Activité antifongique des huiles essentielles de pulicaria mauritanica et micromeris debilis sur quelque souches du genre alternari.

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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

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Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Centre Universitaire Salhi Ahmed -Naâma-

Institut des Sciences et Technologies
Département des Sciences de la Nature et de la Vie

Mémoire de fin d'études

En vue de l'obtention du Diplôme de
Master Académique en science biologique

Spécialité : Microbiologie Appliquée
Thème

Etude de l'activité antifongique des huiles essentielles de

Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis contre quelques

champignons phytopatogènes du genre Alternaria sp

Présenté par :

Mme BENATTA Fatima Zahra Mme DJELILATE Yosra

Soutenu le : 01 Juillet 2018

Jury :

Président : M. MERIOUA SIDI MOHAMMED M.C.B

Encadreur : M. GHERIB MOHAMMED M.C.A

Examinateurs : M. AMROUCHE ABDELILEH M.C.A

Mme YAKOUBI MERYEM M.A.B

Année Universitaire 2018/2019

Remercîement

Ce mémoire n'aurait pas pu être ce qu'il est, sans l'aide d'ALLAH Miséricordieux le tout puissant qui nous a donné la force afin de l'accomplir.

Tous d'abord nous tenons à exprimer nos profonds remerciements et notre vive reconnaissance à notre promoteur,

Mr GHERIB Mohammed. Maitre de conférences Au département de SNV, Faculté des sciences et technologie, Centre Universitaire Salhi Ahmed de Naama, pour nous avoir fait l'honneur de diriger ce travail. Nous voudrons qu'il trouve ici toute notre reconnaissance pour ses encouragements, ses conseils, ses recommandations, le temps qu'il nous a consacré et sa bienveillance.

Nous adressons nos sincère remercîments à Mr MERIOUA Sidi Mohammed Maitre de conférence B au C.U. Naama d'avoir accepté de présider le jury de ce mémoire .Les remarques et suggestions seront d'une grande valeur pour l'enrichissement de ce travail.

Nous remercions profondément M^r AMROUCHE AbdelIllah Maitre de Conférences A au C.U.Naama pour sa disponibilité et ses encouragements pour l'accomplissement de ce travail. Qu'il trouve ici notre profonde reconnaissance. Nous le remercions aussi d'avoir accepté de juger ce travail.

Nous voudrons remercier très sincèrement notre Co-promoteur et notre examinatrice M^me YAKO7JBI Meryem maitre assistante B au C.7J.Naama .Nous la remercions, du fond du coeur pour l' esprit scientifique et humain de grande qualité.

Nous exprimons aussi notre reconnaissance à M^r Maarouf Abderezzak professeur au C.7J.Naama pour son aide pour l'identification des plantes médicinales étudiées.

A Mme

BENHAMZA Messaouda, pour le soutien moral, les encouragements, les conseils et la disponibilité ; qu'elle trouve ici notre profonde reconnaissance.

Nos remercîments vont également à l'ensemble du personnel technique des laboratoires dans lesquels ce travail a été réalisé, pour la sympathie qu'ils nous ont témoignée ainsi qu'à toute, les personnes qui, de prés ou de loin, nous ont aidé pour achever ce travail.

Dédicace

Je dédie ce travail

A mon père pour ses encouragements et son soutien

tout au long de mes études et aussi pour ses innombrables

sacrifices.

A ma mère que Dieu le tout-puissant la protège et lui

donne la force pour qu'elle continue à couronner notre vie.

A mes soeurs : Amina et khadidja.

A mes frères : Boubeker, Omar et Othman.

A mes nièces et mes neveux.

A toute ma famille.

A mes amis :Siham, Yakout et Farouk

Fatima Zahra

Dédicace

Je dédie ce travail

A ma mère qui m'a donné la vie

A mon père qui s'est sacrifié pour mon bonheur et ma

réussite.

A mes frères, mes soeurs et ma petite Chaimaa

A tous les membres de ma famille, petite et grande

A ceux, qui me sont chers.

Yosra

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Abstract

This stady aimed to evaluate in vitro the antifungal activity of the essential oils of two aromatic plants growing in Naama: Pulicaria mauritanica and Micromeria debilis against ten fungal strains belonging Alternaria sp responsible of the fungal diseases that infect tomatoes..

The identification of fungal isolates was based on cultural traits and morphological characters. The results showed that the identified strains belong to the following species: Alternaria alternata, Alternaria tenuissima, Alternaria solani and Alternaria tomatophila.

While, the yield of essential oil resulting from a hydrodistillation extraction was of the order of 0.30% and 0.045% for P.mauritanica and M.debilis respectively. The study of the antifungal activity of these oils by the direct contact method revealed an important activity to some strains tested.

The effectiveness of each EO is estimated by determining the inhibition rate of mycelial growth and the rate of inhibition of sporulation, where the total inhibition of the majority of strains gave us MIC mean value ranging between 0.95 to 1.1ìl / ml.

Finally, these oils can be considered as a potential alternative to synthetic fungicides.

Key words: Pulicaria mauritanica, Micromeria debilis, Alternaria sp, Hydrodistillation, Essential oil, Antifungal activity.

Résumé

Le but de ce travail était d'évaluer l'activité antifongique in vitro des huiles essentielles de deux plantes aromatiques de la région de Naama : Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis vis-à-vis de dix souches fongiques du genre Alternaria sp responsables de l'alternariose de la plante de tomate.

L'identification des isolats fongiques a été basée sur les caractères culturaux et les caractères morphologiques. Les souches identifiées appartiennent aux espèces Alternaria alternata, Alternaria tenuissima, Alternaria solani et Alternaria tomatophila.

Le rendement en huile essentielle issu d'une extraction par hydrodistillation était de l'ordre de 0.30% et 0.045% pour P.mauritanica et M.debilis respectivement. L'étude de l'activité antifongique de ces huiles par la méthode de contact direct a révélé une importante activité vis-à-vis des souches testées.

L'efficacité de chaque HE est estimée par la détermination du taux d'inhibition de la croissance mycélienne et le taux d'inhibition de la sporulation, d'où l'inhibition total de la majorité des souches nous a donné des valeurs de CMI comprises entre 0.95 à 1.1ul/ml.

En conclusion, ces huiles peuvent être considérées comme une alternative potentielle aux fongicides synthétiques.

Mots clés : Pulicaria mauritanica ,Micromeria debilis ,Alternaria sp, Hydrodistillation ,Huile essentielle, Activité antifongique.

Glossaire

Chlamydospore : une spore à grande paroi épaisse, une spore de repos, de plusieurs types

de champignons

Conidies: Spore issue de la multiplication asexuée formée à l'extrémité d'un conidiophore.

Conidiophore: Hyphe aérien spécialisé qui produit à son extrémité plusieurs conidies.

Dictyospore : une spore multicellulaire de certains champignons qui a des cloisons

transversales et longitudinales

Floraison : Phase du cycle vital des phanérogames qui marque le début de la période

reproductive

Fragrance : odeur agréablement parfumé émise par les plantes

Hyphe : Filament dépourvu de chlorophylle constituant le thalle des champignons.

Isolat: Matériel biologique prélevé sur un organisme vivant, en vue de son étude ou de sa

culture in vitro.

Mycélium: Appareil végétatif d'un champignon constitué d'un ensemble d'hyphes.

Pathogène : organisme susceptible de causer une maladie.

Phytopathogène : Qui cause une maladie chez les plantes.

Piriforme : en forme de poire

Plante hôte: Espèce de plante dont dépend le développement d'un organisme (source

nutritive).

Pubescent : qui est couvert d'un duvet de poils fins et courts

Rampant : en botanique, qualifie certains organes d'une plante croissant parallèlement au sol

Rendement : la grandeur qui exprime la production généralement en poids.

Sédatif : une substance qui a une action dépressive sur le système nerveux.

Spore : Spore issue de la multiplication sexué et asexuée.

Sporulation ; aptitude d'un champignon à produire des spores.

Liste des figures

Figure 1 Différents organes de la tomate a: Les feuilles b : la fleur c: Le fruit P5

Figure 2 Chaine des conidies P9

P10

Figure 3 A. alternata, (a) colonie sur gélose pomme de terre carotte (PCA)

après 6 jours, (b) modèle de sporulation à long chaînes, (c) conidies dans une chaîne avec septa longitudinaux et transversaux

Figure 4 A.tenuissima, (a)colonie sur PCA après 6 jours, (b) sporulation à

courte chaine, (c) chaînes conidiales et conidies

P11

P11

Figure 5 A. arborescens, (a) colonie sur PCA après 6 jours, (b) modèle de

sporulation à long conidiophore primaire, (c) conidies avec des décorations de surface.

Figure 6 A.solani , colonie sur PCA après 6 jours et les conidies P12

Figure 7 Conidies et conidiophores de la souche A. tomatophila représentative P12

Figure 8 Symptômes de l'aternariose sur la foliole P13

Figure 9 Symptômes de l'aternariose sur fruit P13

Figure 10 Lésions provoquées par Alternaria tomatophila et A.alternata; A sur tige, B sur collet

P14

Figure 11 Développement et symptômes de maladies causées par Alternaria spp P16

Figure 12 Formule chimique de l'isoprène méthyl-2-buta-1,3-diène P18

Figure 13 Méthodes d'extraction des HE P20

Figure 14 Appareillage utilisé pour l'hydrodistillation P20

Figure 15 Photo de Pulicaria mauritanica P23

Figure 16 Photo de Micromeria debilis P25

Figure 17 Photos représentant les étapes de l'induction de la sporulation P29

Figure 18 Photos représentant la methode de microculture P30

Figure 19 Situation géographique des lieux des prélèvements P31

Figure 20 Montage de type Clevenger P32

Figure 21 Protocole expérimental de l'activité antifongique P34

Figure 22 Photo représente la détermination du taux d'inhibition de la sporulation

P35

P38

Figure 23 Aspect macroscopique des colonies (revers et avers) des espèces d'Alternaria à petite spores sur milieu PDA

P38

Figure 24 Aspect macroscopique des colonies (revers et avers) des espèces d'Alternaria à grosses spores sur milieu PDA

P39

Figure 25 Aspect macroscopique des colonies des espèces d'Alternaria à petites

spores sur milieu PCA après induction de la sporulation

Figure 26 Aspect macroscopique des colonies des espèces d'Alternaria à grosse

spores sur milieu PCA après induction de la sporulation

P39

Figure 27 Aspect microscopique des espèces d'Alternaria à petites spores . P40

Figure 28 Aspect microscopique des espèces d'Alternaria à grosses spores P41

Figure 29 Huile essentielle de P. mauritanica P40

Figure 30 Huile essentielle de M. debilis P40

P43

Figure 31 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A01 et A10) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P. mauritanica

Figure 32 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria( A18 et A37 et A42) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P. mauritanica

P44

P45

Figure 33 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A45, A51 et A57) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P. mauritanica

Figure 34 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (AT01 et AT04) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P.mauritanica

P46

P47

Figure 35 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A01 et A10) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis

Figure 36 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A18, A37et A42) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis.

P48

P49

Figure 37 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A45, A51et A57) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis.

P50

Figure 38 Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (AT01 et AT04) en fonction de temps et concentration de l'huile essentielles de M.debilis

Figure 39 Taux d'inhibition de la croissance mycélienne de l'HE P.mauritanica. P51

Figure 40 Taux d'inhibition de la croissance mycélienne de l'HE M.debilis. P51

Figure 41 Taux d'inhibition de la sporulation de l'HE de P.mauritanica P53

Figure 42 Taux d'inhibition de la sporulation de l'HE de P.mauritanica P53

P54

Figure 43 Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrations d' HE.de P.mauritanica aprés 10 jours d'incubation.

Figure 44 Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrations d' HE.de P.mauritanica aprés 10 jours d'incubation.

P55

P56

Figure 45 Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrations d' HE.de M.debilis aprés 10 jours d'incubation.

Figure 46 Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrationsd' HE.de M.debilis après 10 jours d'incubation

P57

P58

Figure 47 Vitesse de la croissance mycélienne sous l'effet de différentes concentrations en HE de P.mauritanica

P59

Figure 48 Vitesse de la croissance mycélienne sous l'effet de différente concentration en HE de M.debilis

