Antibiorésistance des entérobacteries productrices de b-lactamases à spectre étendu isolées de l'hôpital de Sétif (Algérie): détermination des gènes par PCR-multiplex

1 íØÓ ÓÇÈÚ ÊÇÍÑ ÉÚãÇÌ

Univesité Ferhat Abbas Sétif 1
Faculté des Sciences de la
Nature et de la Vie

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ÉÇíÍáÇ

J ÉÚíÈØáÇ ãæáÚ

DEPARTEMENT DE MICROBIOLOGIE N° /SNV/2017

MEMOIRE

Présenté par:

REFOUFI KHALIL ABDALLAH
Pour l'obtention du diplôme de

MASTER EN BIOLOGIE

Filière: Biologie

Spécialité: Microbiologie Appliquée

THèME

Soutenue publiquement le : 01/07/2017

DEvANT LE JURY

Président : Dr. Silini Allaoua MCA UFA SETIF1

Promoteur : Dr. Silini-Cherif Hasfa MCA UFA SETIF1

Co-promoteur : Pr. Sahli Farida Pr CHU/UFA SETIF1

Examinateur : Dr. Yahiaoui Bilal MCA UFA SETIF1

Laboratoire de Microbiologie Appliquée

2016/2017

DEDICACE

Je dédie ce modeste travail à celle qui m'a donné la vie le symbole de tendresse qui s'est sacrifiée

pour mon bonheur et ma réussite, à la lumière de ma vie íã

A ma cher grand mère Malika

A mes frères Mohsen et Ayoub que J'aime beaucoup

A mes soeurs Hadjer et Hafsa que j'aime autant

A ma cher époue Aicha qui m'a aidé tout ce parcours de Master

A mes deux petites puces Ritedj et Djenat

A mes oncles TOUFIK, SEDDIK, LAZHER, AZZEDINE, AHMES et FETHEDDINE

A mes tentes NABILA, HOURIA, SAMIA, KHAOULA, LAMIA, et HANANE

A tout mes cousins et cousines

A mes meilleurs amis KAMAL et FOUZI

A Moumeni A/Krim et Zerroug Imad qui mon soutenue

A Radjai Issam prof. d'Anglais qui ma beaucoup aidé

A mes collégues de ces deux années de Master surtout Kebaili Oussama, Boutaghane, Méziane

Amine, Marouani Kaouther et Soltani Nassima qui mon aidés a intégré A ma famille REFOUFI et GHODBANE

Je souhaite remercie aussi toute l'équipe du Laboratoire surtout HARBOUCHE Wided, KHABCHACHE Hasna, BOULAHYA Zineb, GUETTOUCHE Houda, AYADI Hayet, DIABI

REMERCIEMENT

Avant tout, je remercie le bon Dieu tout puissant qui m'a donné la force et de m'avoir permis d'arriver à ce stade-là.

Ce travail a été effectué au sein de deux laboratoires : Laboratoire de « Microbiologie »,

Hôpital « SAADNA Mohamed Abdennour » de Sétif, Algérie ; et Laboratoire de recherche à l'Université FERHAT Abbas, Faculté des Sciences Nature et Vie, El BAZ.

Mes remerciements s'adressent d'abord, à mon directeur de thèse, le Docteur SILINI-CHERIF Hafsa. Je la remercie pour son encadrement, pour ses encouragements et sa rigueur scientifique au quotidien durant ce modeste travail. Merci de m'avoir fait confiance et m'a encouragé pour la réalisation de mon mémoire de fin d'étude.

Je remercie également, ma co-directrice de thèse, Madame le Professeur SAHLI Farida pour ses aides et ses orientations.

C'est avec un grand plaisir que je remercie le Docteur SILINI Allaoua, pour l'honneur qu'il m'a fait en acceptant de présider le jury de cette thèse, que ce travail constitue le témoignage de notre respect.

Je tiens également à exprimer mes plus profonds remerciements au Docteur YAHIAOUI Bilal, pour sa disponibilité, et pour l'honneur qu'il m'a fait en acceptant d'examiner ce travail. Je le remercie pour ses précieux conseils et ses encouragements.

Je remercie le Docteur MESSAI Chafik Redha pour l'aide et les conseils qu'il ma donné. Je voudrais désormais remercier Mr BIAZ Mustapha, le chef de service du laboratoire de

Microbiologie, CHU de Sétif ; pour m'avoir accueilli au sein de son laboratoire, pour ses discussions scientifiques et son ouverture d'esprit. Je le remercie pour sa confiance, son soutien, ses encouragements, et son affection.

Mes vifs remerciements s'adressent également a Mme YAHIA-CHERIF-BOUNECHADA Nora de m'avoir aidé tout au long de ma présence au Laboratoire de Sétif.

Nardjes, BOUDJLLEL Naziha, CHERRAD Hasna, Marwa. Je remercie aussi tous mes collègues et mes enseignants, ainsi que les personnels administratifs de l'université FERHAT Abbas.

Merci enfin à l'ensemble des personnes qui m'ont aidé de prés ou de loin dans l'élaboration de ma thèse.

SOMMAIRE

Listes de tableaux Listes des figures

Liste des abreviations

Résumé

Introduction 1

CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1-Les entérobactéries 3

1-1-Définition 3

1-2-Classification 3

1-3-Caractères bactériologiques 3

1-4-Caractères biochimiques 4

1-5-Caractères antigéniques 4

1-6-Pouvoir Pathogène 4

2-Les f3-lactamines 7

2-1-Classification des f3-lactamines 7

2-1-1-Les pénicillines (noyau péname) 8

2-1-2-Les céphalosporines (noyau céphème) 8

2-1-3-Les pénèmes (Carbapénèmes) 10

2-1-4-Les monobactames 10

2-1-5-Les inhibiteurs des f3-lactamases 10

2-2-Mode d'action des f3-lactamines 12

3-Résistance des entérobactéries aux f3-lactamines 12

3-1-Types de résistance 12

3-1-1-La résistance naturelle 13

3-1-2-La résistance acquise 13

3-2-Supports génétiques de la résistance 14

3-2-1-Le chromosome 14

3-2-2-Les éléments génétiques mobiles 14

a) Plasmides 15

b) Séquences d'insertion et transposons 16

c) Les intégrons 16

3-3-Mécanismes de résistance aux f3-lactamines 17

3-3-1-Diminution de la perméabilité 17

3-3-2-Modification de la cible 17

3-3-3-Hyperproduction du système d'efflux 17

3-3-4-Production d'enzymes 18

4-Les f3-lactamases 18

4-1-Classification des f3-lactamases 19

4-1-1-Classification d'Ambler 19

4-1-2-Classification de Bush-Jacoby-Medeiros 20

5-Les f3-lactamases à spectre élargi BLSE 22

5-1-Différents types de BLSE 22

5-1-1-BLSE de type TEM (Temoneira - nom du patient) 22

5-1-2-BLSE de type SHV : (Sulfhydryl variable) 24

5-1-3-BLSE de type CTX-M (Cefotaximase-Munich) 25

5-1-4-Autres types de BLSE 25

5-1-5-Les Carbapénèmases 26

a)Classification des carbapénèmases 26

6-Epidémiologie mondiale des entérobactéries BLSE 29

6-1-Les BLSE classiques 29

6-1-1-En Europe 29

6-1-2-En Afrique 29

6-1-3-En Asie 30

6-1-4-En Amérique 31

6-2-Les BLSE de type carbapénèmases 32

7-Facteurs de risque d'acquérir une BLSE 33

CHAPITRE 2 : MATERIEL ET METHODES

1-Prélèvement et identification 34

1-1-La mini galerie (galerie classique) 34

1-2-La galerie Api 20^E 35

1-3-Le systeme MicroScan WalkAways SIEMENS 35

2-Antibiogramme 36

3-Détection phénotypique des EBLSE 37

3-1-Test de synergie 38

3-2-Test du double disque 38

3-3-Test à la cloxacilline 39

4-Détection génotypique des EBLSE 40

4-1-Extraction d'ADN plasmidique par la lyse alcaline 40

a) Extraction d'ADN 40

b) Extraction de l'ADN chromosomique par Boiling 41

4-2-Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) 41

4-2-1-Principe 41

4-3-Electrophorèse sur gel d'agarose 43

CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION

Résultats 44

1-Entérobactéries 44

1-1-Répartition des entérobactéries par espèces 44

1-2-Répartition des entérobactéries selon l'origine de l'infection 45

1-3-Pourcentage des entérobactéries selon le sexe 45

1-4-Répartition des entérobactéries selon les tranches d'âge 46

1-5-Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques 47

1-6-Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques par année 47

a) Résistance aux f3-lactamines 47

b) Résistance aux autres antibiotiques 48

2-Les EBLSE 49

2-1-Fréquence d'isolement des EBLSE 49

2-2-Répartition des EBLSE selon l'espèce 50

2-3-Répartition des EBLSE selon l'origine de l'infection 50

2-4-Répartition des EBLSE selon le service 51

2-5-Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement 52

2-6-Répartition des EBLSE selon le sexe 52

2-7-Profil de résistance des EBLSE 53

2-7-1-Résistance aux f3-lactamines 53

2-7-2-Résistance aux aminosides 54

2-7-3-Résistance aux quinolones 54

2-7-4-Résistance aux autres antibiotiques 54

3-Support génétique de la résistance 55

4-Caractérisation des BLSE par la PCR-multiplex 58

4-1-BLSE de type CTX-M 58

4-2-BLSE de type SHV 60

4-3-BLSE de type TEM 60

4-4-Résistances multiples 60

Discussion 63

Conclusions et Perspectives 69

Références bibliographique 72

Annexe

Liste des tableaux

Tableau 1. Classification des f3-lactamines 11

Tableau 2. Classification global des BLSE 21

Tableau 3. Principales carbapénémases des entérobactéries 27

Tableau 4. Antibiotiques testés 37

Tableau 5. Composition des différents tampons d'extraction 40

Tableau 6. Amorces utilisées 41

Tableau 7. Etapes de la PCR-Multiplex 42

Tableau 8. Différents types de plasmides extraits des EBLSE 56

Tableau 9. Caractéristiques générales et moléculaires des souches d'entérobactéries

productrices de f3-lactamases à spectre étendu isolées au CHU de Sétif 61-62

Liste des figures

Figure 1. Structures chimiques des principales f3-lactamines et inhibiteurs de f3-lactamases... 8

Figure 2. Structure chimique de la ceftaroline 10
Figure 3. Modes de transmission du matériel génétique : la conjugaison, la transformation et

la transduction chez les bactéries 15

Figure 4. Mode d'action des f3-lactamases 18

Figure 5. Les BLSE dérivées de TEM 23

Figure 6. Les BLSE dérivées de SHV 24

Figure 7. Disposition des disques d'antibiotique pour le test de synergie 38

Figure 8. Schéma de détection de BLSE par le test du double disque 39

Figure 9. Photo du thermocycleur TC-4000 42

Figure 10. Photo d'une migration d'ADN par électrophorèse 43

Figure 11. Photo du transilluminateur Fisher-Bioblock UV 43

Figure 12. Répartition des entérobactéries selon l'espèce 44

Figure 13. Pourcentages des entérobactéries selon l'origine de l'infection 45

Figure 14. Pourcentages des souches entériques selon le sexe 46

Figure 15. Répartition des entérobactéries selon les tranches d'âge 46

Figure 16. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux antibiotiques 47

Figure 17. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux f3-lactamines par année 48

Figure 18. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux autres antibotiques par année 49

Figure 19. Fréquence des EBLSE 49

Figure 20. Répartition des EBLSE par espèce 50

Figure 21. Répartition des EBLSE selon l'origine de l'infection 51

Figure 22. Répartition des EBLSE selon le service 51

Figure 23. Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement 52

Figure 24. Répartition des EBLSE selon le sexe 52

Figure 25. Test de synergie 53

Figure 26. Test de synergie vu dans un antibiogramme d'une souche Klebsiella pneumoniae

BLSE+ 54

Figure 27. Profil de résistance des EBLSE aux antibiotiques 55

Figure 28. Profil plasmidique des 56 souches d'EBLSE 57

Figure 29. Amplifications par PCR-Multiplex des gènes blaCTX-M, blaSHV et blaTEM 59

Figure 30. Prévalence des gènes de résistance chez les souches amplifiées 60

Figure 31. Stratégies et les cibles bactériennes utilisées pour lutter contre la résistance aux. 71

Liste des abréviations: ATB : Antibiogramme.

BCP : Bromo-Créso-Phénol. bla : bêta-lactamse.

BLSE : 3-Lactamase à Spectre Elargi.

C1/2/3/4/5G : Céphalosporine de 1^ére /2^éme /3^éme /4^éme /5^éme Génération.

Cfr : Citrobacter freundii.

CHU : Centre Hospitalo-Universitaire.

CMI : Concentration Minimale Inhibitrice.

CTX-M : Céfotaximase-Munich.

DAEC : E. coli à Adhérence Diffuse.

Eae : Enterobacter aerogenes.

EAEC : E. coli Entéroagrégatives.

EBLSE : Entérobactéries 3-Lactamase à Spectre Elargi.

Ecl: Enterobacter cloacae.

Eco: Escherichia coli.

EHEC : E. coli Entérohémorragiques.

EIEC : E. coli Entéroinvasives.

Enz : Enzyme.

EPEC : E. coli Entéropathogènes.

ETEC : E. coli Entérotoxinogènes.

IR : Intégrons de Résistance.

kpb : kilos paire de base.

KPC : Klebsiella pneumoniae Carbapénémase.

Kpn: Klebsiella pneumoniae.

KT : cathéter.

LCR : Liquide Céphalo-Rachidien.

LP : Liquide Pleural.

McF : McFarland.

MH: Muler-Hinton.

Mmo: Morganella morganii

MYSTIC: Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection.

MâL : Métallo-â-Lactamase.

OMS : Organisation Mondiale de la Santé.

ONPG : OrthoNitrophényl b-D-GalactoPyranoside.

pb : paire de base.

PB : Prélèvement Buccal.

PBP: Penicillin Binding Proteins.

PCR: Polymerase Chain Reaction.

PLP : Protéines de Liaison aux Pénicillines.

PR : Prélèvement Rectal.

PV : Prélèvement Vaginal.

RM : Rouge Méthyle.

Ser : Sérine.

SHV: Sulfhydryl Variable.

SI : Séquence d'Insertion.

Sma : Serratia marcescens.

TEM: Temoneira.

TRI : TEM Résistantes aux Inhibiteurs.

TSI : Triple Sugar Iron.

VP : Voges-Proskauer.

WHO: World Health Organization.

Mots clés : Entérobactéries, BLSE, plasmides, PCR-multiplex.

Résumé

Résumé

L'évaluation de la résistance aux antibiotiques des entérobactéries provenant de malades externes ou hospitalisés dans les différents services du CHU de Sétif, durant la période de Janvier 2013 à Avril 2017 porte sur les données du logiciel de sauvegarde «Whonet 5.6 » utilisé au laboratoire.2421 souches d'entérobactéries isolées sont identifiées. E. coli est la souche la plus fréquente (n= 1160), suivie par K. pneumoniae (n=479) et P.mirabilis (n=216). Ces souches proviennent majoritairement du milieu hospitalier (57.71 %) et semblent coloniser les adultes plutôt que les enfants où le sexe féminin représente un facteur de risque. Le profil de résistance de ces entérobactéries atteste d'un taux très élevé de résistance aux bêtalactamines. Les valeurs maximales sont notées pour l'amoxiclline où 98.40% des

souches sont résistantes et les plus faibles résistances sont notées pour les
carbapénèmes (l'imipénème et l'ertapénème) et la cefoxitine. Les 56 entérobactéries productrices de BLSE isolées durant l'année 2017 représentent 35% de la totalité des entérobactéries isolées pendant cette période. Elles sont réparties comme suit : 23 E. coli, 22 K. pneumoniae, 4 E. cloacae, 3 M. morganii, 2 S. marcescens, 1 E. aerogenes et 1 C. freundii. Elles sont plutôt issues d'infections nosocomiales (75%) que communautaires (25%). Les services les plus concernés sont l'infectieux et la néphrologie et les prélèvements les plus incriminés sont les urines et le pus.

Ces souches EBLSE ont des résistances très élevées (100%) à la majorité des â-lactamines (AMX, AMP, TIC, C3G, C4G et l'aztréonam). Alors que l'IMP, ERT, MER, AMK et FOS restent les antibiotiques les plus actifs. Le profil plasmidique des souches EBLSE confirme qu'elles peuvent héberger de 1 à 4 types de plasmides. La caractérisation des gènes des BLSE effectuée sur l'ADN (plasmidique ou chromosomique) de 33 souchespar

l'amplification multiple des gènes (CTX-M, TEM et SHV) a permis l'obtention d'une
prévalence de CTX-M (87.87%) suivie de SHV (42.42%) et de TEM (27.27%). Toutefois, cinq souches K. pneumoniae (n=4) et E. aerogenes (n=1) semblent porter les 3 gènes de résistance en même temps, indiquant la gravité de ce phénomène.

Key Words: Enterobacteria, BLSE, plasmids, PCR-multiplex.

Résumé

Abstract

The evaluation of the resistance to the enterobacteria resulting from external patients or hospitalized in the different services of Setif CHU, from January 2013 to April 2017.

Carried out on the data of the saveguard software «Whonet 5, 6», utilized at laboratory. 2421 isolated strains of enterobacteria are identified. E.coli the most frequent strain (n = 1160), followed by K.pneumonia (n=479) and P.mirabilis (n=216).

Theses strains usually come from the hospital milieu (57.71%) and seem to attain adults rather than children where the feminine sex represents a risk factor.

