Memoire Online - Installation d'une unité de production de biofertilisants

I.2.2.Les biofertilisants à base des bactéries solubilisatrices des éléments minéraux 4

I.2.3.Les biofertilisants à base de rhizobactéries favorisant la croissance des plantes

Introduction

Les sols sont considérés comme des systèmes dynamiques qui contiennent une variété de micro-organismes tels que les bactéries, les actinomycètes et les champignons. Le maintien de cette microflore tellurique favorable est très important pour la durabilité des sols.

Cependant, les techniques agricoles utilisées ces dernières décennies (utilisation de grandes quantités d'intrants chimiques, tassement des sols...) ont provoqué une raréfaction, voire une élimination de certaines micro-organismes bénéfiques de la plupart des sols cultivés ce qui a contribué à la perte de productivité de ces sols.

Vu le rôle fondamental joué par les micro-organismes telluriques dans la fertilité des sols, une alternative de maintien d'augmentation de leur biomasse devient une nécessité de nos jours. Cette stratégie doit viser essentiellement à réduire considérablement l'apport d'engrais chimiques de synthèse et de pesticides. De ce fait, le recours à une agriculture raisonnée paraît être la meilleure solution. L'exploitation des nouveaux outils biologiques ouvre des perspectives d'innovation et d'amélioration des systèmes de culture conduisant à minimiser les risques de pollution de l'environnement (sol, eau et air) et de contamination des aliments.

Parmi ces outils biologiques, les biofertilisants représentent une tentative dont la demande ne cesse d'augmenter. L'intérêt de ces biofertilisants réside dans la large gamme d'actions dont ils offrent à l'agronomie d'aujourd'hui. Cette diversité d'actions possède comme origine la différence de la composition des préparations biologiques. En effet, ces préparations contiennent des souches de cellules vivantes ou latentes dont certaines possèdent une action directe sur la croissance des végétaux tel est le cas des bactéries solubilatrices des éléments minéraux et d'autres ayant une action indirecte par le biais des phytohormones.

Dans ce cadre, l'installation d'une unité de production de biofertilisants en Tunisie paraît être une solution pour l'amélioration de la fertilité des sols cultivés à travers la réintroduction de micro-organismes autochtones bénéfiques.

I. Les biofertilisants

Les bactéries fixatrices d'azote ont été isolées de la rhizosphère de la majorité des plantes cultivées présentant le plus souvent un taux d'azote fixé inférieure à 20 kg par hectare et par cycle cultural (Roger et Ladha, 1992).

Ces bactéries peuvent exister soit sous forme libre (seules ou en symbiose avec d'autres bactéries du sol) soit en symbiose avec des plantes tout en assurant la fixation de l'azote atmosphérique (N2). En fonction de leur régime respiratoire, ces micro-organismes peuvent être soit aérobies soit anaérobies.

I.2.1.1. Les bactéries symbiotiques

Les rhizobiums sont des bactéries du sol qui se caractérisent par leur faculté unique d'infecter les poils absorbants des légumineuses et de produire sur les racines des nodules, siège de la fixation d'azote atmosphérique (Franche et al., 2009).

Ils sont des micro-organismes en forme de bâtonnet qui existent uniquement à l'état végétatif. Ce sont des bactéries Gram négatif. A la différence de nombreux autres microorganismes du sol, les rhizobiums ne produisent pas de spores. Ils sont aérobies et mobiles (Jordan, 1984). Le rhizobium est classé parmi les espèces économiquement importantes. Cet intérêt provient du fait de l'importance de la quantité d'azote dont il peut fixer. Cette fixation se déroule au sein des nodosités sur les racines des légumineuses (Gage, 2004).

Ces micro-organismes présentent sept genres qui sont hautement spécifiques pour former des nodules dans les légumineuses tout en indiquant que le premier inoculum rhizobial a été produit aux Etats-Unis et commercialisé par une entreprise privée dans les années 1930.

C'est une fougère flottante qui fixe l'azote atmosphérique en association avec l'algue bleue verte Anabaena azollae fixatrice d'azote. Les frondes d'Azolla se composent de sporophytes avec un rhizome flottant, de petites feuilles et des racines bilobées qui se chevauchent entre elles. Elle est utilisée comme engrais biologique pour le riz dans les zones humides en fournissant environ 40-60 kg d'N / ha par récolte de riz (Roger, 1993).

I.2.1.2. Les bactéries non symbiotiques a. Azotobacter

Il en existe plusieurs espèces d'Azotobacter. Parmi ces espèces, A. chroococcum présente l'espèce dominante dans les sols arables capable de fixer l'N2 pour une dose qui varie entre 2-15 mg N2 / g de sol à partir d'une source de carbone dans les milieux de culture (Amutha

I.2.2. Les biofertilisants à base des bactéries solubilisatrices des éléments minéraux a. Bactéries solubilisant le silicate (SSB)

Ces micro-organismes sont capables de dégrader les silicates qui sont des minéraux formés à partir d'un motif élémentaire tétraédrique (SiO4). Ils fournissent :

-Les acides organiques comme l'acide citrique, l'acide oxalique, les acides aminés et les acides hydro-carboxyliques dont le complexe avec des cations permet de promouvoir leur enlèvement et leur rétention dans le milieu à l'état dissous (Agritech, 2014).

