Mesure de l'efficacité d'extraits d'algues sur la vigne (Vitis vinifera L.), en conditions contrôlées et au vignoble, validée par la mesure de l'activité photosynthétique et les analyses chimiques

3.3.2. Fluorimétrie

3.3.2.1. Présentation de la méthode

Nous avons mesuré la fluorescence rapide de la chlorophylle (< 1 sec.) au moyen d'un fluorimètre, le Plant Efficiency Analyser (PEA) de la société Hansatech. Les données sont stockées dans l'appareil de mesure et ensuite transférées vers un ordinateur pour leur traitement. La capacité de stockage de l'appareil est de 82 mesures.

P Principe

Lors de la phase claire de la photosynthèse, le transfert d'énergie au niveau des pigments ne se fait pas à 100%. En effet, l'énergie solaire absorbée a plusieurs destins. Une grande partie de cette énergie sert à alimenter les réactions chimiques de la photosynthèse. Le reste est dissipé sous différentes formes dont les principales sont l'émission de chaleur et l'émission de fluorescence. Toutes ces voies de désexcitation sont interdépendantes. Ainsi, si un processus de désexcitation est rendu impossible ou est diminué pour quelque raison que ce soit, les trois autres seront augmentés.

Dès lors, une augmentation de l'émission de fluorescence indiquera une diminution plus ou moins marquée de la photochimie. Les caractéristiques de la fluorescence émise sont fondamentalement déterminées par les pigments absorbants de l'antenne pigmentaire du PSII (LHCII) ( Hall et al., 1994), le transfert d'énergie d'excitation et la nature et l'orientation des pigments. Cependant, la fluorescence est aussi affectée par l'état redox des centres réactionnels et des donneurs et accepteurs du photosystème II ( Strasser et al., 2000). La première mise en évidence d'une relation entre les réactions primaires de la photosynthèse et la fluorescence de la Chl a est due à Kautsky et Hirsh, en 1931.

Lorsqu'on illumine avec une lumière saturante un échantillon photosynthétique, préalablement adapté au noir, on peut observer une émission de fluorescence. Cette émission montre une croissance rapide jusqu'à un maximum, suivi par un déclin pour enfin atteindre une valeur stable, c'est l'effet Kautsky (figure 15). L'adaptation préalable au noir permet de vider la chaîne de transport des électrons. L'accepteur primaire d'électrons (une quinone, Q_A) est alors sous sa forme oxydée et les centres réactionnels sont dits « ouverts ». La rapide augmentation d'émission de fluorescence correspond à la réduction de Q_A en Q_A^-, commençant avec tous les centres réactionnels ouverts ( Guissé et al., 1995).

Figure 15 : courbe typique d'émission de fluorescence d'un échantillon photosynthétique in vivo, l' « effet Kautsky » ( Strasser et al., 2000)

Les mesures sont effectuées sur les feuilles attachées. L'opération consiste à envoyer un flash lumineux d'intensité saturante constante, de longueur d'onde = 650 nm, sur des feuilles préalablement adaptées à l'obscurité. Ce flash lumineux est une source d'excitation pour la chlorophylle. Cette dernière relaxe une partie de son énergie d'excitation sous forme de fluorescence. L'appareil mesure la rapide montée de fluorescence à une longueur d'onde de = 730 nm. On observe ainsi l'effet Kautsky.

P Appareil de mesure

Le PEA est un fluorimètre portable permettant de mesurer la fluorescence avec une résolution de 10 sec. L'appareil est constitué d'une boîte de contrôle et d'une unité de mesure.

Le boîtier de commande contient une batterie permettant une autonomie d'une journée de mesures au moins. Il contient également une mémoire permettant de stocker 82 mesures. On y trouve des sorties permettant des connexions vers un ordinateur, le courant du secteur et l'unité de mesure.

L'unité de mesure est constituée d'une source lumineuse d'excitation et d'une cellule de mesure de la fluorescence émise par la chlorophylle. Le rôle de source lumineuse est rempli par 6 LED (light emitting diodes) produisant un flash lumineux d'excitation (de longueur d'onde = 650 nm) d'intensité réglable (% de 600 W.m^-2). La cellule de mesure de la fluorescence est constituée d'une photodiode et d'un circuit d'amplification.

