Memoire Online - Etude de la toxicité systémique de l'extrait aqueux du mélange des plantes Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale chez le rat

Tous les animaux ont été pesés peu de temps avant le début du traitement, puis tous les 7 jours, et enfin le jour du sacrifice. Les variations pondérales hebdomadaires étaient calculées et enregistrés. La formule utilisée pour le calcul était :

II.3.2.6. Hématologie et biochimie clinique

Les animaux ont été mis à jeun durant la nuit qui a précédé la prise de sang. A la fin de la période d'essai, des échantillons de sang arteroveineux ont été prélevés au cours du sacrifice des animaux, une partie dans des tubes à héparine, et l'autre partie dans des tubes secs de 5 ml. Le sang contenu dans ces derniers a été centrifugé pour obtenir le sérum. Avec le sang contenu dans les tubes à héparine, les examens hématologiques de Numération Formule Sanguine (NFS) ont été effectués : hématocrite, concentration d'hémoglobine, numération des érythrocytes et des réticulocytes, numération et formule leucocytaire, numération des plaquettes. Le sérum obtenu a été utilisé pour des dosages biochimiques, effectués conformément aux protocoles fournis avec les kits commerciaux Fortress Diagnostics révisés en octobre 2007. Il s'agit:du cholestérol total, du HDL-cholestérol, des triglycérides, de la créatinine, de la bilirubine totale, de l'alanine aminotransférase (ALAT), et de l'aspartate aminotransférase (ASAT). Les protéines totales ont aussi été dosées, à l'aide de la méthode du Biuret décrite par Gornall et al., (1949).

-Principe du test : Le cholestérol est présent dans le sérum sous la forme d'esters de cholestérol et de cholestérol libre. Les esters de cholestérol présents dans le sérum sont hydrolysés par la cholestérol-esterase puis le cholestérol est mesuré en l'oxydant avec la cholestérol-oxydase pour produire du peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène à son tour réagit avec le phénol et le 4-amino-antipyrine en présence de la peroxydase pour produire la quinoneimine à coloration rouge. L'intensité de la coloration produite est directement proportionnelle à la concentration de cholestérol dans l'échantillon.

Tampon :	50 mmol/l
Cholestérol oxydase :	> 100 UI
Cholestérol Estérase :	> 150 UI
4-aminoantipyrine :	0,3 mmol/l
Péroxydase :	> 800 UI
Phénol :	6,0 mmol/l
Standard Cholestérol :	200 mg/dl

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit :
	Réactif blanc	Standard/Echantillon
Eau distillée	10 ul	-
Standard/Echantillon	-	10 ul
Réactif	1000 ul	1000 ul
Les préparations ont été homogénéisées puis incubées pendant 10 minutes à 20-25°C. Puis l'absorbance des standard et échantillons a été lue contre celle du réactif blanc.

- Principe du test :Les LDL sont précipités par addition de l'acide phosphotungstique en présence des ions magnésium. La fraction HDL reste dans le surnageant et est déterminée par le dosage du cholestérol.

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit :
		Macro	Semi Micro
Échantillon		500 ul	200 ul
Précipitant HDL		1000 ul	-
Précipitant dilué		-	500 ul
Les préparations ont été homogénéisées puis incubées pendant 10 minutes à température ambiante. Elles ont ensuite été centrifugées à 4000 trs/mn. Le contenu en cholestérol a été déterminé dans le surnageant clair dans les 2 heures qui suivaient, par la méthode CHOD-PAP.
PROCEDURE DU CHOD-PAP CHOLESTEROL : Un seul réactif blanc a été utilisé par série. Le Pipetage s'est fait dans les tubes d'essai comme suit :
	Réactif blanc	Standard	échantillon
Eau distillée	100 ul	-	-
Surnageant	-	-	100 ul
Standard	-	100 ul	-
Réactif	1 ml	1 ml	1 ml
Les préparations ont été homogénéisées puis incubées 10 minutes à température ambiante. Puis l'absorbance du standard et des échantillons a été lue contre celle du réactif blanc dans l'heure.

