Memoire Online - Etude de la toxicité systémique de l'extrait aqueux du mélange des plantes Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale chez le rat

Ce travail n'a pu être réalisé que grâce à l'intervention de plusieurs personnes que je me dois de remercier. Il s'agit :

- de mes parents, BAYIHA Valentin et NGAMBI Marie Rose, à qui je suis reconnaissant pour le soutien tant moral que financier qu'ils m'ont octroyé jusqu'à présent ;

- du Pr KAMTCHOUING Pierre qui a bien voulu m'intégrer dans son unité de recherche et diriger ce travail ;

- du Dr DZEUFIET DJOMENI Paul Désiré, dont l'assistance personnelle a été plus qu'essentielle tout au long de ce travail ;

- du corps enseignant du département de Biologie et Physiologie Animales de l'Université de Yaoundé I pour les connaissances prodiguées ;

- de mes aînés de laboratoire, en particulier : KADA SANDA Antoine, ATSANG A Kiki Gisèle, TEMDIE Romeo Joël, ABOUBAKAR O. Bibi-farouck, BELLA NDZANA Martin Thierry, NDAYOU Zacharie Achille et KEMETA AZAMBOU David ;

- du reste de ma famille, en particulier mes soeurs NGAMBI BAYIHA Marie Charlène et BAYIHA Françoise Chaveli ;

et de tous ceux qui ont participé de près ou de loin à la réalisation de ce travail et dont les noms auraient involontairement été omis. Qu'ils voient dans ce travail l'expression de ma sincère reconnaissance.

SOMMAIRE

Remerciements............................................................................................	i
Sommaire..................................................................................................	ii
Listes des figures.............................................................................................	iii
Liste des tableaux.........................................................................................	iii
Liste des abréviations....................................................................................	iv
Résume.....................................................................................................	v
Abstract....................................................................................................	vi
INTRODUCTION.......................................................................................	1
CHAPITRE I : REVUE DE LA LITTERATURE.................................................	3
I.1. Les plantes d'essai...............................................................................	4
I.1.1. Aframomum melegueta K. Schuman (Zingiberacées).................................	4
I.1.2. Mondia whitei (Hook. F.) Skeels (Periplolacées).....................................	5
I.1.3. Piper guineense Schum. et Thonn (Piperacées).......................................	6
I.1.4. Zingiber officinale Roscoe (Zingiberacées)............................................	8
I.2. Principes de toxicologie.................................................................................	10
I.2.1. Notion de toxicologie....................................................................	10
I.2.2. Les voies d'exposition aux produits toxiques..........................................	10
I.2.3. Le cheminement d'un toxique dans l'organisme......................................	12
I.2.4. L'effet toxique............................................................................	14
I.2.5. Les manifestations toxiques : description par quelques organes cibles............	17
I.2.6. L'évaluation des effets toxiques........................................................	19
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES...................................................	23
II.1. Le matériel végétal.............................................................................	24
II.1.1. Préparation de l'extrait.....................................................................	24
II.1.2. Préparation des solutions d'essai..........................................................	25
II.2. Les animaux....................................................................................	26
II.3. Protocole expérimental........................................................................	26
II.3.1. Toxicité orale aiguë.........................................................................	26
II.3.2. Toxicité orale subchronique.........................................................................	28
CHAPITRE III : RESULTATS........................................................................	42
III.1. Toxicité orale aiguë...........................................................................	43
III.1.1. Effets de l'extrait sur l'aspect général, le comportement, et la mortalité des animaux ...........................................................................................................	43
III.1.2. Effets de l'extrait sur le poids corporel..............................................	43
III.1.3. Autopsie générale........................................................................	44
III.2. Toxicité orale subchronique.....................................................................	44
III.2.1. Effets de l'extrait sur la mortalité, l'aspect général, et le comportement des animaux...................................................................................................	44
III.2.2. Effets de l'extrait sur le poids corporel................................................	45
III.2.3. Effets de l'extrait sur quelques paramètres hématologiques et biochimiques...	47
III.2.4. Pathologie...................................................................................	48
CHAPITRE IV : DISCUSSION.....................................................................	54
CONCLUSION..........................................................................................	60
Références................................................................................................	62
Annexe.......................................................................................................	69

LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Feuilles (a), fruits (b) et Graines (c) de Aframomum melegueta.....................	4
Figure 2 : Feuilles (a), inflorescences (b), et racines (c) de Mondia whitei.....................	5
Figure 3 : Feuilles (a) et graines (b) de Piper guineense...........................................	7
Figure 4 : Plante entière (a), et rhizome (b) de Zingiber officinale................................	8
Figure 5 : Schéma du procédé utilisé pour l'extraction aqueuse du mélange de Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale...............................	25
Figure 6 : Courbe d'étalonnage du dosage des protéines par la méthode de Biuret............	37
Figure 7 : Courbe d'étalonnage de l'activité ALAT................................................	38
Figure 8: Courbe d'étalonnage de l'activité ASAT...............................................	39
Figure 9 : Evolution des poids corporels en essai aiguë...........................................	44
Figure 10 : Evolution des poids corporels chez les survivants mâles (A) et femelles (B) en essai subchronique.......................................................................................	45
Figure 11 : Microphotographies des coupes de foie normal (Témoin) (a), de foie avec congestions vasculaires (100 mg/kg) (b), de foie légèrement enflammé + dilatation des capillaires sinusoïdes (200 mg/kg) (c), de foie enflammé (Toutes les doses) (d)...............	50
Figure 12 : Microphotographies de coupes de rein normal (Témoin) (a), de rein présentant une clarification tubulaire (200 mg/kg) (b) ou une inflammation (400 mg/kg) (c).............	51
Figure 13 : Microphotographie de coupes d'un poumon enflammé (Toutes les doses).......	52
Figure 14 : Microphotographie de coupe d'un ovaire normal.................................	52
Figure 15 : Microphotographie de coupe de testicule présentant un grand nombre de cellules rondes (Toutes les doses)......................................................................	53

LISTE DES TABLEAUX

LISTE DES ABREVIATIONS

ICCVAM:Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods

OCDE/OECD : Organisation de Coopération et de Développement Economique/ Organisation of Economic Corporation and Development

RESUME

Le mélange des plantes Aframomum melegueta,Mondia whitei, Piper guineense et Zingiber officinale est traditionnellement utilisé pour la prise en charge de l'infertilité masculine et de l'impuissance sexuelle. Afin de déterminer les risques pour la santé humaine associés à cette utilisation, une évaluation de la toxicité de l'extrait aqueux du mélange en prises unique et quotidiennes a été réalisée chez le rat conformément aux lignes directrices 423 et 407 de l'OCDE pour les essais de produits chimiques. En prise unique, une dose de 2000 mg/kg de la substance a été testée uniquement chez les femelles, plus sensibles à la létalité des substances. En prises quotidiennes (33 jours), 3 doses (100, 200, et 400 mg/kg) et un groupe témoin ont été employés, la dose de 100 mg/kg représentant la dose thérapeutique estimée chez le Rat. Pour chaque dose, 10 animaux (5 par sexe) étaient utilisés. En essai aiguë, aucun changement majeur lié au traitement n'a été observé sur toute la durée d'observation. La DL₅₀ a été estimée supérieure à 2,5 g/kg, ce qui a permis de classer l'extrait comme substance faiblement toxique. En essai subchronique, 4 animaux (2 mâles et 2 femelles) sur 28 sont morts des suites du traitement (200 et 400 mg/kg) durant la période d'essai. Les animaux concernés présentaient avant leur décès de la léthargie, de la tachypnée, de la maigreur, et une fourrure hérissée. Une des femelles survivantes (400 mg/kg) présentait en plus des symptômes sus-cités une réduction des facultés nociceptive, auditive, et préhensile. L'autopsie des animaux a révélé des atteintes sur le foie dans les deux sexes (200 et 400 mg/kg). Une réduction du poids relatif des poumons (400 mg/kg) a été notée chez les femelles. Les analyses hématologiques et sériques à la fin de l'essai ont révélé une réduction de la concentration moyenne en hémoglobine corpusculaire (400 mg/kg), une réduction du cholestérol sérique total (200 et 400 mg/kg), et une augmentation dose-dépendante du taux d'ASAT sérique chez les femelles. Les analyses histopathologiques quant à elles ont révélé des inflammations hépatiques et pulmonaires liés au traitement à toutes les doses chez les femelles. En conclusion, la consommation quotidienne de l'extrait aqueux du mélange des quatre plantes d'essai à dose thérapeutique ne semble pas présenter de risques important pour la santé masculine, soutenant ainsi l'utilisation traditionnelle de l'extrait. Cependant, une éventuelle utilisation quotidienne à des doses plus élevées exposerait le mâle à des affections sérieuses, notamment hépatiques et nerveuses.

Mots clés :Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, Zingiber officinale, toxicité, OCDE.