Liste des tableaux

Tableau 1 Principaux pays producteur de la tomate P6

Tableau 2 Origine des isolats d'Alternaria sp. P28

Tableau3 Caractères culturaux des isolats d'Alternaria sp sur milieu PDA P37

Tableau 4 Caractéristiques des huiles essentielles P41

Tableau 5 Rendement calculé en (%) pour les deux espèces étudiées P42

Table des matières

Remerciment Dédicace

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Abstract Résumé

Glossaire

Liste des figures Liste des tableaux Table des matières

Introduction générale 1

Partie bibliographique 2

Chapitre I : La plante hôte 4

I.1 Généralité sur la tomate 4

I.2 Historique 4

I.3 Nomenclature et classification 4

I.4 Description botanique 5

I.5 Production de la tomate 5

I.5.1 Dans le monde 5

I.5.2 En Algérie 6

I.6 Importance nutritionnelle 6

Chapitre II: Le pathogène 7

II .1 Généralités sur Alternaria 7

II.2 Historique 7

II.3 Classification 8

II.4 Caractéristiques du genre 8

Table des matières

II .4.1 Caractères culturaux 8

II .4.2 Caractères morphologiques 9

II .5 Alternaria pathogène des tomates 9

II .5 .1 Alternaria à petite spore 9

II .5 .1.1 Alternaria Alternata 9

II .5 .1.2 Alternaria Tenuissima 10

II .5 .1.3 Alternaria arborecsence 11

II .5 .2 Alternaria à grosse spore 11

II .5 .2.1 Alternaria solani 11

II .5 .2.2 Alternaria tomatophila 12

II .6.Alternariose 12

II.6.1 Symptômes 13

II.6.1.1 Sur feuiles 13

II.6.1.2 Sur fruits 13

II .6.1.3 Sur tiges et collets 14

II .7 Cycle infectieux 14

II .7. 1 Conservation, source d'inoculum 14

II .7. 2 Pénétration et invasion 14

II .7. 3 Sporulation et dissémination 15

Chapitre III les huiles essentielles 17

III.1.Aromathérapie 17

III.2.Généralités sur les huiles essentielles 17

III.3 Chimie des huiles essentielles 18

III.3.1 Terpènes et Terpénoides 18

III.3.2 Composés aromatiques 19

III.4 Caractéristiques et propriétés physiques 19

III.5.Méthodes d'extraction 19

Table des matières

III.5.1 Méthodes conventionnelles 20

III.5.1.1 Hydrodistillation 20

III.5.1.2 Extraction par entraînement à la vapeur d'eau 21

III.5.1.3 Pressage à froid 21

III.5.1.4 Enfleurage 21

III.5.1.5 Extraction par solvant organique 21

III.5.2 Méthodes innovantes 21

III.5.2.1 Extraction par micro-onde 21

III.5.2.2 Extraction par les ultrasons 21

III.6 Analyses des huiles essentielles 22

III.7.Rendement 22

III.8 Conservation des huiles essentielles 22

III.9 Action des huiles essentielles contre les champignons 22

III.10 Plantes étudiées 23

III.10.1 Pulicaria mauritanica 23

III.10.1.1 Description botanique 24

III.10.1.2 composition chimique 24

III.10.1.3 Propriétés thérapeutiques 24

III.10.2 Micromeria debilis 25

III.10.2.1 Description botanique 25

III.10.2.2 composition chimique 26

III.10.2.3 Propriétés thérapeutiques 26

Partie éxpérimentale 27

Chapitre I : Matériels et méthodes 28

I.1 Matériel fongique 28

I.1.1 Choix des souches 28

I.1.2 Origine des souches 28

Table des matières

I.1.3 Repiquage des souches 28

I.1.4 Induction de la sporulation 29

I.1.5 Conservation des isolats 29

I.1.6 Identification des isolats 29

I.1.6.1 Etude macroscopique 29

I.1.6.2 Etude microscopiques 30

I.2 Matériel végétal 31

I.2.1 Récolte de matériel végétal 31

I.2.2 Identification botanique 31

I.2.3 Préparation des échantillons 31

I.2.4 Extraction de l'huile essentielle 32

I.2.5 Calcul du rendement en huile essentielle 32

I .3 Activité antifongique 30

I .3.1 Effet des huiles essentielles sur la croissance mycélienne 30

I .3.2 Évaluation de l'indice antifongique 34

I .3.3 Effet des huiles essentielle sur la sporulation 35

I .3.4. Détermination de la vitesse de la croissance mycélienne 35

Chapitre II : Résultats et Interprétations 36

II .1 Matériel fongique 36

II .1.1 Identification des isolats 36

II .1.1.1 Etude macroscopique 36

II .1.1.2 Etude microscopique 40

II .2 Caractéristiques des huiles essentielles 41

II .3 Rendement des huiles essentielles 42

II .4 Activité antifongique 42

II .4.1 Cinétique de la croissance mycélienne 42

II .4.1.1Cas de l'HE de P. mauritanica 42

Table des matières

II .4.1.2 Cas de l'HE de M.debilis 47

II .3 .3 Taux d'inhibition de la croissance mycélienne 50

II .3 .4 Taux d'inhibition de la sporulation 52

II .3 .4 Détermination de la vitesse de la croissance mycélienne 58

Conclusion générale 62

Références bibliographiques 65

Annexes

« Le don d'une pLante utiLe me parait

pLus précieux que La découverte d'une mine

d'or et d'un monument pLus durabLe qu'une

pyramide »

Bernardin de Saint-Pierre.

INTRODUCTION

Page 1

Introduction

Les champignons sont les principaux agents infectieux des plantes, responsables des altérations au cours des stades de développement, et sont les principaux microorganismes responsables de pertes en agriculture (kacemi et al, 2017).

Les espèces du genre Alternaria sont répandues à grande échelle. Une partie considérable des espèces sont cosmopolites .Selon le style de vie saprophytes ils se développent sur les parties mortes des plantes. Une partie d'entre eux jouent un mode de vie parasite necrotrophes et une qui cause des graves maladies, ces espèces sont considérées comme un véritable organisme nuisible spécifique de l'hôte.

Les symptômes causés par ces pathogènes se présentent généralement sous forme des taches brunes à noirâtre sur les solanacées. Les dégâts causés par les principaux agents de l'alternariose se traduisent par des brulures au niveau des feuilles, des tiges, des collets et des fruits (Ranc, 2010).

Cette maladie est contrôlée souvent par des fongicides. Or, ces derniers constituent un véritable danger pour la santé humaine et l'environnement (kacemi et al., 2017).

Le traitement des mycoses reste difficile d'une part du fait du nombre limité de principes réellement efficaces et de leur coût très élevé et d'autre part lié à l'émergence de souches résistantes à certains antimycosiques usuels (El Mansouri, 2013).

Ces différentes difficultés ont suscité l'intérêt de plusieurs chercheurs à trouver d'autres substances fongitoxiques inoffensives et non polluantes, pouvant être une solution alternative aux médicaments actuels.

Les plantes aromatiques et médicinales de part leur utilisation ancestrale nous offrent un terrain important d'investigation (El Haci, 2015).

Différentes espèces de végétaux sont connues depuis longtemps par leurs effets antimicrobiens. Les plantes aromatiques et médicinales (PAM) constituent une richesse naturelle très importante dont la valorisation demande une parfaite connaissance des propriétés à mettre en valeur. Les propriétés médicales des plantes médicinales dépendent de la présence d'agents bioactifs variés et appartenant à différentes classes chimiques. Ces propriétés, dues souvent à la fraction d'huile essentielle (HE), peuvent être mises à profit pour traiter les infections mycosiques (El Mansouri, 2013) .

les huiles essentielles représentent des molécules de fortes valeurs, utilisées dans la pharmacologie car elles ont un effet spécifique sur d'autres organismes (Remmal et al., 1993), elles ont un spectre d'activité très large due principalement à leur grande affinité

Introduction

grâce a leur natures, pour cela, les activités antibactériennes de ces produits ont été rapportées dans de très nombreux travaux (Bouzouita et al., 2008).

La région Sud-Ouest de notre pays même si elle est dotée d'un climat sec renferme des régions qui possèdent des variétés de plantes surprenantes par leur aspect et par leur capacité d'adaptation.

Le présent travail constitue l'ébauche d'un projet de recherche dans le but de valoriser la flore locale visant à étudier l'activité antifongique in vitro des huiles essentielles de deux plantes aromatiques Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis de la wilaya de Naama sur dix (10) souches de champignons du genre Alternaria responsables des taches brunes de la tomate.

Nous avons organisé notre travail en trois grandes parties:

? La 1^ere partie consiste une étude bibliographique sur la plante hôte, le pathogène et la lutte biologique par les huiles essentielles de deux plantes aromatiques : Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis.

? La 2^eme partie représente la partie expérimentale qui consiste à l'identification des espèces d'Alternaria , l'extraction des huiles essentielles de Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis et l'étude du pouvoir antifongique de ces deux plantes sur les espèces d'Alternaria sp.

? La 3^eme partie est consacrée à la présentation des résultats obtenus et leurs discussions.

? Enfin, notre travail est clôturé par une conclusion générale pour restituer les principaux résultats obtenus, les limites de notre travail et les perspectives voulues pour pouvoir compléter et améliorer cette étude.

Page 2

PARTIE

BIBlIoGRAPHIQUE

Page 4

Partie bibliographique

Chapitre I : La plante hôte

I.1 Généralité sur la tomate

La tomate (Solanum lycopersicum), est l'un des plus populaires légumes dans le monde entier et le deuxième produit le plus précieux après la pomme de terre, fraîches ou après transformation (Kumar et al., 2008) avec une production de 170,8 millions de tonnes en 2013 (FAO, 2013).

I.2 Historique

La tomate est originaire de l'Amérique de Sud, dans la région montagneuse des Andes (Equateur, Pérou, Chili), la tomate fut domestiquée au Mexique, avant d'être importé en Europe au XVI siècle par les conquistadores (Peratla et al., 2006).

En Algérie, la tomate a été introduite par les cultivateurs du Sud de l'Espagne. Sa culture a commencé dans la région d'Oran en 1905 puis, elle s'étendit vers le centre, notamment au littoral Algérois (Latigui, 1984).

I.3 Nomenclature et classification

En 1753, le botaniste suédois Linnaeus l'a nommée Solanum lycopersicum, mais 15 ans plus tard Philipe Miller a remplacé ce nom par Lycopersicom esculentum. Bien que les taxonomistes aient récemment réintroduits son nom original Solanum lycopersicum (Milet, 2017).

La tomate fait partie de la famille des Solanaceae et du genre Solanum. La famille des Solanaceae comprend 94 genres et environ 2950 espèces cosmopolites. Le genre Solanum est très important dans le monde (environ 1700 espèces recensées) et comporte des plantes alimentaires comme la pomme de terre (Solanum tuberosum), et bien sûr la tomate (Ranc, 2010).

La classification scientifique de la tomate proposée en 2007 par Benton est la suivante :

· Règne : Plantae

· Embranchement : Tracheophyta

· Classe : Mangoliopsida

· Ordre : Solanales

· Famille : Solanaceae

· Genre : Solanum

· Espèce : Solanum lycopersicum

Page 5

Partie bibliographique

I.4 Description botanique

La tomate est une plante herbacée vivace, ce qui signifie qu'elle peut vivre plusieurs années, elle est cultivé dans les régions à climat chaud, mais peut également être planté dans une serre en hiver (Possada, 2016), c'est une plante aux tiges ramifiées et port rampant. La tige est pubescente, épaisse aux entre-noeuds. Les feuilles sont composées (5à7 folioles), alternées et persistantes. Les fruits sont des baies formées de 2 à 3 loges, à graines très nombreuses, et dont la taille, la forme et la couleur varient avec les différentes variétés. Elle a une température optimale de croissance de l'ordre de 25°C et un thermopériodisme journalier de 10°C, conditions qu'elle a retenues de son origine montagnarde (Bessadat, 2014).

a

b

c

Figure 1: Différents organes de la tomate a: Les feuilles b : la fleur c: Le fruit
(Oukala, 2014).

I.5 Production de la tomate

I.5.1 Dans le monde

Les principaux pays producteurs sont la Chine, les USA, l'Inde, la Turquie, l'Egypte, l'Italie, l'Iran, le Brésil et l'Espagne.

La tomate représente 8,2% de la surface totale assignée pour l'agriculture et les récoltes industrielles (MADR, 2013)

La production de la tomate a progressé régulièrement, elle est passée de 48 millions de tonnes en 1978 à 159 millions de tonnes en 2011 (Blancard et al., 2009 )

Le tableau 1 montre les principaux pays producteur de la tomate en 2013.

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Tableau 1: Principaux pays producteur de la tomate (FAOSTAT, 2013)

Classement	Pays		Production*	01
Chine	52.6		02
Inde	18.8		03
Etats-Unis	14.5		04
Turquie	11.9		05
Egypte	8.3		06
Iran	6.0		07
Italie	5.6		08
Espagne	4.9

* : Millions de tonnes

I.5.2 En Algérie

La tomate occupe une place privilégiée dans le secteur maraicher en Algérie. Elle est considérée comme une espèce prioritaire et classée en troisième lieu après la pomme de terre et l'oignon. La production moyenne en 2011 est de 790 mille tonnes avec un rendement moyen de 336 Qx / ha (Snoussi, 2010).

I.6 Importance nutritionnelle

La tomate est très prisée pour son intérêt alimentaire et sa valeur nutritive. Le fruit de tomate est très riche en vitamine A, C et K, sa composition en vitamine, en acide organique, potassium et en lycopène le rend un légume anticancéreux. (Possada, 2016)

Sa richesse en nutriment, leur peau fine et leurs tissus mous rend les tomates facilement infectées et susceptibles à une pénétration et une croissance rapides des différents types d'espèces d'Alternaria. (Vaquera et al., 2014)

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Chapitre II: Le pathogène

II .1Généralités sur Alternaria

Alternaria est un genre fongique omniprésent qui comprend prés de 275 espèces (Simmons, 2007) mésophile, leurs activités prédominantes disparaissent lorsque la température s'élève (Botton et al., 1990) , avec des modes de vies saprophytes endophytes et phytopathogènes (Saharan et al., 2016), qui peuvent affecter les cultures sur champ ou les produits végétaux pendant la récolte et post-récolte (Logrieco et al., 2009).

En général, les espèces du genre Alternaria provoquent une destruction relativement lente des tissus hôtes par la réduction du potentiel photosynthétique. Les tissus affaiblis par le stress, la sénescence ou les blessures sont plus susceptibles à l'infection par Alternaria sp. (Vaquera et al., 2014) . Ce genre peut pousser sur plusieurs substrats y compris les graines, les feuilles et les fruits des plantes, cultures, sol et air (Kokaeva et al., 2015).

Les spores sont de couleur brune foncée et naissent en chaînes simples ou ramifiées à l'extrémité de conidiophores simples et sombres ; elles sont divisées en plusieurs cellules par des parois transversales et verticales. Les nouvelles spores sont produites par extrusion à l'extrémité de la spore précédente, par le biais d'un pore de la paroi. Elles sont communément isolées à partir de la décomposition des matières végétales, mais causent aussi des maladies des plantes. Les spores des Alternaria sont dispersées par les courants d'air et sont généralement une composante majeure de l'air extérieur (Siciliano, 2017). Certaines espèces produisent des toxines spécifiques à l'hôte (HST) qui contribuent à leur pouvoir pathogène et à leur virulence (Virginia, 2016).

Les espèces d'Alternaria sont des agents phytopathogènes responsables de la détérioration des produits agricoles, capables de produire des métabolites secondaires potentiellement affectant la santé humaine (Siciliano, 2017) voire des pertes économiques, les aliments végétaux infectés par Alternaria peuvent introduire de grandes quantités de ces toxines dans l'alimentation humaine. Des études supplémentaires sur le potentiel toxique de ces toxines et leur danger pour la consommation humaine sont nécessaires pour réaliser une évaluation fiable des risques liés à une exposition alimentaire (Virginia, 2016)

II.2 Historique

En 1816, Nees décrit pour la première fois un champignon qu'il a nommé Alternaria tenuis. Parmi les caractéristiques de ce genre ; la production des chaines de

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conidies de couleur foncé avec des septa transversales et longitudinales ; il a cité cette espèce comme un synonyme de Torula alternata.