De manière générale, les isolats bactériens fabriqués à partir de différents endroits ont un potentiel variable de solubilisation des silicates. Des études d'inoculation avec des isolats sélectionnés avec de la terre rouge, sol argileux, sable et la terre vallonnée ont montré que les organismes se multiplient dans tous les types de sol et libèrent plus de silice augmentant ainsi la disponibilité de la silice dans le sol et l'eau (Amutha et al., 2014).

I.2.3. Les biofertilisants à base de rhizobactéries favorisant la croissance des plantes (PGPR)

Les rhizobactéries sont définies comme des bactéries qui colonisent les racines ou la rhizosphère du sol et qui sont bénéfiques aux cultures (PGPR) (Beauchamp, 1993).

Ces bactéries sont actuellement commercialisées sous forme d'inoculum. Elles semblent promouvoir la croissance des cultures par plusieurs mécanismes qui sont comme suit : suppression des maladies des plantes (par des bio-protecteurs), l'amélioration de l'acquisition des éléments nutritifs (biofertilisants), ou la production de phytohormones (appelées biostimulants) (Agritech, 2014).

Des espèces comme le Pseudomonas et Bacillus élaborent des substances qui ne sont pas encore bien définies soit comme des phytohormones soit comme des régulateurs de croissance permettant aux cultures d'avoir plus de racines fines augmentant ainsi la surface d'absorption chez les plantes. Ces PGPR sont désignés comme des bio-stimulants et les

phytohormones qu'ils produisent comprennent : indole-acétique, les cytokinines, les gibbérellines et les inhibiteurs de la production d'éthylène (Agritech, 2014).

I.2.4. Les biofertilisants à base des champignons mycorhiziens arbusculaires

La mycorhize représente une association symbiotique entre des champignons telluriques et les racines des plantes. Ces associations mycorhiziennes concernent plus de 95% des plantes terrestres dont la plupart sont des plantes agricoles et horticoles (Barea et al., 1980).

Le type de symbiose est connu par sa capacité de fournir un meilleur accès aux éléments nutritifs du sol aidant ainsi les plantes à mieux résister aux stress environnementaux (sécheresse, salinité, attaque par des agents pathogènes...) de façon naturelle (Smith et Read, 2008).

En effet, les mycorhizes arbusculaires (MA) jouent un rôle considérable dans l'amélioration de la nutrition du végétal, notamment en phosphore. Bien que l'avantage principal apporté par les mycorhizes soit nutritionnel, des effets non nutritionnels sont également observés. En effet, les MA se comportent comme des bioprotecteurs en renforçant les défenses naturelles de la plante contre les bactéries et champignons phytopathogènes, et en augmentant la tolérance des végétaux à différents stress abiotiques (Van Vuuren et al., 2010).

Au-delà de ces effets bénéfiques sur le développement et la santé des plantes, le réseau mycélien extra-radiculaire qui se développe dans le sol favorise la rétention de ses agrégats, en stabilisant ainsi sa structure et sa qualité. De ce fait, les mycorhizes MA peuvent aussi être considérées comme des biostabilisants (Jeffries et al., 2003; Gianinazzi et al., 2010).

Sachant que les ressources en phosphates minéraux se raréfient, la maîtrise de la fertilisation devient une priorité dans une stratégie de gestion durable (Van Vuuren et al.,

2010). Puisque la symbiose mycorhizienne permet une meilleure nutrition phosphatée,
elle peut jouer un rôle important dans la durabilité de nos systèmes agricoles (Plenchette et al. 2005; Hijri et al. 2006).

En conclusion, cette première partie renseigne sur le large spectre d'activité des biofertilisants qui varie en fonction des micro-organismes les composant. Ceci rend le choix du produit dépendant des données agronomiques du pays et du lieu où il sera appliqué. Pour ce faire, une analyse des conditions environnementales dans les différentes régions de la Tunisie est nécessaire. En effet, la Tunisie est un pays qui se caractérise par un climat aride qui cause un déficit d'eau affectant d'une mauvaise manière l'agronomie tunisienne. En plus,

les sols tunisiens souffrent d'un appauvrissement en matière organique. Ce qui rend le stress hydrique et la pauvreté des sols tunisiens en MO les critères de base pour le choix de biofertilisants.

II. La production des biofertilisants

II.1. Production des biofertilisants à base de Rhizobium II.1.1. Isolement du nodule frais

La première étape est l'isolement des nodules sur des racines fraîches des légumineuses sont cultivées sous serre puis nettoyées avec de l'eau du robinet pour enlever toutes les saletés et les particules organiques. Ensuite, les racines sont coupées à 2-3 mm de chaque côté des nodules et afin de ne pas les endommager, l'utilisation des pinces est conseillée (Burton, 1985 ; Beck et al., 1993). Ainsi, les nodules intacts sont immergés pendant 10 secondes dans de l'éthanol à 95% ou dans l'isopropanol afin de briser la tension de surface et d'éliminer les bulles d'air. Ce traitement est suivi par un trempage dans une solution d'hypochlorite de sodium à 2.5 % pendant 4-5 minutes (Burton, 1985).

