Cristallographie de deux enzymes : mutant de l'uridine monophosphate kinase d' E. coli insensible à la régulation allostérique et la cytokinine oxydase

II)-La cytokinine oxydase de maïs (CKOm)

Le développement de plantes est régulé par des interactions entre l'environnement et les

facteurs endogènes, particulièrement les hormones. Les phytohormones représentent l'un des éléments essentiels de la régulation de la croissance et du développement des plantes [impliquées à tous les stades depuis la pollinisation jusqu'au contrôle de la floraison, de la fructification et de la sénescence].

Les effets qu'elles provoquent sont souvent pléïotropes et résultent d'interactions complexes qui rendent leur étude difficile. Nous nous intéressons plus particulièrement aux cytokinines qui constituent une des six classes d'hormones végétales (cytokinines + gibbérellines, dormine, éthylène, auxine et brassinostéroïdes).

A-Les cytokinines (www.inrp.fr/biotic/morpho/html/cytokinines.htm)

1-Nature chimique (Figure 9): Environ 200 cytokinines ont été identifiées et isolées (depuis les années 50). Les plus fréquentes sont la trans-zéatine et la N6 -isopentényladénine. Leur formule est à base d'adénine substituée : au lieu du H du groupement amine en position 6 vient se brancher un autre groupement. De plus, beaucoup de cytokinines sont sous forme conjuguée : dans ce cas, il s'agit le plus souvent de glycosideS.

2-Lieu de synthèse : Les cytokinines sont présentes dans presque tous les tissus. Elles sont particulièrement abondantes dans les graines et les fruits. Elles sont, pour l'essentiel, synthétisées sur place, ce qui fait qu'elles se trouvent généralement en quantité suffisante sur leur lieu d'utilisation. Cependant, pour les tissus à prolifération intense, un complément peut être nécessaire. Il semble que

les tissus proches de l'apex racinaire soient impliqués dans la production des ces cytokinines surnuméraires qui vont alors migrer vers les tissus demandeurs via la sève brute.

3-Rôles : Les cytokinines :

-stimulent la division cellulaire : effet sur la duplication des chromosomes et sur le recloisonnement cellulaire ;

-peuvent agir sur l'élongation cellulaire (augmentation de la taille des cellules) au niveau des tiges ou des racines ;

-ont en général un effet inhibiteur sur l'élongation longitudinale mais favorisent l'extension radiale.

Par ailleurs, la meilleure connaissance des mécanismes de leur action devrait permettre le développement d'une utilisation raisonnée des régulateurs de croissance à activité agoniste ou

antagoniste en agriculture et en arboriculture.

HN

N ^HN

N

^N N

N N

H

HA8

NH N

N6-(2-isopentenyl)adénine: IP

Inhibiteur

Figure 9 : Formules de quelques cytokinines et d'un inhibiteur

CKOm

^H2^O

Cytokinine

Composé intermédiaire

(Quinones)

Adénine

Aldéhyde

Figure 10 : Dégradation des cytokinines par la CKOm (Malito et al, 2004)

B-La cytokinine oxydase du maïs (CKOm)

1-Propriétés et Structure 3D : Dans beaucoup de tissus végétaux l'oxydation semble être la voie

principale pour l'inactivation des cytokinines. Le système enzymatique capable de cliver la chaîne N6- latérale des cytokinines a été découvert en 1971 par Paèes et al. Les cytokinines oxydases de maïs (CKOm) oxydent les cytokinines en présence d'oxygène moléculaire [dégradation irréversible : production de l'adénine et d'un aldéhyde] (Figure 10). La CKOm est une flavoenzyme monomérique,

elle fait partie de la famille des oxydoréductases à cofacteur FAD (Flavine Adénine Dinucléotide), ce dernier est lié d'une façon covalente à l'His 87. La MM de la CKOm est de 69 kDa, sa séquence est constituée de 516 aa. L'aminoacétonitrile, HA-8 (un inhibiteur irréversible : molécule suicide) et le cyanure (CN) inhibent son activité alors que les complexes de cuivre-imidazole l'activent (Kopeèny

et al, 2004).

Le clonage du gène de ckx, fait en 1999, fut une étape cruciale dans l'élucidation du rôle de la CKOm dans le développement des plantes (Galuszka et al, 2001 ; Malito et al, 2004). Des grains de maïs, l'orge et de blé ont été souvent employés pour la purification de la CKO.

Les seules structures de la CKO disponibles sur la PDB sont celles publiées en 2004 par Malito

et al : enzyme seule, complexée avec Isopentényladénine (IP), avec la Trans-zéatine (TZ) et avec la

Benzylaminopurine (Figure 11 a)).

2-Objectifs du stage : Plusieurs mutant ont étés produits par mutagenèse dirigée (Figure 11 b)). La détermination de la structure 3D de mutant de résidus proches du FAD et de l'enzyme sauvage en

présence d'inhibiteurs va permettre de mieux comprendre le fonctionnement de cette enzyme.

Figure 11 a) : Structure de

la CKOm

La CKOm est monomérique, elle comporte deux

domaines :

-en bleu le domaine de liaison avec le FAD

-en rouge le domaine de fixation du substrat

Le FAD est montré en jaune, le substrat (IP) est

montré en noir (Malito et al, 2004).

Figure 11 b) : Mutants de la CKOm

ion du substrat

^{%o Leu)} P427 - hydrop

P427Q (Pro %o

V378 - fixation du substrat

V378 L (Val %o Leu)

P427 - hydrophobicité

P427Q (Pro %o Gln)

E288 - interaction avec le D169

E288Q (Glu %o Gln)

D169 - fixation du substrat

D169 - fixation du substrat Résidu clef dans la catalyse D169E (Asp %o%o%o%o Glu)

D169N (Asp %o Asn)

Résidu clef dans la catalyse

D169E (Asp %o Glu) D169N (Asp %o Asn)

L492 - transfer de protons et reduction du FAD

L492A (Leu %o Ala)

L492 - transfer de protons et reduction du FAD

L492A (Leu %o Ala)

Figures 11 a) et b) : Structure 3D et sites de mutagenèse dirigée de la CKOm