Memoire Online - Recherche de staphylocoque et salmonella sur la paume de main chez les vendeurs des aliments sur les voies publiques dans la commune Makiso a Kisangani

Cette étude a été menée dans la ville de Kisangani, commune Makiso, une des six communes de la dite ville, chef lieu de la province de la Tshopo.

Makiso est situé au centre de la ville de Kisangani en République démocratique du Congo. Elle comprend une zone marchande, la mairie, le gouvernorat, l'Université de Kisangani, l'Institut Supérieur Pédagogique, l'Institut supérieur de commerce de Kisangani, la grande Poste, la BRALIMA, la SOTEXKI et tant d'autres.

Les échantillons ont été prélevés dans trois sites différents: Shaumba UNIKIS, Marché central et aux alentours de la Faculté des Sciences. Trois prélevements ont été realisés dans chaque site.

Les échantillons ont été prélevés par écouvillonage de paume de main des vendeurs des aliments sur les voies publiques. L'écouvillon est ensuite placé dans le tube à essai contenant 10ml d'eau peptoneé, puis transféré au laboratoire de Microbiologie et Phytopathologie de la Faculté des Sciences dans une glacière portative, pour les analyses.

Nous avons procédé à une dilution jusqu'à 10^-5. 1ml de chacune de ces dilutions a été inoculé dans la boîte de Petri et 15 ml de Staphylococus agar ont été coulés dans la boîte. Après homogénéisation par un mouvement de rotation et solidification, les boîtes ont été incubées à 37°C pendant 24h. Des colonies jaunes ou blanches sont comptées.

Un millilitre de l'échantillon mère est prélevé, puis dilué dans 9 ml de Muller-kauffmann contenu dans le tube à essai de 10ml. La solution est incubée à 37⁰C pendant 24h. Après 24h, prélever 2ml de la solution incubée et déposer dans deux boîtes de Petri respectivement 1ml par boîte. Couler ensuite 15 ml du milieu S.S agar par boîte. Homogénéiser par un mouvement de rotation; puis, laisser se solidifier. Après solidification, incuber à 37°C pendant 24h. Des colonies noirâtres sont comptées.

Il s'agit d'une coloration complexe qui est obligatoire pour une première étape d'identification des microorganismes.

Les diverses étapes de la coloration de Gram peuvent être résumées de la façon suivante :

+ Une colonie bactérienne isolée et pure est prélevée dans la boite de Pétri à l'aide d'une anse de platine.

+ Un frottis mince est réalisé sur une lame avec l'anse. La lame est ensuite fixée rapide au-dessus de la flamme du bec Bunsen.

+ Quelques gouttes de violet de gentiane sont versées sur la lame et laissées agir pendant 60 secondes. La lame est ensuite lavée à l'eau courante.

+ Quelques gouttes de lugol sont versées sur la lame pour réagir pendant 30 secondes. La lame est du nouveau lavé à l'eau courante.

+ La lame est recouverte d'éthanol (alcool) pendant 10 secondes puis lavée tout de suite afin d'éviter une décoloration exagérée.

+ La fuchsine est appliquée pendant 10 secondes pour une recoloration du prélèvement. + La lame est séchée sur la flamme de bec Bunsen.

+ La lame est recouverte d'huile à immersion avant l'observation au microscope optique à l'objectif X100 (Randriamalala, 2018)

La détection de la présence de la catalase chez les bactéries est essentielle pour différencier les Staphylococcus (catalase positive) des Streptococcus (catalase négative).

Bien qu'elle soit principalement utile pour différencier entre ces genres, il est également utile dans la distinction entre les espèces appartenant au meme genre comme Aerococcus (catalase positive) et Aerococcus viridians (catalase négative) par exemple.

Le test de catalase est également utile pour différencier entre les bactéries aérobies et anaérobies obligatoire.

+ À l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée, ajouter l'inoculum bactérien, + Observer immédiatement,

? S'il y a apparition des bulles, dégagement des dioxygènes : catalase positive ? S'il y a abscence des bulles : catalase négative (Prudencio,2018).

Le test mettant en évidence l'aptitude des Staphylocoques à coaguler le plasma est le principal test caractérisant S. aureus. Ce test de détection consiste à incuber pendant au moins 4 h à 37 °C un mélange de 0.5 ml de plasma et de la souche à tester. L'apparition d'un caillot est observée après 4 heures en inclinant à 90 °.