Figure 16 : boîtier de commande et unité de mesure du PEA ( Hansatech, 1999)

P Les clips

De manière à placer la feuille à l'obscurité, des clips sont positionnés au moins 30 minutes avant la mesure. Il s'agit de pinces, dont la partie se trouvant en contact avec la face supérieure de la feuille comporte une fenêtre de lecture pouvant être obstruée au moyen d'une plaque métallique coulissante. L'unité de mesure du PEA vient se positionner sur le clip, la plaque métallique est tirée et la mesure peut être exécutée.

Figure 17 : schéma d'un clip de mise à l'obscurité ( Hansatech, 1999)

P Paramètres mesurés

Le logiciel « Biolyzer », permet une visualisation des courbes de fluorescence et le calcul de certains indices via le JIP-test. En effet, les paramètres mesurés sont à la base du calcul d'un certain nombre d'expressions biophysiques et phénoménologiques conduisant à la description dynamique d'un échantillon photosynthétique à un état physiologique donné (Strasser 1998 in Hermans 1999). Les indices sont exprimés sur base d'unités arbitraires d'absorbance relative.

Tableau 6 : paramètres mesurés par le Plant Efficiency Analyser
F0	Fluorescence minimale, extrapolée à partir de la valeur de F50sec. Elle correspond à la valeur de fluorescence émise au début de l'illumination.
FM	Valeur de fluorescence maximale. Cette valeur est atteinte quand la chaîne de transport d'électron est complètement saturée et que l'accepteur d'électrons QA est complètement réduit.
FV	Fluorescence variable maximale. FV = FM - F0.
FV / FM	Ce rapport est proportionnel au rendement quantique de photochimie, il montre un degré de corrélation élevé avec le rendement quantique de la photosynthèse nette.
Tfmax	Temps écoulé entre le début de l'éclairage et le maximum de fluorescence.
Area	Surface au-dessus de la courbe de fluorescence, entre Ft et FM.
Area/FV = SM	Paramètre exprimant l'énergie nécessaire pour fermer tous les centres réactionnels.
F50sec F100sec F300sec F2msec F30msec	Valeurs correspondant aux points singuliers de la courbe (paliers pendant la montée de fluorescence).

Afin de comprendre les expressions calculées par le logiciel, on se basera sur un modèle schématique des flux d'énergie dans un appareil photosynthétique. Par souci de simplification, on considérera les composantes suivantes du PSII ( Strasser et al., 2000):

§ Pigments antennes (principalement Chl)

§ Centre réactionnel

§ Accepteur primaire d'électron (Q_A)

§ Transfert d'électron au-delà de Q_A

On peut alors définir plusieurs flux d'énergie (figure 18) :

Ø Un flux de photons absorbé par les pigments de l'antenne (ABS)

Ø Un flux de dissipation (DI) représentant la somme de toutes les voies de désexcitation, à l'exception de la photochimie. Ce flux inclut l'émission de fluorescence (F)

Ø Un flux d'énergie d'excitation atteignant le centre réactionnel et y étant piégé, aboutissant à la réduction de Q_A (TR) en Q_A^-

Ø Un flux d'énergie correspondant au transport d'électron après Q_A^- (ET)

Figure 18  : flux d'énergie dans un appareil photosynthétique

(d'après Strasser et al., 2000)

Ces flux permettent d'établir des rendements au niveau de chaque étape :

_{P Po}, le rendement quantique maximum, représentant la probabilité qu'un photon absorbé par les antennes serve effectivement à une séparation de charge au niveau du centre réactionnel.

_{P o}, l'efficacité avec laquelle l'énergie piégée va permettre de déplacer un électron plus loin que Q_A^-. Autrement dit, cela représente la probabilité qu'un photon ayant servi à la séparation de charge, déplace un électron au-delà de Q_A^-.

_{P Eo}, la probabilité qu'un photon absorbé déplace un électron dans la chaîne de transport