Ces nodules peuvent être aussi stérilisés superficiellement par immersion dans de chlorure mercurique (HgC12) à 0, l % pendant 3 mn ou dans une solution de peroxyde d'hydrogène (3%) (Burton, 1985). Après stérilisation, i1s sont écrasés dans une goutte d'eau stérile. Ainsi, la suspension obtenue est étalée sur le milieu Yeast Extract Manitol (YEM) composé à base de mannitol et d'extrait de levure contenu dans des boites de Pétri (Yokoyama et al., 2006).

Enfin, l'ensemble est incubé à 25-28 ° C pendant 3 à 10 jours en fonction de l'espèce jusqu'à ce que des colonies apparaissent (Burton, 1985). L'isolat d'une seule colonie de rhizobium est ensuite purifié et confirmé comme Rhizobium en démontrant sa capacité à former des nodules sur une légumineuse hôte d'essai dans des conditions contrôlées (authentification des isolats) (Burton, 1985).

II.1.2. Production de bouillon de culture

Le but de cette étape réside dans l'obtention d'une forte densité de rhizobiums dans le bouillon de culture. Cette opération est favorisée par le faite que ces micro-organismes sont connus par leur capacité à être cultivés facilement dans un milieu liquide. En revanche, ce processus est influencé par plusieurs facteurs qui sont : le milieu de culture, la souche de rhizobium, la température et l'aération (Yokoyama et al., 2006).

Il est très important d'indiquer que la stérilisation de l'ensemble de l'enceinte de croissance et du milieu ainsi que d'assurer l'inoculation du fermenteur avec la culture de Rhizobium dans un environnement stérile sont des précautions à ne pas négliger (Yokoyama et al., 2006).

Étant donné que les rhizobiums sont des bactéries aérobies, des longues expériences ont montré que ces derniers ont besoin de 5-10 litre d'air pour 1 litre de milieu de culture en une heure (Roughley ,1970). De plus, la température optimale de croissance rhizobienne est de 28 à 30°C (Patil et Alagawadi, 2010).

Le bouillon de culture doit contenir une source d'énergie qui peut être des sucres, des alcools ou certains acides. Ce milieu doit contenir aussi bien des facteurs de croissance que des vitamines. Cependant, certaines espèces peuvent produire leurs propres facteurs de croissance (Patil et Alagawadi, 2010).

Ainsi, la composition du bouillon en gramme par litre d'eau distillée est la suivante :

Ingrédients	g l-1
K2HPO4	0.5
MgSO4.7H2O	0.1
NaCl	0.2
Mannitol	10.0
Extrait de levure	0.5

Toutefois, certains laboratoires utilisent le saccharose ou l'infusion de maïs, au lieu d'ajouter le mannitol. L'ensemble du mélange doit être maintenu à un pH de 6,4 (Hémissi Zaghdoudi, 2013).

Enfin, la culture est incubée à 30 #177; 2 ° C en culture submergée avec une agitation orbitale de 150 ppm (partie par million). Cette incubation demeure jusqu'à ce que la population de cellules soit maximale de 10¹⁰ à 10¹¹ ufc (unité formant une colonie) / ml. La culture obtenue est appelée culture démarreur (Yokoyama et al., 2006).

Il reste à noter que le temps de reproduction varie en fonction des bactéries. Il est de 2 à 4 heures pour les bactéries dites « à croissance rapide » qui produisent généralement des colonies relativement grandes de 2 à 4 mm de diamètre en 3 à 5 jours et de 6 à 8 heures pour celles « à croissance lente » qui forment des colonies de 1mm de diamètre en 7 à 10 jours (Hémissi Zaghdoudi, 2013).

II.1.3. Procédures de contrôle de la qualité du biofertilisant rhizobial

Le contrôle de la qualité des biofertilisants rhizobiaux est basé sur trois types de test : - Test de culture Mère

Les qualités suivantes des échantillons de bouillon doivent être vérifiées:

I pH : Si le pH du bouillon diminue, cela signifie la présence de contaminants.

I Densité optique : Suite à la croissance des rhizobiums le bouillon de culture deviendra trouble au bout de 3-4 jours. Cette turbidité, ou la densité optique (DO) est mesurée en utilisant un spectrophotomètre (à 540 nm). La valeur de DO corrèle avec le nombre de cellules.

I Nombre total : en utilisant Petroff-Hausser une chambre de comptage pour déterminer le nombre total des cellules viables et mortes.

I Nombre viable : Le nombre de cellules vivantes est pris en compte par des procédés de propagation sur plaque de diffusion en faisant des dilutions en série 10 - 1, 10 - 6 ou 10 - 7 (dépendent de la concentration). Ensuite, trois échantillons répétés de 0,1 millilitre du bouillon 10 - 6 et 10 - 5 sont répartis sur les plaques contenant : Extrait de levure + mannitol + gélose rouge (congo). Les plaques sont incubées à (28 - 30 ° C) ou à une température ambiante pendant 7 jours. Les colonies de cellules de rhizobium sont rondes et à bord lisse. Elles sont de couleur blanche et n'absorbent pas la couleur rouge.