En 1832 Fries a établi un nouveau genre Macrosporium, comprend des espèces ayant les mêmes caractéristiques avec Alternaria et qui ont aujourd'hui reconnus comme des espèces d'Alternaria. Pendant une bonne période, de nombreuses espèces d'Alternaria ont été décrites. Deux autre genres ont été établi :Stemphylium et Ulocladium avec les mêmes caractéristiques, ces genres compliquent la résolution taxonomique. Kiessler (1912) a mis le synonyme à la fois A.tenuis et Torula alternata avec A. alternata Kiessel. Wiltshire (1933,1938) a proposé des critères pour les genres Alternaria et Stemphylium, Ulocladium n'a pas été officiellement reconnus. En 1964 Joly a proposé que ces espèces atypiques classées comme Alternaria. Plusieurs descriptions et critères morphologiques révisés de ces genres, données lieu à un nombre croissant de nouvelles espèces qui ont été résumés dans Simmons (2007), dans lequel 275 espèces d'Alternaria ont été reconnues.

II .3 Classification

Le genre Alternaria comprend plus de 250 espèces. Les méthodes traditionnelles d'identification des espèces d'Alternaria sont basées sur les caractéristiques morphologiques, des structures de reproduction et les schémas de sporulation dans des conditions de culture contrôlées. (Virginia, 2016)

Le genre Alternaria appartient à la classification suivante :

· Phylum: Ascomycota

· Subdivision: Pezizomycotina

· Classe: Dothediomycetes,

· Ordre: Pleosporales

· Famille: Pleosporaceae.

· Genre : Alternaria

Alternaria appartient à la division Deuteromycota avec plusieurs espèces. (Mamgain, 2013).

II .4 Caractéristiques du genre

II .4.1 Caractères culturaux

Les colonies sont de croissance rapide sur milieu Sabouraud à 25-30°C. La

croissance est habituellement inhibée à 37°C, comme en présence de cycloheximide. La colonie, blanc-gris au départ, devient rapidement foncée (vert foncé à noire) au recto comme au verso. La texture est duveteuse à laineuse (Pitt et Hocking, 1997).

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II .4.2 Caractères morphologique

Les hyphes, septés, sont ramifiés et tardivement certains filaments sont pigmentés en brun. Les conidiophores sont cloisonnés, bruns, septés, simples ou ramifiés, plus ou moins droits ou flexueux (génicules) (Chabasse, 2002) .

Les conidies sont de couleur brune également, très caractéristique du genre, organisées en chainette. Ce sont des dictyospores : conidies piriformes, à la base élargie avec des septa transversaux, obliques et longitudinaux en nombre variable. Leur extrémité est constituée d'une partie rétrécie plus ou moins longue appelée le « bec ». L'aspect global rappelle la forme d'une massue. Elles mesurent entre 50-100 um de long et 3-16 um de large (Calmes, 2011).

Figure 2 : Chaines des conidies

II .5 Alternaria pathogène des tomates

Alternaria est signalé depuis plusieurs décennies comme pathogène des Solanacées surtout l'espèce A.solani et a longtemps été décrit comme affectant la tomate, l'aubergine, la pomme de terre, ainsi que plusieurs membres de cette famille botanique (Blancard et al., 2012). Ainsi, plusieurs espèces d'Alternaria seraient inféodées à plus d'une soixantaine de Solanacées (Bessadat, 2012).

II .5 .1 Alternaria à petite spore

II .5 .1.1 Alternaria Alternata

A. Alternata est un champignon filamenteux cosmopolite ubiquiste. Communément isolé à partir de plantes, de sols, de nourriture corrompue ainsi qu'à partir de l'air. Elle présente des colonies veloutées parfois à centre cotonné de couleur vert olivâtre à vert foncé.

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Les hyphes sont septées, les conidiophores sont bruns, septés et elles ont souvent l'aspect de «zigzags».Ils portent des conidies simples ou ramifiées. Les conidies présentent des cloisonnements transversaux (1à8) et longitudinaux (0à3) avec une taille de 6,559,8×4,2-16,5 ìm. (Bessadat et al., 2014)

A alternata a été considéré comme l'espèce principal productrice de mycotoxine, les autres membres du genre tels que : A. solani, A.arborescence, A. tenuissima capable aussi de produire ces contaminants toxiques dans leur hôte.

A. alternata produit plusieurs toxines, dont la plus importante est l'acide tenazonique (TA). (Logrieco et al., 2003)

a

b

c

Figure 3: A. alternata, (a) colonie sur gélose pomme de terre carotte (PCA) après 6 jours, (b) modèle de sporulation à long chaînes, (c) conidies dans une chaîne avec septa longitudinaux et transversaux (Ramezani et al., 2019).

II .5 .1.2 Alternaria tenuissima

A. tenuissima, a des conidiophores solitaires ou dans des groupes, simples, bruns, lisse et septés. Les conidies ont été solitaires ou dans des chaînes courtes, la longueur des conidies est habituellement plus courte avec une couleur brune à brune doré, Les conidies présentent des cloisonnements transversaux (4à9) et longitudinaux (0à4) avec une taille de 9,8-60,20 × 8,6-15,5 ìm. (Bessadat et al ,2014)

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a

b

c

Figure 4: A.tenuissima, (a)colonie sur PCA après 6 jours, (b) sporulation à courte chaine, (c) chaînes conidiales et conidies (Ramezani et al., 2019).

II .5 .1.3 Aletrnaria arborescens

A.arborescens appartient au groupe d'espèces à petites spores au sein du genre Alternaria avec de couleur de spore brune et de taille de 8,6-38,4 X 3,2-12,8 ìm ; les conidies présentent des septa transversals varient de 1-6 et longitudinal ou oblique varient de 0-3, la chaîne de conidies est apparue comme faible touffes de branches bien ramifiées. (Bessadat et al ,2014)

a

b

c

Figure 5 : A. arborescens, (a) colonie sur PCA après 6 jours, (b) modèle de sporulation à long conidiophore primaire, (c) conidies avec des décorations de surface.

II .5 .2 Alternaria a grosse spore

II .5 .2.1 Alternaria solani

A. solani appartient au groupe d'espèces à grosses spores au sein du genre Alternaria, les conidies solitaires, supportées individuellement ou rarement en chaine de

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deux, sur des conidiophores simples et séptés (Neergaard, 1945) elles mesurent entre 150 et 200 ìm de long (de la base à l'extrémité du bec) (Simmons, 2007).

a

b

c

Figure 6: A.solani , (a) colonie sur PCA après 6 jours, (b et c ) les conidies
(Zheng et al. , 2015)

II .5 .2.2Alternaria tomatophila

A.tomatophila comme A. solani, appartient aux espèces à grosse spores. Elle dispose d'un mycélium cloisonné se mélanisant progressivement avec l'âge, elle produite de courts conidiophores bruns sur lesquels ne se forme souvent qu'une seule conidie (Simmons, 2000). Les conidies sont brunes, pluricellulaires et très allongées. Elles possèdent un long appendice hyalin (bec) (Figure 7), parfois bifurqué et plus long que le corps de la spore, qui mesure entre 120 et 300 ìm de long.

A.tomatophila est le pathogène le plus commun lié à la brûlure foliaire de la tomate.

Figure 7: Conidies et conidiophores de la souche A. tomatophila . (Simmons, 2007)

II .6.Alternariose

L'Alternariose de la tomate, causée par les espèces d'Alternaria, est une des principales maladies de la tomate pouvant affecter toutes les parties de la plantes et tous les stades de développement.

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Elle est caractérisée par l'apparition des tâches noires arrondies à la surface des feuilles, des tiges et des fruits. Ces tâches sont caractérisées par une croissance en anneaux concentriques, donnant aux lésions une forme de cible. Le pathogène passe la mauvaise saison sur les débris de culture. Les infections sont dues à la projection des spores sur la plante par le vent, la pluie où directement par contact entre les feuilles et le sol (Edouard, 2010).

II .6.1 Symptômes

II .6.1.1 Sur feuille

L'alternariose apparaît sous forme des taches concentriques brunes foncés et bien délimitées de tailles variables, la feuille commence à pourrir ; L'infection par la suite s'étend à toute la feuille. La plante finit par perdre ses feuilles (Michel, 1991).

Figure 8 : Symptômes de l'aternariose sur la foliole

II .6.1.2 Sur fruit

Les taches sur le fruit se produisent d'abord à son forme de zones creuses avec des anneaux concentriques (Figure 9). De cette zone, le champignon se propage et éventuellement, la pourriture couvert la moitié supérieure du fruit. (Glasscock, 1944; Jones et al., 1997).

Figure 9 : Symptômes de l'aternariose sur fruit

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II .6.1.3 Sur tiges et collets

Les tiges attaquées par l'Alternaria présentent des plages superficiellement colorées en brun, qui s'agrandissent avec le développement de la maladie, puis le desséchement de la tige peut entraîner sa mort ou celle de toute la plante .

a b

Figure 10 : Lésions provoquées par A. tomatophila et A.alternata; a sur tige, b sur collet

(Bessadat, 2014)

II .7 Cycle infectieux

L'alternariose est favorisé par un cycle infectieux similaire pour toutes les espèces d'Alternaria, responsable de cette maladie (Farrar et al., 2004). Ce cycle est devisé en plusieurs stades : conservation, pénétration et invasion, sporulation puis dissémination. (Figure 11)

II .7. 1 Conservation, source d'inoculum

L'Alternaria peut se conserver dans les résidus de culture, les sols contaminés et les tubercules infectés durant plusieurs années (Christine, 2000). Les chlamydospores peuvent également servir de structure de survie (Basu, 1974). Elle serait aussi capable de se maintenir d'une saison à l'autre sur d'autres solanacées comme la tomate, l'aubergine, poivron (Neegaard, 1945 ; Ellis et Gibson, 1975 ; Blancard et al., 2012).

II .7. 2 Pénétration et invasion

Une fois les spores d'Alternaria sont en contact avec les cellules végétales, elles sont capables de germer et produisent un ou plusieurs tubes germinatifs, la pénétration dans les tissus végétaux se fait soit directement à travers les stomates ou les blessures (Agrios, 2005) ou soit par pénétration enzymatique, cette stratégie est la plus évidente chez les Alternaria. La colonisation de l'hôte est facilitée par des enzymes (cellulase,

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pectinase,....etc). La pénétration peut se produire à des températures entre 10°C et 25°C (Sherf et MacNab, 1986).

II .7. 3 Sporulation et dissémination

Sur des tissus colonisés, quand les conditions climatiques sont favorable, Alternaria ne perde pas à produire des conidiophores, Les spores sont disséminées par le vent, la pluie et les insectes ; les conidies produites assurent des contaminations secondaires et par la suite plusieurs cycles parasitaires peuvent avoir lieu dans la culture (Messiaen, 1991)

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Germination

des conidies

les conidies et le mycélium passent

l'hiver dans une plante infectée, des débris sur les graines, des tubercules,etc

Pénétration à travers la plaie

Pénétration directe

Conidie

Lésions sur tubercule de pomme

Les conidies réinfectent les plantes

Lésion sur fruit de tomate

Invasion de la feuille

Invasion de la tige ou du fruit

Lésions sur feuille de tomate

Lésions sur tige

Production des conidies sur les tissus infectés

Dépérissement du collet

Lésion précoce sur feuille, tige et fruit

Figure 11 : Développement et symptômes de maladies causées par Alternaria sp.

(Agrios, 2005)

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Chapitre III : les huiles essentielles

III.1.Aromathérapie

L'aromathérapie est l'utilisation médicale des extraits aromatiques des plantes. Ce terme a été inventé par René Maurice Gattefossé, pharmacien français dans les années 1910. Ce mot vient du latin « aroma » signifiant odeur et du grec « therapeia » signifiant

traitement. Il s'agit donc de soigner par les huiles essentielles (Pierron, 2014).

Tous les êtres vivants ont un métabolisme primaire qui fournit les molécules de base (acides nucléiques, lipides, protéines, acides aminés et glucides). Les plantes produisent, en plus, un grand nombre de composés qui ne sont pas issus directement lors de la photosynthèse, mais résultent des réactions chimiques ultérieures. Ces composés sont appelés métabolites secondaires. De nos jours, un grand nombre de ces composés sont utilisés en médecine moderne et une majorité de ceux-ci le sont selon leur usage traditionnel (Mohammedi, 2013).

Nous citerons ci-dessous un groupe important considéré comme une source de molécules biologiquement actives.

III.2.Généralités sur les huiles essentielles

Les HE sont des substances volatiles non grasses sécrétées par des plantes aromatiques. (Gherib, 2009). Le terme «huile» vient de leur caractère hydrophobe et de leur propriété de se solubiliser dans les graisses, alors que le terme «essentielle» fait référence à l'odeur dégagée par la plante productrice. (El Mansouri, 2013). Elles peuvent être extraite de différentes parties d'un végétal : les feuilles (ex : l'eucalyptus), les fleurs (ex : la camomille), l'écorce (ex : la cannelle), le bois (ex : le cèdre), le zeste (ex : le citron) et bien d'autres encore : les graines, les baies, les fruits, le bulbe... (Pierron, 2014) obtenu par entrainement à la vapeur ou par hydrodistillation. (El Haci, 2015)

Les huiles essentielles (HE) ont été utilisées depuis des millénaires pour leurs vertus thérapeutiques (antiseptique, antibactérienne, antivirale, analgésique, sédative, anti inflammatoire ...) et ont été largement utilisées en tant que fragrance et le sont toujours. (El Haci, 2015)

Actuellement, le règne végétal nous offre une grande diversité permettant d'obtenir plus de 3000 HE, parmi lesquelles, environ 300 sont importantes d'un point de vue commercial, spécialement dans l'industrie pharmaceutique, l'agroalimentaire, le cosmétique et la parfumerie (Bakkali et al., 2008).

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Une HE est un Produit odorant, généralement de composition complexe, obtenue à partir d'une matière première végétale botaniquement définie, soit par entraînement à la vapeur d'eau, soit par distillation sèche, soit par un procédé mécanique approprié sans chauffage. L'huile essentielle est le plus souvent séparée de la phase aqueuse par un procédé physique n'entraînant pas de changement significatif de sa composition. (Filatre, 2011). La quantité d'huile essentielle contenue dans les plantes est toujours faible, parfois très faible, voire infime. (Pierron, 2014)

Dans la nature, les HE semblent jouer un rôle dans la protection des végétaux contre les agressions extérieurs causées par les microorganismes, contre les insectes et même les animaux herbivores (Bakkali et al., 2008). Elles ont aussi un rôle dans l'attraction des insectes pour la dispersion des grains de pollen et des graines de certaines plantes (El Haci, 2015). les huiles essentielles ou leurs composés actifs pourraient également être employés comme agents de protection contre les champignons phytopathogènes, et les microorganismes envahissant les denrées alimentaires. (Mohammedi, 2013).