The resistance profile of theses enterobacteria manifests a higher rate of resistance to beta-lactamines.

The maximal values are noted for amoxicilline where (98.40%) of the strains are resistant and the weakest resistance is noted for the carbapenemes (imipenemes and ertapenemes) and the cefoxitine. The 56 enterobacteria which produces BLSE isolated along the year 2017 represent 35% of the whole: 23 E. coli, 22 enterobacteria previously isolated during this period. They are divided as follows: K. pneumoniae, 4 E. cloacae, 3 M. morganii, 2 S. marcescens, 1 E. aerogenes and 1 C. freundii. They are the outcome of nosocomial infections (75%) rather than communitory (25%).The mostly concerned services are the infection and the nephrology services and the most requested samples are the urines and the puss.

Theses EBLSE strains possess a higher resistance (100%) to the majority of B-lactamines (AMX, AMP, TIC, C3G, C4G and aztreonam). While IMP, ERT, MER, AMK and FOS remain the most active antibiotics. The plasmidic profile of the EBLSE strains confirms that they can host from 1 to 4 types of plasmids. The EBLSE genes characterization carried out on DNA (plasmidic or chromosomic) of 33 strains via the multiple amplification of the genes (CTX-M, TEM and SHY) allowed the obtainment of a prevalence of CTX-M (87.87%) followed by SHY (42.42%) and by TEM (27.27%). However, five strains K. pneumonia (n=4) and E. aerogenes (n=1) seem to carry 3 genes of resistance at the same time, a factor that clearly indicates the seriousness of this phenomenon.

INTRODUCTION

1

Introduction

Introduction

Depuis la découvert des antibiotiques en 1928 par Alexander Fleming et dés leur utilisation durant la seconde guerre mondiale, les antibiotiques de la famille des â-lactamines ont été confrontés à l'émergence de la résistance.

Cependant, la résistance bactérienne aux antibiotiques est en perpétuelle évolution. Cette résistance est la résultante d'interactions complexes entre la bactérie d'une part et son environnement d'autre part. Elle est liée essentiellement à un usage excessif des antibiotiques aussi bien en médecine humaine, qu'en médecine vétérinaire ou dans l'alimentation animale (Bradford. 2001b). Les bactéries, pour faire face à la pression de sélection exercée par les antibiotiques utilisent des parades leur permettant de s'adapter aux conditions hostiles de leur environnement (Benredjeb et al. 2000).

Selon le rapport de l'OMS en 2014, sur la surveillance mondiale de la résistance aux antimicrobiens, la résistance aux antibiotiques est une réalité existant partout dans le monde et constitue désormais une grave menace pour la santé publique (Anonyme. 2014). En effet, on assiste à l'émergence et à la dissémination des bactéries multirésistantes par hyperproduction de céphalosporinase (AmpC) ou production de bêtalactamases à spectre élargi (BLSE) ou encore de carbapénémases.

Jusque dans les années 2000, la diffusion des entérobactéries productrices de BLSE concernait essentiellement le milieu hospitalier, de nombreuses épidémies hospitalières en réanimation ou en hospitalisation de longs séjours ayant été décrites. Mais aujourd'hui, la diffusion à grande échelle dans le domaine communautaire de ce type de résistance laisse augurer un problème majeur de santé publique. Les infections causées par les souches productrices de BLSE sont associées à une morbidité et une mortalité élevées, à une prolongation de la durée de l'hospitalisation et à une augmentation des coûts d'hospitalisation.

Découvertes au début des années 1980, les BLSE sont une grande famille d'enzymes bactériens capables d'hydrolyser les pénicillines, les quatre générations de céphalosporines et l'aztréonam. Elles n'hydrolysent pas les carbapénèmes ni les céphamides. Elles sont retrouvées essentiellement dans la famille des entérobactéries, principalement Escherichia coli et Klebsiella spp. (Bradford, 2001a).

La plupart des BLSE détectées auparavant étaient les types classiques TEM et SHV qui diffusaient majoritairement chez des souches de Klebsiella pneumoniae et d'Enterobacter spp

2

Introduction

étroitement associés à des infections nosocomiales. Actuellement, un nouveau type d'enzyme, le CTX-M dissémine au sein des souches communautaires. Les gènes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA ont été décrits dans plusieurs études épidémiologiques. La résistance bactérienne par production de BLSE est devenue un problème de santé publique mondiale car compromettant gravement les thérapies antimicrobiennes.

De ce fait, le but de ce travail est l'évaluation de la résistance aux f3-lactamines, des souches d'entérobactéries d'isolement courant dans le CHU de Sétif, afin de déterminer la fréquence de résistance aux céphalosporines de 3éme génération et des résistances associées au sein des espèces.

Par la suite, une caractérisation par la technique moléculaire (PCR) des f3-lactamases dessouches d'entérobactéries productrices pour mettre en évidence le degré de leur diversité génétique.

CHAPITRE 1

SYNTHESE

BIBLIOGRAPHIQUE

3

Chpaitr 1 : Synthese bibliographique

1- Les entérobactéries 1-1- Définition

Les entérobactéries sont des bactéries commensales ou pathologiques du tube digestif de l'homme et des animaux, d'où leur nom (entéro= intestin grêle). Elles peuvent être transitoirement présentes, en dehors du tube digestif, sur différentes parties du revêtement cutanéo-muqueux (Nauciel et Vildé. 2005) et également dans l'environnement. Certaines sont des pathogènes obligatoires provoquent dès leur entrée dans le tube digestif des malades. D'autres, présentent un caractère opportuniste, elles ne sont pathogènes que sur fond d'immunodépression. D'autres groupes prolifèrent dans l'environnement et peuvent être une source de contamination (Grosjean et al. 2011).

1-2- Classification

La position phylogénétique de la famille des Enterobacteriaceae se trouve dans l'ordre des Enterobacteriales de la classe des Gammaproteobacteria. Cette famille comprend 176 espèces nommées ou plus, répertoriées en 44 genres (Garrity et al. 2005), dont les plus récents sont Alterococcus, Arsenophorus, Brenneria, Pectobacterium, Raoultella, Samsonia et Sodalis. Les relations phylogénétiques des genres sont fondées sur l'analyse des séquences de l'ARNr 16S des souches types de l'espèce (Garrity et al. 2005).Les genres de cette famille sont regroupés en cinq tribus, d'après leurs propriétés fermentatives : Escherichiae, Klebsielleae, Proteae, Yersiniae et Erwiniae.

1-3- Caractères bactériologiques

Les Enterobacteriaceae sont des bacilles à Gram négatif mobiles ou immobiles, avec des extrémités arrondies de 0.5- 1.5 ìm d'épaisseur et 2-4 ìm de longueur, parfois capsulés. Leurs exigences nutritionnelles sont, en général, réduites se développent bien dans un bouillon ou sur gélose ordinaire incubés 18 heures à 37°C. Sur milieu gélosé, ils peuvent donner différentes formes de colonies. Les formes S (smooth) sont l'aspect habituel des colonies lisses, bombés, brillantes et humides. Les formes R (rough) s'observent surtout avec les souches ayant subi plusieurs repiquage où les colonies sont rugueuse, sèches, à contours irréguliers et de teinte mate (Avril et al. 2000).

4

Chpaitr 1 : Synthese bibliographique

1-4- Caractères biochimiques

L'identification des Enterobacteriaceae repose sur l'étude des caractères biochimiques. Elles donnent une réaction d'oxydase négative, acidifient le glucose par métabolisme fermentatif, avec ou sans production de gaz et réduisent les nitrates en nitrites. Des galeries biochimiques permettent de déterminer avec précision le genre et l'espèce, se basant sur :

· Production d'hydrogène sulfuré

· Recherche de l'uréase.

· Production d'indole.

· Recherche des décarboxylases.

· Recherche des désaminases oxydatives.

· Utilisation du citrate.

· Utilisation du mannitol.

· Recherche de l'acétoïne ou réaction Voges-Proskauer (VP).

· Test à l'ONPG (Orthonitrophényl b-D-Galactopyranoside).

1-5- Caractères antigéniques

L'identification des antigènes et sérogroupes a permis de différencier les souches pathogènes des souches commensales. En effet, certains sérotypes ne sont jamais, ou rarement, associés à des maladies tandis que d'autres le sont très fréquemment.

L'antigène somatique O, définissant le sérogroupe, est contenu dans les lipopolysaccharides présents sur la paroi bactérienne. L'antigène flagellaire H est de nature protéique entrant dans la structure du flagelle permettant la mobilité de la bactérie. L'antigène de surface K est présent de façon inconstante il bloque l'agglutinabilité de l'antigène O qui peut être restituée après chauffage de la souche à 100°C car il est détruit par ébullition. Les antigènes de surface aussi appelés antigènes de capsule ou d'enveloppe sont appelés « Vi » chez Salmonella (Avril et al. 2000).

1-6- Pouvoir Pathogène

Les entérobactéries occupent une place très importante en pathologie humaine infectieuse. Cette importance s'explique aussi bien par la variété des espèces bactériennes qui les composent qu'à leur incidence au niveau de la santé des populations. Les Enterobacteriaceae

5

Chpaitr 1 : Synthese bibliographique

forment une vaste famille de bactéries qui sont à l'origine de maladies de gravité très variable, en raison de mécanismes pathogéniques distincts. La fréquence et la gravité des infections, dont elles sont responsables (septicémies, infections nosocomiales, méningites...), traduisent des difficultés de prise en charge liées entre autres à des difficultés d'identification et à leur résistance aux antibiotiques. On les rencontre dans les prélèvements d'origine divers, mais particulièrement dans les urines et les prélèvements sanguins qui constituent une part très importante des activités du laboratoire de bactériologie. Les entérobactéries constituent plus de 80% des germes isolés en laboratoire : Escherichia, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Morganella et Yersinia sont les bactéries les plus souvent retrouvés.

Escherichia coli est un germe très courant. Son habitat est le colon humain où il est le plus abondant. Chez l'homme, la colonisation par E. coli est précoce, et peut être responsable d'un nombre varié de pathologie. Toutefois, trois types de syndromes majeurs résultent de l'infection par de souches E. coli pathogènes :

- Infections urinaires (impliqué dans 80 % des infections urinaires), l'incidence de ces infections est plus marquée chez les personnes de sexe féminin en milieu extrahospitalier en raison notamment de la colonisation de la région péri-urétrale. En milieu hospitalier, l'incidence est égale entre les deux sexes en rapport essentiellement avec l'utilisation fréquente des sondes urinaires.

- Infections digestives (diarrhées, infections hépatobiliaires et autres), E. coli cause principalement des infections du tractus digestif, en raison de la contamination de l'eau ou des aliments par la flore fécale des malades ou des porteurs. E. coli est subdivisé en 6 pathovars majeurs selon le type de maladie engendrée et les facteurs de virulence associés : les ETEC (E. coli Entérotoxinogènes), les EHEC (E. coli Entérohémorragiques), les EPEC (E. coli Entéropathogènes), les DAEC (E. coli à Adhérence Diffuse), les EAEC (E. coli Entéroagrégatives) et les EIEC (E. coli Entéroinvasives) (Avril et al.2000).

- Méningites néonatales et septicémies, E. coli à l'origine de maladies extra- intestinales, a acquis la capacité de déjouer les défenses immunitaires de l'hôte, et à se propager dans l'organisme et il peut coloniser les voies génitales et générer des méningites néonatales.

Klebsiella pneumoniae habite le tractus digestif et le système respiratoire supérieur. Ce germe est principalement isolé en milieu hospitalier, le portage étant fortement accru chez les

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patients hospitalisés. Toutefois, il est également présent en dehors des hôpitaux, notamment chez des patients diabétiques, fortement débilités, ou souffrant de maladies respiratoires chroniques. Klebsiella pneumoniae peut causer des pneumonies lobaires, des bronchites et broncho-pneumonies, la contamination pulmonaire se faisant surtout par voie aérienne, mais la voie hématogène n'étant pas exclue. Klebsiella pneumoniae est également retrouvé dans des infections urinaires suite au passage de la flore fécale aux voies urinaires. Finalement, des bactériémies compliquent parfois les infections localisées.

Klebsiella oxytoca est une bactérie isolée dans la majorité des cas dans les selles, mais peut aussi être isolée dans les urines, le sang et les sécrétions naso-pharyngées et trachéales. A l'instar de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca peut infecter les voies urinaires et respiratoires des patients hospitalisés.

Salmonella constitue un vaste groupe de bactéries, composé de plus de 2000 variétés, et subdivisé en deux sous-groupes. Le premier comprend les Salmonella dites majeures qui causent les fièvres typhoïdes et paratyphoïdes dues à la transmission féco-orale, l'eau ou la nourriture étant contaminées par les selles d'un malade ou d'un porteur sain.

Le second est composé des Salmonella dites mineures qui sont à l'origine d'intoxications alimentaires (aliments provenant d'animaux infectés ou contaminés ; viande, produits laitiers...), de gastro-entérites et de bactériémies.

Enterobacter cloacae est un germe colonisant souvent les patients hospitalisés et plus particulièrement ceux traités par antibiotiques. Il a été associé à des épidémies nosocomiales et est considéré comme pathogène opportuniste (Hart. 2006). Il peut causer de nombreux types d'infections, y compris abcès cérébraux, pneumonie, méningite, septicémie et infection de plaies, infection des voies urinaires et des infections de la cavité abdominale ou des intestins (Farmer et al. 2007). De plus, il a été observé dans des infections liées à des appareils intra-vasculaires et des infections au point de chirurgie (surtout des infections postopératoires ou liées à des dispositifs comme des prothèses biliaires).

Serratia marcescens colonise les systèmes respiratoires, digestifs et urinaires des patients. Bien que les germes isolés en milieu hospitalier soient le plus souvent responsables d'une colonisation asymptomatique, quelques infections nosocomiales sont relatées dans la

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littérature: ce sont essentiellement des bactériémies, des infections des voies respiratoires inférieures, des infections urinaires et cutanées. Ces infections sont dues à des germes qui proviennent des patients eux-mêmes ou de leur environnement (Mirabaud. 2003).

Citrobacter freundii est un agent pathogène nosocomial opportuniste rare, qui entraîne normalement des infections des voies urinaires, des bactériémies, des sepsis abdominaux et des abcès cérébraux ainsi que des pneumonies et d'autres infections néonatales (Pepperell et al. 2002).

2- Les â-lactamines

Les f3-lactamines demeurent les antibiotiques les plus utilisés dans la pratique clinique courante. Cette large utilisation est principalement liée à leur faible toxicité, à leur pouvoir bactéricide et à la diversité des molécules (Robin et al. 2012).

L'histoire des B-lactamines débute depuis l'introduction de la pénicilline G en thérapeutique dans les années 1940.Il faudra attendre le début des années 1960 pour voir apparaître les premières synthèses de B-lactamines permettant leur développement à l'échelle industrielle. Un grand nombre de molécules incluant les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénémes a été développé. Cependant, la grande utilisation des B-lactamines depuis plus de 60 ans s'est accompagnée d'une augmentation importante de la résistance bactérienne à ces antibiotiques. D'autre part, le développement de nouveaux antibiotiques connaît un franc ralentissement depuis plus de 10 ans (Robin et al. 2012).

Cette famille est caractérisée par la présence constante de cycle f3-lactame associé à des cycles et des chaînes latérales variables expliquant les propriétés pharmacocinétiques et le spectre d'activité des différents produits (Cavallo et al. 2004).

2-1- Classification des â-lactamines

Quatre groupes de cette classe d'antibiotique peuvent être décrits et ce en fonction de leurs caractéristiques structurales : les pénames (pénicillines), les céphèmes (céphalosporines), les pénèmes et les monobactames (Fig.1).

Chpaitr 1 : Synthese bibliographique

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Figure 1. Structures chimiques des principales f3-lactamines et inhibiteurs de f3-lactamases
(Nordmann et al. 2012)

2-1-1- Les pénicillines (noyau péname)

La formule générale des pénicillines associe un noyau B-lactame à un cycle thiazolidine et une chaîne latérale en C-6 (Fig.1). Selon la nature de la chaîne latérale reliée à cette molécule, on distingue plusieurs sous-classes de pénicillines(Tab.1) (Gazengel. 2007).

2-1-2- Les céphalosporines (noyau céphème)

Les céphalosporines se distinguent chimiquement des pénicillines par le remplacement du cycle thiazolidine par un cycle dihydrothiazine (noyau « céphème ») avec un atome de soufre

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en position 1 (Fig.1). Ces composés sont obtenus par synthèse ou semi-synthèse, à partir de la céphalosporine C, qui est un produit de fermentation d'un champignon (Cephalosporium acremonium), grand producteur de l'acide amino-7-céphalosporanique (noyau de base) (Gazengel. 2007). On distingue cinq générations de céphalosporines (Tab.1). Elles sont classées en fonction de leur date d'apparition, qui correspond à chaque fois à l'acquisition de nouvelles propriétés :

? Les céphalosporines de 1^ère génération (C1G)

Ont un niveau d'activité assez limité vis-à-vis des bacilles à Gram (-), en raison de leur sensibilité aux f3-lactamases (Nauciel et Vildé. 2005).

? Les céphalosporines de 2^éme génération (G)

Caractérisées par une meilleure résistance aux B-lactamases et un spectre d'action plus large. Elles possèdent un pouvoir antibactérien un peu plus élevé (CMI plus basses) et un spectre plus large que le 1^er groupe vers les entérobactéries (Gazengel. 2007).