? Le pH : Maintenir le pH neutre pour l'inoculant. Étant donné que la tourbe est acide, le pH doit être augmenté avec du CaCO3.

? L'humidité : La teneur optimale en humidité de la tourbe-inoculant est comprise entre 40 - 50%. A basse humidité les rhizobiums vont mourir rapidement. Si l'humidité est élevée, l'inoculant peut coller au sac en plastique et, par conséquent, détériore la croissance des rhizobiums.

La révélation des infections chez les plantes peut se faire par une méthode indirecte connue par la méthode du nombre le plus probable (NPP) suite à la formation des nodules. Elle est largement utilisée lorsque la tourbe n'est pas stérile. L'inconvénient de cette technique réside dans la longue durée de l'obtention de résultat. La lecture des résultats se fait par le biais des signes où le signe + indique la présence des nodules et le signe - indique leur absence (Patiyuth et al., 2006).

II.2. Production des biofertilisants à base des champignons mycorhiziens arbusculaires

II.2.1. Méthodes de production

Le mode de production d'inoculums diffère selon la famille des champignons (Haimet, 2013). Les champignons mycorhiziens arbusculaires sont des symbiotes obligatoires strictes c'est à dire dépendants de la présence d'une plante hôte pour se développer et se multiplier. Le producteur d'inoculum est alors tenu de cocultiver le complexe « champignon-plante hôte ». Sans l'utilisation de plantes hôtes il serait impossible de mener à terme le cycle de vie du mycorhize jusqu'à la production de nouvelles propagules / spores (Haimet, 2013).

A ce jour, les deux technologies de production les plus utilisées sont : la méthode conventionnelle et la méthode in vitro.

Cette méthode consiste à multiplier le champignon mycorhizien sur des racines cultivées sur milieu synthétique en conditions stériles.

De ce fait, l'inoculum sous forme solide ou en suspension liquide pourra se composer de différents types de propagules : spores, mycélium fongique, fragments de racines mycorhizées. Un ou plusieurs types de propagules peuvent être formulés dans un même inoculum mycorhizien. De plus, les inoculums de champignons mycorhiziens peuvent contenir une ou plusieurs espèces fongiques mélangées. Les produits multi-espèces sont plus proches des conditions naturelles car dans les écosystèmes il est rare de ne rencontrer qu'une seule espèce de champignon mycorhizien. La présence de plusieurs espèces fongiques permet à l'inoculum de répondre à une plus grande diversité de conditions de culture (Italpollina, 2015).

La multiplication in vitro est souvent à moindre coût, et nécessite des systèmes plus réduits, ainsi que des milieux de culture artificiels pour des temps de production plus courts. L'utilisation de cette technologie reste utile pour les tests de laboratoire in vitro, mais l'inoculum mycorhizien ainsi obtenu (environnement artificiel sur des racines génétiquement modifiés) est mal adapté à des applications dans le domaine agricole, fournissant des résultats peu satisfaisant dans l'ensemble (Italpollina, 2015).

D'autres modes d'inoculation peuvent être pratiqués, comme le pralinage des racines et l'injection au pied des arbres (Gianinazzi, 2012). De nouvelles technologies sont aussi en développement, comme l'enrobage de graines avec des spores de champignons MA, ou leur distribution via les circuits d'arrosage. Leur réussite devrait fortement favoriser l'essor de l'utilisation des champignons MA en production végétal (Gianinazzi, 2012).

II.2.2. Processus de production par la méthode conventionnelle

Selon la publication INVAM, pour la production d'inoculum à partir des cultures monospécifiques (à base d'une seule espèce mycorhizienne), le piégeage des spores des mycorhizes arbusculaires est souvent une nécessité (Saito et al., 2006).

En effet, ces cultures pièges peuvent également aider à l'identification des champignons MA. Les spores échantillonnées directement d'une parcelle de terrain peuvent paraître en bonne santé, mais ne sont pas viables. Les spores peuvent apparaître différemment, en raison de l'altération du sol et les effets de l'environnement (Saito et al., 2006). Les cultures pièges sont importantes dans les cas suivants :

? Les pots de la culture piège sont ensuite laissés à sécher à l'ombre pour un maximum de deux semaines.

? Récolter les spores en utilisant les techniques de tamisage et de décantation.

? Les spores monospécifiques sont prêtes pour l'inoculation sur les plantules des cultures désirées (Saito et al., 2006).

II.2.3. Principales méthodes de contrôle

Plusieurs méthodes analytiques sont utilisées afin de détecter, quantifier et identifier la flore mycorhizienne (Haimet, 2013). Parmi ces méthodes on peut citer :

Ce test est couramment utilisé pour quantifier les populations microbiennes (bactéries, champignons saprophytiques) et le nombre de propagules infectieuses dans un échantillon

(Gianinazzi-Pearson et al., 1985). Il s'appuie sur des dilutions successives de l'échantillon à dénombrer puis sur la culture, en conditions contrôlées, de plantes hôtes inoculées avec chaque dilution réalisée. Ce test peut être réalisé sur un échantillon de sol, un support de culture inoculé ou un inoculum mycorhizien (Gianinazzi-Pearson et al., 1985).