III.3 Chimie des huiles essentielles

Les HE sont des mélanges complexes et éminemment variables de constituants qui appartiennent de façon quasi exclusive à deux groupes caractérisés par des origines biogénétiques distinctes : le groupe des terpènes et des terpénoides représentant la classe la plus importante d'une part et celui des composés aromatiques dérivés de phenylpropane, beaucoup moins fréquent, d'autre part (Brunton, 2009).

III.3.1 Terpènes et Terpénoides

Les terpènes représentent un groupe d'un intérêt chimique considérable, les terpènes ont un caractère commun, ils sont tous formés par la réunion d'unité isoprénique figure (12)

Figure 12: Formule chimique de l'isoprène méthyl-2-buta-1,3-diène (Benayad, 2008) On définit alors les monoterpènes (2 unités : C10), les sesquiterpènes (3unités : C15), les diterpènes (4 unités : 0) , les triterpènes (6 unités : C30),..etc, Le terpène qui possède un oxygène est un terpénoïde.

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III.3.2 Composés aromatiques

Les composés aromatiques des HE sont principalement des dérivés du phénylpropane C6-C3 ont une biogenèse différente de celle des terpènes, On peut citer l'acide et l'aldéhyde cinnamique (HE de cannelle), l'eugénol (HE de girofle), le carvacrol (HE d'origan), qui sont les principaux membres de cette famille.

Les acides organiques, les cétones de faible poids moléculaire et les coumarines volatiles entrent également en faible proportion dans la constitution des HE (El Mansouri, 2013).

III.4 Caractéristiques et propriétés physiques

Les huiles essentielles sont constituées de molécules aromatiques de très faible masse moléculaire. Elles sont très inflammables et très odorantes, liquides à température ambiante, les HE se volatilisent quand elles sont exposées à l'air. Elles ne sont que très rarement colorées. Leur densité est en général inférieure à celle de l'eau sauf les huiles essentielles de sassafras, de girofle et de cannelle. Elles ont un indice de réfraction élevé et la plupart dévient la lumière polarisée (optiquement active) (Bouguerra, 2012).

Elles ont parfois un toucher gras ou huileux mais ce ne sont pas des corps gras. Par évaporation, peuvent retourner à l'état de vapeur sans laisser des traces, ce qui n'est pas le cas des huiles fixes (olive, tournesol ...) qui ne sont pas volatiles et laissent sur le papier une trace grasse persistante. (Bouguerra, 2012)

Les huiles essentielles ne sont que très peu solubles ou pas du tout dans l'eau. Entraînables à la vapeur d'eau, elles se retrouvent dans le protoplasme sous forme d'émulsion plus ou moins stable qui tende à se collecter en gouttelettes de grosse taille (Benayad, 2008).

III.5.Méthodes d'extraction

L'obtention des HE se fait actuellement par plusieurs méthodes d'extraction. Certains auteurs les classifient en deux groupes : les méthodes conventionnelles, dites classiques ; hydrodistilation, entrainement à la vapeur, expression, enfleurage ,et les méthodes innovantes assisté par micro-onde ou par ultra sons (Ouis, 2015)

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Entrainement à la vapeur

Expression Hydrodistilation

Enfleurage

Solvant organique

Huile essentielle

Micro-onde Ultra-son

Figure 13 : Méthodes d'extraction des HE

III.5.1 Méthodes conventionnelles III.5.1.1 Hydrodistillation

L'hydrodistillation est la méthode la plus simple et la plus ancienne, utilisée depuis des siècles pour l'extraction des HE. Historiquement, Avicenne (980-1037) a été le premier à développer l'extraction à travers l'alambic. Il a extrait la première HE pure de la rose (El Haci, 2015). La plante est mise en contact avec de l'eau dans un ballon lors d'une extraction au laboratoire ou dans un alambic industriel. Le tout est porté à l' ébullition. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et les huiles essentielles se séparent de l'eau par différence de densité (Gherib, 2009).

Figure 14: Appareillage utilisé pour l'hydrodistillation (Lagunez, 2006).

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III.5.1.2 Extraction par entraînement à la vapeur d'eau

Cette méthode est l'une des méthodes les plus utilisées pour l'obtention des HE. Son Príncipe est le même que celui de l'hydrodistillation sauf qu'il n'y a pas de contact direct entre la matière végétale et l'eau (Masango, 2005).

III.5.1.3 Pressage à froid

Le pressage à froid est une méthode traditionnelle, essentiellement, utilisée pour extraire les HE à partir des agrumes. L'expression à froid consiste à rompre ou dilacérer les parois des sacs oléifères contenus dans le mésocarpe situé juste sous l'écorce de fruit. Les HE sont obtenues mécaniquement par pression à froid qui donne une émulsion aqueuse. L'HE est ensuite récupérée par centrifugation (Ferhat et al., 2007).

III.5.1.4 Enfleurage

L'enfleurage est une ancienne méthode utilisée pour l'extraction des plantes aromatiques destinées surtout à la parfumerie. Le principe consiste à placer les fleurs odorantes dans la graisse, afin de laisser les arômes y pénétrer. Une fois saturée, celle-ci est ensuite lavée à l'alcool pour extraire les composés odorants. L'alcool obtenu est ensuite évaporé pour donner l'absolue. Cette méthode est peu utilisée de nos jours à cause de l'utilisation de la graisse animale et du coût de production élevé. Elle a été remplacée par l'extraction aux solvants (Mnayer, 2014)

III.5.1.5 Extraction par solvant organique

Certaines HE ont une densité voisine de l'eau et le procédé par distillation à la vapeur d'eau ne peut être utilisé dans ce cas. Le principe consiste à faire macérer la plante dans le solvant afin de faire passer les substances odorantes dans le solvant (Ouis, 2015).

III.5.2 Méthodes innovantes

III.5.2.1 Extraction par micro-onde

Extraction par micro-onde consiste à chauffer l'extractant (eau ou solvant organique) mis en contact avec le matériel végétal sous l'énergie micro-onde ce qui permet un chauffage homogène. Ce nouveau procédé permet des gains considérables de temps et d'énergie (Ericsson et al., 2000).

III.5.2.2Extraction par les ultrasons

Le matériel végétal est mis en contacte avec le solvant (eau ou solvant organique) et en même temps soumis à l'action des ondes ultrasoniques, ces derniers induisent des

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vibrations mécaniques au niveau des membranes des poches sécrétrices induisant une libération rapide des gouttelettes d'HE (Romanik et al., 2007) .

III.6 Analyses des huiles essentielles

Deux types d'analyse qui ont pour but d'identifier les différents constituants d'une huile essentielle afin d'en connaître la composition chimique: la chromatographie en phase gazeuse GC et la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse GC/MS.

La chromatographie en phase gazeuse GC est utilisée pour l'analyse quantitative et la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse GC/MS pour l'analyse qualitative. La GC et la GC/MS permettent, en plus de connaître très exactement la composition chimique, la recherche d'éventuelles traces de produits indésirables tels des pesticides ou des produits chimiques ajoutés (Renata et al., 2006 ) .

III.7.Rendement

Le rendement de la distillation est donc limité: de plusieurs kilogrammes à plusieurs tonnes d'organes producteurs sont nécessaires pour obtenir un kilogramme d'HE. Le volume de matériel à récolter est souvent important, ce qui explique les coûts élevés de certaines HE, notamment la rose de Damas ou le néroli bigaradier (Pierron, 2014).

III.8 Conservation des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont des substances sensibles et très délicates, ce qui rend leur conservation difficile et obligatoire dans le but de limiter les risques de dégradation, ces dégradations peuvent modifier leurs propriétés si elles ne sont pas enfermées dans des flacons opaques à l'abri de la chaleur (une température de 4°C) et de la lumière (Valnet, 2000).

III.9 Action des huiles essentielles contre les champignons

Plusieurs huiles essentielles offrent un espoir illimité et grand potentiel à l'égard des problèmes de la résistance des micro-organismes aux antibiotiques, connu de façon empirique depuis des siècles, leurs efficacités anti-infectieuses a été scientifiquement démontré in vitro (Oussalah et al, 2007) et in vivo (Chami et al, 2004).

L'étude de l'effet fongicide et fongistatique des HE vis-à-vis des champignons pathogènes a fait l'objet de plusieurs travaux. L'action antifongique des huiles essentielles est due à une augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique suivie d'une rupture de celle-ci entraînant une fuite du contenu cytoplasmique (Gherib, 2009). Les groupes moléculaires avec les plus puissantes actions

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antifongiques sont les groupes fonctionnels des composés majoritaires (alcools, phénols, composés terpéniques et cétoniques) et à leurs effets synergiques (Buert, 2004).

III.10 Plantes étudiées

III.10.1 Pulicaria mauritanica

P. mauritanica est une plante aromatique et endémique qui pousse à l'état sauvage dans le sud-est du Maroc et en Algérie.

Selon Hussein et al., 2017, le genre Pulicaria comprend 100 espèces largement diffusées en Europe, l'Afrique du nord et en Asie. Pulicaria est un genre qui regroupe les plantes à fleurs de la famille des Asteraceae.

· Nom scientifique : Pulicaria mauritanica

· Nom vernaculaire : ÉíÑíÇÓ ÉJíJ.Q

Figure 16: Photo de Pulicaria mauritanica (Gherib, 2014)

D'après Quezel et Santa (1963) et Dupont (2004) la classification qu'occupe Pulicaria mauritanica est la suivante :

· Embranchement: Phanérogames ou Spermaphytes.

· Sous-embranchement: Angiospermes.

· Classe: Eudicots.

· Sous classe: Asteridées

· Ordre: Asterales.

· Famille: Astéracées.

· Genre: Pulicaria.

· Espèce: Pulicaria mauritanica.

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III.10.1.1 Description botanique

Pulicaria mauritanica est une espèce endémique au Maroc et en Algérie, c'est une espèce très odorante à odeur camphrée, elle est velue ou laineuse avec des feuilles radiales plus petites (5-6 cm) les tiges sont dressées et rameuses, portant des feuilles à bord ondulé, les capitules solitaires sont fixés par de longs pédoncules épaissis au sommet. Les akènes sont oblongs, orangés, brillants et à cotes blanches et marquées (Gherib, 2014).

III.10.1.2 Composition chimique

Les études phytochimiques du genre Pulicaria ont fait l'objet de plusieurs travaux rapportés par Liu et al.en 2010. Ces auteurs révèlent que les espèces de Pulicaria contiennent une grande variété de composés, tel que les dérivés phénoliques, les monoterpènes, les sesquitérpènes, les diterpènes, les triterpènes, les stéroides et les flavonoïdes.

La caractérisation des huiles essentielles du genre Pulicaria a fait l'objet de plusieurs travaux, permettant l'existence d'une variabilité chimique de cette huile essentielle (wayertahel et al., 1998, Hambali et al., 2005 ; El Kamali et al., 2009 ;El Abed et al.,2010 ; Ravendach et al., 2011 ; Gristofari et al., 2011)

En revanche la caractérisation de l'HE de P. mauritanica a fait l'objet de très peu d'étude. Gattefossé et Igolen en 1945 ont rapporté que le carvotanacétone et le composé majoritaire de l'HE de P.mauritanica avec un pourcentage de l'ordre de 81.0%, une deuxième étude a été réalisé par Gristofari et al. en 2011 sur l'huile essentielle de cette plante récoltée dans quatre stations différentes au Maroc, révèle également une grande richesse en carvotanacétone (79.99%, 92.13%), suivi de linalol (0.4%-2.1%) et de carvacrol (0.4%-1.2%). Ces auteurs ont étudié aussi l'activité antifongique de ces huiles vis-à-vis trois champignons phytopathogènes (Znini et al., 2013).

III.10.1.3 Propriétés thérapeutiques

Pulicaria mauritanica Coss. connue sous le nom vernaculaire de « mariwa sfayrya», elle est considérée comme une plante médicinale. Dans la région de Naama, elle est utilisée dans le traitement des troubles intestinaux, des maux de tète par fumigation aussi donnée aux femmes après l'accouchement (Gherib, 2014).

Au Maroc cette plante porte plusieurs noms vernaculaires "Bamghar" et "Ifenzi oudaden" la décoction et la macération de ses feuilles et de ses fleurs est utilisée pour traiter les troubles digestifs et circulatoires (Hamadouch et al., 2018).

Page 25

Partie bibliographique

III.10.2 Micromeria debilis

C'est une plante endémique en Algerie et en Maroc, appartient à la famille des Lamiaceae également connue comme Satureja briquetii Maire.

· Nom scientifique : Micromeria debilis

· Nom vernaculaire: ÉÏÇíÕáÇ ÚÇäÚä

Figure 17: Photo de Micromeria debilis

D'après Quezel et Santa (1963) la classification qu'occupe Micromeria debilis est la suivante:

· Règne : Plantae

· Division : Magnoliophyta

· Classe : Magnoliopsida

· Ordre : Lamiales

· Famille : Lamiaceae

· Genre : Micromeria

· Espèce : Micromeria debilis III.10.2.1 Description botanique

Le genre Micromeria contient environ soixante-dix(70) espèces avec trente-deux(32) sous-espèces. M. debilis est un petit buisson avec des tiges très étroites et des feuilles rhomboïdes généralement de couleur pourpre et de revers rougeâtre. Le calice est caractérisé par des très court dents triangulaires, hérissées, de poils appressés identique à celle du reste de la plante. (Quezel et Santa, 1963)

Page 26

Partie bibliographique

III.10.2.2 Composition chimique

La caractérisation de l'HE de M. debilis a fait l'objet de très peu d'étude. Gherib et al. en 2016 ont montrés que les monoterpènes sont les composants prédominants de l'HE de M. debilis avec un pourcentage de l'ordre de 54,6%, et sont principalement représentés par les â-pinène (19,3%). Géranial (8,7%), linalol (6,5%) et Neral (5.4%).