Si aucun caillot n'est observé au bout de 4 heures, l'essai sera poursuivi avec une incubation pendant une nuit à la température ambiante et une observation finale à 24 heures (Mekhloufi, 2018).

Ce test permet l'identification de 99 % de souches de S aureus, mais certaines souches ne produisent pas de coagulase. Alors l'identification de l'espèce est dans ce cas réalisée par d'autres tests.

A proximité du bec-bunsen, prélever une colonie bactérienne, déposer dans le tube contenant 10 ml d'eau physiologique, ensemencer rapidement en strie très serrées sur toute la surface d'une nouvelle boite de Pétrie contenant la gélose Mueller- Hinton par écouvillonage. Les disques imbibés d'antibiotique sont déposés aseptiquement sur la gélose au moyen d'une pince stérile. Laisser les boîtes 15 minutes à la température de laboratoire pour laisser les antibiotiques se diffuser. Incuber à 37⁰C pendant 24h.

L'effet des antibiotiques sur les germes est mis en évidence par lapparition des zones d'inhibition. On considère comme zone d'inhibition, le Halo clair autour des disques où il y a absence totale de croissance. Ainsi, la sensibilité des bactéries aux antibiotiques sera appréciée en mesurant le diamètre de zone avec une latte millimétrée. La valeur obtenue moins le diamètre du disque (7mm) sera comparée à celle de diamètre critique de l'antibiotique (Prudencio, 2018):

? Si le diamètre de la zone d'inhibition est inférieur au diamètre critique: il convient de conclure résistant (R);

? Si le diamètre de la zone d'inhibition est supérieur au diamètre critique: il convient de conclure sensible (S);

? Les réponses intermédiaires sont assimilées aux résistants. II.2.7. Analyse statistique des données d'analyse microbiologique

Afin de comparer les différents sites ciblés par rapport aux valeurs moyennes des paramètres microbiologiques considérés, une analyse descriptive a été réalisée. Ainsi, pour comparer la variation considérée d'un site à un autre, une analyse de la variance (ANOVA) a été réalisée.

Les données ont été collectées dans l'anonymat avec un consentement éclairé des vendeures.

III.1.1. Isolément et dénombrement

Le dénombrement en UFC/ml de germe de Staphylococcus et Salmonella pour tous les prélèvements effectués, leurs différentes moyennes et les caractéristiques des souches isolées sont présentés dans les tableaux 2,3 ,4,5,6 et 7. A noter qu'aucune croissance n'a été observée pour les Salmonella.

Tableau 2. Dénombrement des Staphylococcus et Salmonella dans les échantillons prélevés sur les mains des vendeurs de restaurant se trouvant au marché central.

A la lumière du tableau 2, on constate que le nombre de colonies de Staphylococcus varie de 340 à 822,7 UFC/ml et une absence de colonies de Salmonella. Ainsi le Staphylococcus est la bactérie la plus fréquente isolée en grand nombre des paumes de main des vendeurs des aliments se trouvant au marché central.

Tableau 3. Dénombrement des Staphylococcus et Salmonella dans les échantillons prélevés sur les mains des vendeurs de restaurant se trouvant au Shaumba/UNIKIS

A la lumière du tableau 3, le nombre de Staphylococcus varie de 175 à 447,6 UFC/ml, ainsi, le Staphylococcus est l'espèce la plus fréquente dans le site, contrairement aux Salmonella qui sont absentes.

Tableau 4. Dénombrement des Staphylococcus et Salmonella dans les échantillons prélevés sur les mains des vendeurs de restaurant se trouvant aux alentour de la Faculté des sciences.

A la lumière du tableau 4, le nombre de Staphylococcus a été présent dans deux échantillons (E1: 255 UFC/ml et E2: 180 UFC/ml), contrairement aux Salmonella qui n'ont pas pu pousser durant l'ensemencement.

Tableau 5. La moyenne de Staphylococcus et Salmonella trouvés dans les échantillons prélevés sur les mains des vendeurs de trois différents sites.

En faisant la moyenne, il ressort que la présence de Staphylococus la plus faible entre les trois sites se situe au restaurant se trouvant aux alentours de la faculté des sciences/ UNIKIS (145 UFC/ml). Cependant, la présence de Staphylococus la plus élevée se situe au restaurant se trouvant au niveau de marché central de Kisangani (539,93 UFC/ml).