Le test MPN et le taux ou la fréquence de mycorhization sont des analyses complémentaires permettant d'orienter l'agriculteur sur les pratiques culturales à adopter pour favoriser l'augmentation du potentiel mycorhizien de sa parcelle et le développement d'une symbiose mycorhizienne bien établie (Haimet, 2013).

II.3. La préparation des supports de biofertilisants

Les biofertilisants sont généralement préparés comme inoculants à base de support contenant des micro-organismes. L'incorporation des microorganismes dans un matériau de support permet : Une manipulation facile, un stockage à long terme et de haute efficacité des biofertilisants. Fondamentalement, l'inoculant transporteur basé de ces bactéries peut être préparé par une procédure commune (Senoo et Narumi, 2006).

La façon la plus courante de l'inoculation est "l'inoculation des semences", dans lequel l'inoculant (Mélange bactéries-support) est mélangé avec de l'eau bouillie, et ensuite mélangé avec des graines. Dans ce cas, le transporteur doit être sous forme de poudre fine. Pour réaliser le revêtement étanche d'inoculant sur la surface des semences, l'utilisation d'adhésif, tel que la gomme arabique, la méthyléthylcellulose, solutions de saccharose, et les huiles végétales, est recommandée (Senoo et Narumi, 2006).Tout matériau collant disponible localement, qui est non toxique pour les bactéries et les graines, peut être utilisé comme adhésif.

L'inoculation de graines n'est pas toujours couronnée de succès. Cela peut être dû à la faible densité de population et / ou faible taux de survie de la souche bactérienne ou de la spore inoculée sur la surface des graines et dans le sol. Dans un tel cas, «l'inoculation du sol" sera adoptée (Senoo et Narumi, 2006). Pour l'inoculation du sol en général, l'inoculant granulaire est placé dans le sillon sous ou à côté de la semence. Cela améliore la chance pour la souche inoculée d'être en contact avec les racines des plantes (Van Veen et al., 1997).

Une grande variété de matériaux utilisés comme transporteurs a été mis au point pour améliorer la survie et l'efficacité biologique des inoculants en protégeant les microorganismes de stress biotiques et abiotiques (Van Veen et al., 1997).

Un support approprié devrait être peu coûteux, facile à utiliser, miscible, emballable, et disponible. En outre, le transporteur doit permettre l'échange de gaz, notamment de l'oxygène, et sa teneur en matière organique et sa capacité de rétention d'eau doivent être élevées (Bashan, 1998 ; Ben Rebah et al., 2002). Selon Somasegaran and Hoben (1994) un bon matériau de support doit être non toxique, soit aux inoculants ou à la plante elle-même. En outre, Stephens et Rask (2000) et Ferreira et Castro (2005) ont déclaré que les transporteurs devraient avoir un pH neutre ou facilement réglable, être localement abondante à un coût raisonnable et capable d'être stériliser.

Parmi les transporteurs qui peuvent soutenir des niveaux élevés de la charge microbienne, la tourbe est considérée comme le support le plus utilisé (Burton, 1967 ; Peterson et Loynachan, 1981) , mais n'est pas universellement disponible (Tilak et Subba Rao, 1978).

Alternativement, différents matériaux tels que les sous-produits industriels, les déchets organiques, les sols minéraux, les sous-produits végétaux, le charbon, la perlite et les déchets agro-industriels ont été testés comme milieu de culture pour la croissance microbienne (Brockwell et Bottomley, 1995 ; Stephens et Rask, 2000).

Un support peut être un matériau, tels que la tourbe, la vermiculite, la poudre de lignite, l'argile, le talc, le son de riz, le phosphate de roche granulé, le charbon de bois, le sol, le compost de paille de riz ou de blé ou un mélange de ces matériaux (Brar et al., 2012).

Dans la pratique courante, pour une meilleure durée de vie de la formulation de biofertilisant, un transporteur ou un mélange de tels matériaux de support sont choisis sur la base de la viabilité des micro-organismes mélangés avec eux. De même, la pré-stérilisation de la matière de support et son enrichissement en éléments nutritifs est l'autre stratégie pour améliorer la durée de conservation, en permettant de maintenir le micro-organisme dans un micro-environnement non compétitif (Stephens et Rask, 2000). Le saccharose, le maltose, le tréhalose, la mélasse, le glucose et le glycérol sont des nutriments supplémentaires et des agents protecteurs de cellules couramment utilisées avec un matériau de support pour assurer la viabilité cellulaire maximale et la durée de conservation prolongée.

La stérilisation des matériaux support est essentielle pour garder un nombre élevé de micro-organismes inoculés sur le support pendant une longue période de stockage (Senoo et Narumi, 2006).

III. Conception de l'unité de production de biofertilisants

L'installation d'une unité de biofertilisants doit obéir à certains critères comme : la production appropriée, l'emplacement, l'espace de construction, les équipements, les machines, autre matériel de laboratoire et fonds de roulement (Biomate india, 2008).

III.1. Le plan

Ce plan a été élaboré par un logiciel d'architecture disponible sur Internet nommé Kozikaza (figure 1).

L'unité s'étend sur une superficie totale de 1429.12 m² dont deux tiers sont réservés aux laboratoires de production.