- Principe du test :Les triglycérides sont hydrolysés par la lipoprotéine lipase pour donner le glycérol et des acides gras. Puis, par l'action successive de la glycérol kinase en présence de Mg²⁺ et de la glycérol phosphatase en présence d'ATP, le glycérol est convertit en dihydroxyacétone phosphate et peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène à son tour réagit avec le chlorophénol et le 4-amino-antipyrine en présence de la peroxydase pour produire le 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone coloré. L'intensité de la coloration produite est directement proportionnelle à la concentration de triglycérides dans l'échantillon.

Tampon :	Tampon pH 7.8	50 mmol/l
	p-chlorophénol	2 mmol/l
	Lipoprotéine Lipase	150000 U/l
	Glycérolkinase	800 U/l
	Glycérol-3-P-oxydase	4000 U/l
	Peroxydase	440 U/l
	4-aminoantipyrine	0,7 mmol/l
	ATP	0,3 mmol/l
	Mg²⁺	40 mmol/l
	Na-cholate	0,20 mmol/l
	Potassium-Hexacyanoferrate(II)	1 umol/l
Standard :	Concentration de triglycérides de 200 mg/dl	2,24 mmol/l

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit :
	Réactif blanc	Standard/échantillon
Eau distillée	10 ul	-
Standard/Echantillon	-	10 ul
Réactif	1000 ul	1000 ul
Les préparations ont été homogénéisées puis incubées pendant 10 minutes à 20-25°C. Puis l'absorbance des standard et échantillons a été lue contre celle du réactif blanc.

- Principe du test :La créatinine réagit avec l'acide picrique en milieu alcalin pour former un complexe jaune intense. La quantité de complexe formé est directement proportionnelle au taux de créatine dans l'échantillon.

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit :
	Standard/échantillon
Standard/échantillon	100 ul
Réactif de travail	1 ml
Les préparations ont été homogénéisées. Puis l'absorbance des standard et échantillons a été lue après 30 secondes puis encore après exactement 120 secondes.

Le changement dans l'absorbance de l'échantillon/standard (Äabs) = abs. à 150 secondes - abs. à 30 secondes.

- Principe du test :La bilirubine totale réagit avec le 2,4-dichloroaniline pour former l'azobilirubine. La bilirubine liée à l'albumine est libérée par un détergent.

Réactif DCA :	Détergent	58 g/l
	HCl	80 mmol/l
	2,4-dichloroaniline	3.0 mmol/l
Nitrite de sodium :		2.5 mmol/l
Réactif blanc :	Détergent	29 g/l
	HCl	40 mmol/l
	2,4-dichloroaniline	1.5 mmol/l

Le réactif DCA (dichloroaniline) est mélangé à égal volume avec le réactif nitrite.

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit :
	échantillon	échantillon blanc
échantillon	100 ul	100 ul
Réactif de travail	1000 ul	-
Réactif à blanc	-	1000 ul
Les préparations ont été homogénéisées et laissées pendant 10 minutes à température ambiante, à l'abri de la lumière. Puis l'absorbance des échantillons a été lue contre celle de l'échantillon blanc dans les 60 minutes.

La méthode du Biuret décrite par Gornall et al., (1949) a été utilisée pour doser les protéines sériques.

- Principe : En milieu basique, le tartrate forme avec le sel cuivrique un complexe soluble. L'addition d'une protéine déplace le cuivre complexé pour former un autre complexe cuivro-protéique de couleur violette. L'intensité de coloration est proportionnelle à la concentration des protéines dans la solution à doser.

Les tubes utilisés pour le dosage des protéines ont été préparés et complétés avec les différents réactifs suivant l'ordre présenté dans le tableau IIIci-après.

