov = covariance

V= Variance

Domaine de signification P< 0,05 Z E [-1,96 ; +1,96] P< 0,01 Z E [-2,58 ; +2,58]



Figure 4 : Présentation DCA Vantage Analyzer

1- Languette flexible, 2- Cartouche de réactif, 3- Agent desséchant, 4- fenêtre optique.

Figure 5: Kit de réactifs de l'hémoglobine A1c DCA Systems ou DCA 2000®

	1-tube capillaire en verre; 2- tampon absorbant ; 3-mécanisme de blocage.
Figure 6 : Cartouche de réactif

Table des matières

Dédicaces ..14

Remerciements 17

Liste des abréviations ..20

Liste des figures .21

Liste des tableaux.. 22

Introduction 24

I- Généralités 27

1- Données générales sur le diabète ...28

1-1- Le glucose 28

1-2- Définition du diabète 28

1-3- Différents types de diabète 28

2- Historique du dosage de l'hémoglobine glyquée.. ..30

3- Définition de l'hémoglobine glyquée .30

4- Différentes formes de l'hémoglobine A . 31

5- Phénomène de glycation .33

6- Quelques méthodes de dosage de l'hémoglobine glyquée .35

6-1- Méthodes dosant l'hémoglobine totale 35

6- 2- Méthodes dosant spécifiquement l'HbA1_c 36

7- Intérêts du dosage de l'hémoglobine glyquée 37

8- Limites du dosage de l'hémoglobine glyquée 39

II- Cadre, matériel et méthode d'étude 40

1- Présentation de la structure 41

1-1- Description du laboratoire . 41

1-2- Quelques examens réalisés laboratoire. 44

2- Méthode d'étude ..45

2-1- Population d'étude 45

2-2- réalisation du dosage de l'hémoglobine glyquée .....45

2-3- Réalisation du dosage de la glycémie 50

III- Résultats et discussion .52

1- Résultats . 53

2- Discussion 56

IV- Conclusion et suggestions .58

1- Conclusion . .59

2- Suggestions 60

Références bibliographiques 61

Annexes 67

^RésuméNotre étude a eu pour objectif général de faire une étude comparative de l'hémoglobine glyquée et du glucose sanguin dans les hyperglycémies diabétiques. Cette étude s'est déroulée à la Clinique Polyvalente MAHOUNA du 03 août au 12 octobre 2009 sur trente (30) patients diabétiques.

Le dosage de la glycémie et de l'hémoglobine glyquée a été réalisé chez ces patients.

Des résultats trouvés, il ressort que :

· L'âge moyen des patients diabétiques est de 48 ans

· La moyenne de la glycémie obtenue est de 2,32g/l

· La moyenne de l'hémoglobine glyquée est 8,29%

· Le coefficient de corrélation entre la glycémie et le taux d'HbA1c est : r=0,74 (p< 0,005) ; ceci montre qu'il y a une corrélation significative entre la glycémie et le taux d'HbA1c.

En dépit de cette corrélation, nous ne pouvons extrapoler le taux de glycémie déterminé au taux d'hémoglobine glyquée. Néanmoins, l'hémoglobine glyquée reste indispensable dans le suivi du patient diabétique.

Mots clés : Hémoglobine glyquée, glycémie, patients diabétiques