III.2. Le bâtiment

Le bâtiment doit être fondé dans une zone homogène sur la base de l'interaction des caractéristiques de sols, de la géomorphologie et du climat. Cet endroit doit être qualifié de tampon pour réduire les risques de contamination au cours du processus de contrôle de la production et de la qualité.

Le bâtiment reste l'infrastructure la plus importante. L'architecture globale présente l'élément clé pour la réussite de la production de biofertilisants. Pour ce faire, elle doit être organisée dans une architecture en H. Le choix de cette architecture repose sur le fait de son aspect économe en surface et sa capacité de s'adapter au processus de stérilisation avec marche en avant, autrement dit partir du « souillé », pour aller vers le « propre » et ensuite vers le « stérile », sans possibilité de retour en arrière et sans croisement de flux de « souillé » et de « propre » (Biomate india, 2008).

La notion de stérilisation est consolidée par le biais d'un couloir de circulation placé entre les deux espaces de multiplication. Il dispose d'un système de traitement d'air pour autoriser la circulation des personnels en tenues professionnelles. La stérilisation est accentuée par la présence des portes qui sont munies de panneaux transparents, ayant une résistance au feu convenable et comportant de préférence un système de fermeture automatique (OMS, 2005).

? 2 laboratoires : une destinée à la production des biofertilisants à base de bactéries et l'autre réservée à la production des biofertilisants à base des mycorhizes arbusculaires.

III.3. L'administration

et techniques de réaliser leurs missions dans les meilleures conditions tout en respectant les directives et règles administratives. Pour atteindre ces objectifs, différentes tâches doivent être mise en oeuvre dont les principales sont : préparation, mise en oeuvre du budget et contrôle de

son exécution, achats et procédures d'appel d'offre, contrats et convention, gestion du

personnel de l'unité, élaboration et suivi du plan de formation, accueil physique

et téléphonique, courrier et mise en oeuvre et suivi des règles d'hygiène et de sécurité (Atilf,

III.4. Les laboratoires

Un laboratoire doit être construit par des murs, des plafonds et des sols lisses, faciles à nettoyer, imperméables aux liquides et résistants aux désinfectants utilisés dans le laboratoire. Les revêtements de sol doivent être antidérapants. Ensuite, pour garantir le bon déroulement du travail, l'étendu du laboratoire doit être suffisamment spacieux (OMS, 2005).

? Un système de ventilation mécanique assurant un flux d'air dirigé vers l'intérieur sans recyclage.

? Une alimentation électrique doit être fiable et de puissance suffisante; il faut prévoir un éclairage de secours permettant de sortir en cas de nécessité.

? Une alimentation en gaz de ville doit être fiable et suffisante. Il est impératif d'assurer le bon entretien de cette installation

? Une installation des lavabos, si possible avec l'eau courante, dans chaque salle du laboratoire, de préférence près de la porte.

? Une installation de systèmes de protection physique et de sécurité anti-incendie doit être envisagée.

Enfin, il faut prévoir la place et les moyens matériels permettant de manipuler et d'entreposer sans danger les solvants, les substances radioactives ainsi que les gaz comprimés et liquéfiés.

III.4.1. Laboratoire de production des biofertilisants à base de Rhizobium

Cette unité de production est formée par une serre et plusieurs salles : une salle d'isolement des souches bactériennes, une salle de multiplication de l'inoculum bactérien, une salle de conditionnement, une salle de contrôle de qualité et une salle de stockage des inoculums bactériens. L'ensemble s'étend sur une superficie totale de 414.22 m².

Cette salle de superficie 46.56 m² est consacrée à l'isolement des nodules, qui sont extraits à partir des racines fraîches des légumineuses cultivées sous serre. Les racines sont nettoyées et coupées en 2-3 mm de chaque côté des nodules. Ces derniers sont stérilisés superficiellement pour être écrasés par la suite dans une goutte d'eau stérile (Burton, 1985 ; Beck et al, 1993).

La production du milieu doit tenir compte des exigences des rhizobiums en énergie, en azote, en certains sels minéraux et en facteurs de croissance (Yokoyama et al., 2006). Ce cursus est pratiqué dans des récipients de différentes tailles qui sont ensuite passés à l'autoclave pour être stérilisés. Cette stérilisation est également nécessaire pour tous les équipements de cette chambre. La notion de stérilisation s'étend pour atteindre l'air d'admission qui sera véhiculé par un compresseur accompagné par des filtres stériles (Yokoyama et al., 2006).

Au niveau de cette salle de superficie de 42.77 m², un mélange entre le support stérile avec la culture bactérienne sera effectué dans un sac stérile de polypropylène et thermoscellé (Yokoyama et al., 2006).

Chaque sachet du support doit être pré-stérilisé de façon aseptique puis injecté avec la culture au moyen d'une seringue munie d'une aiguille stérile. A ceci s'ajoute, une machine automatique de distribution (seringue automatique) est utilisée afin d'augmenter le taux de production. Une fois le mélange est préparé, le trou de perforation sera immédiatement scellé avec une étiquette autocollante pré imprimé. Les sacs sont ensuite malaxés à la main ou par un agitateur jusqu'à ce que l'inoculum liquide sera absorbé uniformément dans le transporteur (Yokoyama et al., 2006).