N° tube	0	1	2	3	4	5	6	X₁	...	X_n
SAB (5 mg/mL)	0	0,25	0,5	0,75	1	1,25	1,75	0	...	0
Eau distillée (mL)	3	2,75	2,5	2,25	2	1,75	1,25	2,95	...	2,95
Réactif de Biuret (mL)	2	2	2	2	2	2	2	2	...	2
Sérum (uL)	0	0	0	0	0	0	0	50	...	50
Quantité de protéines (mg)	0	1,25	2,5	3,75	5	6,25	7,5	?	...	?

Tube 0 : tube blanc ; Tube 1 à 5 : tubes étalons ; Tubes X1 à Xn : tubes échantillons

Dans une série des tubes à essai a été introduit successivement 50 uL de sérum puis 2 ml de la solution de Biuret. L'ensemble a été homogénéisé par le vortex et incubé pendant 20 minutes à température ambiante. Dans le tube témoin, le sérum a été remplacé par l'eau distillée. L'absorbance est lue à 540 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (type Genesis) contre le témoin. La concentration des protéines dans les différents tubes échantillons a été déterminée à partir de la courbe d'étalonnage réalisé avec une solution de SAB (Figure 6).

Figure 6 : Courbe d'étalonnage du dosage des protéines par la méthode de Biuret

- Principe du test :Le dosage repose sur le transfert enzymatique médié parL'ALAT d'un groupement amine de la L-alanine au á-oxoglutarate pour obtenir le L-glutamate et le pyruvate.

Tampon :	Tampon phosphate	100 mmol/l
	L-alanine	200 mmol/l
	á-oxoglutarate	2,0 mmol/l
Réactif coloré :	2,4-dinitrophenyl hydrazine	2,0 mmol/l
Standard pyruvate :	Pyruvate	2,0 mmol/l
Hydroxyde de sodium :		4,0 mol/l

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit (37°C):
	Réactif blanc	Test
Echantillon	-	100 ul
Tampon ALAT (R1)	500 ul	500 ul
Eau distillée	100 ul	-
Les préparations ont été homogénéisées et incubées pendant exactement 30 minutes à 37°C dans un bain-marie.
Réactif coloré ALAT (R2)	500 ul	500 ul
Les préparations ont été homogénéiséeset incubées pendant exactement 20 minutes à température ambiante.
NaOH (dilué)	5,0 ml	5,0 ml
Les solutions ont été homogénéiséespuis l'absorbance a été lue contre le réactif blanc après 5 minutes. L'activité de l'ALAT correspondante à la densité optique lue s'est faite via la courbe d'étalonnage de (Figure 7).

- Principe du test :Le dosage repose sur le transfert enzymatique médié par l'ASATd'un groupement amine de la L-aspartate au á-oxoglutarate pour obtenir le L-glutamate et l'oxaloacétate.

Tampon :	Tampon phosphate	100 mmol/l
	L-aspartate	200 mmol/l
	á-oxoglutarate	2,0 mmol/l
Réactif coloré :	2,4-dinitrophenyl hydrazine	2,0 mmol/l
Standard pyruvate :	Pyruvate	2,0 mmol/l
Hydroxyde de sodium :		4,0 mol/l

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit (37°C):
	Réactif blanc	Test
Echantillon	-	100 ul
Tampon ASAT (R1)	500 ul	500 ul
Eau distillée	100 ul	-
Les préparations ont été homogénéiséeset incubées pendant exactement 30 minutes à 37°C dans un bain-marie.
Réactif coloré ASAT (R2)	500 ul	500 ul
Les préparations ont été homogénéisées et incubées pendant 20 minutes à température ambiante.
NaOH (dilué)	5,0 ml	5,0 ml
Les solutions ont été homogénéisées puis l'absorbance a été lu contre le réactif blanc après 5 minutes. L'activité de l'ASAT correspondante à la densité optique lue s'est faite via la courbe d'étalonnage (Figure 8).

Etude de la toxicité systémique de l'extrait aqueux du mélange des plantes Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale chez le rat

II.3.2.5. Poids corporels

II.3.2.6. Hématologie et biochimie clinique