? Les céphalosporines de 3^éme génération (C3G)

L'ensemble de leurs propriétés antibactériennes et pharmacocinétiques autorise des posologies réduites pour une efficacité accrue. Les C3G sont inactives, à des degrés divers par les f3-lactamases à spectre élargi (Nauciel et Vildé. 2005).

? Les céphalosporines de 4^éme génération (C4G)

Représentées par Céfépime et Céfpirome, elles restent actives chez les entérobactéries ayant acquis une résistance aux C3G par hyperproduction d'une céphalosporinase, et inactives en cas de f3-lactamase à spectre étendu. Elles sont une substitution possible aux céphalosporines de troisième génération pour le traitement de germes résistants (Hardman et Limbird. 1998). ? Les céphalosporines de 5^éme génération (C5G)

Représentées par la Ceftaroline, Ceftolozane et Ceftobiprole. Ces antibiotiques sont à usage hospitalier. La Ceftaroline a un large spectre d'activité contre de nombreuses bactéries à Gram négatif (Kenneth et al. 2017).

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Figure 2. Structure chimique de la ceftaroline (Jacquline et Tattevin. 2016). 2-1-3- Les pénèmes (Carbapénèmes)

Les Carbapénèmes sont des f3-lactamines présentant un très large spectre d'activité et une grande stabilité vis à vis de la plupart des ß-lactamases. L'imipenème et le méropeneme ont été les deux premiers antibiotiques disponibles en clinique. Une troisième molécule s'est ajoutée, l'ertapénème. Parmi les nouvelles Carbapénèmes, le doripénème garde une meilleure activité sur les bacilles à Gram négatif. Les Carbapénèmes sont historiquement considérées comme le traitement de choix des infections sévères à bactéries Gram négatives (Grall et Muller-Serieys. 2013).

2-1-4- Les monobactames

L'aztréonam fut le premier monobactame fabriqué synthétiquement, il est réservé au traitement parentéral des infections à bactéries Gram (-). Son spectre d'activité est voisin de celui des C3G (bonne stabilité vis-à-vis des f3-lactamases) (Gazengel. 2007).

2-1-5- Les inhibiteurs des â-lactamases

Ces substances n'ont pas une grande activité bactéricide mais ils sont capables de protéger les f3-lactamines en inhibant les pénicillinases. Ce groupe est composé de :

? L'acide clavulanique, utilisé en association fixe avec l'amoxicilline (Augmentin®) ou la ticarcilline (Claventin®).

? Le sulbactam (Bétamaze®), éventuellement en association avec l'ampicilline (sulbactam 500 mg + ampicilline 1 g (Unacim®).

? Le tazobactam associé à la pipéracilline (Tazocilline®) (Gazengel. 2007).

? L'avibactam, utilisé en association avec ceftazidime, ceftaroline et aztreonam. L'Avibactam (NXL104) est un non-f3-lactame inhibiteur de BLSE avec activité contre la plupart des classe A et classe C f3-lactamases ainsi que certaines enzymes de classe D

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(Buyck et al. 2016). Actuellement, l'avibactam est en développement dans de nombreux essais cliniques.

Tableau 1. Classification des â-lactamines.

Noyau Sous-famille Molécules

Pénames Pénicillines G et V

pénicilline G
pénicilline V

Pénicillines A

ampicilline

amoxicilline
pivmecillinam

Pénicillines M

oxacilline , cloxacilline

Carboxypénicillines

Uréidopénicillines
Inhibiteurs de bêta-
lactamases

ticarcilline, temocilline

mezlocilline,
acide clavulanique (+ amoxicilline + ticarcilline)
sulbactam (seul ou + ampicilline)
tazobactam (+ pipéracilline)
avibactam (+ ceftazidime)

Pénémes Carbapénèmes imipéneme

méropéneme ertapéneme doripénéme

Monobactames Monobactame aztréonam

Céphèmes C1G (1^ère génération)

céfalotine, céfalexine, céfapirine, céfazoline,

céfadroxil, céfaclor, céfatrizine, céfradine

G (2^ème génération) C3G (3^ème génération)

céfamandole, céfuroxime, céfoxitine céfotétan céfotaxime, ceftizoxime, céfopérazone, ceftriaxone, ceftazidime, cefsulodine

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céfixime, cefpodoxime proxétyl, céfotiam hexétil

C4G (4ème génération) C5G (5ème génération)

céfépime, cefpirome ceftaroline, ceftobiprole, ceftolozane

2-2- Mode d'action des â-lactamines

Les f3-lactamines ciblent les protéines de la membrane cytoplasmique qu'on appelle les PLP (protéines de liaison aux pénicillines) ou PBP (Penicillin Binding Proteins). Ces PLP sont en effet les enzymes impliqués dans la synthèse du peptidoglycane (les transpeptidases, les carboxypeptidases et les transglycosylases). Les f3-lactamines présentent une analogie structurale avec un constituant du peptidoglycane en formation, le dipeptide D-ala-D-ala qui est le substrat naturel de ces enzymes. Elles agissent en « substrat suicide » en bloquant le fonctionnement de ces enzymes inhibant ainsi la formation du peptidoglycane. Par conséquent, cette inhibition entraîne un arrêt de la croissance bactérienne (bactériostase). Le blocage de la multiplication est suivi d'une lyse bactérienne. Le peptidoglycane est dégradé sous l'action d'autolysines, ce qui entraîne finalement la lyse (bactéricide).

Le nombre et la nature des PLP varient selon les espèces bactériennes, donc l'affinité des divers PLP n'est pas la même pour toutes les molécules des f3-lactamines. L'effet d'une f3-lactamine est en fonction de son affinité pour les différentes PLP de la bactérie considérée (Gaudy et Buxeraud. 2005).

3- Résistance des entérobactéries aux â-lactamines

La résistance bactérienne aux antibiotiques est un véritable problème de santé publique. Depuis l'utilisation des antibiotiques, la résistance n'a jamais cessé d'augmenter et les bactéries ont toujours réussi à contourner les antibiotiques destinés à les tuer. Jusqu'à maintenant, cette évolution était compensée par la mise sur le marché de nouveaux antibiotiques, mais celle-ci s'est considérablement amenuisée laissant le risque de voir apparaître une aire dite « post-antibiotique » (Armand-Lefévre. 2017).

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3-1- Types de résistance

La bactérie est considérée résistante lorsqu'elle supporte une concentration d'antibiotique nettement plus élevée que celle qui inhibe la multiplication de la majorité des autres bactéries de la même espèce (Boulahbal. 2010) ou de la tuer (Poole. 2004 ; Schwarz et Chaslus-Dancla. 2001). Les conditions d'activité d'un antibiotique sont de posséder une cible spécifique, de demeurer sous forme active, d'accéder à la cible et d'interagir efficacement avec elle en la désactivant.

Les entérobactéries sont soit sensibles aux â-lactamines, soit naturellement résistantes ou soit ont une résistance acquise (Vora et Auckenthaler. 2009).

3-1-1- La résistance naturelle

La résistance naturelle est programmée sur le génome et constante à l'intérieur du taxon ; elle constitue un critère d'identification stable d'une espèce. La résistance naturelle ou intrinsèque à un antibiotique est essentiellement due à la présence de gènes chromosomiques; elle est donc commune à toutes les bactéries d'une même espèce et transmise à la descendance. Dans tous les cas, la résistance naturelle fait partie des caractères normaux de l'espèce ; elle détermine le niveau de sensibilité « basal » des bactéries et définit le phénotype sauvage d'une espèce. Elle est constitutive et touche toute une famille d'antibiotiques (Mayer et al. 2000). Ainsi, les entérobactéries ont une résistance naturelle à la pénicilline G, V et les pénicillines du groupe M (Philippon et Arlet. 2012).

3-1-2- La résistance acquise

Ce terme est utilisé pour désigner le résultat d'un processus permettant à des bactéries d'une espèce originellement sensible de devenir résistante à un ou plusieurs antibiotiques. L'acquisition de ces résistances est déterminée par des modifications génétiques consécutives à des mutations ponctuelles (plutôt rare) ou à l'acquisition de nouveaux gènes de résistance exogènes (plutôt fréquent) par le biais de plasmides, de bactériophages, de transposons ou d'intégrons (Davies. 1997 ; Chopra et al. 2003).

La capacité de multiplication très rapide des bactéries favorise la sélection d'évènements génétiques favorables et la possibilité d'échange d'information même entre espèces lointaines leur conférant un très grand pouvoir d'adaptation aux contraintes du milieu. L'évolution des

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mécanismes de résistance aux antibiotiques, et notamment aux â-lactamines illustre parfaitement ce phénomène.

3-2- Supports génétiques de la résistance

Parmi les modalités d'acquisition de la résistance aux antibiotiques, le transfert horizontal de gènes est un élément-clé. Ce type de transfert a probablement lieu dans tous les écosystèmes terrestres colonisés par les bactéries. Ainsi ces transferts ont été mis en évidence dans de nombreux écosystèmes, tels les sols, les rivières, les environnements marins, mais aussi les tubes digestifs d'insectes ou de mammifères. Différents éléments génétiques sont impliqués dans ce transfert de gènes.

3-2-1- Le chromosome

La résistance chromosomique acquise résulte d'une mutation. La fréquence de ces mutations est faible et variable (10^-6 à 10^-9) mais la mutation est stable et transmissible à la descendance. La résistance apparaît dans ce cas au hasard et n'est donc pas influencée par l'antibiotique quine fait que la révéler.

3-2-2- Les éléments génétiques mobiles

La résistance aux antibiotiques acquise par les bactéries est principalement due à la présence de trois types d'éléments extra-chromosomiques portant des gènes de résistance : les plasmides, les transposons et des cassettes de résistances insérées sur un intégrons (Bennett. 2008 ; Martinez. 2010 ; Walsh. 2006). Ce type de résistance est transmissible d'une souche ou d'une espèce à une autre selon trois modes de transmission, à savoir la conjugaison (transfert direct entre deux bactéries ayant établi temporairement un contact physique), la transformation (transfert d'ADN nu) et la transduction (transport d'ADN bactérien par des bactériophages).

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Figure 3. Modes de transmission du matériel génétique : la conjugaison, la transformation et la transduction chez les bactéries (Andersson et Hughes. 2010).

a) Plasmides

Les plasmides bactériens revêtent une importance toute particulière dans l'étude des phénomènes de résistance car ils constituent à la fois un vecteur de premier plan pour la dissémination des résistances et un immense réservoir génétique. Comme les chromosomes, les plasmides codent pour des protéines et des molécules d'ARN et se répliquent durant la croissance bactérienne. Les plasmides partagent certaines fonctions de partition et quelques recombinasses spécifiques de site avec le chromosome de l'hôte (Snyder et Champness. 2007). Contrairement aux chromosomes, les plasmides ne portent toutefois pas de gènes essentiels à la croissance bactérienne. Ils codent plutôt pour des protéines dont la fonction est de conférer un avantage sélectif comme la résistance aux antibiotiques ou encore des facteurs de virulence.

Les plasmides peuvent conférer une résistance aux principales classes d'antibiotiques (Carattoli. 2009). Une même bactérie peut porter un ou plusieurs plasmides selon leur compatibilité mutuelle et chacun d'eux peut contenir un ou plusieurs gènes de résistance (Harbottle et al. 2006).Les plasmides peuvent également se transmettre à une souche sensible principalement par conjugaison mais aussi par transformation ou transduction à l'aide de bactériophages. Les plasmides, en fonction de leur efficacité de conjugaison, vont permettre le

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transfert horizontal de ces composantes à d'autres bactéries qui peuvent être de différentes espèces, genres et familles (Thomas et Nielsen. 2005).Ils peuvent acquérir d'autres gènes de résistance par l'intermédiaire d'éléments transposables et d'intégrons par exemple. La survenue épidémique de bactéries à Gram négatif multirésistantes est largement attribuée à ce type de transmission.

b) Séquences d'insertion et transposons

Ces éléments transposables jouent un rôle très important dans l'évolution des bactéries puisqu'ils sont à l'origine de multiples réarrangements de leur génome. Les transposons (2-20 kpb) sont composés de séquences d'ADN qui fonctionnent comme des sites de recombinaison et de gènes codants pour des protéines participant à la réaction de recombinaison. Les sites de recombinaison sont situés aux deux extrémités du transposon et organisés en séquences inversées répétées. Les éléments transposables ont la capacité de se déplacer et de s'insérer à différents endroits dans un chromosome ou un plasmide par un processus de transposition anarchique. Il existe différentes types d'éléments transposables ; les séquences d'insertion (SI) étant de courtes séquences génétiques de 800 à 2000 pb, elles codent uniquement pour la transposition et les transposons composites codent pour les déterminants de la transposition ainsi que pour d'autres fonctions, notamment celle de conférer la résistance aux antibiotiques (El Salabi et al. 2013).

c) Les intégrons

Les intégrons, plus récemment décrits vers la fin des années 80, jouent un rôle majeur dans l'acquisition et l'expression de gènes de résistance aux antibiotiques, notamment chez les bactéries à Gram négatif. Le rôle d'une partie de ces intégrons, parfois nommés intégrons de résistance (IR), est majeur dans la dissémination de la résistance aux antibiotiques et notamment chez des souches d'intérêt clinique. L'ampleur de la diffusion de la résistance est attribuable en majeure partie au déplacement des gènes de résistance par le biais d'intégrons (Domingues et al. 2012).Ceux-ci sont des éléments génétiques mobiles avec une structure spécifique composée de deux segments conservés encadrant une région centrale appelée «cassette » (Domingues et al. 2012 ; Recchla et Hall. 1997). La transposition des intégrons n'est pas anarchique et a lieu au niveau de sites spécifiques, celle-ci peut recevoir, a différents moment des gènes variés dont ceux de la résistance aux antibiotiques qui vont s'insérer toujours au même endroit « site d'insertion » ce qui provoque l'allongement de l'intégrons

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dans un sens. Les intégrons peuvent être associés à des (SI), des transposons ou des plasmides pouvant leur conférer une mobilité (Domingues et al. 2012).

3-3- Mécanismes de résistance aux â-lactamines

Les différents mécanismes de résistance aux f3-lactamines peuvent s'exprimer seuls ou de façon concomitante agissant alors de façon synergique. Il peut s'agir d'une diminution d'affinité de la cible, d'une diminution de la perméabilité de la membrane, de l'expression d'une pompe d'efflux actif ou de la production d'enzyme de type f3-lactamase (Vora et Auckenthaler. 2009).

3-3-1- Diminution de la perméabilité

La pénétration des f3-lactamines, à travers la membrane externe s'effectue à travers les porines qui sont des canaux protéiques remplis d'eau. Ainsi, la sensibilité aux f3-lactamines dépend du nombre de porines fonctionnelles. L'altération des porines par mutation est à l'origine de résistances acquises aux f3-lactamines, soit par une modification structurale d'une porine essentielle, ce qui a été décrit chez E. coli, soit par une diminution quantitative des porines, qui est la situation la plus fréquente (Kumar et Schweizer. 2005).

3-3-2- Modification de la cible

La résistance aux f3-lactamines, conférée par les PLPs, chez les bactéries à Gram négatif joue un rôle mineur dans la résistance (Spratt et al. 1989). Cette résistance peut avoir lieu par des mutations dans les gènes chromosomiques codant pour les PLPs ou par l'acquisition de gènes étrangers codant pour de nouveaux PLPs ayant une affinité différente aux f3-lactamines (Georgopapadakou. 1993). Une diminution de la production de la PLP1A a été associée à la résistance pour l'imipénème et au mécillinam chez P. mirabilis suite à une perte d'affinité de la PLP2 et à une diminution de la quantité de PLP1 (Neuwirth et al. 1995).Ces mutations chez les entérobactéries restent rares (Robin et al. 2012).

3-3-3- Hyperproduction du système d'efflux

Les systèmes d'efflux éliminent activement les f3-lactamines dans le milieu extérieur en utilisant la force proton-motrice. Ainsi, ils diminuent la concentration d'antibiotique au contact de sa cible et donc son efficacité. Le système d'efflux actif est efficace grâce aux

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protéines transmembranaires ancrées dans la membrane cytoplasmique mais également dans la membrane externe des bactéries à Gram négatif (Walsh. 2003).

L'implication des systèmes d'efflux dans la résistance aux f3-lactamines a été clairement identifiée dans plusieurs études en particulier chez K. pneumoniae. Cependant ce type de mécanisme touchant préférentiellement la céfoxitine et les G semble difficile à distinguer du point de vue phénotypique des résistances par modification des porines (Bialek-Davenet et al. 2011 ; Robin et al. 2012).

3-3-4- Production d'enzymes

La production des f3-lactamases est le principal mécanisme de résistance des entérobactéries aux f3-lactamines (Abbas et al. 2012).Cependant, toutes les entérobactéries, quel que soit leur groupe, sont capables d'intégrer des gènes de résistance codant pour une f3-lactamase (Zoghleb et Dupont. 2005).

4- Les â-lactamases

C'est le mécanisme qui nous intéresse le plus dans notre étude. Les f3-lactamases sont des enzymes bactériennes hydrolysant la fonction amine du cycle f3-lactame et rendant l'antibiotique inactif avant qu'il n'atteigne sa cible : les PLP. Les f3-lactamases sont des enzymes constitutionnelles ou acquises, produites par les bactéries. Leur activité enzymatique provoque l'ouverture du cycle f3-lactame et crée un intermédiaire acyl-enzyme instable qui est ensuite dégradé en acide inactif (Vodovara et al. 2013).Les gènes codant pour ces enzymes sont principalement situés sur des éléments génétiques mobiles (plasmides, transposons, intégrons) (Boyer et al. 2011).

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Figure 4. Mode d'action des f3-lactamases (Barrial et Scotet. 2006).