Il reste à indiquer que si le matériau de support contient des nutriments disponibles pour le développement des bactéries (par exemple le sol minéral), l'injection de culture de départ des cellules bactériennes avec de l'eau stérile pour le réglage de l'humidité est suffisante.

Cette chambre occupant une superficie de 47.94 m² est dédiée à réaliser trois types de tests de contrôle de qualité du produit : le test de culture Mère, le test de Bouillon et le test de la tourbe (support)

Ces tests sont assurés par un certain nombre de matériels tels que le microscope, le pH-mètre et le spectrophotomètre (figure 3).

Les résultats ainsi obtenues sont introduites dans une base de données. Par défaut, tous les documents concernant la production de biofertilisants sont stockés de manière centralisée sur le serveur web de l'unité, sauvegardés sur un disque dur séparé sur le même ordinateur, et mémoriser sur un autre ordinateur dans le laboratoire.

III.4.2. Laboratoire de production des biofertilisants à base de mycorhizes

L'usine de production du biofertilisant est formée par plusieurs salles occupant une superficie totale de 519.09 m² et dont la disposition est comme suit : en amont de la serre de multiplication de l'inoculum mycorhizien, une salle de séchage et de conditionnement de l'inoculum est installée suivie successivement par une salle d'isolement des souches mycorhiziennes. En outre, l'usine renferme une salle de contrôle de qualité et une salle de stockage des inoculums mycorhiziens.

La serre garantie la maximisation de la productivité des cultures en optimisant la relation entre la croissance des plantes hôtes et la biomasse des mycorhizes. Elle présente l'espace le plus étendu avec une superficie de 203.27 m² (figure4). Pour que les plantes soient indemnes de maladies, la culture doit se faire dans des pots ou dans des contenaires (INVAM, 2012).

Dans ce cadre, la plupart des cultures sont cultivées pendant 3 à 4 mois pour minimiser l'accumulation de saprophytes dans le milieu de croissance excessive et de la sénescence des racines. Toutefois, une culture maintenue plus que 5 mois et un arrosage réglementé est recommandé (INVAM, 2012).

Cette chambre est complètement isolée de toutes les zones de culture de plantes ainsi que l'usage du sol non stérilisé est strictement interdit (INVAM, 2012). Elle occupe un espace de 40.55 m².

- Les spores sont obtenues suite à une décantation de l'échantillon tamisé (INVAM, 2012).

? Les tables et les étagères sont nettoyées avec une éponge humide ou une serviette. d. Salle de contrôle de qualité

Cette salle occupant 47.66 m² de superficie est consacrée pour effectuer des tests de contrôle (figure 6). Ces tests englobent le dénombrement des spores, l'évaluation du niveau de colonisation des racines, le test MPN et l'examen microscopique des spores isolées dont le nombre varie entre 10 à 15 pots par jour. Une fois extraites, les spores sont transportées dans des boîtes de Pétri en verre et conservés dans le réfrigérateur du laboratoire. En effet, l'examen est réalisé par un stéréo microscope le jour de l'extraction.

Les informations ainsi récupérées sont stockées dans une base de données et toutes les notes écrites sont archivées comme une sauvegarde physique. De façon systématique, tous les dossiers ayant traité la collecte de la culture sont stockés de manière centralisée sur le serveur web de l'unité, sauvegardés sur un disque dur séparé sur le même ordinateur, et mémoriser sur un autre ordinateur dans le laboratoire (INVAM, 2012).

Le stockage se fait dans un espace de 65.13 m² à une atmosphère de 4°C au niveau des étagères de racks métalliques (figure 7). Ces dernières sont caractérisées par des surfaces maillées pour optimiser la circulation d'air autour de toutes les cultures tout en facilitant leur nettoyage. Les racks sont placés au centre de la pièce et équipés par des roues pour faciliter leur déplacement. La durée de stockage peut atteindre 3 ans au maximum (INVAM, 2012).

I La surface des sacs et celle des étiquettes de sacs doit être nettoyée de toute poussière avant qu'ils ne soient placés dans cette salle.

I Les planchers et les étagères sont régulièrement nettoyés avec un chiffon ou une éponge humide.

I Les cultures doivent être stockées dans un coin du laboratoire où la température de l'air ne soit pas préjudiciable à la viabilité champignon.

IV-Etude économique

Notre projet consiste à mettre en place une unité de production de biofertilisants. Ce projet est installé pour couvrir le déficit biologique des sols tunisiens qui ne cesse d'augmenter année après année.

? Un intérêt écologique et environnemental : maintenance de la diversité biologique

? Un intérêt agronomique : effets bénéfiques aussi bien sur le rendement que la qualité des produits agricoles.

De plus, le marché tunisien est dépourvu d'un tel projet d'après une enquête établie auparavant du ministère de l'agriculture. Ceci garantie plus de chance de réussite à notre projet. En effet, l'absence des concurrents nous rend un leader dans ce type de production en Tunisie.

Pour satisfaire tous les dépenses de notre unité, nous allons adopter une stratégie de financement qui se fait à raison de 30% sur fonds propres du responsable de l'exploitation et 70% sous forme d'emprunts au taux d'intérêt annuel de 12% remboursable en 4 ans.