III.10.2.3 Propriétés thérapeutiques

Les espèces de Micromeria ont généralement de nombreuses activités pharmacologiques, y compris anesthésique, antiseptique et antirhumatismal. Elles sont utilisées contre les maux de tète, les douleurs abdominales, les infections cutanées, et les problèmes de l'hypertension en raison des principaux constituants de son huile essentielles (Gulluce et al., 2004). L'HE et les extraits des espèces de Micromeria ont une activité biologique antibactérienne et antifongique (Marin et al., 2015 ; Bakkour et al., 2012).

PARTIE

EXPERIMENTALE

Page 28

Partie expérimentale

Chapitre I : Matériels et méthodes

I.1 Matériel fongique

I.1.1 Choix des souches

Les souches fongiques ont été choisies parce qu'elles ont été révélées fortement virulentes par Mme Yakoubi sur deux variétés de plante de tomate.

I.1.2 Origine des souches

Les isolats d'Alternaria sp. utilisées pour cette étude proviennent de différentes wilaya d'Algérie (Oran, Mostaganem, Relizane, et Ain Temouchent). Ces isolats ont été isolés au sein de laboratoire de microbiologie appliquée (université d'Oran 1 Ahmed Ben Bella) par Mme Yakoubi M. à partir de différentes parties de la plante de tomate (tige, feuille et fruit) présentant les symptômes d'alternariose. Ces isolats sont représentés dans le tableau 2.

Tableau 2 : Origine des isolats d'Alternaria sp.

Code d'isolats	Date de prélèvement	Lieu de prélèvement		Partie d'isolement	A1
18/03/2015	Mostaganem (Stidia)	Fruit		A10
18/03/2015	Mostaganem (Ouriah)	Fruit		A11
18/03/2015	Mostaganem(Stidia)	Fruit		A18
18/03/2015	Mostaganem (Ouriah)	Fruit		A37
25/03/2015	Oran (Sidi Maarouf)	Feuille		A42
25/03/2015	Oran (Sidi Maarouf)	Feuille		A45
24/04/2015	Oran (Bousfer)	Feuille		A51
10/04/2015	Ain Temouchent	Feuille		A57
24/04/2015	Oran (Bousfer)	Feuille		AT01
18/03/2015	Mostaganem (Stidia)	Tige		AT04
18/03/2015	Mostaganem(Ouriah)	Tige

I.1.3 Repiquage des souches

Afin d'obtenir des cultures fongiques jeunes ; des fragments mycéliens de 5mm² des isolats d'Alternaria sont découpés à l'anse à partir de la marge des colonies puis transférées sur une nouvelle boite contenant le milieu PDA (Pomme Dextrose Agar),les boites sont ensuite incubées à 25#177;2 °C pendant 7 à 10 jours.

Page 29

Partie expérimentale

I.1.4 Induction de la sporulation

Dans le cas des espèces d'Alternaria qui présentent une faible sporulation ; les conidies sont obtenues après induction de la sporulation selon la méthode décrite par (Lyudmila et al., 2005) avec quelque modification : le mycélium des colonies (âgés de 10 à 14 jours) cultivé sur milieu PCA est blessé à l'aide d'un scalpel stérile, puis les boites de pétri sont placées au réfrigérateur (+5°C) pendant 12 heures puis exposées à la lumière du soleil pendant 120 min, elles sont ensuite transférés à 25#177;2°C sous l'obscurité continu pendant 48h.

Figure 17 : Photos représentant les étapes de l'induction de la sporulation

I.1.5 Conservation des isolats

La conservation des isolats d'Alternaria se fait dans des tubes à essai contenant le milieu PDA incliné, puis mis à incuber à 25#177;2°C, âpres 7 jours les isolats sont transférés à 4°C et ceci pour des utilisations ultérieures.

I.1.6 Identification des isolats I.1.6.1 Etude macroscopique

L'étude macroscopique des isolats d'Alternaria se fait à l'oeil nu, elle est basée sur

la description morphologique des colonies cultivées sur milieu PDA et incubées à 25#177;2°C

pendant 7 à 10 jours. Les critères morpho-culturaux retenus pour la caractérisation des

colonies selon Botton et al., 1990 sont :

? L'aspect du mycélium

? La vitesse de la croissance mycélienne

? La couleur des colonies (avers et revers)

? Les marges (couleur et forme)

? La pigmentation de milieu.

Partie expérimentale

I.1.6.2 Etude microscopique

Cette étude se fait par l'observation des isolats au microscope optique aux differents grossissement (Gx10 , Gx40, et par l'huile à immersion à (Gx100). Ce type d'identification est fondé essentiellement sur l'étude morphologique du mycelium (absence ou presence de cloison, couleur ,...etc) et des spores ( forme, couleur, taille, nombre de septa, formation des chaines de spores)

Les préparations microscopiques ont été réalisées par deux méthodes :

A l'etat frais

La manipulation consiste à mettre un petit fragement mycelien sur la lame propre placée entre deux becs bunsen en presence d'une goutte de liquide de montage (lactopphenol, bleu de methylene), puis le recouvrir délicatement d'une lamelle en évitant de créer des bulles d'air des débordements.

Par microculture (culture sur lame ou méthode de carré de gelose)

Cette technique consiste à ensemencer les spores des moisissures sur des petits carrés de PDA (15mmx15mm) de 2 mm d'epaisseur placés entre lames et lamelles. Les spores sont ensemencés sur les limites périphériques du milieu pour fournir un potentiel d'oxygène élevé afin qu'elles puissent germer. L'ensemble est conditionné dans une chambre humidifiées, et après 3 jours d'incubation à 25#177;2°C, les lamelles aux quelles s'adhèrent le mycélium sont transférées sur d'autre lames stériles contenant quelques gouttes de lactophenol pour l'observation microscopique aux grossissements x10, x40 et x100.

Les observations sont comparées aux clés d'identification propre à chaque espèce (Simmons, 2007)

Page 30

Figure 18 : Photos représentant la méthode de microculture

Page 31

Partie expérimentale

I.2 Matériel végétal

Nous avons utilisé la partie aérienne de Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis pour extraire leurs huiles essentielles, et tester leurs activités antifongiques sur Dix (10) souches du genre Alternaria.

I.2.1 Récolte de matériel végétal

Le matériel végétal est récolté dans la wilaya de Naama le mois de Novembre 2018.et le mois de Février 2019 dans la région d'Ain Sefra : Djbel Mekter pour Pulicaria mauritanica et Mograr pour Micromeria debilis

Figure 19 : Situation géographique des lieux des prélèvements I.2.2 Identification botanique

Les deux espèces ont été identifiées au sein du centre universitaire Salhi Ahmed de Naama exactement dans le laboratoire de microbiologie N01 par M^r Maarouf A. (professeur au C.U.Naama).

I.2.3 Préparation des échantillons

Le matériel végétal récolté est ensuite séché à l'abri de la température et la lumière de soleil afin de préserver au maximum l'intégrité des molécules pendant huit (08) jours en moyenne.

Après l'opération de séchage, les parties destinées particulièrement tiges, feuilles et fleurs sont ensuite conservées dans des sacs en papier.

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Partie expérimentale

I.2.4 Extraction de l'huile essentielle

La technique utilisée pour l'extraction de l'huile essentielle est la technique conventionnelle par hydrodistillation (water distillation), l'extraction a été faite par un montage de type Clevenger. Le principe de cette méthode consiste à exploiter la volatilité des constituants de l'HE. Le matériel végétal est immergé directement dans l'eau distillée 50 g de matériel végétal sec (partie aérienne de la plante) est introduit dans un ballon de 01litres imprégné d'eau distillée, l'ensemble est porté à l'ébullition pendant 2 à 3 heures. Les composés volatils entraînés par la vapeur d'eau dégagée sont condensés au niveau d'un réfrigérant (Bettaieb R. et al. ,2017) et puis sont récupérées. Après décantation l'huile essentielle obtenue est conservé à une température de 4°C dans des tubes ombrés et bien scellés (Msaada et al., 2012)( Bettaieb R. et al. ,2017) .

Figure 20 : Montage de type Clevenger I.2.5 Calcul du rendement en huile essentielle

Le rendement est défini comme étant le rapport entre la masse de l'huile essentielle obtenue et la masse du matériel végétal utilisé, le rendement est exprimé en pourcentage (%) et calculé par la formule suivante :

RHE% = (mh / mv) x100

RITE = rendement en huile essentielle en %.

mh =masse d'huiles essentielles récupérées en gramme (g).

mv = masse d'essai du matériel végétal en gramme (g) (Selvakumar et al., 2012).

Page 33

Partie expérimentale

I .3 Activité antifongique

I .3.1 Effet des huiles essentielles sur la croissance mycélienne

L'effet antifongique des huiles essentielles sur les isolats d'Alternaria, est évalué selon la méthode de contact directe sur gélose décrite par Fandoham (2004). Différentes concentrations en huile essentielles 0.8 uL/mL, 0.95 uL/mL , 1.1 uL/mL sont obtenues par addition de 12, 14.25 et 16.5 uL d'huile essentielle à 15 mL de milieu PDA en surfusion à 45⁰C contenant Tween 20 (Sigma 0,5%, v/v). Le mélange (huile essentielle+PDA+ Tween 20) est ensuite homogénéisé au vortex puis coulée dans des boites de pétri de 90 mm de diamètre.

Deux concentrations ont été utilisées pour l'HE de M.debilis (0.95 uL/mL, 1.1 uL/mL).

Des disques mycéliens de 6 mm de diamètre prélevés à partir de la périphérie des colonies fongiques âgées de 10 jours, sont déposés aseptiquement au centre des boites de pétri contenant le milieu PDA additionné à différentes concentrations d'huile essentielle avec trois répétitions pour chaque isolat et chaque concentration. Les boites de pétri témoins contiennent 15 ml de milieu PDA additionné au Tween 20 (sans huile essentielle). Les souches testées sont ensuite incubées à 25⁰C pendant 10 jours.

La mesure de la croissance mycélienne est effectuée chaque jour à partir du 3éme jusqu'au 10^éme jour d'incubation par mesure des deux diamètres perpendiculaires des colonies.

La CMI (concentration minimale inhibitrice) est déterminée après 10 jours d'incubation et correspond à la plus faible concentration pour laquelle nous n'observons pas de croissance fongique à l'oeil nu (Remmal et al., 1993, Kumar et al., 2008).

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Partie expérimentale

A1

A10

A18

A37

A42

A45

A51

A57

AT1

AT4

Témoin

Incubation à 25 °C pendant 10 jours

0.8 ul

Milieu de culture PDA+Tween 20

+ HE ul

0.95 ul

1.1ul

Figure 21 : Protocole expérimental de l'activité antifongique

I .3.2 Évaluation de l'indice antifongique

L'indice antifongique (pourcentage d'inhibition) est déterminé par la formule suivante (Kasmi et al., 2018) :

IAF(%) = [(X- Xi) / X] ×100

Avec :

X : Estimation de la croissance mycélienne ou de la sporulation chez le témoin - diamètre de disque initial (en absence d'huile essentielle).

Xi : Estimation de la croissance mycélienne ou de la sporulation chez l'essai - diamètre de disque initial (en présence d'huile essentielle)

Page 35

Partie expérimentale

I .3.3 Effet des huiles essentielles sur la sporulation

Les colonies fongiques âgées de 10 jours, ayant servis pour l'estimation de la croissance mycélienne ont été utilisées pour l'évaluation du taux de la sporulation (Mebarki, 2015).

Les spores d'Alternaria.sp. sont récupérées aseptiquement à la surface des colonies à l'aide d'une pipette pasteur recourbée par addition de 5 ml d'eau distillée stérile; après agitation au vortex / 30 seconde, la suspension sporale est filtrée à travers une double mousline stérile puis récupérée dans des tubes stériles. Le taux des spores est déterminé à l'aide d'une cellule malassez.

Les résultats sont exprimés en nombre de spore/ ml de suspension sporale.

Figure 22: Photo représente la détermination du taux d'inhibition de la sporulation

I.3.4 Détermination de la vitesse de la croissance mycélienne

Selon (Cahagnier et Molard, 1998) la vitesse de la croissance mycélienne de chaque concentration est déterminée par la formule suivante :

VC= [D1/Te1]+[(D2-D1)/Te2]+ [(D3-D2)/Te3]+... + [(Dn-Dn-1)/Ten]

D = Diamètre de la zone de croissance du chaque jour (mm). Te = Temps d'incubation (heure).

Page 36

Partie expérimentale

Chapitre II : Résultats et discussions

II .1 Matériel fongique

II .1.1 Identification des isolats

L'Identification des espèces d'Alternaria a été réalisé selon les clés de détermination de (Simmons, 2007 ; Rodrigues et al., 2010 et Mirkarimi et al ,2013) en se basant sur les caractères macroscopiques des colonies (aspect, couleur, les marges, ....etc) et sur les caractères microscopiques du mycélium et des spores (forme des spores, enchainement des spores, la couleur, la taille ....etc.)

II .1.1.1Etude macroscopique

L'étude macroscopique des 10 isolats d'Alternaria sp sur milieu PDA après sept (7) jours d'incubation à 25°C, a révélé une variabilité considérable entre les caractères morphologiques des isolats (tableau 3). Les isolats présentent une couleur de colonie varie du clair au foncé avec une teinte vert olive à grisâtre, la majorité des colonies ont un aspect duveteux ou cotonneux avec des bordures régulières ou irrégulières.

Ces observations sont en accord avec ceux obtenus par (Mirkarimi et al., 2013) qui avaient reporté que la couleur des colonies d'A.tenuissima est vert olive. De même (Zheng et al., 2015) ont observé un aspect cotonneux pour A.tenuissima avec une couleur vert grisâtre a verdâtre, aussi (Kumari et al., 2009) ont observé différents isolats d'A .alternata, les colonies avaient une texture cotonneuse à compacte et dense avec une couleur clair à noir foncé.

Parmi les isolats à petites spores, aucune pigmentation n'a été observée dans le milieu PDA, tandis que les isolats à grosses spores ont présenté une pigmentation varie entre jaune et orange. (Virender et al., 2008) ont reporté que la pigmentation d'A.solani dans le milieu PDA varie entre jaune, marron, brunâtre à noir, les mêmes observations ont été signalés par ( Kumar et al. 2008).