Le résultat de la coloration Gram sur les 10 souches de Staphylococcus aureus isolées est présenté dans le tableau 6:

A la lumière du tableau 6, l'analyse de la coloration Gram effectuée pour les 10 souches présumées de Staphycoccus révèle la présence de cocci Gram positif pour toutes les 10 souches soumises à la coloration de Gram.

III.1.2.2. Test de catalase et coagulase des souches de Staphylococcus aureus isolées

Les résultats de test catalase et coagulase sont présentés dans le tableau 7:

SOUCHE	CATALASE	COAGULASE
S1	+	+
S2	+	+
S3	+	+
S4	+	+
S5	+	+
S6	+	+
S7	+	+
S8	+	+
S9	+	+

Le tableau 7 révèle que toutes les 10 souches sont catalases et coagulases positives, ce qui indique la presence de Staphylococcus aureus.

La sensiblité des souches de Staphylocoques a été testée face aux antibiotiques, après mesure de la zone d'inhibition autour de disque d'antibiotique.

Les differents diamètres des zones d'inhibition (en mm) des souches de Staphylococcus aureus soumises au test de sensibilité aux antibiotiques sont présentés dans le tableau 8:

Tableaau 8. Les diamètres des zones d'inhibition (en mm) observés et mesurés autour des

disques d'antibiotiques.
SOUCHE	PENICILINE	OXACILLINE	PEFLOXACINE
S1	12,5	0	13,5
S2	13,5	0	11,5
S3	14,5	0	8,5
S4	11,5	0	12,5
S5	8,5	0	10,5
S6	8,5	0	9,5
S7	7,5	0	11,5
S8	14,5	0	11,5
S9	0	0	9,5
S10	0	0	10,5
Légende

S1: Souche de Staphylococcus aureus prélevée dans le premier site lors du premier prélevement.

A la lumière du tableau 8, il ressort que toutes les souches de Staphylococcus aureus ont présenté une résistance envers les 3 différents antibiotiques testés.

L'analyse statistique nous a montré qu'il n'y a pas des différences significatives pour ce qui est de la charge bactérienne de Staphylococcus aureus dans trois sites frequentés : F=2,569, df= 3,811, p= 0,1966, á= 0,05.

La présente étude consistait à la recherche de Staphylococus et Salmonella sur les paumes de mains des vendeurs des aliments sur les voies publiques de la ville de Kisangani, Commune Makiso. En effet, neuf échantillons des vendeurs qui assurent différents services dans ces restaurants ont été prélevés durant l'étude et soumis aux analyses microbiologiques.

L'analyse de dénombrement effectuée après prélèvement a montré la présence de Staphylococus sur les mains de tous les vendeurs, mais une absence de Salmonella (tableau 2,3 et 4). La caractérisation de ces souches nous a révélé la présence de cocci Gram positif (Tableau 6). Les souches ont été identifiées par les tests biochimiques (Tableau 7).

L'espèce Staphylococcus aureus a été l'espèce la plus mise en evidence durant cette étude. Cela pourrait s'expliquer par le fait que Staphylococcus aureus est présent sur la peau d'une majorité de personnes et il est facile d'imaginer comment il se propage. Une bonne hygiène des mains est importante pour limiter la propagation de cette espèce. Le même constat a été fait par Nsobani Lukelo à Kinshasa en 2012. Au terme de son étude, il a remarqué une prédominance de Staphylococcus aureus dans une proportion de 62% parmi les nombreuses espèces bactériennes identifiées.

Nos résultats sont comparables à ceux de Kouame et al. (2019) qui ont effectué une enquête sur les pratiques d'hygiène, et des analyses microbiologiques ont été effectuées sur les mains des vendeurs de la viande de poulet braisé. Les analyses microbiologiques effectuées révélaient la présence de Staphylococcus aureus dans toutes les communes. Les études réalisées par Muinde et al. (2005) ont révélé que les manipulateurs d'aliment ont souvent un faible niveau d'éducation. Ils sont sans licence, sans formation en matière d'hygiène alimentaire et de technologie.

Nos résultats se rapprochent également à ceux de Kikèlola (2018). En effet, parmis les 13 germes identifiés sur les mains des vendeuses de nourritures à la frontière de Seme-krake, au Benin en 2018, le Staphylococus aureus était parmi les germes dont la fréquence était élevée.