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4-1- Classification des â-lactamases

Les deux classifications couramment utilisées sont celle d'Ambler et de Bush, Jacoby et Medeiros. La classification structurale d'Ambler est basée sur la séquence peptidique du site enzymatique et distingue quatre classes, alors que la classification fonctionnelle de Bush et ses collaborateurs repose sur l'activité hydrolytique et la sensibilité des f3-lactamases aux inhibiteurs. Elle rend compte de leur diversité fonctionnelle au sein des quatre classes structurales d'Ambler, notamment dans sa classe A (Vodovara et al. 2013).Aujourd'hui, les classifications d'Ambler et de Bush-Jacoby-Medeiros sont considérées comme étant les plus pertinentes (Bush et al. 1995).

4-1-1- Classification d'Ambler

? Les â-lactamases de classe A

Les f3-lactamases de classe A, d'origine chromosomique ou plasmidique, se caractérisent par leur capacité à hydrolyser l'amide cyclique lié à la molécule de f3-lactame. Cette activité hydrolytique, assurée par une sérine conservée (Ser-70)- induit la formation d'acide pénicilloïque pour la pénicilline et de céphalosporoate, analogue aux pénicillinoates, pour les céphalosporines. Cette sérine est retrouvée dans le site actif de la f3-lactamase et assure un fort taux de résistance aux pénicillines, céphalosporines et carbénicillines. Cependant, les f3-lactamases de classe A sont sensibles aux inhibiteurs de f3-lactamases (Livermore. 1995).

? Les â-lactamases de la classe B

Les f3-lactamases de classe B sont des métallo-f3-lactamases et utilisent un ion de zinc (Zn2+) comme cofacteur permettant ainsi la décomposition de l'anneau f3-lactame (Ambler. 1980 ; Bandoh et al. 1991). Ces enzymes ont émergés depuis une dizaine d'années, d'abord chez Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, puis chez les entérobactéries et d'autres bacilles à Gram négatif. L'importance clinique des métallo-bêta-lactamases est liée au fait qu'elles hydrolysent les carbapenèmes, composés qui échappent à l'activité des f3-lactamases à sérine active. La plupart des métallo-f3-lactamases hydrolysent une variété de pénicillines et de céphalosporines, et sont insensibles aux inhibiteurs suicides classiques (Bebrone. 2007).

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? Les â-lactamases de la classe C

Les f3-lactamases de classe C, décrites en 1981 par Jaurin et Grundstrom, ont longtemps été ubiquitaires aux chromosomes de différentes espèces bactériennes entériques (Jaurin et Grundstrom. 1981).Dans la classe C, on retrouve les céphalosporinases AmpC qui sont codées par des gènes qui étaient primitivement situés sur le chromosome de nombreuses bactéries à Gram négatif telles que Citrobacter freundii, Serratia marcescens et Enterobacter spp. Chez ces bactéries, l'expression d'AmpC est inductible, les gènes codant pour ces enzymes sont aussi présents chez E. coli, où ils ne sont pas inductibles. Ces enzymes sont résistantes à l'acide clavulanique (Philippon et al. 2002).

? Les â-lactamases de la classe D

Les f3-lactamases de classe D se distinguent par leur capacité à hydrolyser les pénicillines isoxazolyl (oxacilline) et la méthicilline, et sont faiblement inhibées par l'acide clavulanique. Elles sont retrouvées fréquemment chez Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter spp. (OXA-11, 14, 16, 17 et 19) et peu chez les enterobactéries (Paterson et Bonomo. 2005).De plus, certains membres de cette famille, dont OXA-10 (PSE-2) et OXA-11 (Hall et al. 1993), possèdent un large spectre d'activité assurant une forte résistance aux céphalosporines de troisième génération dont la céfotaxime, le céfoperazone et la ceftazidime (Hall et al. 1993 ; Livermore. 1995).

4-1-2- Classification de Bush-Jacoby-Medeiros

Elle est établie selon les propriétés fonctionnelles de l'enzyme définies par son substrat préférentiel et son profil d'hydrolyse (Bush et al. 1995). Ces auteurs divisent ces enzymes en quatre groupes (1 à 4) avec plusieurs sous-groupes. Les bêtalactamases de la classe A sont ainsi subdivisées en 8 groupes fonctionnels 2a, 2b, 2be, 2br,2ber, 2c, 2e et 2f (Bush et Jacoby. 2010).

Cette classification phénotypique de f3-lactamases pose un certain problème puisque différentes mutations ponctuelles peuvent influencer leur susceptibilité à ces substrats et inhibiteurs (Jacoby et Medeiros. 1991). Un autre aspect restrictif de cette classification relève du fait que l'attribution d'un acronyme à un gène de résistance n'a plus la même signification. Par exemple, les f3- lactamases PSE, ou "Pseudomonas Specific Enzymes", ont aussi été identifiées chez les Enterobacteriaceae, ce qui remet en question la pertinence de ce préfixe (Matthew et al. 1979).

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Tableau 2. Classification global des BLSE (Bush et al. 2010).

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5- Les â-lactamases à spectre élargi BLSE

Les BLSE ont été décrites pour la première fois en 1983, en Allemagne (Knothe et al. 1983), il n'y a pas de consensus concernant la définition de f3-lactamases à spectre étendu (BLSE). Classiquement, les BLSE sont définies comme des enzymes appartenant à la classe A (à l'exception des BLSE de type OXA classe D de la classification d'Ambler), capables d'hydrolyser les pénicillines, céphalosporines de première, deuxième, troisième et quatrième génération (céfépime ou cefpirome) et l'aztréonam. Elles sont inhibées in vitro par les inhibiteurs des f3-lactamases (acide clavulanique, tazobactam et sulbactam) (Livermore. 1995). Par contre, les BLSE sont sensibles aux céphamycines (céfotétan et cefoxitine) ainsi qu'aux carbapénèmes. Une co-résistance avec les aminosides, les tétracyclines et les fluoroquinolones est fréquente. Les bactéries possédant des BLSE sont dites multirésistantes (Paterson et Bonomo. 2005).

Il s'agit d'un mécanisme de résistance de type plasmidique, et donc transmissible à d'autres bactéries. La présence de ce type de mécanisme de résistance au sein de souches pathogènes fait peser un risque majeur d'inadéquation thérapeutique et donc d'échec thérapeutique (Schwaber et Carmeli. 2007), et est également un facteur de diffusion.

Au sein des entérobactéries, Klebsiella pneumoniae et Escherichia coli sont les deux espèces les plus fréquemment porteuses de ces mécanismes de résistance. Toutefois, ces enzymes ont été retrouvées au sein de nombreuses autres espèces bactériennes, entérobactéries et bacilles non fermentant (tels que Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii) (Jacoby et Munoz-Price. 2005).

5-1- Différents types de BLSE

Elles sont classées selon leurs types moléculaires, les plus fréquents étant les types TEM, SHV, CTX-M (Jacoby et Munoz-Price. 2005) et les nouvelles étant les carbapénèmases.

5-1-1- BLSE de type TEM (Temoneira - nom du patient)

La première f3-lactamase plasmidique de type TEM (TEM-1) a été isolée en 1965, en Grèce, à partir d'une souche d'E. coli isolée chez une patiente nommée Temoneira, d'où la nomination (Datta et Kontomichalou. 1965). La majorité des BLSE de ce type dérivent par quatre à sept mutations ponctuelles de l'enzyme originale (TEM-1 ou TEM-2). Les substitutions les plus courantes sont le glutamate en lysine en position 104, l'arginine en

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sérine en position 164, la glycine en sérine en position 238 et le glutamate en lysine en position 240 (Bradford. 2001). Une seule de ces substitutions peut entraîner une importante modification de l'affinité de l'enzyme. Par exemple, lorsque l'acide aminé devient une sérine, l'interaction entre le -NH3 de la sérine et le groupement oxy-amino des C3G se traduit par une meilleure stabilité de la â-lactamine dans le site actif de l'enzyme. Ces mutations rendent l'enzyme capable d'hydrolyser les C3G, mais aussi plus vulnérable à l'action des inhibiteurs (acide clavulanique).

Cependant, d'autres mutations peuvent conférer la résistance aux inhibiteurs. Ces variantes sont appelées TRI (TEM résistantes aux inhibiteurs). Les enzymes dérivées par mutations permettant d'hydrolyser à la fois les C3G et les inhibiteurs sont de plus en plus fréquentes (Rodriguez-Villalobos et Struelens. 2006).

Figure 5.Les BLSE dérivées de TEM (Ambler et al. 1991).

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5-1-2- BLSE de type SHV : (Sulfhydryl variable)

Les enzymes BLSE de type SHV dérivent par mutations ponctuelles de l'enzyme originale SHV-1 qui correspond a un gène blaSHV de pénicillinase chromosomique de K. pneumoniae (Brisse et Verhoef. 2001 ; Haeggman et al. 2004), et cette désignation SHV est liée au sulfhydryl variable. La majorité des BLSE de type SHV est caractérisée par la substitution d'acides aminés Gly238Ser ou Gly238Ser et Glu240Lys. Le résidu sérine à la position 238 est indispensable pour l'hydrolyse efficace du céfotaxime et le résidu lysine est crucial pour l'hydrolyse efficace de la ceftazidime (Elhani. 2012).

La majorité des BLSE de type SHV ont été décrite chez les souches de K.pneumoniae, toutefois ces enzymes ont été trouvées chez C. freundii, C. diversus, E. coli, E. cloacae (Bradford. 2001).La présence de la séquence d'insertion IS26 sur le gène SHV faciliterait l'acquisition du phénotype BLSE (Hammond et al. 2005).

Figure 6.Les BLSE dérivées de SHV (Bradford. 1999).

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5-1-3- BLSE de type CTX-M (Cefotaximase-Munich)

Les BLSE de type CTX-M ont été décrites initialement en 1986 (FEC-1) au Japon, en Allemagne et en France en 1989 (CTXM-1) et ont depuis lors disséminé largement dans le monde (Thomson et Moland. 2000). Ces enzymes représentent à l'heure actuelle les BLSE les plus fréquentes au niveau mondial après leur diffusion rapide depuis les années 90 (Bonnet. 2004 ; Livermore et al. 2007).

Le groupe CTX-M (pour céfotaximase) conférait à l'origine, chez les entérobactéries, un plus haut niveau de résistance au céfotaxime (ou ceftriaxone), céfépime et aztréonam qu'à la ceftazidime (Arlet et Philippon. 2003 ; Bonnet. 2004). Certaines d'entre elles ont évolué plus récemment par mutation (ponctuelle ou non) générant un haut niveau de résistance à la ceftazidime telles les enzymes CTX-M-15, CTX-M-16, CTX-M-19, CTX-M-23 et CTX-M-32 (Bonnet. 2004). Les CTX-M sont plus fortement inhibées par le tazobactam que par l'acide clavulanique.

Ces nouvelles BLSE ne sont pas étroitement liées aux â-lactamases de type TEM ou SHV puisqu'elles ne présentent que 40 % d'homologie avec ces BLSE classiques (Elhani. 2012). Les analyses génétiques ont montré que les gènes progéniteurs appartiennent au genre Kluyvera, entérobactéries d'isolement très rare en bactériologie médicale (Bonnet. 2004 ; Humeniuk et al. 2002). La â-lactamase naturelle de Kluyvera cryocrescens (KLUC-1) présente 95 à 100 % d'identité avec les enzymes plasmidique du phylum CTX-M-1 (Decousser et al. 2001).

5-1-4- Autres types de BLSE

D'autres BLSE ont une distribution moins large, caractérisées par un haut niveau de résistance à la ceftazidime et parfois à l'aztréonam plutôt qu'au céfotaxime (Arlet et Philippon. 2003 ; Bradford. 2001), qui sont individualisées en BES-1 (brazilian extended spectrum), GES-1 (Guyana extended spectrum), PER-1 (Pseudomonas extended resistance) (Weldhagen et al. 2003), SFO-1 (Serratia fonticola), TLA-1 (Tlahuicas, tribu mexicaine), et VEB-1 (Vietnam extended spectrum). Des enzymes proches de GES-1 ont été découvertes en Grèce, malheureusement dénommées à tort IBC (integron borne cephalosporinase) (IBC-1, IBC-2) (Philippon et Arlet. 2006). Enfin, l'OXA-1 qui a une grande activité catalytique pour la cloxacilline, l'oxacilline et la méticilline.

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5-1-5- Les Carbapénèmases

Les Carbapénèmases décrites chez les entérobactéries appartiennent aux quatre classes connues de f3-lactamases (classe A, B, C, D de la classification d'Ambler) (Queenan et Bush, 2007 ; Poirel et al. 2007). Les plus importantes actuellement en clinique sont les KPC, MBL et OXA-48. L'activité des Carbapénèmases de classe A est inhibé in vitro totalement ou partiellement par les inhibiteurs des f3-lactamases (acide clavulanique et tazobactam), alors que les autres carbapénèmases sont insensibles à ces inhibiteurs classiques de f3-lactamases (Nordmann et Carrer. 2010).

a) Classification des carbapénèmases ? Les Carbapénèmases de classe A

Les carbapénèmases de classe A ont été tout d'abord rapportées dans plusieurs souches d'entérobactéries isolées de l'environnement (Serratia, Enterobacter), produisant des bêta-lactamases dont l'activité était inhibée par l'acide clavulanique. Elles hydrolysaient, à divers degrés, toutes les bêtalactamines. Leurs gènes sont chromosomiques ou plasmidique. Il s'agissait des bêtalactamases NmcA, Sme-1, Sme-2/Sme-3, IMI-1/IMI-2, ou SFC-1. D'autres carbapénémases, de type GES, ont été identifiées chez K. pneumoniae et E. coli. Ces enzymes hydrolysent les carbapénèmes faiblement (Queenan et Bush. 2007 ; Poirel et al. 2007). Les carbapénémases de classe A, les plus fréquentes et les plus menaçantes, sont les carbapénémases de type KPC (Nordmann et al. 2009). La première souche exprimant KPC fut identifiée chez une souche de K. pneumoniae en 1996, en Caroline du Nord aux États-Unis (Yigit et al. 2001). Elle hydrolyse toutes les bêtalactamines. Son activité est partiellement inhibée par l'acide clavulanique ou le tazobactam. Le plus souvent les souches qui produisent KPC expriment également d'autres bêta-lactamases dont de nombreux types de BLSE (TEM, SHV, CTX-M) et possèdent un certain degré de résistance par imperméabilité. Les souches KPC apparaissent donc le plus souvent multirésistantes aux bêta-lactamines, l'ertapénème étant la carbapénème dont le niveau de résistance est le plus élevé. Les études génétiques montrent que ces gènes KPC sont localisés sur une variété importante de plasmides mais qu'ils sont associés à des transposons de même nature de type Tn3. La mobilité de ces plasmides et transposons contribuerait fortement à la diffusion interespèce de ces gènes KPC (Nordmann et al. 2009). L'association des gènes KPC à d'autres gènes de résistance aux

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antibiotiques sur de mêmes structures génétiques explique en grande partie la multirésistance de ces souches.

Tableau 3.Principales carbapénémases des entérobactéries (Nordmann et al.2012).

classificatio n Ambler	Nomde l'enzyme	Plasmide/ Chromosome	Spectre d'hydrolyse						inhibiteurs
			Pen	C1G	G	C3G	ATM	CARBA
A	SEM-1 to -3	Chromosome	++	++	-	+	+	+		acid clav, TAZ, SULB, NXL-104
	NMC-A	Chromosome	++	++	-	+	-	++
	IMI-2	Plasmide	++	++	-	+	-	++
	GES-4,- 5,-6	Plasmide	++	++	+	+	-	+
	KPC-2 to -12	Plasmide	++	++	-	++	+	++		acid clav TAZ, SULB, acidBoron ic
B	IMP-1 to -33	Plasmide	++	++	++	++	-	++		EDTA
	VIM-1 to -33	Plasmide	++	++	++	++	-	++
	NDM-1 to -6	Plasmide	++	++	++	++	-	+
	KHM-1	Plasmide	++	++	++	++	-	++
D	OXA-48	Plasmide	++	++	+/-	+/-	-	+		NaCl
	OXA-181	Plasmide	++	++	+/-	+/-	-	+

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? Les Carbapénèmases de classe B

Les premières carbapénémases de classe B (IMP) (ou métallo bêtalactamases, MBL) avaient été identifiées chez des espèces d'entérobactéries typiquement hospitalières (Serratia, Citrobacter et Enterobacter) au Japon (Queenan et Bush. 2007 ; Walsh. 2008). Puis d'autres MBL ont été isolées dans le monde entier ; il s'agit de nombreuses variétés de bêtalactamases de type IMP et VIM, GIM-1, KHM-1 et NDM-1 (Walsh. 2008 ; Yong et al. 2009). Ce sont des métallo-enzymes qui contiennent des ions zinc dans leur site actif. Ces enzymes hydrolysent fortement toutes les bêtalactamines à l'exception de l'aztreonam. Leur activité n'est inhibée ni par l'acide clavulanique ni par le tazobactam. Les niveaux de résistance aux carbapénèmes sont assez variables (Queenan et Bush. 2007 ; Walsh. 2008). Dans de nombreux cas, les souches productrices de MBL produisent aussi des BLSE (Walsh. 2008). Les gènes de ces MBL sont, le plus souvent, plasmidique et associés au sein d'intégrons et de transposons, structures assurant la mobilité de ces gènes de résistance et la multirésistance aux antibiotiques des souches (Queenan et Bush. 2007 ; Walsh. 2008).