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Partie expérimentale

Tableau 3 : Caractères culturaux des isolats d'Alternaria sp sur milieu PDA

Partie expérimentale

A01

A18

A57

A10

AT04

Figure 23 : Aspect macroscopique des colonies (revers et avers) des espèces d'Alternaria à petite spores sur milieu PDA

A37 A42

A45 A51

AT01

Page 38

Figure 24 : Aspect macroscopique des colonies (revers et avers) des espèces d'Alternaria à grosses spores sur milieu PDA

Page 39

Partie expérimentale

A57

AT04

A10

A01

A18

Figure 25 : Aspect macroscopique des colonies des espèces d'Alternaria à petites spores
sur milieu PCA après induction de la sporulation

A51

AT01

A42

A37

A45

Figure 26 : Aspect macroscopique des colonies des espèces d'Alternaria à grosses

spores sur milieu PCA après induction de la sporulation

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Partie expérimentale

II .1.1.2 Etude microscopique

L'observation microscopique des dix (10) isolats d'Alternaria sp a révélé deux types des conidies: les petites spores et les grosses spores.

Les souches à petites spores sont caractérisées par des spores de forme ellipsoïde et ovoïde, et une couleur varie entre brun et jaune avec des cloisons transversaux et longitudinaux.

En revanche les souches à grosses spores présentent des conidies avec forme de massue, de couleur varie entre brun et jaune. Les isolats d'A tomatophila différent d'A.solani par la taille, la forme des conidies et le nombre des cloisons et aussi les spores d'A.tomatophila caractérisés par un long bec. Ces résultats sont similaires à ceux cités par (Rodrigues et al. 2010) qui avaient reporté qu'A.tomatophila présente un long bec par rapport à A.solani parfois bifurqué et plus long que le corps de la spore.

Bien que les caractéristiques microscopiques des conidies et conidiophores fournissent souvent les principaux critères taxonomiques pour l'identification des espèces fongiques, une identification moléculaire reste nécessaire afin de confirmer ces espèces.

A01 A10

A57

AT04

A18

Figure 27 : Aspect microscopique des espèces d'Alternaria à petites spores (Gx40) .

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Partie expérimentale

A37 A42 A45

A51 AT01

Figure 28: Aspect microscopique des espèces d'Alternaria à grosses spores(Gx100)

II .2 Caractéristiques des huiles essentielles

Les huiles essentielles des espèces étudiées obtenues après une hydrodistillation, présentent des caractéristiques regroupées dans le tableau suivant :

Tableau 4 : Caractéristiques des huiles essentielles

Espèce	Couleur	Odeur		Aspect	P.mauritanica
Jaune foncé	Forte odeur	Liquide		M. debilis
Vert clair	Forte odeur	Liquide

Ces caractéristiques différent dune plante à une autre aussi de la partie soumise à l'extraction (Gherib, 2014).

Partie expérimentale

Page 42

Figure 29: Huile essentielle de Figure 30: Huile essentielle de

P. mauritanica M. debilis

II .3 Rendement des huiles essentielles

Le rendement en huile essentielle des deux espèces est exprimé en pourcentage massique par rapport à la matière végétal sèche, représenté dans le tableau 5

Tableau 5 : Rendement calculé en (%) pour les deux espèces étudiées

Espèce	Quantité de la biomasse(g)	Quantité d'huile (g)		Rendement (%)	P. mauritanica
50	0.15	(0.15/50) x 100=0.30		M.debilis
400	0.18	(0.18/400)x100=0.045

Le rendement d'extraction que nous avons obtenu de l'HE de P.mauritanica est de l'ordre de 0.30%, cette valeur est inferieure a celle obtenu par (Gherib, 2014) en période de floraison (1.17 %) et à la fin de floraison (0.70 %). On parallèle, on a obtenu un rendement de l'ordre de 0.045% de l'HE de M.debilis, et qui est inferieur a ceux obtenu par (Gherib et al., 2016) dans les deux périodes de floraison : Mai 0.07% et Novembre 0.12%.

Divers facteurs peuvent influencer le rendement en HE tels que, la période de récolte de la plante, l'âge, la partie soumise à la distillation, conditions de stockage de la plante et la méthode d'extraction utilisée.

II .4 Activité antifongique

II .4.1 Cinétique de croissance mycélienne II .4.1.1 Cas d'HE de P.mauritanica

Les figures 31,32, 33 et 34 représentent les résultats enregistrés sur la cinétique de croissance des souches d'Alternaria sp en fonction de temps (jours) et la concentration de l'HE de P. mauritanica.

Page 43

Partie expérimentale

On a observé que la croissance mycélienne dans la plupart des souches testées est lente par rapport au témoin et l'augmentation de la concentration exerce un retard de croissance voire inexistant à une concentration de 1.1ul/ml des souches A18, A37 , A57 ,AT1 et AT4, ce qui explique que l'HE de P. mauritanica a un effet sur la croissance des souches fongiques.

Diamétre de croissance mycélienne en (mm)

Diamétre de croissance mycélienneen (mm)

40

40

90

80

70

60

50

30

20

70

60

50

30

20

10

10

0

0

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

la souche A01

la souche A10

0,8 ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

Figure 31: Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A01 et A10) en fonction de
temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P. mauritanica

Page 44

Partie expérimentale

70

60

50

40

30

20

10

0

Diamètre de croissance mycélienneen (mm)

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche A42

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

70

60

50

40

Diamètre de croissance

30

20

10

0

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Diamètre de croissance mycélienne en (mm)

mycélienne en (mm)

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

la souche A37

la souche A18

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml Temoin

Figure 32: Cinétique de croissance des souches d'Alternaria( A18 et A37 et A42) en
fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P. mauritanica

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Partie expérimentale

Diamètre de croissance mycélienne en(mm)

80

70

60

50

40

30

20

10

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml Temoin

80

70

60

50

40

30

20

10

0

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Diamètre de croissance mycélienne en (mm)

Diamètre de croissance mycélienne en (mm)

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche A51

La souche A57

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

La souche A45

0

J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10

90

Figure 33: Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A45, A51 et A57)en
fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P. mauritanica

Partie expérimentale

Diamètre de croissance mycélienne en(mm)

Diamètre de _en ^croissance (mm) mycélienne

40

80

70

60

50

30

20

10

40

80

70

60

50

30

20

10

0

0

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche AT04

La souche AT01

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

Figure 34 : Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (AT01 et AT04) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de P.mauritanica

Page 46

Page 47

Partie expérimentale

II .4.1.2 Cas d'HE de M. debilis

Les figures 35, 36 , 37 et 38 représentent les résultats enregistrés sur la cinétique de la croissance des souches d'Alternaria en fonction de temps (jours) et les concentrations de l'HE M. debilis .

On a observé que la croissance mycélienne dans la plupart des souches testées est moins important par rapport au témoin et plus la concentration en HE augmente, plus la croissance diminue , ce qui explique que l'HE de M. debilis a un effet inhibiteur sur la croissance, mis appart la souche A42 ou elle a été inhibé par une concentration de 1.1ul/ml, et la souche A57 qu'elle a été inhibé par une concentration de 0.95ul/ml

Diamètre de _en ^croissance (mm) mycélienne

60

50

40

30

20

10

0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Diamètre de croissance mycélienne en (mm)

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche A10

0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

La souche A01

0

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

70

Figure 35 : Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A01 et A10) en fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis

Page 48

Partie expérimentale

Diamètre de _en ^croissance (mm) mycélienne

80

60

40

20

0

0,95ul/ml 1,1ul/ml temoin

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Diamètre de croissance mycélienne en (mm)

Diamètre de croissance mycélienne en(mm)

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche A37

La souche A42

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

La souche A18

100

Figure 36 : Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A18, A37et A42) en
fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis.

Page 49

Partie expérimentale

Diamètre de _en ^croissance (mm) mycélienne

80

70

60

50

40

30

20

10

0

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

La souche A45

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

90

Diamètre de croissance mycélienne en (mm)

80

70

60

50

40

30

20

10

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

La souche A51

0

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

90

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Diamètre de croissance mycelienne en (mm)

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche A57

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

Figure 37: Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (A45, A51et A57) en
fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis.

Page 50

Partie expérimentale

Diamètre de croissance mycélienneen (mm)

Diamètre de croissance mycélienne en(mm)

40

40

90

80

90

80

70

60

50

30

20

70

60

50

30

20

10

10

0

0

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

j3 j4 j5 j6 j7 j8 j9 j10

La souche AT01

La souche AT04

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

0,95ul/ml 1,1ul/ml témoin

Figure 38 : Cinétique de croissance des souches d'Alternaria (AT01 et AT04) en
fonction de temps (jours) et concentration de l'huile essentielles de M.debilis

II .3 .3 Taux d'inhibition de la croissance mycélienne

Les résultats illustrés dans la figure 39 montrent le taux d'inhibition de la croissance mycélienne de l'HE de P.mauritanica.

On a observé que l'HE a des effets différents sur les souches d'Alternaria sp. L'inhibition totale (100%) a été remarquée à une concentration de 1.1ul/ml pour les souches A18, A37, A57, AT1, AT4

Page 51

Partie expérimentale

Pourcentage d'inhibition %

100

40

90

80

70

60

50

30

20

10

0

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml

Concentrations ul/ml

A01 A10 A18 A37 A42 A45 A51 A57 AT1 AT4

Figure 39 : Taux d'inhibition de la croissance mycélienne de l'HE de P.mauritanica.
Alors que la figure 40 démontre le taux d'inhibition de la croissance mycélienne de l'HE

de M.debilis avec des effets différents sur les souches d'Alternaria sp., un taux d'inhibition totale (100%) a été remarqué a une concentration de1.1ul/ml pour la souche A57 et la concentration 0.95 pour la souche A42.

pourcentage d'inhibition %

100

40

80

60

20

0

0,95ul/ml 1,1ul/ml

Concentrations ul/ml

A01

A10

A18

A37

A42

A45

A51

A57

AT1

AT4

Figure 40 : Taux d'inhibition de la croissance mycélienne de l'HE M.debilis.

Page 52

Partie expérimentale

Les résultats que nous avons obtenus ont montré une activité antifongique considérable. L'HE de P.mauritanica renferme une intéressante activité sur les moisissures. En effet cinq souches sont inhibées à des concentrations minimales inhibitrices (CMI) entre 0.95ul/ml et 1.1ul/ml (A18, A37, A57, AT1, AT4) et la souche A42 par une CMI entre 1.1ul/ml et 1.2ul/ml. Nos résultats de CMI sont inférieurs par ceux obtenus par (Znini et al. 2013). Ces auteurs ont testé l'activité antifongique de l'HE de P.mauritanica vis-à-vis de trois souches fongiques phytopathogènes, à savoir : Alternaria sp., Penicillium expansum et Rhizopus stolonifer par la méthode de contacte direct. Ils ont obtenu des CMI de l'ordre de 2ul/ml pour Alternaria sp. et Penicillium expansum.

On ce qui concerne l'HE de M. debilis qui a présenté une activité antifongique inhibitrice, deux souches ont été inhibées, l'une avec une CMI inferieure ou égale à 0.95 ul/ml et la deuxième avec une CMI entre 0.95 ul/ml et 1.1ul/ml.

Selon Gherib et al. 2016, les résultats ont montré que l'huile essentielle avait un large spectre d'activité antimicrobienne. La méthode de diffusion à la gélose a montré que l'huile était efficace contre S. typhimurium, K. pneumoniae et C. albicans avec une CMI de 2ul/ml.

En générale, la variabilité des résultats est probablement due à l'influence de plusieurs facteurs tels que la méthodologie, les microorganismes testés et les huiles essentielles utilisées (Pattnaik et al ., 1996) .

II .3 .4 Taux d'inhibition de la sporulation

Le taux d'inhibition de la sporulation des souches fongiques de l'HE de P.mauritanica en fonction de trois concentrations (figure 41) montre des effets très remarquable sur presque toutes les souches d'Alternaria sp.

L'inhibition totale (100%) a été remarqué a une concentration de 1.1ul/ml pour les souches A01, A18, A51 et A57 et pour les autre souches, on a remarqué qu'il ya une inhibition importante supérieure à 60%.

Page 53

Partie expérimentale

Pourcentage d'inhibition %

100

40

90

80

70

60

50

30

20

10

0

0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml

Concentrations ul/ml

A01 A10 A18 A37 A42 A45 A51 A57 AT1 AT4

Figure 41 : Taux d'inhibition de la sporulation de l'HE de P.mauritanica

Les résultats illustrés dans la figure 42 montrent le taux d'inhibition de la sporulation de l'HE de M.debilis.

On a observé que l'HE a des effets différents sur les souches d'Alternaria. L'inhibition totale (100%) a été remarqué a une concentration de1.1ul/ml pour les souches A01, A37, A42, A51, A57 et la souche AT4 et la concentration 0.95 ul/ml pour la souche A42.

Pourcentage d'inhibition %

100

40

90

80

70

60

50

30

20

10

0

0,95ul/ml 1,1ul/ml

Concentrations ul/ml

A01 A10 A18 A37 A42 A45 A51 A57 AT1 AT4

Figure 42 : Taux d'inhibition de la sporulation de l'HE de P.mauritanica

Page 54

Partie expérimentale

Les deux huiles sont des bons inhibiteurs de la croissance mycélienne et de la sporulation. L'activité la plus remarquable est constatée avec l'HE de P.mauritanica. Cette huile exerce une très bonne activité antifongique. En effet cette activité augmente par l'augmentation de la concentration

Témoin

0.8ul/ml 0.95ul/ml 1.1ul/ml

Témoin

A01 A01 A01 A01

Témoin

Témoin

A42

Témoin

A10

A37 A37 A37 A37

A18 A18 A18 A18

1.1ul/ml

0.8ul/ml 0.95ul/ml

0.8ul/ml 0.95ul/ml 1.1ul/ml

0.8ul/ml

0.8ul/ml

A10

A42

0.95ul/ml

0.95ul/ml

A10

A42

1.1ul/ml

A10

1.1ul/ml

A42

Figure 43 : Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrations
d' HE.de P.mauritanica aprés 10 jours d'incubation.

Page 55

Partie expérimentale

Témoin

0.8u/ml

0.95ul/ml

1.1ul/ml

Témoin

AT4 AT4 AT4 AT4

Témoin

Témoin

AT1

Témoin

A45 A45 A45 A45

A51

A57

AT1

0.8u/ml 0.95ul/ml 1.1ul/ml

0.8u/ml

0.8u/ml 0.95ul/ml 1.1ul/ml

0.8u/ml 0.95ul/ml

A51

A57 A57 A57

0.95ul/ml 1.1ul/ml

AT1

A51

1.1ul/ml

A51

AT1

Figure 44: Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrations
d' HE.de P.mauritanica aprés 10 jours d'incubation.