Une étude similaire a été menée par Rachedi et al. (2021), qui ont travaillé sur la surface des mains des cuisiniers d'INATAA. Nos résultats se concordent, car une charge microbienne importante de Staphylococus des mains des cuisiniers variait d'un jour à un autre certainement quand les cuisiniers s'appliquent dans le lavage de leurs mains.

Ghita (2020) a travaillé sur l'étude phénotypique et moléculaire des micro-organismes isolés des aliments et leurs environnement dans une structure de restauration hospitalière et pratiques d'hygiène, sur la totalité des prélèvements des mains analysés, 92.5% ont présenté des germes. La fréquence d'isolement de Staphylococcus spp était de 83,33%.

Une étude a été menée par Nait et al. (2015) dont leurs résultats sont comparables aux résultats de cette présente étude, car, les résultats du dénombrement de Staphylococcus ont révélé la présence très remarquable de colonie de Staphylococcus même après nettoyage des mains. Cela était du à plusieurs facteur:

? Les employés n'ont pas utilisé de solution désinfectante le jour où le prélèvement a été effectué;

? Absence de serviettes en papier jetables pour le séchage des mains après lavage.

Au cours de l'étude réalisée par Rosine-Olga (2019), la bactérie Staphylococus a été l'espèce majoritaire identifiée. Ces résultats se rapprochent aussi à ceux de Nabila et al. (2014), qui rapportent que les bactéries fréquemment isolées des surfaces des mains à l'Hôpital El Idrissi de Kenitra au Maroc, sont les Staphylococcus à coagulase positive.

Une étude a été menée par Gonsu et al. (2015). Ces derniers ont révélé que le Staphylococus areus représentaient les contaminants les plus isolés.

Nos résultats sont non loin de ceux de Fabien (2015) qui avait trouvé que tous ces échantillons des mains prélevés présentaient un très haut risque en ce qui concerne les entérobactéries et les staphylocoques.

Les résultats de cette présente étude se concordent également à ceux de Zaharatou et al. (2013). Le mains de 12 étudiants en stage ont été écouvillonnées juste avant le début des manipulations au laboratoire. Après analyses, l'espèce Staphylococcus aureus a été l'espèce la plus mise en évidence.

Nos résultats sont comparables à ceux de Maroua et al. (2019) qui ont travaillé sur la recherche et identification phénotypique des germes responsables des infections nosocomiales dans un milieu hospitalier, dans le Service Cardiologie et Service Médecine Interne Femme, ils ont trouvé une présence remarquable de l'espèce Staphylococus aureus.

Pour ce qui est de Salmonella, durant l'étude de Maroua (2019), ses résultats sont à peu près similaires aux notre. En effet sur l'ensemble des germes isolés, Salmonella n'a été présent qu'à 2 %.

Nos résultats se concordent à ceux de Aouissi et al. (2020). Ils ont écouvillonné au total dix échantillons des paumes de main et aucun d'eux n'a donné une culture de Salmonella.

Comparativement à nos résultats, Sylla (2020) a effectué 63 nombre de prélèvement pour la recherche de Salmonella, toutes les boîtes n'ont pas poussé.

Une étude a été également menée par Hamzé et al. (2008) sur l'analyse biologique réalisée chez les travailleurs dans le secteur alimentaire au nord de Liba. Nos résultats se concordent car le Salmonella n'a été trouvée chez aucun des travailleurs.

Une étude a été menée par Mohamed et al. (2016). En effet, parmis ses antibiotiques testés, la péniciline, péfloxacine et oxaciline ont présenté la plus faible activité de résistance sur les souches isolées. Elazhari et al. (2009) ont fait aussi le même constant.

Comparativement aux résultats trouvés par Hamzé et al. (2008), nos résultats se concordent pas pour deux antibiotique, car il y avait présence d'une résistance importante vis-à-vis de péniciline (98,7%) et péfloxacine (14,3%), mais une faible résistance à l'oxacilline.

Recherche de staphylocoque et salmonella sur la paume de main chez les vendeurs des aliments sur les voies publiques dans la commune Makiso a Kisangani

CHAPITRE DEUXIEUME : MATERIEL ET METHODES

III.1.1. Isolément et dénombrement