? Les Carbapénèmases de classe C et D

Les carbapénèmases de classe D, OXA-48, décrites tout d'abord chez K. pneumoniae (Poirel et al. 2004) hydrolysent fortement les carbapénèmes et n'hydrolysent pas les céphalosporines de 3^e génération. Son activité n'est pas inhibée par l'acide clavulanique (Poirel et al. 2004) OXA-48 est souvent associée à d'autres bêtalactamases, en particulier des BLSE, ce qui contribue à la multirésistance des souches (Carrer et al. 2010 ; Gülmez et al. 2008). En l'absence d'autres bêtalactamases, les souches qui ne produisent que l'OXA-48 peuvent ne présenter qu'une légère diminution de la sensibilité aux carbapénèmes (Aktas et al. 2008). Le réservoir naturel de ce gène OXA-48 a été identifié ; il s'agit de Shewanella sp., ce qui suggère le transfert de ce gène de résistance en milieu aqueux (Poirel et al. 2004) Le gène d'OXA-48 est localisé au sein d'un transposon comportant deux séquences d'insertion identiques assurant mobilité et expression (Poirel et al. 2004).

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6- Epidémiologie mondiale des entérobactéries BLSE 6-1- Les BLSE classiques

Depuis plus de 30 ans, la résistance des entérobactéries aux C3G ne cesse de se renforcer notamment par l'acquisition de BLSE. De nombreuses études relatent la progression continue à l'échelle mondiale de ce type de résistance (Belmonte et al. 2010).

L'avènement des BLSE a commencé en Europe de l'Ouest mais a gagné rapidement les Etats-Unis, l'Asie et même l'Afrique. Aujourd'hui leur répartition est mondiale et leur prévalence très variable selon la localisation, l'espèce bactérienne et l'origine des isolats (Bradfor. 2001a). L'épidémiologie des BLSE a été étudiée par de grands programmes de surveillance antimicrobienne notamment le programme SENTRY dans la région Asie-pacifique entre 1998 et 2002 et le programme MYSTIC (Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection) en Europe et aux Etats-Unis entre 1997 et 2004.

6-1-1- En Europe

La première bêta-lactamase a été isolée en Allemagne. Il s'agissait du SHV-2 décrit chez K. pneumoniae en 1983 (Knothe et al. 1983) puis en 1985 chez K. ozaenae (Kliebe et al. 1985). En France, en 1984, une variante de TEM-2, nommée TEM-3 est détectée également chez K. pneumoniae dans différents hôpitaux. En 1989, presque simultanément en Allemagne en France et en Italie, une nouvelle famille de BLSE a été reconnue et nommée CTX-M. En 1991, à Ankara (Turquie), et plus tard en France, les enzymes de type OXA, ont été découvertes (Canton et al. 2008).

Les données du programme de surveillance MYSTIC en Europe entre 1997 et 2004 ont montré une augmentation de la prévalence et la dispersion des souches productrices de BLSE. Chez les souches de E. coli productrices de BLSE, la prévalence va de 2,1 % en 1997 à 10,8 % en 2004; chez K. pneumoniae elle va de 9,0 % à 13,6 % (Goossens et Grabein. 2005).

6-1-2- En Afrique

Deux études ont permis de faire le point sur la production des BLSE en Afrique. La première relève la diversité de la prévalence des souches productrices de BLSE sur le continent et conclut que la proportion de ces souches est inférieure à 15 % (Tansarli et al. 2014). Dans la partie nord de l'Afrique, on retrouve les gènes CTX-M-3, CTX-M-15 et TEM-1 chez K.

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pneumoniae et TEM, SHV et CTX-M-1 chez E. cloacae avec une prévalence de 32,1% parmi les entérobactéries en Algérie (Messai et al. 2008; Ahmed et al. 2012; Nedjai et al. 2013).Au Maroc, la prévalence est de 1.3 % avec les types TEM-1, SHV-5 et CTX-M-15 chez E. coli (Bourjilat et al. 2011). En Ethiopie, la prévalence de Klebsiella spp productrice de BLSE est de 33,3 % (Seid et Asrat. 2005) En Afrique du sud, une étude identifie TEM-1,-26, SHV-2,-5 chez Proteus mirabilis et E. coli (Pitout et al. 1998). En Afrique centrale, il a été rapporté au Cameroun les BLSE de type SHV-12, CTX-M-15, OXA-1, OXA-30, TEM-1 avec un portage fécale de 54,06 % (Lonchel et al. 2013a; Lonchel et al. 2013b).En Centrafrique, la prévalence est de 4 % chez les entérobactéries avec les types SHV-2A, SHV-12, CTX-M-3, CTX-M-15 et TEM-1 (Frank et al. 2006). En Afrique de l'Ouest, E. coli productrice de CTX-M-15 est retrouvé chez les enfants au Sénégal (Ruppé et al. 2009) et où la prévalence est estimée à 3,8 % (Sire et al. 2007). Au Nigeria, CTX-M-15, SHV, TEM ont été signalés chez K. pneumoniae (Soge et al. 2006) et OXA-10, VEB-1, CMY chez Providencia spp (Aibinu et al. 2011).

La deuxième étude conclut que les entérobactéries hospitalières et communautaires productrices de BLSE varient entre les pays et selon les échantillons considérés mais reste communes en Afrique. Ce sont les enzymes de classe A et D (Storberg. 2014). La vraie prédominance des BLSE n'est pas connue, probablement en raison des difficultés de leur détection. Mais il est clair que leur prévalence et leur distribution mondiale augmente de jours en jours.

6-1-3- En Asie

En Asie, des études sur la résistance aux antibiotiques ont montré des niveaux élevés des phénotypes BLSE en Chine, en Corée, au Japon et en Inde. Des travaux à la fin des années 1990 suggèrent que SHV-5 et SHV-12 étaient les plus communs. En Chine, et d'autres pays d'Asie, les types dominants sont CTX-M-14 et CTX-M-3 et CTX-M-2 au Japon. En Inde la prévalence des phénotypes BLSE chez E. coli et K. pneumoniae est de68 % (Hawkey. 2008). Dans le cadre du programme SENTRY, l'incidence de la production de BLSE chez E. coli varie de 13 % à 35 % et un taux > 20 % chez K. pneumoniae, en Chine, au Japon, en Taïwan, au Singapore (Hirakata et al. 2005).

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6-1-4- En Amérique

Aux Etats-Unis, les grandes études de surveillance ont été menées par le CDC et par le programme MYSTIC. L'occurrence de la production de BLSE chez les entérobactéries s'étend de 0 à 25%, selon les établissements, avec une moyenne autour de 3% (CDC National Nosocomial Infections Surveillance http://www.cdc.gov/ncidod/hip/SURVEILL/NNIS.HTM et Bradford, 2001a). Une analyse des données du programme MYSTIC entre 1999-2004 aux Etats-Unis a révélé 5,1 % et 7,2 % de phénotype BLSE chez les souches de E. coli et Klebsiella spp, respectivement en 1999 et une baisse en 2004, notamment 1,4 % pour E. coli et 4,4 % pour Klebsiella spp (Goossens et Grabein. 2005). Peu de CTX-M ont été signalés aux Etats-Unis, contrairement au reste du monde (Bush. 2008). Au Canada, une grande variété de BLSE a été identifiée, avec des membres de la classe TEM, SHV et CTX-M-14. Au Mexique l'enzyme TLA-1 hébergé par une souche d'E. coli a été rapportée en 1993 (Naas et al. 2008).

En Amérique du Sud le taux de BLSE est parmi les plus élevés du monde. Les types SHV et TEM sont fréquents, CTX-M est endémique et largement dominant. Selon de récentes enquêtes multi-continentales, les Klebsiella isolés de l'Amérique latine ont la prévalence la plus élevée de BLSE (45,4 %). Chez E. coli, elle est de 8,5 % et chez P. mirabilis, 22,4 % (Données programme SENTRY) (Winokur et al. 2001).

En 15 ans, la diffusion mondiale des BLSE de type CTX-M chez les entérobactéries a explosé de façon extrêmement rapide, d'où le terme de «pandémie CTX-M» (Rossolini et al. 2008). Les études épidémiologiques récentes rapportent que la situation est endémique dans la plupart des pays d'Europe, d'Asie et d'Amérique du Sud avec de forts taux de prévalence de CTX-M parmi les souches productrices de BLSE : E. coli (de 30 à 90%) et de K. pneumoniae (de 10 à 60 %) (Livermore et al. 2007 ; Rossolini et al. 2008). A noter que quelques CTX-M sont retrouvées spécifiquement dans certains pays (comme CTX-M-9 et CTX-M-14 en Espagne, CTX-M-1 en Italie ou CTX-M-2 en Amérique du Sud, au Japon et en Palestine) tandis que CTX-M-15 est mondialement distribuée et est responsable chez les humains des cas d'infections nosocomiales et communautaires (Rossolini et al. 2008).

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6-2- Les BLSE de type carbapénèmases

Les carbapénémases de type KPC (Klebsiella pneumoniae carbapénémase) ont tout d'abord été décrites sur la côte Est des États Unis en 1996 (Yigit et al. 2001) avant d'être identifiées dans la plupart des états du pays, avec notamment une très forte prévalence dans l'état de New York. Ces souches ont également été décrites en Grèce et en Palestine où elles semblent à l'heure actuelle endémiques (Nordmann et al. 2009). Plusieurs variants ont été décrits à ce jour (KPC-1 à KPC-11), le gène blaKPC-2 est actuellement le plus répandu sur la planète. Si les niveaux de résistance aux carbapénèmes des souches productrices d'enzymes de type KPC sont très variables, l'ertapénème est la molécule ayant la plus faible activité. Les souches productrices de KPC sont très fréquemment des souches multirésistantes et les options thérapeutiques sont très souvent réduites. De ce fait, la mortalité associée aux infections par les bactéries productrices d'enzyme de type KPC est élevée, très souvent supérieure à 50% (Nordmann et al. 2011).

Les enzymes de type VIM (Verona Integron encoded Metallo-bêta-lactamase) et IMP (Imipénémase) qui représentent la majorité des carbapénémases de classe B ont été rejointes en 2008 par une nouvelle enzyme appelée NDM-1 (NewDelhi metallo-bêta-lactamase 1).La première métallo â-lactamase de type IMP a été décrite au Japon en 1991 (Ito et al. 1995) Depuis, ce type d'enzyme a diffusé dans le monde entier et les enzymes de type VIM et IMP sont désormais endémiques dans certains pays tels que la Grèce, l'Italie, l'Espagne, Taiwan et le Japon (Nordmann et al. 2011).

La plupart des souches productrices de métallo-â-lactamases sont des K. pneumoniae multirésistantes acquises dans les établissements de soins. La mortalité associée à ce type de souches varie de 18 à 67% (Nordmann et al. 2011).

La première souche de K. pneumoniae productrice d'OXA-48 a été isolée en Turquie en 2003 (Poirel et al. 2004). Depuis, les bactéries productrices d'oxacillinases, notamment OXA-48, ont très largement émergé dans tous les pays du pourtour méditerranéen et en Afrique (Nordmann et al. 2011). Plus récemment, des souches produisant une oxacillinase similaire, OXA-181, ont été isolées en Inde ou chez des patients d'origine indienne (Castanheira et al. 2011). OXA-48 est principalement retrouvée chez K. pneumoniae et E. coli, même si d'autres espèces d'entérobactéries peuvent produire ce type d'enzyme. Les carbapénémases de classe D hydrolysent plus faiblement les carbapénèmes et les céphalosporines de 3^ème génération, ce

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qui sous-estime probablement leur fréquence de diffusion chez les entérobactéries du monde entier.

Toutefois, le niveau de résistance aux carbapénèmes est plus élevé lorsqu'elles sont associées à une BLSE et à un défaut de perméabilité membranaire (Carrer et al. 2010 ; Cuzon et al. 2011). La mortalité associée à ce type d'infection demeure inconnue à ce jour.

7- Facteurs de risque d'acquérir une BLSE

Différents facteurs de risque ont été fréquemment associés avec l'acquisition d'une souche productrice de BLSE. Le premier facteur concerne l'utilisation accrue des antibiotiques de type céphalosporines de 3ème génération quelques années avant l'apparition des premières BLSE, et par conséquent, la mise en évidence d'un lien de causalité entre cette utilisation et l'émergence des BLSE (Sirot. 1989). En d'autres termes, les antibiotiques exercent une pression de sélection non-négligeable (Jacobson et al. 1995), et cette pression de sélection est d'autant plus marquée que le nombre de patients traités est important et que la durée de l'antibiothérapie est longue (Asensio et al.2000). De plus, on peut constater que la restriction de l'utilisation des antibiotiques a permis la diminution du nombre de BLSE (Chow et al. 1991 ; Follath et al. 1987).

Le deuxième facteur de risque concerne la dissémination des souches résistantes et englobe d'une part le problème des « réservoirs » et d'autre part la transmission des germes. De plus, différents facteurs en relation avec l'acquisition de bactéries productrices de BLSE concerne des patients gravement malades, suite à une hospitalisation prolongée et après exposition à des dispositifs invasifs (cathéters veineux, sonde urinaire ou tube endotrachéal). Un séjour de longue durée implique une plus longue exposition au risque d'acquérir une bactérie multi-résistante comme E. coli et Klebsiella (Kassis-Chikhani et al. 2004 ; Wiener et al. 1999), ce qui signifie une augmentation du risque pour le patient d'être colonisé (Goldsteinet al. 1995). D'autres facteurs de risque sont la malnutrition, l'hémodialyse, la nutrition parentérale totale, l'admission en réanimation ou l'hospitalisation préalable (Lautenbach et al. 2001).

CHAPITRE 2

MATERIEL ET

METHODES

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Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

Matériel et méthodes

Cette étude portant sur l'évaluation de la résistance aux antibiotiques des entérobactéries est divisée en deux étapes :

- La première étape se propose de faire une étude rétrospective des données, de l'isolement des entérobactéries provenant de malades externes ou hospitalisés dans les différents services du CHU SAADNA Mohamed Abdennour de Sétif, durant la période de Janvier 2013 à Avril 2017. Le logiciel de sauvegarde «Whonet 5.6 » utilisé au laboratoire a été notre source d'information.

- Dans un deuxième temps, les entérobactéries BLSE positifs isolées durant l'année 2017, sont caractérisées du point de vue moléculaire par l'extraction de plasmides et la détermination des gènes de résistance codant pour ces â-lactamases en utilisant une PCR-Multiplex.

1- Prélèvement et identification

Les prélèvements issus des malades des différents services hospitaliers ou ceux du milieu extra hospitalier sont recueillis et guidés selon la nature du prélèvement à la paillasse approprié comme suit :

- Paillasse Divers(1) : Pus, PB, Crachat.

- Paillasse Divers(2) : PV, KT, Sonde.

- Paillasse ECBU : Urine.

- Paillasse Hémoculture : Sang.

- Paillasse Coproculture : Selles, PR.

- Paillasse Ponction : LCR, LP, Liquide Sinovial...

Après isolement et purification des entérobactéries sur milieu sélectif BCP ou Hektoen. Leur caractérisation est déterminée par une identification biochimiques en utilisant différentes méthodes, la galerie classique, la galerie Api 20^E (la plus pratique) ou l'automate SIEMENS MicroScan WalkAway.

1-1- La mini galerie (galerie classique)

La mini galerie repose sur plusieurs tests biochimiques

? L'urée-indole : permettant la recherche de l'uréase et de l'indole

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Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

· La gélose TSI (Triple Sugar Iron) :l'utilisation des sucres (glucose, lactose et saccharose) est détectée par le virage de l'indicateur de pH, et la production H2S est révélée la présence d'un précipité noir.

· La gélose Mannitol-Mobilité : l'utilisation du mannitol (changement de couleur du rouge au jaune) et de la mobilité du germe.

· La gélose citrate de Simmons : utilisé pour étudier la capacité de la bactérie à croître en présence du citrate de sodium comme seule source de carbone.

· Le milieu Clarck & Lubs : la mise en évidence des voies fermentaires, voie du butan-2,3-diol (VP+) ou voie des acides mixtes (RM+).

· Les acides aminés (ADH-ODC-LDC) : permettant de voir le métabolisme protéique pour différencier chaque espèce d'une autre.

Les milieux ensemencés sont incubés à 37°C/24h et la lecture se fait selon le test. 1-2- La galerie Api 20^E

L'identification par la galerie rapide API 20^E (Analytical profil index) est un système pour l'identification des entérobactéries utilisant 20 tests biochimiques standardisés et miniaturisés, ainsi qu'une base de données.

La galerie est ensemencée, à l'aide d'une pipette Pasteur, par une suspension bactérienne dont l'opacité est équivalente à 0,5 McFarland. Les tubes et les cupules de la galerie sont remplis selon les recommandations du fournisseur. L'incubation se fait à 37 C° #177; 1C° pendant 18-24h.

La lecture des galeries se fait selon les indications du fournisseur. Après codification des réactions en un profil numérique, on se réfère à un catalogue analytique où l'identification est donnée avec un pourcentage et une appréciation.

1-3- Le systeme MicroScan WalkAways SIEMENS

Le système WalkAways est un automate-incubateur relié à un ordinateur comportant le logiciel d'identification des bactéries, il ressemble à la galerie Api 20^E mais de manière plus sophistiquée. Ce système utilise des plaques de 96 puits avec des réactifs lyophilisés et chaque microorganisme à sa plaque spécifique comme suit :

· Combo 54 : bacille Gram négatif non fermentant (Lactose -).

· Combo 53 : bacille Gram négatif fermentant (Lactose +).

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Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

? Combo 28 : cocci Gram positif (Staphylocoques).

? Combo PC1A : cocci Gram positif (Streptocoques).