Page 56

Partie expérimentale

Témoin

0.95ul/ml 1.1ul/ml

Témoin Cin

A10

A18

ca

Témoin

hui

A37 A37 A37

Témoin

Témoin n de

A01

A42

0.95ul/ml

0.95ul/ml

0.95ul/ml

0.95ul/ml 1.1ul/ml

A01 A01

A10

A18 A18

A42 A42

1.1ul/ml

1.1ul/ml

1.1ul/ml

A10

Figure 45: Aspect macroscopique des colonies testées par differentes concentrations
d' HE.de M.debilis aprés 10 jours d'incubation..

Page 57

Partie expérimentale

Témoin

0.95ul/ml 1.1ul/ml

A45

Témo

Témoin

AT4 AT4 AT4

AT1 AT1 AT1

Témoin

Témoin

A51

A57

0.95ul/ml 1.1ul/ml

0.95ul/ml

0.95ul/ml 1.1ul/ml

0.95ul/ml

A57

A45

A51

1.1ul/ml

1.1ul/ml

A57

A45

A51

Figure 46: Aspect macroscopique des colonies testées par differentes
concentrationsd' HE.de M.debilis après 10 jours d'incubation

Page 58

Partie expérimentale

II .3 .4 Détermination de la vitesse de la croissance mycélienne

La figure 47 représente la vitesse de la croissance mycélienne en présence de différentes concentrations de l'huile essentielle de P.mauritanica.

On a remarqué que la vitesse la plus haute est celle du témoin dans les deux huiles, et qui se diffère d'une souche à une autre, aussi plus la concentrations de l'HE augmente plus la vitesse de la croissance mycélienne diminue, où elle a atteint la valeur la plus basse de 0.08mm/h à une concentration de 1.1ul/ml par les souches A18, A37, A57, AT01, AT4.

Vitesse de croissance (mm/h)

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0

0ul/ml 0,8ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml

A01 A10 A18 A37 A42 A45 A51 A57 AT1 AT4

Figure 47 : Vitesse de la croissance mycélienne sous l'effet de différentes concentrations
en HE de P.mauritanica

La vitesse de la croissance mycélienne en présence de différentes concentrations de l'HE de M.debilis est illustrée dans la figure.48

La vitesse la plus haute est toujours du témoin, se diffère d'une souche à une autre, aussi plus la concentration de l' HE augmente plus la vitesse de la croissance mycélienne diminue, où elle a atteint la valeur la plus basse de 0.08mm/h à une concentration de

Page 59

Partie expérimentale

1.1ul/ml par la souche A42 qui a été inhibé par cette concentration et la souche A57 qui a présenté une vitesse stable dans les deux concentrations.

vitesse de croissance (mm/h)

0.8

0.6

0.4

0.2

1.4

1.2

0

1

0ul/ml 0,95ul/ml 1,1ul/ml

A01 A10 A18 A37 A42 A45 A51 A57 AT1 AT4

Figure 48 : Vitesse de la croissance mycélienne sous l'effet de différente concentration
en HE de M.debilis

La différence du pouvoir antifongique des huiles essentielles des deux plantes peut être liée à leurs compositions chimiques.

Selon ces observations, on peut spéculer que la forte activité antifongique observée chez les huile essentielles provient de l'efficacité de ses composants, comme elle peut être le résultat de synergie entre les différents constituants des huiles El Ajjouri et al ., 2008.

Gattefossé et Igolen en 1945 ont raporté que le carvotanacétone et le composé majoritaire de l'HE de P.mauritanica avec un pourcentage de l'ordre de 81.0%,une deuxième étude a été réalisé par Gristofari et al. (2011) sur l'huile essentielle de cette plante récoltée dans quatre stations differentes au Maroc, révèle également une grande richesse en carvotanacétone (79.99%, 92.13%), suivi de linalol 0.4%-2.1% et de carvacrol( 0.4%-1.2%).

Nasser et al.,2012 ont raporté que l'HE de P.undulata prénte aussi un porcentage elevé en carvotanacétone (91.4%)

Page 60

Partie expérimentale

Gherib et al. (2016) ont rapporté que les monoterpènes sont les composants les prédominants (54,6%) de l'HE de M. debilis et ont été présenté principalement représentée par â-pinène (19,3%). Géranial (8,7%), linalol (6,5%).

CONCLUSION

GéNéRALE

Page 62

Conclusion générale

Nos cultures sont souvent soumises à des niveaux variables de contamination microbienne, principalement dues à des champignons phytopathogènes, qui infectent généralement l'hôte.

L'application des huiles essentielles est récemment devenue une méthode très attrayante de lutte contre les maladies fongiques. On pense que la production d'huiles essentielles par les plantes est principalement un mécanisme de défense contre les agents pathogènes nuisibles, notamment parce qu'elles possèdent des propriétés antimicrobiennes et antifongiques.

Dans le but de protéger notre culture de tomate contre les prédateurs (infections fongiques) et afin de valoriser notre flore locale, nous nous sommes intéressés d'étudier l'activité biologique des huiles essentielles de la partie aérienne de P.mauritanica et M.debilis, en évaluant leurs pouvoir antifongique vis-à-vis les espèces d'Alternaria sp qui attaquent notre culture.

Premièrement, les souches isolées de différentes régions du Nord-Ouest d'Algérie, ont été identifiée par l'utilisation des critères culturaux (couleur, vitesse de croissance et aspect de mycélium) et des critères morphologiques (forme des spores, couleur,..), l'étude de ces caractéristiques révèle l'apparence de quatre espèces du genre Alternaria à savoir les espèces à petite spore représentés par A.alternata et A.tenuissima, et les espèces à grosse spore représenté par A.tomatophila et A.solani.

Les plantes utilisées possèdent des rendements divers qui sont de l'ordre de 0.30% et 0,045% respectivement pour P.mauritanica et M.debilis.

Dans un second temps, nous avons évalué in vitro l'activité antifongique des HE sur les espèces d'Alternaria sp par la méthode de contacte direct. A la lumière des résultats parvenus par cette étude, on conclu que les deux HE présentent une inhibition total de la croissance mycélienne de cinq souches à une concentration de 1.1ul/ml de l'HE de P. mauritanica et deux souches à des concentrations de 0.95ul/ml et 1.1ul/ml. Les deux huiles présentent aussi un taux d'inhibition de la sporulation très élevé pour la majorité des souches.

Point de vue comparatif, l'HE de P.mauritanica présente un effet mieux que l'HE de M.debilis vis-à-vis les CMI et les souches inhibées

En fin, et à l'essor de la présente étude, les résultats obtenus ne constituent qu'une

première étape de recherche il serait intéressant de Poursuivre la recherche
phytochimique, et mener une étude plus approfondie sur les huile essentielles de

Page 63

Conclusion générale

P.mauritanica et M.debilis afin d'isoler et d'identifier les composés ayant une activité antifongique et même d'autre métabolites.

Les huiles essentielles des deux plantes étudiées, ont manifesté un bon effet antifongique à l'échelle du laboratoire »in vitro `', pour assurer leurs utilisation comme alternative des produits chimiques pour la protection des cultures de tomates, une deuxième étude in vivo doit être réalisée pour mieux affiner l'effet des ces huiles.

RéféREnCES

BIBlIoGRAPHIQUES

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ANNEXES

Annexes

Annexe1: Milieux de culture

PDA : Ptatos Dextrose Agar

· Pomme de terre 200 g

· Sucrose 10 g

· Agar 15 g

· Eau distillée 1000 ml

PCA : Pomme de terre Carotte Agar

· Pomme de terre 40 g

· Carotte 40 g

· Agar 20 g

· Eau distillée 1000ml

Lactophénol:

·	Glycérol	40g
·	Phénol	20g
·	Acide lactique	20g

Annexe2 : Cinétique de la croissance

? De la plante de Pulicaria maurintanica Cinétique de la souche A01

A01	0,8 ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	6#177;0	6#177;0	6#177;0	21,4#177;0
j4	6,5#177;0,5	6,33#177;0,57	6#177;0	28,3#177;0
j5	9#177;1,5	7,16#177;2,02	6#177;0	35,16#177;0.1
j6	13,83#177;4,53	8,33#177;3,17	8#177;2,17	40,16#177;0.1
j7	17,33#177;1,75	11,5#177;2,64	10,66#177;2,75	44,5#177;0
j8	19#177;1,73	17,66#177;5,29	16,5#177;1,80	50,3#177;0.1
j9	25,16#177;3,54	21#177;2,29	20,16#177;2,51	58,6#177;0.2
j10	28,5#177;4,58	23,06#177;1,67	20,16#177;2,08	61,16#177;0.1

Annexes

Cinétique de la souche A10

A10	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	6,66#177;1,15	6#177;0	6#177;0	31,4#177;0.1
j4	8,33#177;2,84	6,16#177;0,28	6#177;0	41,6#177;0.2
j5	13,66#177;4,61	10,66#177;0,28	6,66#177;1,15	49,3#177;0.1
j6	21,16#177;4,64	17,16#177;0,28	10#177;3,6	59,5#177;0.1
j7	25,66#177;7,0	22,83#177;0,28	14,5#177;5,07	67,6#177;0.2
j8	34#177;7,93	32#177;1	19,66#177;7,23	73,1#177;0.6
j9	43,66#177;11,11	41,66#177;1,6	30#177;7,54	81,8#177;0.5
j10	46,66#177;12,90	47#177;1,73	33,5#177;8,18	83,1#177;0.6

Cinétique de la souche A18

A18	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	Témoin
j3	6,5#177;0	6#177;0	6#177;0	26,5#177;0.1
j4	7,33#177;0,57	6,16#177;0,28	6#177;0	34#177;0.1
j5	9#177;3,46	6,33#177;0,57	6#177;0	40,6#177;0.1
j6	14,05#177;6,16	9,33#177;4,93	6#177;0	47,5#177;0.3
j7	14,33#177;6,21	11,5#177;6,24	6#177;0	50,6#177;0.8
j8	26,33#177;6,25	16#177;8,32	6#177;0	54,6#177;0.9
j9	39#177;15,17	26,83#177;6,02	6#177;0	58,3#177;1.3
j10	37,16#177;5,05	31,33#177;2,30	6#177;0	59,8#177;1.6

Cinétique de la souche A37

A37	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	Témoin
j3	7#177;1,73	6,66#177;1,15	6#177;0	23#177;0.1
j4	10,5#177;3,12	8,5#177;2,17	6#177;0	45,1#177;0.1
j5	16,83#177;4,31	11#177;4,58	6#177;0	53,5#177;0.3
j6	23,83#177;5,61	13,83#177;7,75	6#177;0	57,8#177;0.9
j7	31,33#177;3,75	18,5#177;10,33	6#177;0	63,8#177;1.2
j8	38,83#177;5,39	22#177;11,13	6#177;0	66#177;1.5
j9	48,83#177;4,01	32,16#177;11,23	6#177;0	70,5#177;1.3
j10	53,66#177;3,68	35,33#177;11,026	6#177;0	76,8#177;1

Annexes

Cinétique de la souche A42

A42	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	temoin
j3	7#177;0,86	6#177;	6#177;	35,3#177;0
j4	10,33#177;2,88	6,16#177;0,28	6#177;	43,8#177;0
j5	13,66#177;4,72	11#177;0	6,33#177;0,57	49,1#177;0.2
j6	23,16#177;5,79	15,16#177;2,46	6,5#177;0,5	56,6#177;0.4
j7	31,33#177;6,78	23#177;2,64	10,33#177;1,44	57,6#177;0.6
j8	40#177;6,53	30,33#177;3,25	15,66#177;2,36	58,8#177;0.6
j9	50,66#177;6,65	39,33#177;2,36	24,33#177;5,05	60,5#177;0.6
j10	56,36#177;9,48	40,16#177;2,51	28#177;6,94	61#177;0.7

Cinétique de la souche A45

A45	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	Témoin
J3	9,33#177;3,51	6	6,66#177;0	32#177;0
J4	13,16#177;6,29	8,08#177;0,8	10,5#177;3,96	39,5#177;0
J5	18,66#177;4,53	15,16#177;1,25	15,5#177;4,92	48,5#177;0.1
J6	28,83#177;7,81	20#177;7	21,16#177;3,25	61#177;0.2
J7	31,16#177;6,21	28,33#177;1,44	25#177;4,33	60,3#177;0.1
J8	36,33#177;5,00	34,16#177;1,60	27,83#177;2,02	70,6#177;0.5
J9	40,33#177;7,97	37,66#177;3,61	31,33#177;2,51	74,3#177;0.5
J10	41,83#177;11,40	40,16#177;7,28	32,5#177;1,5	76,5#177;0.4

Cinétique de la souche A51

A51	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	7#177;0,86	6#177;0	6#177;0	36#177;0
j4	10,5#177;1,32	7,5#177;0,86	6#177;0	42,8#177;0.2
j5	15,66#177;1,44	12,66#177;1,52	7,33#177;0,57	49,6#177;0.3
j6	21,33#177;1,25	17,83#177;1,25	13,16#177;1,25	57#177;0.5
j7	27,66#177;2,02	22,83#177;1,52	19,16#177;1,25	59,1#177;0.8
j8	34,5#177;1,32	30,16#177;2,84	23,66#177;0,28	64,3#177;0.8
j9	43,66#177;2,51	43#177;2,17	36,83#177;2,56	74#177;1.5
j10	48,83#177;2,92	45,83#177;2,75	40,33#177;3,05	73,6#177;1.5

Annexes

Cinétique de la souche A57

A57	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	Témoin
j3	7#177;0,86	6#177;0	6#177;0	29,1#177;0.4
j4	10#177;2,78	6,33#177;0,57	6#177;0	39,1#177;0.1
j5	10,83#177;2,02	10,16#177;1,25	6#177;0	47,8#177;0.1
j6	15,16#177;2,75	13,83#177;1,89	6#177;0	53,6#177;0.2
j7	19,5#177;3,04	18,73#177;2,13	6#177;0	60,1#177;0.5
j8	26,5#177;4,58	26#177;3,60	6#177;0	63,5#177;1
j9	30,5#177;3,96	31,33#177;3,17	6#177;0	69#177;1
j10	36#177;4,09	35,16#177;4,64	6#177;0	71,3#177;1