Dans le même contexte, notre projet sera installé dans une zone de l'intérieur du pays afin de profiter des remboursements que l'état offre pour les projets installés dans ces zones. En outre, l'innovation de notre projet ainsi que sa vision écologique nous offre des subventions établies dans ce cadre.

Basé sur les différents paramètres technico-économiques, une description des éléments de revenus et ceux de dépenses peut être établie. En effet, les éléments de revenus comprennent la vente des biofertilisants alors que ceux de dépenses comprennent le coût des matières

premières, du transport et de la commission, d'emballage, des salaires, les réparations et l'entretien, l'assurance, la publicité et autres frais généraux.

Actif		Passif
Actif immobilisé *Immobilisations corporelles*	60 000DT 80 000DT 50 000DT 20 000DT	Financement permanent Capitaux propres	70 000DT 105 000DT 80 000DT
Terrain Constructions Installations techniques, matériels et outillage Matériel de transport		Capital social *Capitaux propres et assimilés*
		Subvention d'investissement *Dettes de financement*
		Emprunts obligatoires
Total 1	210 000DT	Total 1	255 000DT
Actif circulant Matières premières Approvisionnements : emballages,... Production en cours Créances	15 000DT 10 000DT 10 000DT 20 000DT	Passif circulant Dettes fournisseurs Dettes fiscales et sociales	45 000DT 50 000DT
Total 2	55 000DT	Total 2	95 000DT
Trésorerie active Caisse, chèques bancaires et postaux	120 000DT	Trésorerie passive Concours bancaires et Soldes bancaires créditeurs	35000DT
Total3	120 000DT	Total3	35 000DT
Total général (1) + (2) + (3)	385 000DT	Total général (1) + (2) + (3)	385 000DT

Etant donné que l'idée de notre projet est considérablement nouvelle par rapport à l'esprit de l'agriculteur tunisien, le recours à l'exportation est une stratégie fortement conseillée.

En effet, au départ le fait de se limiter uniquement à la production locale parait être un risque vu les caractéristiques particulières que porte notre agriculture. De ce fait, un taux de 30 % d'export peut être suffisant au début.

Une fois la production est mise en oeuvre, une stratégie de marketing doit être réalisée. Pour ce faire, nous utiliserons simultanément plusieurs circuits (vente directe, vente à des grossistes, grandes surfaces, vente à des collectivités). Ce travail est assuré par un représentant commercial. Pour les intermédiaires, nous décidons de leur donner des

promotions et de leur offrir une facilité de paiement afin de pousser la vente. De plus, nous organiserons des sessions de formations à nos personnels (représentants commerciaux) et faire contrôler la force de vente pour prendre les décisions adéquates au moment opportun.

Cette politique de commercialisation peut être également élargie par des publicités publiées à la télé ou à la radio. A ceci s'ajoute, des affiches publicitaires et des prospectus peuvent être utilisés. De plus, on peut adopter une stratégie de porte à porte afin de garantir la bonne connaissance de notre produit auprès des agriculteurs.

En conclusion, nous allons installer des points de vente au niveau des grands rassemblements agronomiques afin de faciliter l'accès à nos produits et de fournir des services rapide et précis.

Conclusion

Les biofertilisants à base de mycorhizes arbusculaires et de rhizobiums d'origine tunisienne peuvent être un remède face à l'appauvrissement de nos sols et la chute de leur fertilité. L'importance de ces micro-organismes prend naissance de leurs capacités à augmenter la teneur des éléments minéraux présents dans le sol et d'améliorer la résistance des végétaux aux stress environnementaux. Pour cela, l'installation d'une unité de production de biofertilisants locaux devient une nécessité en Tunisie.

Etant donné que les principaux biofertilisants à base des micro-organismes qui n'appartiennent pas à la même famille, la production de chaque type de biofertilisant va adopter des étapes différentes. Pour cette raison, l'architecture de notre unité est basée sur la séparation des deux laboratoires afin d'éviter les contaminations entre les micro-organismes formant les fertilisants. Cette séparation est favorisée par la mise en place d'un couloir de circulation dont les caractéristiques sont en faveur de notre objectif.

En plus, l'emplacement des salles au niveau de chaque compartiment est réalisé de sorte que le traitement des produits sera réalisé en une atmosphère indemne de toute contamination afin de garantir une meilleure qualité à nos produits tel est le cas de la salle de séchage des mycorhizes. Le stockage des produits occupe à son tour un rôle important dans la réussite de notre unité. En effet, un stockage réalisé avec les précautions nécessaires assure d'une part la survie des micro-organismes donc l'efficacité biologique des inoculums est également procurée et d'autre part le stockage à long terme devient une perspective possible. Ceci est garanti par le biais de l'usage des supports appropriés peu coûteux, facile à manipuler, emballables et disponibles.

En conclusion, notre projet d'installation d'une unité de production de biofertilisants à base de micro-organismes autochtones est le premier de son genre en Tunisie. C'est un projet qui peut participer dans l'amélioration de la fertilité des sols cultivés et d'assurer la durabilité de la production agricole Tunisienne.

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