La plaque ensemencée sera incubée dans l'automate pendent 24h/37°C, puis elle sera lu grâce au logiciel et le résultat est imprimé.

2- Antibiogramme

Une fois la souche isolée et purifiée, sa sensibilité aux antibiotiques est testée par l'antibiogramme standard réalisé par la méthode de diffusion des disques(CA-SFM/EUCAST, 2014) qui permet la détermination du phénotype sensible (S) de l'espèce et les différentes résistances acquises (I ou R) avec des termes de diminution significative de sensibilité (synergie, antagonisme).Une suspension bactérienne préparée à partir d'une culture pure de 18-24 h est ajustée au standard 0,5 McFarland. A partir de cette suspension bactérienne diluée au 1/10 dans l'eau physiologique (0,9 % NaCl) des géloses de Mueller-Hinton sont ensemencées par écouvillonnage. Après séchage des boîtes, des disques de papier buvard imprégnés d'antibiotiques sont déposés à la surface du milieu manuellement ou à l'aide d'un distributeur automatique. L'incubation se fait 37 °C pendant 18 à 24h. La mesure du diamètre des zones d'inhibition autour de chaque disque et comparée aux standards du CA-SFM et permet de déterminer les phénotypes sensibles (S), intermédiaires (I) et résistants (R).

Par l'automate, l'antibiogramme est effectué grâce aux antibiotiques lyophilisés dans la plaque. L'automate peut tester la sensibilité d'une souche envers un antibiotique. Dans ce cas, l'inoculum préparé est valable à la fois pour l'identification et l'antibiogramme. La plaque contient les réactifs pour identifier et pour tester la sensibilité en même temps, d'où l'avantage de l'automate, identification et antibiogramme en 24h.

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Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

Tableau 4. Antibiotiques testés.

Antibiotiques	Abréviations	Charge (jig)		Antibiotiques	Abréviations		CH (jig/UI)		Ampicille
AMP	10		Ertapeneme	ETP	10			Amoxicilline
AMX	25		Meropeneme	MEP	10			Ticarcilline
TIC			Imipeneme	IPM	10			Amoxicilline/ Acide Clavulanique
AMC	25 /	10	Acide Nalidixique	AN	30			Piperacilline/ Tazobactam
PTZ	75 /	10	Gentamycine	GM	10			Aztreonam
AZM	30		Amikacine	AMK	30			Cefazoline
CZO	30		Tobramycine	TOB	10			Cefuroxime
CXM	30		Tigecilline	TGY	30			Cephalothine
CEP	30		Minocycline	MIC	30			Cefoxitine
FOX	30		Ciprofloxacin	CIP	5			Cefepime
FEP	30		Levofloxacin	LVX	5			Cefotaxime
CTX	30		Fosfomycine	FOS	50			Ceftazidime
CAZ	30		Sulfaméthoxa zole- triméthoprim	SXT	1.25		/ 23.75

3- Détection phénotypique des EBLSE

Dans le cas de l'automate, la détection des EBLSE est automatique par la technique des CMI. Par contre, sur l'antibiogramme standard la réduction de la sensibilité aux céphalosporines de troisième génération nécessite la mise en évidence de l'existence d'une BLSE par la recherche d'une synergie entre l'acide clavulanique et les céphalosporines de troisième génération selon les techniques suivantes :

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Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

3-1- Test de synergie

La détection de f3-lactamases à spectre élargi peut être mise en évidence par la méthode des disques consistant à rechercher une image de synergie entre un disque d'antibiotique contenant un inhibiteur de f3-lactamase et les disques de céphalosporines de troisième génération (cefotaxime, ceftazidime et cefopérazone) et l'aztréonam. Cette synergie se traduitpar l'élargissement de la zone d'inhibition en regard du disque de C3G sous forme d'un "bouchon de champagne" (Jarlier et al. 1988).

Les disques d'amoxicilline + acide clavulanique (AMC 20/10) et les disques de C3G (CTX 30ìg, FEP 30ìg et CAZ 30ìg) et l'aztréonam (ATM 30ìg) sont déposés à la surface du milieu MH à une distance de 20 à 30 mm entre les disques. Après incubation à 37°C/18hle test est considéré positif quand le diamètre d'inhibition du disque de céphalosporine de troisième génération appliqué après pré-diffusion du disque de l'AMC est supérieur ou égale de 4 à 5 mm par rapport au diamètre d'inhibition du disque C3G.

CAZ

AMC

ATM

CTX

FEP

Figure 7. Disposition des disques d'antibiotique pour le test de synergie.

3-2- Test du double disque

Le test espagnol comme il est appelé, consiste à rechercher une augmentation de la zone d'inhibition d'un disque de C3G, précédé par l'application d'un disque contenant l'AMC, comparé à un autre disque portant la même céphalosporine et placé côte à côte sur la gélose

39

Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

de MH (Rahal et al. 2005).On procède de la même manière que la technique d'antibiogramme dans la préparation de l'inoculum et l'ensemencement, puis on place deux antibiotiques : un disque d'AMC et un disque de CTX (C3G) à une distance de 25 mm selon la figure. On laisse diffuser à température ambiante pendant une heure et on remplace le disque d'AMC par un disque de CTX (C3G).On incube pendant 18 h à 37°C. Le test du double disque est considéré positif quand le diamètre d'inhibition du disque de céphalosporine de troisième génération appliqué après pré-diffusion du disque de l'AMC est supérieur ou égale de 4 à 5 mm par rapport au diamètre d'inhibition du disque C3G.

CTX

CTX

1 heure

Après

AMC CTX

Figure 8. Schéma de détection de BLSE par le test du double disque
(Rahal et al. 2005).

3-3- Test à la cloxacilline

Le test à la cloxacilline est effectué pour identifier une BLSE associée à une céphalosporinase déréprimée. La cloxacilline ajoutée au milieu MH (0,25 mg/ml) inhibe très fortement toutes les céphalosporinases hyper-produites (Drieux et al. 2008 ; Philippon et Arlet. 2006). Si un tel mécanisme de résistance existe, les boites de Pétri contenant le milieu MH additionné de cloxacilline présentent une restauration de l'activité de â-lactamases et apparition de l'image de synergie en bouchon de champagne recherchée.

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Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

4- Détection génotypique des EBLSE

4- 1- Extraction d'ADN

L'extraction est réalisée par deux méthodes selon la nature plasmidique ou chromosomique de l'ADN.

a) Extraction d'ADN plasmidique par la lyse alcaline

La méthode de la lyse alcaline est une technique rapide permettant l'extraction des plasmides (ADN extra-chromosomiques) de différentes tailles, de petite et de grande taille (>100kb).Elle met à profit les propriétés structurales de l'ADN plasmidique, qui est libérée après la lyse des bactéries sous des conditions dénaturant l'ADN chromosomique (Kado et Liu. 1981).

L'extraction est réalisée selon le protocole suivant :

- Des cultures bactériennes sur milieu LB sont réalisées la veille.1ml de la culture est centrifugé dans une tube Eppendorf (13000 rpm/1 min). Le culot ainsi obtenu est resuspendu dans 300 ìl du tampon P1 et agité.300 ìl du tampon P2 sont ajoutés (tampon de lyse) et les tubes sont agités par inversion environ 6 fois.300 ìl du tampon P3 est additionné et le tube est agité par inversion (formation d'un précipité).Le précipité est centrifugé à 13000 rpm/10 mn et le surnageant est transféré dans un nouveau tube Eppendorf auquel sont ajoutés 630ìl d'isopropanol refroidie à -20°C pour précipiter l'ADN. Après centrifugationà13000 rpm/15 mn le surnageant est éliminé et le culot est lavé de ses sels avec 700ìl d'éthanol à 70%. L'alcool éliminé, le culot est, ensuite, séché à l'air libre ou à l'étuve puis il est resuspendu dans 50ìl de TE (Tris/HCl-EDTA) et conservé à -20°C.

Tableau 5. Composition des différents tampons d'extraction.

Tampon P1		- 50 mM Tris/HCl (pH 8) - 10 mM EDTA (pH 8) - 1 ìl d'ARNase	Tampon P2
- 0.2 M NaOH - 1 % SDS		Tampon P3
- 88.3 g K-acétate - 15 ml acide formique - 300 ml H2O

41

42

Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

b) Extraction de l'ADN chromosomique par Boiling

L'ADN des entérobactéries est extrait par la méthode du boiling. 1.5ml de la culture sur milieu LB est centrifugé à 12000 rpm/1mn. Le culot bactérien est resuspendu dans 180 ìl de TE et agité. Ce dernier est porté à ébullition à 100 °C/10mn puis refroidi à -20°C/10mn. Après centrifugation à 12000rpm/10 mn, le surnageant est récupéré dans un nouveau tube Eppendorf et conservé à 4°C pendant une nuit pour éventuelle dégradation de l'ARN puis à - 20°C pour une utilisation ultérieure.

4-2- Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction)

La recherche des gènes de résistance blaCTX-M, blaSHV et blaTEM a été effectué par une PCR-Multiplex.

4-2-1- Principe

La technique de réaction de polymérisation en chaîne ou PCR permet d'amplifier en un nombre élevé de copies une séquence particulière d'ADN. La polymérisation se réalise dans un mélange réactionnel contenant de faibles quantités d'ADN possédant la séquence à amplifier, les amorces nucléotidiques complémentaires des séquences qui encadrent la cible à amplifier, l'ADN polymérase et un mélange des quatre dNTP (dATP, dTTP, dCTP et dGTP). Elle débute par une étape de dénaturation thermique de l'ADN à amplifier. Des séquences oligonucléotidiques complémentaires ou amorces sont alors hybridées aux extrémités 3' des deux brins du fragment d'ADN matrice. L'allongement des amorces dans le sens 5'--> 3' est, ensuite, assuré par l'ADN polymérase Taq. Les nouvelles molécules d'ADN ainsi formées sont dénaturées et un nouveau cycle peut commencer, la réaction se répétant ainsi jusqu'à plusieurs dizaines de fois (Bonnet et al. 2000b ; Hennequin et al. 2012).

Tableau 6. Amorces utilisées (Jouini et al. 2007).

Génes	Amorces	Séquences		Tm°C	blaCTX-M
For	5'-CTC CGC TTT GCG ATG TGA AG -3'	59.4
Rev	5'-ACC GCG ATA TCG TTG GT -3'	52.8		blaSHV
For	5'-CAC TCA AGG ATG TAT TGT G -3'	52.4
Rev	5'-TTA GCG TTG CCA GTG CTC G -3'	58.8		blaTEM
For	5'-ATT CTT GAA GAC GAA AGG GC-3'	55.3
Rev	5'-ACG CTC AGT GGA ACG AAA AC-3'	57.3

Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

La réaction PCR d'un volume final de 25 ìl, est composée de

- dNTP 0,5ul,

- MgCl2+ tampon 4ul,

- Taq-polymérase (solis biodine) 0,3ul,

- ADN de l'échantillon 5ul,

- Amorces spécifiques du gène à amplifier : 0,2ul (de chaque),

- H2O (eau ultra pure stérile) qsp 25ul.

L'amplification de l'ADN se déroule selon les étapes décrites ci -dessous

Tableau 7.Etapes de la PCR-Multiplex.

blaCTX-M/SHV-TEM				Dénaturation initial
94°C	/ 5 min		Dénaturation
94°C	/ 1 min		Hybridation
52°C	/ 1 min		Elongation
72°C	/ 1 min		Elongation final
72°C	/ 5 min		Nombre de cycles
30

Pour chaque PCR, il faut toujours un témoin positif et un témoin négatif. L'amplification se déroule dans un thermocycleur TC-4000.

Figure 9. Photo du thermocycleur TC-4000.

Chpaitr 02 : Materiels et méthodes

4-3- Electrophorèse sur gel d'agarose

Les produits d'amplification sont analysés sur gel d'agarose à 1.5% (p/v) contenant 10ul d'une solution de bromure d'éthidium (0,5 mg/l).Par contre, l'analyse des plasmides se fait sur un gel à 0.8%. La migration est réalisé pendant 30mn à 100V et le gel est visualisé sous lumière UV et photographié.

Figure 10. Photo d'une migration d'ADN par électrophorèse.

43

Figure 11. Photo du transilluminateur Fisher-Bioblock UV.

CHAPITRE 3

RESULTATS ET

DISCUSSION

44

Chapitre 03 : Résultats et discussion

Résultats

1 -Entérobactéries

Durant cette étude, 2421 souches d'entérobactéries ont été isolées pendant la période de 4 ans et 4 mois (du 01/01/2013 au 30/04/2017), de patients hospitalisés ou externes du Centre Hospitalo-universitaire de Sétif.

1-1- Répartition des entérobactéries par espèces

Les souches d'entérobactéries identifiées sont réparties comme suit ; E. coli est la souche la plus fréquente (n= 1160), suivie par K. pneumoniae (n=479) et P.mirabilis (n=216) ces trois souches représentent plus de 67% des entérobatéries isolées. Les autres espèces minoritaires sont E. cloacae (n=91), Enterobacter sp (n=59), Klebsiella sp (n=42), M. morganii (n=40), S. macescens (n=38), K. oxytoca (n=35), Citrobacter sp (n=30), C. freundii (n=28) et P. vulgaris (n=27). D'autresespèces rarement isoléessont identifiées comme Enterobacter gergoviae, Pantoea, Providencia, Salmonella, Shigella, Hafnia, Cedecae devisae, Ewingella... (n=176) (fig.12).

45,00%

40,00%

50,00%

35,00%

30,00%

25,00%

20,00%

15,00%

10,00%

5,00%

0,00%

47,91%

19,78%

8,92% 3,76%

2,44%

1,73%

1,65%

1,57%

1,45%

1,24%

1,16%

7,28%

1,12%

Figure 12. Répartition des entérobactéries selon l'espèce.

45

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

1-2- Répartition des entérobactéries selon l'origine de l'infection

Plus de la moitié des souches d'entérobactéries isolées proviennent du milieu hospitalier soit 57.71 %. Par contre (42.29%) des prélèvements représentent des infections communautaires (fig.13).

57.71%

42.29%

OUT IN

Figure 13. Pourcentages des entérobactéries selon l'origine de l'infection.

1-3- Pourcentage des entérobactéries selon le sexe

La population du sexe féminin est la plus touchée par les infections à entérobactéries (54.29%) par rapport au sexe masculin (44.97%) (fig.14).

46

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

60,00%

50,00%

40,00%

30,00%

20,00%

10,00%

0,00%

Feminin

54,29%

Masculin

44,97%

Inconnue

0,74%

Figure 14. Pourcentages des souches entériques selon le sexe.

1-4- Répartition des entérobactéries selon les tranches d'âge

La majorité des entérobactéries sont isolées, plus chez les adultes que chez les enfants ; mais lors de la répartition de l'âge par tranche, la tranche d'âge 1-10 ans est la plus élevé (14.38 %), suivi de la tranche 61 et plus (13.06 %), la tranche 21-30 ans est en troisième position (11.42%), de 31-40 ans (8.33%), de 51-60 ans (7.30%), de 11-20 ans (6.93%), de 41-50 ans (6.18%), alors que les nourrissons de <1 ans en dernier(1.20%). Cependant, (31.20%) d'entérobactéries ont été isolées d'un sexe inconnu (fig. 15).

35,00%

30,00%

25,00%

20,00%

15,00% 11,42%

8,33% 6,18% 7,30%

10,00%

5,00%

0,00%

Inconnu < 1 ans 01-10

ans

31,20%

1,20%

14,38%

6,93%

11-20

ans

21-30

ans

31-40

ans

41-50

51-60 61 ans

ans ans et plus

13,06%

Figure 15. Répartition des entérobactéries selon les tranches d'âge.

47

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

1-5- Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques

L'étude de la sensibilité des entérobactéries aux antibiotiques atteste d'un taux très élevé de résistance aux bêtalactamines (fig.16). Les résistances maximales sont notées pour

l'amoxicilline où 98.40% des souches sont résistantes, suivie par la céfazoline
(88.90%) et l'aztréonam (52.79%). La résistance aux C3G est également élevée, elle est de 40.72% et 30.10% respectivement pour la cefotaxime et la ceftazidime. En revanche, une sensibilité relative existe pour l'augmentin (12.58%), la céfépime (8.39%) et le ciprofloxacine (8.24%).Les plus faibles résistances sont notées pour les carbapénèmes (l'imipeneme et l'ertapeneme) et la cefoxitine.

100,00%

40,00%

90,00%

80,00%

70,00%

60,00%

50,00%

30,00%

20,00%

10,00%

0,00%

98,40%

88,90%

52,79%

40,72%

30,10%

28,57%

21,43%

20,38%

12,58%

8,39%

8,24%

7,53%

4,82%

7,22%

4,71%

4,36%

2,35%

Figure 16. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux antibiotiques

1-6- Profil de résistance des entérobactéries aux antibiotiques par année

Les données décrites ci-dessous relatent d'une manière plus détaillée l'évolution de la résistance des entérobactéries aux f3-lactamines et aux autres antibiotiques par année, durant la période du 01/01/2013 au 30/04/2017 :

a) Résistance aux â-lactamines

La résistance des entérobactéries aux f3-lactamines montre un taux élevé de résistance à AMX de presque 100% pendant les 5 années étudiés et à la CZO (C1G) d'un taux d'environ 90%. Une augmentation importante de résistance à AMC, AMP et les C3G d'une moyenne de 510% par an est notée. L'apparence considérable de la FOX et l'augmentation de la résistance

48

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

des antibiotiques du dernier recours IPM et ETP dans le traitement constitue un véritable problème de santé publique.