Cinétique de la souche AT1

AT1	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	Témoin
j3	7,5#177;1,5	6,5#177;0,86	6#177;0	30,8#177;0.5
j4	10,16#177;2,25	8,33#177;0,76	6#177;0	42,3#177;0.4
j5	14,16#177;2,25	14#177;3,46	6#177;0	51,2#177;0.5
j6	18,33#177;2,51	17,6#177;2,02	6#177;0	57,1#177;0.4
j7	28,83#177;2,46	23,66#177;9,56	6#177;0	64,8#177;0.4
j8	36,5#177;2,56	31,16#177;11,82	6#177;0	72,3#177;0.7
j9	44,83333#177;3,51	36,66#177;13,25	6#177;0	73#177;0.2
j10	47,33#177;3,12	40#177;13,01	6#177;0	75,3#177;0.2

Cinétique de la souche AT4

AT4	0,8ul/ml	0,95ul/ml	1,1ul/ml	Témoin
j3	6,5#177;0,5	6#177;0	6#177;0	25,6#177;0
j4	8#177;1,5	8,33#177;0,57	6#177;0	37,3#177;0
j5	10,33#177;2,08	8,16#177;2,02	6#177;0	44,6#177;0
j6	14#177;0,5	10,83#177;0,57	6#177;0	52,8#177;0
j7	18,33#177;2,51	14,66#177;3,75	6#177;0	57,2#177;0.2
j8	23,5#177;4,09	21,66#177;2,88	6#177;0	64,5#177;0.6
j9	31,33#177;3,17	28,16#177;2,02	6#177;0	67,5#177;0.9
j10	32,5#177;0,5	28,83#177;7,50	6#177;0	70,6#177;0.7

Annexes

? De la plante de Micromeria debilis Cinétique de la souche A01

A01	0,95ul/m	1,1ul/ml	témoin
j3	6#177;0	6#177;0	24,6#177;2.5
j4	8,33#177;0.5	6,33#177; 0.5	28,5#177;1.3
j5	10,66#177;0.5	7,66#177; 0.5	36,5#177;6.2
j6	13,33#177;0.5	10#177; 1	43,8#177;0.3
j7	17,33#177;0.5	11,66#177; 0.5	49,5#177;7.7
j8	19,66#177;0.5	13,3 #177; 0.5	58#177;3.5
j9	22,33#177;0.7	16,83 #177;1.5	62,3#177;2.2
j10	24,5#177;0.5	18,33#177; 1.5	65,3#177;2.5

Cinétique de la souche A10

A10	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	10,66#177; 2	8#177;1	34#177;1
j4	14,6#177; 1.5	11.66#177;1.5	43,5#177;1.3
j5	21,66#177; 2	14.66#177;2	51,6#177;2.7
j6	26,66#177;1.5	19.83#177;4.6	63,5#177;1.3
j7	37,66#177;1.1	26#177;6.2	73,6#177;2.2
j8	43,33#177;1.5	31.5#177;8.2	85#177;0
j9	48,66#177;1.7	36.83#177;8.8	85,8#177;0.5
j10	54,5#177; 1.3	42.5#177;9.1	88#177;1

Cinétique de la souche A18

A18	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	6,5#177;0.5	6,33#177;0.5	28,6#177;1.5
j4	8,33#177;0.7	8,83#177;1	33,5#177;1.5
j5	11,33#177;0.7	10,33#177;0.7	37,6#177;1.6
j6	14#177;1.3	11#177;1	47,1#177;4
j7	16#177;1.3	11,66#177;0.7	55#177;4.2
j8	22,33#177;1	17,33#177;3.7	65,3#177;2.5
j9	28#177;2.2	24,5#177;2.7	77,1#177;0.7
j10	31#177;2.2	27,33#177;.2	79,8#177;0.7

Annexes

Cinétique de la souche A37

A37	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	10,5#177;0.5	6#177;0	32,6#177;3.4
j4	16,8#177;1	10,5#177;0.5	42,8#177;4
j5	21,1#177;0.2	14,16#177;0.7	48,8#177;3.8
j6	27,8#177;1.2	20#177;0.5	58,3#177;5.2
j7	35#177;1.3	25#177;1.7	69,6#177;6.6
j8	42,5#177;2.7	29,1#177;0.7	77,3#177;2.2
j9	50,5#177;3.2	36,6#177;0.7	81,6#177;1.6
j10	53,3#177;2	43,5#177;1.5	82,16#177;0.7

Cinétique de la souche A42

A42	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	6#177;0	6#177;0	27,8#177;0.2
j4	11,66#177;0.5	6#177;0	36,6#177;1
j5	19,66#177;1.2	6#177;0	44,1#177;1.2
j6	26,8#177;1.2	6#177;0	53,5#177;2
j7	35#177;1.8	6#177;0	62,5#177;2.7
j8	43,8#177;2	6#177;0	68,6#177;5.96
j9	49,6#177;2	6#177;0	74,1#177;3.3
j10	52,66#177;1.2	6#177;0	79#177;1.5

Cinétique de la souche A45

A45	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	9,16#177;0.7	6#177;0	32,5#177;1.6
j4	13,1#177;1.7	8,5#177;0.5	41#177;1.5
j5	16,8#177;1.6	12,3#177;1	48#177;2.5
j6	20,16#177;1.4	16#177;1.3	56,1#177;3.1
j7	23#177;1	19,5#177;0.8	66,6#177;2.7
j8	26,16#177;0.7	22,83#177;1.2	75,8#177;2.3
j9	30#177;0.5	26,5#177;0.8	80,3#177;0.2
j10	32,3#177;1.7	29,8#177;1.2	83#177;1.6

Annexes

Cinétique de la souche A51

A51	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	7,66#177;0.7	6,8#177;0.2	33,5#177;2.7
j4	12,33#177;0.7	11,8#177;0.7	43#177;4.4
j5	16#177;1.8	15,1#177;1	48,8#177;3.6
j6	20#177;2.5	19,1#177;0.7	56,3#177;4.8
j7	25,66#177;2.7	24#177;1.3	66,1#177;9.3
j8	33,1#177;2	29,1#177;3.5	68,7#177;4.3
j9	38#177;1.8	37,66#177;4.4	72,6#177;2.9
j10	43#177;4.5	42,73#177;3.7	76,3#177;2.5

Cinétique de la souche A57

A57	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	6#177;0	6#177;0	22,3#177;4.8
j4	6#177;0	6#177;0	27,5#177;4
j5	6#177;0	6#177;0	34,5#177;4.3
j6	6#177;0	6#177;0	41,8#177;3.8
j7	6#177;0	6#177;0	48,5#177;5.7
j8	6#177;0	6#177;0	57,3#177;8.3
j9	6#177;0	6#177;0	69,3#177;6.8
j10	6#177;0	6#177;0	78,5#177;5.5

Cinétique de la souche AT1

AT1	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	9,5#177;0.5	7,1#177;0.2	31#177;0.5
j4	14#177;0.5	10,8#177;0.7	40,5#177;0.8
j5	17,3#177;1	14,1#177;1	49,5#177;1.3
j6	22,3#177;1.8	19,5#177;1.5	56,5#177;1.5
j7	29#177;3.6	24,6#177;2.3	66,8#177;2.4
j8	35,5#177;3.1	31,8#177;3.7	74,6#177;2.3
j9	43,1#177;2.9	38,8#177;5.2	80,8#177;1
j10	48,33#177;2.9	43#177;4	82,8#177;0.7

Annexes

Cinétique de la souche AT4

AT4	0,95ul/ml	1,1ul/ml	témoin
j3	8#177;1	6,33#177;0.5	32,3#177;0.7
j4	12,16#177;0.7	8,8#177;0.28	40,1#177;2.3
j5	15,83#177;0.2	11,16#177;0.7	52#177;3.4
j6	20,6#177;1	14,8#177;0.2	59#177;1.5
j7	25,5#177;1.8	23,1#177;2.7	69,8#177;1.2
j8	31,5#177;0.5	25#177;1	78,6#177;3
j9	37,66#177;0.76	30,1#177;1	82,5#177;3.2
j10	42,3#177;1.2	36,16#177;2.2	82,6#177;2

Annexe 3: Taux d'inhibition de la croissance

> De la plante de Pulicaria mauritanica

P.maurintanica	A01	A10	A18	A37	A42	A45	A51	A57	AT1		AT4	0,8ul/ml
59,2	47,25	42,06	32,67	8,42	49,17	36,63	54,05	50,93	58,97		0,95ul/ml
69,05	46,82	52,91	58,56	37,87	51,53	41,07	55,33	40,35	64,65		1,1ul/ml
74,31	64,33	100	100	60	62,41	49,21	100	100	100

> De la plante de Micomeria debilis

M.debilis	A01	A10	A18	A37	A42	A45	A51	A57	AT1		AT4	0,95ul/ml
68,8	40,8	66,1	37,8	36,	65,8	47,3	100	44,8	52,5		1,1ul/ml
79,2	55,4	71	50,7	100	69	47,7	100	51,8	60,6

Annexe 4 : Taux d'inhibition de la sporulation

> De la plante de Pulicaria mauritanica

P.maurintanica	A01	A10	A18	A37	A42	A45	A51	A57	AT1	AT4
0,8ul/ml	47,3#177;0,6	6,3#177;3,7	38,6#177;1,6	42#177;1,3	34,5#177;0,7	47,8#177;0,3	11#177;0,5	47,2#177;3	37,5#177;0.1	66#177;3
0,95ul/ml	97,3#177;0,1	67,9#177;1,8	34,5#177;4,4	90#177;0,2	80,9#177;0,4	60,7#177;0,4	99#177;0,1	97,3#177;4	62,2#177;0.2	74#177;1,8
1,1ul/ml	100#177;0	68,8#177;3,8	100#177;0	90#177;0,2	97,6#177;0,1	86,9#177;0,3	100#177;0	100#177;0	74,8#177;0.1	80#177;1,2

Annexes

> De la plante de Micromeria debilis

M.debilis	A01	A10	A18	A37	A42	A45	A51	A57	AT1	AT4
0,95ul/ml	74,6#177;0,3	37,4 #177;1	53,6#177;0,7	30,#177;0,5	50#177;0,2	80,4#177;0,4	27,#177;0,1	100#177;0	71,4#177;0,1	40#177;0,3
1,1ul/ml	100 #177;0	62,5#177;0,8	69,1#177;0,5	100 #177;0	100#177;0	93,4#177;0,2	81,8#177;0,1	100#177;0	92,8#177;0,1	100 #177;0

Annexe 5 : Vitesse de la croissance

> De la plante de Pulicaria maurintanica

P.maurintanica	A01	A10	A18	A3	A42	A45	A51	A57	AT1	AT4
0ul/ml	0,56	0,79	0,61	0,74	0,69	0,76	0,76	0,71	0,76	0,68
0,8ul/ml	0,21	0,33	0,26	0,38	0,39	0,35	0,35	0,26	0,33	0,25
0,95ul/ml	0,17	0,31	0,21	0,25	0,28	0,3	0,31	0,25	0,3	0,21
1,1ul/ml	0,16	0,22	0,08	0,08	0,19	0,26	0,26	0,08	0,08	0,08

> De la plante de Micomeria debilis

M.debilis	A01	A10	A18	A37	A42	A45	A51	A57	AT1	AT4
0ul/ml	0,61	0,85	0,71	1,2	0,73	0,79	0,77	0,65	0,79	0,8
0,95ul/ml	0,2	0,42	0,23	0,42	0,39	0,28	0,32	0,08	0,37	0,32
1,1ul/ml	0,15	0,32	0,2	0,31	0,08	0,23	0,31	0,08	0,32	0,08

Résumé

Le but de ce travail était d'évaluer l'activité antifongique in vitro des huiles essentielles de deux plantes aromatiques de la région de Naama :Pulicaria mauritanica et Micromeria debilis vis-à-vis de dix souches fongiques du genre Alternaria sp responsables de l'alternariose de la plante de tomate.

L'identification des isolats fongiques a été basée sur les caractères culturaux et les caractères morphologiques. Les souches identifiées appartiennent aux espèces Alternaria alternata, Alternaria tenuissima, Alternaria solani et Alternaria tomatophila.

Le rendement en huile essentielle issu d'une extraction par hydrodistillation était de l'ordre de 0.30% et 0.045% pour P.mauritanica et M.debilis respectivement. L'étude de l'activité antifongique de ces huiles par la méthode de contact direct a révélé une importante activité vis-à-vis des souches testées.

L'efficacité de chaque HE est estimée par la détermination du taux d'inhibition de la croissance mycélienne et le taux d'inhibition de la sporulation, d'où l'inhibition total de la majorité des souches nous a donné des valeurs de CMI comprises entre 0.95 à 1.1ul/ml.

En conclusion, ces huiles peuvent être considérées comme une alternative potentielle aux fongicides synthétiques.

Mots clés : Pulicaria mauritanica ;Micromeria debilis ,Alternaria sp, Hydrodistillation ,Huile essentielle, Activité antifongique.

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Abstract

This stady aimed to evaluate in vitro the antifungal activity of the essential oils of two aromatic plants growing in Naama: Pulicaria mauritanica and Micromeria debilis against ten fungal strains belonging Alternaria sp responsible of the fungal diseases that infect tomatoes..

The identification of fungal isolates was based on cultural traits and morphological characters. The results showed that the identified strains belong to the following species: Alternaria alternata, Alternaria tenuissima, Alternaria solani and Alternaria tomatophila.

While, the yield of essential oil resulting from a hydrodistillation extraction was of the order of 0.30% and 0.045% for P.mauritanica and M.debilis respectively. The study of the antifungal activity of these oils by the direct contact method revealed an important activity to some strains tested.

The effectiveness of each EO is estimated by determining the inhibition rate of mycelial growth and the rate of inhibition of sporulation, where the total inhibition of the majority of strains gave us MIC mean value ranging between 0.95 to 1.1ìl / ml.

Finally, these oils can be considered as a potential alternative to synthetic fungicides. Key words: Pulicaria mauritanica, Micromeria debilis, Alternaria sp, Hydrodistillation, Essential oil, Antifungal activity.