100,00%

40,00%

90,00%

80,00%

70,00%

60,00%

50,00%

30,00%

20,00%

10,00%

0,00%

AMX AMC AMP ATM CPN CZO FEP CTX CAZ FOX ETP IPM

2013 2014 2015 2016 2017

Figure 17. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux f3-lactamines par année. b) Résistance aux autres antibiotiques

Le graphe montre que l'évolution des résistances aux quinolones et aux sulfamides est similaire à celle des f3-lactamines, elle est en augmentation croissante à des taux qu'il faut prendre en considération. En revanche, la résistance aux aminosides est presque stable durant les cinq années avec une nette diminution pour la gentamycine. Par contre, l'acide nalidixique reste l'antibiotique le plus actif.

49

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

35,00%

30,00%

25,00%

20,00%

15,00%

10,00%

5,00%

0,00%

1,29%

4,57%

AN CIP GEN TOB SXT

2,00% 2,85%

2013 2014 2015 2016 2017

8,36%

9,22% 8,89%

13,86% 10,88%

10,45% 8,67% 10,82%

2,90% 2,61%

8,21%

10,35%

21,47%

24,60%

32,02%

Figure 18. Pourcentages de résistance des entérobactéries aux autres antibotiques par année.

2- Les EBLSE

Le test de synergie est positif pour 53 souches d'entérobactéries étudiées. Les 3 autres souches ont montré un test de double synergie négatif. Pour ces souches, il a été nécessaire de pratiquer le test de synergie sur MH contenant de la cloxacilline à cause de la forte expression de leur céphalosporinase.

2-1- Fréquence d'isolement des EBLSE

La prévalence de l'année 2017 a débuté avec un pourcentage élevé des EBLSE (35%) par rapport à la totalité des entérobactéries isolées durant cette période.

EBLSE +

35%

EBLSE -

65%

Figure 19.Fréquence des EBLSE.

50

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

2-2- Répartition des EBLSE selon l'espèce

Les 56 entérobactéries productrices de â-lactamases à spectre élargie isolées durant cette période de 4 mois sont réparties comme suit : 23 E. coli, 22 K. pneumoniae, 4 E. cloacae, 3 M. morganii, 2 S. marcescens, 1 E. aerogenes et 1 C. freundii.

4% 2% 2%

5%

7%

39%

41%

E. coli

K. pneumoniae E. cloacae

M. morganii S. marcescens E. aerogenes C. freundii

Figure 20. Répartition des EBLSE par espèce.

2-3- Répartition des EBLSE selon l'origine de l'infection

La majorité (75%) des entérobactéries sécrétrices de BLSE sont isolées des infections d'origine hospitalières. Les espèces bactériennes impliquées sont E. cloacae et E. aerogenes isolées exclusivement du milieu hospitalier et représentent des germes typiquement d'origine nosocomiales. L'espèce C. freundii est issue d'une infection communautaire. L'espèce S. marcescens semble ubiquitaire elle est issue d'infections nosocomiale et communautaire. Par contre, les espèces E. coli et K. pneumoniae et qui représentent un nombre plus important de souches, leurs fréquences d'isolement des infections nosocomiales sont plus élevées et de l'ordre de (82.61%) et de (72.73%) respectivement.

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

100,00%

40,00%

90,00%

80,00%

70,00%

60,00%

50,00%

30,00%

20,00%

10,00%

0,00%

INF COMMU INF NOSO

Figure 21. Répartition des EBLSE selon l'origine de l'infection.

2-4- Répartition des EBLSE selon le service

Certains services hospitaliers sont apparus plus concernés par le problème de résistance liée à la production de BLSE, notamment les services des maladies infectieuses et de la néphrologie d'où proviennent respectivement (31%) et (12%) des souches BLSE, suivi par le service de pédiatrie avec un taux de (10%). Au niveau des autres services l'isolement de souches BLSE est faible et réparti comme suit : Hématologie (7%), Neurochirurgie (7%), Médecine interne (7%), Cardiologie (5%), Bloc d'Urgence Chirurgical (5%), Orthopédie (5%), Néo-natal (3%), Chirurgie Femme (2%), Bloc d'Urgence Médical (2%), Réa-Médical (2%), et Pneumo-phtisiologie (2%).

ORT

5%

CHF BUM

2% 2%

N-NAT

3%

CARDIO

5%

BUC

5%

7%

MI

N-CH

7%

HTO

7%

R-MED

2%

PED

10%

31%

CX

NEPH

12%

PPHT

2%

51

Figure 22. Répartition des EBLSE selon le service.

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

2-5- Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement

La répartition des sites anatomiques présentée dans la figure 23, montre que le site le plus concerné par les EBLSE sont les urines (32%), suivi du pus (30%) dans lesquels les germes ont été isolés. Les taux retrouvés dans les autres prélèvements sont comme suit : hémocultures (16%), LCR (11%), liquide d'ascite (3%) et (2%) pour chacun des autres prélèvements Drain, Prélèvement Buccal, sonde urinaire et trachéal.

16%

11%

3%

2% 2% 2%

2%

30%

32%

URINE

PUS HEMOCULTURE LCR L. ASCITE

DRAIN

P. BUCCAL SONDE URINAIRE TRACHEAL

Figure 23. Répartition des EBLSE selon la nature du prélèvement.

2-6- Répartition des EBLSE selon le sexe

Le pourcentage est inversé par rapport à la totalité des entérobactéries isolées, le sexe masculin représente un taux plus élevé (51.79%) de la fréquence d'isolement des EBLSE.

Féminin;

48,21%

Masculin;

51,79%

52

Figure 24. Répartition des EBLSE selon le sexe.

53

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

2-7- Profil de résistance des EBLSE

Figure 25.Test de synergie.

L'antibiogramme effectué pour les souches d'EBLSE a permis d'étudier leurs profils de résistance vis-à-vis des antibiotiques testés.

2-7-1- Résistance aux â-lactamines

Durant la période d'étude, le taux de résistance aux céphalosporines de 3^émegénération a connu une augmentation très remarquable. Les résultats de la résistance des 56 isolats d'entérobactéries productrices de BLSE montrent que toutes les souches sont totalement

résistantes (100%) à l'ampicilline, l'amoxicilline et la ticarcilline, ainsi, qu'aux
céphalosporines de 1^ére génération (C1G) la céfazoline et la céfalotine, aux G ; la céfuroxime, aux C3G (CAZ, CTX), à la Céfepime (C4G) et à l'aztréonam. Concernant la résistance de ces souches aux inhibiteurs des â-lactamines on note une résistance élevée vis-à-vis de l'association amoxicilline/acide clavulanique. Par contre, l'association pipéracilline/tazobactam demeure plus active.

Il est à signaler aussi dans ce travail, la présence de 16 souches différentes résistantes à la céfoxitine (FOX), suggérant la possible production d'une céphalosporinase plasmidique de type AmpC.

L'imipéneme et l'ertapeneme restent les antibiotiques de choix avec la sensibilité de 54 souches pour l'imipéneme contre 2 résistantes, 53 souches sensibles à l'ertapeneme contre 3

54

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

souches. La sensibilité au méropeneme portant sur 4 souches se sont montrées toutes sensibles. Cependant, la légère résistance aux IPM et ERT est à prendre en considération.

Figure 26. Test de synergie vu dans un antibiogramme d'une souche Klebsiella pneumoniae

BLSE +.

2-7-2- Résistance aux aminosides

Des résistances associées aux aminosides sont retrouvées chez plus de 60% des souches EBLSE, ce qui présente un fort risque d'échec thérapeutique. Par contre, l'amikacine reste l'antibiotique le plus efficace sur les souches EBLSE avec un taux de sensibilité de 84%. 2-7-3- Résistance aux quinolones

La résistance de souches EBLSE aux C3G est associée à une résistance aux quinolones et aux fluoroquinolones. Cette résistance est observée chez (70%) des souches pour la ciprofloxacineet (35%) pour la levofloxacine.

2-7-4- Résistance aux autres antibiotiques

L'étude de la sensibilité aux autres familles d'antibiotiques a révélé aussi des résistances plus au moins faibles. Quelques souches sont résistantes à la tigécycline, la minocycline, l'association sulfaméthoxazole + triméthoprime et la fosfomycine. Toutefois, la tigécycline et la fosfomycine se sont montré les antibiotiques les plus actifs sur toutes les souches testées.

55

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

100%

40%

90%

80%

70%

60%

50%

30%

20%

10%

0%

AMP/AMX AMX/ACV PIP/TAZ TIC AZM CAZ CTX FEP CPN CZO CXM FOX ETP IPM MER AMK GEN TOB TGY MIC SXT CIP LVX FOS

S I

R

Figure 27. Profil de résistance des EBLSE aux antibiotiques.

3- Support génétique mobile de la résistance ? Les plasmides

Les souches d'entérobactéries productrices de BLSE ont subit une extraction de leur contenu plasmidique par la méthode de (Kado et Liu. 1981).

L'analyse du contenu plasmidique des souches, après migration sur gel d'agarose (0.8%) a révélé que la majorité de souches hébergent un à quatre types de plasmides.

56

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Tableau 8. Différents types de plasmides extraits des EBLSE.

Nom de la souche	Code de la souche	Nombre de types de plasmide		Nombre d'isolats	Escherichia coli
Eco	1	N=19
		(1.11.12.14.15.16.18.19.20.21
		23.24.32.34.39.41.43.53.54)		Escherichia coli
Eco	2	N=1
		(48)		Escherichia coli
Eco	3	N=2
		(4.44)		Escherichia coli
Eco	4	N=1
		(25)		Klebsiella pneumoniae
Kpn	1	N=12
		(3.6.22.26.28.29.30
		31.36.38.40.50)		Klebsiella pneumoniae
Kpn	2	N=6
		(9.37.42.45.47.52)		Klebsiella pneumoniae
Kpn	3	N=3
		(2.7.8)		Klebsiella pneumoniae
Kpn	4	N=1
		(51)		Enterobacter cloacae
Ecl	1	N=3=)
		(13.27.33)		Enterobacter cloacae
Ecl	3	N =1
		(56)		Morganella morganii
Mmo	1	N=3
		(17.46.55)		Serratia marcescens
Sma	1	N=2
		(5.35)		Enterobacter
Eae	1	N=1		aerogenes
		(10)		Citrobacter freundii
Cfr	1	N=1
		(49)

( ) Numéros des isolats

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Figure 28. Profil plasmidique des 56 souches d'EBLSE.

57

58

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

4- Caractérisation des BLSE par la PCR-multiplex

La caractérisation des gènes de BLSE effectuée sur l'ADN (plasmidique ou chromosomique) de l'ensemble des souches par l'amplification multiple des gènes CTX-M, TEM et SHV a permis l'obtention de différents gènes de résistance amplifiés sur 33 souches.

4-1- BLSE de type CTX-M

Ce type de BLSE se reconnaît facilement sur l'antibiogramme en gélose car le CTX est habituellement la molécule la plus touchée avec une très bonne inhibition autour du disque contenant un inhibiteur de f3-lactamases.

La caractérisation moléculaire de f3-lactamases par PCR a révélé que 29/33des souches d'entérobactéries productrices de f3-lactamases à spectre étendue provenant des patients à titre externe et de patients hospitalisés aux différents services à l'hôpital, sont toutes porteuses d'un gène blaCTX-M (Fig.29), soit une prévalence de (87.88 %). Montré et Faire les espèces

59

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Figure 29. Amplifications par PCR-Multiplex des gènes blaCTX-M, blaSHV et blaTEM.

60

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

4-2- BLSE de type SHV

La BLSE de type SHV a été observée chez 15souches d'EBLSE soit une prévalence de (42.42 %) existant chez 12 souches K. pneumoniae, 2 d'E. coli et une souche d'E. aerogenes.

4-3- BLSE de type TEM

Les BLSE de type TEM sont peu fréquentes, elles ont été retrouvées chez 9 souches appartenant à K. pneumoniae (N=6), E. coli (n=2) et une seule souche E. aerogenes, soit une prévalence de (27.27 %).

souches %

	E. coli (14)	K. pneumoni ae (14)	E. cloacae (2)	M. morganii (2)		E. aerogenes (1)	blaCTX-M
68,75%	44,83%	100,00%	100,00%	33,33%		blaSHV
12,50%	37,93%			33,33%		blaTEM
18,75%	17,24%			33,33%

100,00%

40,00%

80,00%

60,00%

20,00%

0,00%

Figure 30. Prévalence des gènes de résistance chez les souches amplifiées.

4-4- Résistances multiples

- BLSE de type CTX-M/SHV

La BLSE de type CTX-M/SHV est observée chez 13 souches soit une prévalence de

(39.39%), 11 K. pneumoniae, une E. aerogenes et une E. coli.

- BLSE de type CTX-M/TEM

Ce type de BLSE a été observé chez 6 souches soit (18.18%), 4 K. pneumoniae, 1 E.

aerogenes et 1 E. coli.

- BLSE de type CTX-M/SHV/TEM

La BLSE de type CTX-M/SHV/TEM est observée chez 5 souches soit une prévalence de

(15.15 %), 4 K. pneumoniae et une seule souche E. aerogenes.

61

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Tableau 9.Caractéristiques générales et moléculaires des souches d'entérobactéries productrices de â-lactamases à spectre étendu isolées au CHU de Sétif.

Souches	Code	Services	prélèvement	Sexe		Gène BLSE	Kpn
1(72c)	Orth	Pus	F	blaCTX-M		Kpn
2(62c)	Hto	Sang	F	blaCTX-M		Kpn
3(72s)	Orth	Pus	F	blaSHV		Kpn
4(62s)	Hto	Sang	F	blaSHV		Kpn
5(72t)	Ortho	Pus	F	blaTEM		Kpn
6(62t)	Hto	Sang	F	blaTEM		Kpn
7	Ext	Urine	M	blaTEM		Kpn
10	BUC	LCR	M	blaCTX-M blaSHV		Kpn
11	N-Ch	Trachéal	M	blaCTX-M blaSHV blaTEM		Kpn
18	Ext	Pus	M	blaCTX-M blaSHV		Kpn
19	Cx	Urine	M	blaCTX-M blaSHV		Kpn
20	Ext	Urine	M	blaCTX-M blaSHV		Kpn
22	Orth	Pus	F	blaCTX-M blaSHV		Kpn
23	Ext	Pus	F	blaCTX-M blaSHV		Kpn
24	N-nat	LCR	F	blaCTX-M		Kpn
31	Néph	Sonde Uri	M	blaCTX-M blaSHV blaTEM		Kpn
32	Péd	LCR	M	blaCTX-M blaSHV		Kpn
36	Péd	Urine	M	blaCTX-M		Kpn
38	Ortho	Pus	F	blaCTX-M blaSHV blaTEM		Kpn
39	Hto	Sang	F	blaCTX-M blaSHV blaTEM

62

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Eco	9	CHF	Pus	F		blaTEM	Eco
13	Cx	Pus	M	blaCTX-M		Eco
14	BUM	Pus	F	blaCTX-M		Eco
15	Ext	Urine	F	blaCTX-M		Eco
16	Péd	Urine	F	blaSHV		Eco
17	Cx	Urine	M	blaCTX-M blaSHV		Eco
21	Ext	Urine	F	blaCTX-M blaTEM		Eco
25	Cx	Pus	M	blaCTX-M		Eco
26	Péd	LCR	M	blaCTX-M		Eco
29	Cx	Urine	M	blaCTX-M		Eco
30	BUC	Pus	M	blaCTX-M		Eco
33	Cx	Urine	F	blaTEM		Eco
35	Cx	Urine	F	blaCTX-M		Eco
37	Ext	Urine	F	blaCTX-M		Eae
12	Cardio	Pus	M	blaCTX-M blaSHV blaTEM		Ecl
8	Ext	Urine	F	blaCTX-M		Ecl
27	Néph	Urine	F	blaCTX-M		Mmo
28	MI	Pus	M	blaCTX-M		Mmo
34	MI	Pus	M	blaCTX-M

63

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Discussion

Depuis plusieurs années, le nombre de bactéries résistantes aux antibiotiques est en constante augmentation, principalement en milieu hospitalier. La menace la plus importante à l'heure actuelle est observée chez les entérobactéries (Armand-Lefévre. 2017) où on assiste à l'émergence d'un grand nombre d'entérobactéries productrices de bêta-lactamases à spectre élargi (BLSE).

Cette étude s'est déroulée du 01/01/2013 au 30/4/2017, période au cours de laquelle le recueil des données de différents types de prélèvements de patients hospitalisés des différents services au CHU de Sétif et de patients à titre externe a permis d'isoler 2421 souches d'entérobactéries. La souche E. coli est l'espèce la plus fréquemment isolée avec 49.91%, suivi par K. pneumoniae (19.78%) et P. mirabilis (8.92%). Des études similaires confirme que E. coli est le pathogène le plus répandu (68,2 %), suivi de Klebsiella spp. (Thibaut et al. 2017). Le même constat a été fait au Maroc en 2005 où E. coli est également classé le germe le plus prédominant avec 44.7 % suivie par Klebsiella sp. (Sekhsokh et al. 2008). Toutefois, en France, E. coli représente la première cause d'infection pathologique mais avec un pourcentage de 62% (Diamantis et al. 2017) ou de 93% (Ménard et al.2017).

La prévalence des entérobactéries isolées des infections nosocomiales est plus élevée par rapport à celles isolées des infections communautaires. Un taux plus élevé (74%) est isolée des infections hospitalière lors d'une enquête faite au CHU de Batna (Benammar et al. 2017). Cependant, ce pourcentage est inversé quand il s'agit d'infections urinaire où la fréquence d'isolement des entérobactéries provient plus des malades à titre externe (Lahlou et al. 2008 ; Hailaji et al. 2016). Il est également noté que les patients de sexe féminin sont un facteur de risque (Nadmi et al. 2010 ; Thibaut et al. 2017 ; Rakotovao-Ravahatra et al. 2017). Les infections particulièrement urinaires sont plus fréquentes chez les femmes avec un pourcentage élevé comparativement aux hommes. Par ailleurs, la majorité de la population semble infectée. Selon les données de la répartition des entérobactéries suivant l'âge des patients. Les différentes tranches d'âge représentent des taux de colonisation plus au moins proches. Des études ailleurs soulèvent des constats mitigés. Certaines, supposent que les jeunes sont les plus infectés par rapport au vieux de plus de 65 ans (Ben Ayed et al. 2017). Par contre d'autres auteurs suggèrent que les personnes âgées sont les plus infectés, révélant ainsi que la démographie en termes d'âge, les traditions et les cultures de chaque région sont pratiquement les causes de ces différences.

64

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Les antibiotiques les plus utilisées dans les infections à entérobactéries sont les â-lactamines. L'étude de la sensibilité des entérobactéries aux antibiotiques atteste d'un taux très élevé de résistance aux bêtalactamines. Les résistances maximales sont notées pour l'amoxiclline où (98.40%) des souches sont résistantes, suivie par la céfazoline (88.90%) et l'aztréonam (52.79%). La résistance aux C3G est également élevée, elle est de (40.72% et (30.10%) respectivement pour la cefotaxime et la ceftazidime. Notre étude démontre à l'instar de nombreux autres travaux que la résistance des entérobactéries est un phénomène grandissant. La mauvaise utilisation des antibiotiques, l'automédication, la recrudescence de la vente illicite des antibiotiques, la mauvaise conservation des antibiotiques, les erreurs de prescription pourraient expliquer en partie l'évolution de la fréquence des résistances.

Une sensibilité remarquable de l'ampicilline (80%) est observée, la restauration de l'activité de cet antibiotique est réapparue suite à son non utilisation au niveau communautaire (sauf en dermatologie) qu'hospitalier. Concernant les aminosides, notre étude révèle une sensibilité élevée (>90%) à la gentamicine et la tobramycine. Ces taux de sensibilité sont bien encadrés par les travaux antérieurs (Tiouit. 2001). Notre étude révèle un faible taux de sensibilité au cotrimoxazole (20.38%). Cette constatation a été faite par certains auteurs au Maghreb où ils ont trouvé (29,94%) de souches sensibles. Par contre d'autres auteurs ont trouvé des pourcentages plus élevés de souches sensibles au cotrimoxazole (Weber. 1993). La résistance à l'AMC présente un taux plus faible que celui trouvé dans l'étude de Diamantis et al. 2017. Des taux faibles mais non négligeable aux C4G (8.39%) constitue un signe d'alerte et l'apparition de résistance combinée avec d'autres antibiotiques est un échec thérapeutique. Alors que, la FOX, IPM, ETP et AN restent les antibiotiques les plus efficaces, malgré la présence d'une légère résistance respectivement de 4.82, 4.71, 4.36 et 2.35%. Ces résultats sont conformes à certains travaux (Benammar et al. 2017).

Les bactéries productrices de BLSE constituent une préoccupation majeure en milieu hospitalier en raison de leur diffusion épidémique et de leur multirésistance aux antibiotiques. En parallèle, le milieu communautaire joue un rôle primordial dans leur propagation. En effet, les BLSE sont retrouvées chez une vaste proportion de bacilles à Gram négatif, et les entérobactéries représentent les germes les plus incriminés (Gniadkowski. 2001).

Dans cette étude s'étalant sur quatre mois, l'incidence des souches d'entérobactéries productrices de BLSE est de 35%.Cette prévalence correspond à peu près à celle retrouvée dans certaines études nationales, en particulier celle faite à Annaba (31.40 %) (Nedjai et al.

65

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

2013) et à Tlemcen (39.22%) (Baba Ahmed-Kazi Tani et al. 2013); mais assez différente de celles rapportées dans d'autres pays, tels au Japon (6,4 %) (Luvsansharav et al. 2011) ou en Belgique (6.6%) (Rodriguez-Villa-Lobos et al. 2011). D'autres études récentes rapportent des taux d'EBLSE variant de 6 à 64 % selon les zones géographiques (Sood et Gupta. 2012 ; Kizilca et al. 2012) ces taux ont augmenté de 16 % en 2005 à 44 % en 2010 (Bourigault et al. 2013).

Les espèces d'entérobactéries les plus productrices de BLSE sont E. coli et K. pneumoniae avec des proportions de (41.07%) et (39.29%) respectivement, suivie par E. cloacae (7.14%) ceci corroborent les résultats d'autres études (Neulier et al. 2014). Par contre, les autres entérobactéries telles que M. morganii, S. marcescens, E. aerogenes et C. freundii sont faiblement représentées. Cependant, des taux plus élevés de la prévalence de Klebsiella productrices de BLSE sont détectées en Amérique du Sud (45,4% à 51,9 %) (Villegas et al. 2008) et en Arabie Saoudite (55%) (Al-Agamy et al. 2009). En Iran, la prévalence des K. pneumoniae productrices de BLSE était très élevée, soit un taux alarmant de 72.1% (Feizabadi et al. 2010).Les résultats des taux d'E. cloacae (7.14%) productrices de BLSE rapportés dans cette étude sont plus faibles que les proportions trouvées dans les pays africains où des taux élevés ont été rapporté, soit (18.5%) au Mali (Duval et al. 2009).

La plupart des EBLSE (75%) sont isolées des infections hospitalières, donnant ainsi une haute prévalence que confirme l'étude nationale faite au CHU de Batna (74%) (Benammar et al. 2017).

Pratiquement, la prévalence globale de la production de BLSE a varié considérablement selon les zones géographiques des pays et dans différents structures hospitalières. Durant les quatre mois d'étude, les souches EBLSE ont été retrouvées dans tous les types de services. Cependant, certaines spécialités sont apparues plus concernées, tels que les services des maladies infectieuses, de néphrologie et de pédiatrie. Dans ces services, les bactéries sont soumises à une pression élevée des antibiotiques. Bien plus, plusieurs de ces patients sont particulièrement vulnérables aux infections suite à une hospitalisation prolongée et après exposition à des dispositifs invasifs (sonde urinaire, cathéters veineux, ou tube endotrachéal). En effet, les patients hospitalisés au sein des unités de soins intensifs présentent plus de risques à contracter une BLSE (Stürenburg et Dietrich. 2003).En général, les services de réanimation sont fréquemment considérés comme des foyers d'origine pour la dissémination des bactéries productrices de BLSE en causant de nombreuses épidémies (Rodriguez-

66

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

Villalobos et Struelens. 2006), ce qui est pratiquement le contraire des résultats de cette étude. Les services de réanimation ont mis des stratégies pour limiter cette dissémination.

En effet, un nombre significativement important des prélèvements recensés sont les urines (32%) prélevées surtout chez les patients hospitalisés. Ce résultat confirme que la majorité des souches BLSE proviennent des urines (Canton et al. 2008 ; Ebongue et al. 2015).

Dans notre étude, le sexe masculin (52%) est retrouvé comme facteur de risque. Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés par certaines études (Colodner et al. 2004 ; Gupta et Datta. 2007). Néanmoins, d'autres ont conclu à un risque plus élevé pour les femmes (Rodriguez-Bano et al. 2008b ; Nedjai et al. 2013).

Les résultats de l'antibiogramme ont montré que les souches présentent une résistance totale de 100% à l'ampicilline, l'amoxicilline (aminopénicillines) et la ticarcilline (carboxypénicillines). Ainsi, les souches sont résistantes à 100 % aux céphalosporines de 1ére génération (C1G) la céfazoline et la céfalotine, aux G la céfuroxime, aux céphalosporines de 3^émegénération (CAZ, CTX), à la Céfepime (C4G) et l'aztréonam (monobactame).Concernant les résistances des â-lactamines associé à l'acide clavulanique, une résistance élevée à AMC (amoxicilline/ac clavulanique) de 65% est notée. Contrairement à l'association PTB (Pipéracilline/Tazobactam) qui est plus actif avec seulement 23% de résistance.

La résistance aux C3G a été signalée dans plusieurs pays africains, Sénégal, Centre-Afrique, Maroc et Algérie (Frank et al. 2006; Ruppé et al. 2009; Bourjilat et al. 2011; Ahmed et al. 2012) avec des taux comparables à ceux trouvés. Cependant, ils sont plus élevés que ceux trouvés en Europe, aux USA et en Chine (Goossens et Grabein. 2005; Hirakata et al. 2005; Winokur et al. 2001) et en Iran (Feizabadi et al. 2010).

Les autres familles d'antibiotiques ont donné une très forte résistance à l'association sulfamides SXT (75%) ; aux quinolones (70% pour la CIP et 35% pour la LVX) de même qu'aux aminosides (61% pour la GN et 63% pour la TOB).

Récemment, un taux beaucoup plus important a été retrouvé dans une étude algérienne, où le pourcentage de la résistance de souches EBLSE est de 100% de résistance à la majorité des antibiotiquesC3G testés, gentamicine et tobramycine (Touati et al. 2012).

Les molécules les plus actives ont été l'imipénème (95 %), l'amikacine (85 %) et la fosfomycine (80 %). La céfoxitine n'est active que chez 70 % des souches.

Il est actuellement prouvé que l'utilisation des antibiotiques, notamment les C3G dans un but thérapeutique est le facteur de risque le plus important dans le développement de résistances

67

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

bactériennes (Rubin et Samore. 2002). Cette pratique est devenue un problème majeur de santé public. Ainsi, des résistances croisées sont observées avec les aminosides, fluoroquinolones, quinolones, et les triméthoprimes-sulfamethoxazoles. Ceci est en rapport avec l'utilisation abusive d'antibiotiques à large spectre (pénicillines, céphalosporines, fluoroquinolones, aminosides).

L'analyse du profil plasmidique des 56 souches BLSE étudiées a montré que nos bactéries possèdent de 1 à 4 types différents de plasmide. Cependant, cette diversité est responsable de la résistance et la co-résistance aux antibiotiques. Dans d'autres études (Mendonça et al. 2009; Tandé et al. 2009, Ahmed et al. 2012) la co-résistance serait due à la présence chez ces souches de grands plasmides qui portent en plus des gènes bêtalactamases d'autres gènes de résistances.

La séparation par électrophorèse des produits PCR-Multiplex de 33 souches d'entérobactéries isolées a permis de mettre en évidence la production de trois types de BLSE, avec une nette prédominance de BLSE de type CTX-M, soit 88%, suivie de SHV 45% et TEM 18%.

Quoique les prévalences soient relativement différentes, le CTX-M est retrouvé majoritaire dans plusieurs études, notamment au Cameroun où les BLSE de type CTX-M est de 97 %, en Afrique du Sud (95 %), en Guinée-Bissau (94,8 %), au Niger (91 %), en Algérie (76 %) au Burkina-Faso (65,49 %), en France (45 %) et en Allemagne (85%) (Giraud-Morin et Fosse. 2008; Peirano et al. 2011; Woerther et al., 2011; Isendahl et al., 2012; Lonchel et al., 2012; Nedjai et al., 2013; Zongo et al. 2015 ; Pietsch et al. 2017).

Le CTX-M appartient aux Bêtalactamases de classe A, décrit pour la première fois en Europe Occidentale et dès lors retrouvé un peu partout dans le monde (Bradford, 2001a; Bonnet, 2004; Paterson et Bonomo, 2005).Dans cette étude, la BLSE CTX-M a dominé chez Escherichia (69%); cette observation est également faite par plusieurs auteurs (Metuor Dabire. 2014; Zongo et al. 2015).

Dans cette étude, 33 isolats producteurs de BLSE sont détectés. Les souches BLSE sont toutes multirésistantes. Les mêmes résultats ont été rapportés dans l'étude d'Ahoyo et al. 2007, les souches BLSE porteuses de gènes CTX-M, sont porteuses d'autres gènes de résistance. Des études antérieures ont montré que les plasmides qui interviennent dans la résistance aux BLSE peuvent transporter plus d'un gène bêta-lactamase comme CTX-M, SHV et TEM, ce qui peut potentialiser l'action des bêtalactamases. Ces gènes sont portés par le même plasmide conjuguatif et peuvent être transférés dans d'autres souches (Ahoyo et al. 2007). Les bêtalactamases de type TEM sont décrites depuis assez longtemps. Aujourd'hui,

68

Chpaitr 03 : Résultats et discussion

plus de100 dérivés de bêta-lactamase de type TEM sont décrits et beaucoup d'entre eux sont des BLSE. Contrairement aux bêtalactamases de type TEM, le groupe des bêtalactamases CTX-Ma connu une évolution rapide ces dernières années.

CONCLUSION

69

Conclusion

Conclusion et Perspectives

La résistance aux antibiotiques, surtout par production de BLSE est une réalité en Algérie et partout dans le monde et leur large dissémination risque de compromettre le traitement des infections courantes dans la communauté comme dans les hôpitaux.

Actuellement, la diffusion de ces souches multi-résistantes, d'entérobactéries productrices de BLSE et de céphalosporinase plasmidique constitue une menace de santé publique, réduisant de manière importante les alternatives thérapeutiques pour le traitement des infections sévères.

Ce travail, réalisé de façon rétrospective sur une période de quatre ans et quatre mois de 2013 jusqu'au 30/04/2017, a pour objectif de définir le profil épidémiologique et moléculaire de souches isolées de patients à titre externe et de patients hospitalisés aux différents services du CHU de Sétif.

Durant cette période, 2421 souches d'entérobactéries ont été isolées dont E. coli est la souche la plus fréquente (n= 1160), suivie par K. pneumoniae (n=479) et P.mirabilis (n=216). Ces souches proviennent majoritairement du milieu hospitalier (57.71 %) et semblent coloniser les adultes plutôt que les enfants où le sexe féminin représente un facteur de risque.

Le profil de résistance de ces entérobactéries atteste d'un taux très élevé de résistance aux bétalactamines. Les valeurs maximales sont notées pour l'amoxiclline où 98.40% des

souches sont résistantes et les plus faibles résistances sont notées pour les
carbapénèmes (l'imipeneme et l'ertapeneme) et la cefoxitine.

Les 56 entérobactéries productrices de BLSE isolées durant l'année 2017 représentent 35% de la totalité des entérobactéries isolées pendant cette période. Elles sont réparties comme suit : 23 E. coli, 22 K. pneumoniae, 4 E. cloacae, 3 M. morganii, 2 S. marcescens, 1 E. aerogenes et 1 C. freundii. Elles sont plutôt issues d'infections nosocomiales (75%) que communautaires (25%). Les services les plus concernés sont l'infectieux et la néphrologie et les prélèvements les plus incriminés sont les urines et le pus.

Ces souches EBLSE ont des résistances très élevées (100%) à la majorité des â-lactamines (AMX, AMP, TIC, C3G, C4G et l'aztréonam).Alors que l'IMP, ERT, MER, AMK et FOS restent les antibiotiques les plus actifs.

Le profil plasmidique des souches EBLSE confirme qu'elles peuvent héberger de 1 à 4 types de plasmides.

70

Conclusion

La caractérisation des gènes des BLSE effectuée sur l'ADN (plasmidique ou chromosomique) de 33 souches par l'amplification multiple des gènes (CTX-M, TEM et SHV) a permis l'obtention d'une prévalence de CTX-M (87.87%) suivie de SHV (42.42%) et de TEM (27.27%). Toutefois, cinq souches (4 K. pneumoniae et 1 E. aerogenes) semblent porter les 3 gènes de résistance en même temps, indiquant la gravité de ce phénomène.

En effet, il est nécessaire de prendre des mesures de prévention pour éviter toute infection par ces germes redoutables qui sont une cause importante de morbidité et de mortalité au niveau mondiale. Pour ce faire il faut améliorer l'observance de l'hygiène des mains, diminuer la charge de travail par l'augmentation du nombre des soignants et réduire la proportion de patients recevant des antibiotiques à l'admission et la durée de traitement.

La lutte contre l'émergence et la diffusion de ces souches multirésistantes aux antibiotiques passe par une meilleure et moindre utilisation des antibiotiques. En effet, une politique d'antibiothérapie justifiée et/ou d'une restriction dans la prescription des céphalosporines de troisième génération et même de toutes les céphalosporines conduisent à une diminution significative de la fréquence des BLSE.

Enfin, les scientifiques à l'heure actuelle cherchent des alternatives qui aide à contrôler en

quelque sorte la résistance aux antibiotiques ou la réguler une bonne fois pour toute :

- L'amélioration de la structure des anciens antibiotiques,

- L'association avec des inhibiteurs des bêtalactamases d'une structure améliorée,

- L'inhibition du transfert des plasmides,

- L'utilisation des peptides antimicrobiens (PAMs),

- Le contrôle de l'activité du riborégulateur,

- L'utilisation de la nanotechnologie,

- L'utilisation des ARN interférents et

- La phagothérapie.

71

Conclusion

Figure 31. Stratégies et les cibles bactériennes utilisées pour lutter contre la résistance aux
antibiotiques (Lemaoui et al. 2017).

REFERENCES

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ANNEXE

Figure 32. Feuille de résultats d'antibiogramme.

Annexe

Figure 33. Résultat final d'un antibiogramme fait par l'automate.

Annexe

Annexe

Figure 34. La plaque utilisée par l'automate pour l'identification et l'antibiogramme.

Annexe

? Figure 35. L'automate MicroScan WalkAways.