ABSTRACT

The mixture of Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense and Zingiber officinale is traditionally used for the management of male infertility and erectile dysfunction. To determine the risk to human health associated with the use of this substance, an assessment of the toxicity of the aqueous extract of the mixture taken in single and daily doses was performed in rats according to the OECD guidelines 423 and 407 for the testing of chemicals. In single dose, the test substance was tested only in females, more susceptible to substances lethality. In daily doses (33 days), 3 doses (100, 200, and 400 mg / kg) and a control group were used, the dose of 100 mg/kg being the therapeutic dose estimated in rats. For each dose, 10 animals (5 per sex) were used. In acute test, no major changes related to treatment were observed throughout the observation period. The LD₅₀ was estimated above 2.5 g/kg, which was used to classify the extract as a slightly toxic substance. In subchronic test, 4 animals (2 males and 2 females) of 28 died as a result of treatment (200 and 400 mg/kg) during the test period. The animals concerned presented symptoms of toxicity like lethargy, tachypnea, thinness, and bristling fur prior to death. One of the surviving females also exhibited the symptoms mentioned above, associated with a reduction of nociceptive, auditory, and prehensile capacities (400 mg/kg). Autopsy of animals showed liver damage in both sexes (200 and 400 mg/kg). A reduction in the relative lung weight (400 mg/kg) was noted in females. The blood and serum at the end of the trial showed a reduction in mean corpuscular hemoglobin concentration (400 mg/kg), reduced serum total cholesterol (200 and 400 mg/kg) and a dose-dependent increased on serum AST levels in females. The histopathology revealed liver and lung inflammations related to treatment at all doses in females. In conclusion, the daily consumption of the aqueous extract of the mixture of the four test plants in therapeutic doses does not seem to have significant health risks for male, supporting the traditional use of the extract. However, any daily use at higher dose exposes male to serious ailments, including liver and nervous ones.

Keywords:Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, Zingiber officinale, toxicity, OECD.

L'intérêt des populations pour la phytothérapie n'a cessé de croitre au fil des années. Ceci se comprend quand on considère les nombreux aspects positifs qu'elle présente. On peut citer : sa diversité,sa souplesse, sa disponibilitédans de nombreuses parties du monde, son faible coût, son faible niveau de participation technologique, et son importance économique grandissante(OMS, 2002). Cet engouement manifeste pour la phytothérapie ne tient cependant pas compte de certains aspectsde celle-ci qui apparaissent encorepour la communauté scientifiquecomme des défis à surmonter. C'est le caspar exemplede son innocuité etde son efficacité. En effet,les preuvesrecueilliesqui soutiennent ces 2 aspects, comme par exemple le recours au long des siècles à grand nombre de pratiques préconisées par la médecine traditionnelle en général et l'expérience transmise de génération en génération,sont jugées trop insuffisantes tant sur le plan quantitatif que qualitatif pour répondre aux critères requis dans le but d'en soutenir l'usageà l'échelle mondiale.Des recherches scientifiques sont toujours nécessaires pour étayer ces constatations(OMS, 2000). C'est dans ce contexte que le Laboratoire de Physiologie Animale de l'Université de Yaoundé I s'est spécialisé dans l'étude des propriétés pharmacologiques et toxicologiques des plantes médicinales.

Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale sont 4 exemples de plantes médicinales, traditionnellement utilisées comme aphrodisiaques. Des études antérieures onteu à justifier cet usage traditionnel (Kamtchouing et al., 2002a ; Kamtchouing et al., 2002b ; Watcho et al., 2005) et à évaluer la toxicité de chaque plante (Nebojsa et al., 2010; Raji et al., 2003; Mascolo et al., 1989; Watcho et al., 2005;...). Ces 4 plantes en mélange sont aussi utiliséespour traiter les infertilités masculines et l'impuissance sexuelle. Des études ont déjà eu à justifierles propriétés pharmacologiques présumées de ce mélange (Dokou-gaïn, 2010),mais aucune donnée sur la toxicité du mélange n'est disponible. Ce manquement a suscité la mise en oeuvre de ce travail qui consistait à étudier la toxicité de l'extrait aqueux du mélange chez le rat,avec pour objectif principal de mettre en évidence les dangers potentiels pour la santé humaine associés à sa consommation.Plus spécifiquement, il s'agissait de classer l'extrait dans une gamme de toxicité via un essai de toxicité aiguë chez les femelles, plus sensibles à la létalité des substances ;et d'obtenir des informations sur les effets nocifs éventuels dus à la consommation quotidienne du produit via un essai de toxicité subchronique dans les deux sexes.

I.1.LES PLANTES D'ESSAI

I.1.1.Aframomum melegueta K. Schum. (Zingibéracées)

Aframomum melegueta K. Schum (Fig. 1) est une épice originaire de l'Afrique tropicale de l'ouest (Iwu, 1993), localisée principalement dans les régions tropicales. Au Cameroun, elle est rencontrée dans les régions du centre, du sud, de l'est, de l'ouest, et du littoral (Noumi et al., 1998). Elle est communément appelée « maniguette ».

Figure 1 : Feuilles (a), fruits (b) et graines (c) de Aframomum melegueta (photos issues desfiches de PROTABASE, 2011)

I.1.1.1.Phytochimie

Il a été rapporté queAframomum melegueta contient des alcaloïdes (piperine), des huiles essentielles, et des résines (Lachman-White et al., 1992). L'analyse chimique des graines a montré que les extraits méthanolique et hexanique sont riches en 6-paradol, 6-gingérol, et 6-shogaols (Ghana Herbal Pharmacopeia, 1992 ; Escoubas et al., 1995 ; Juliani et al., 2007). Le gingerdione a aussi été isolé (Tane et al., 2005).

I.1.1.2. Usages traditionnels

En Afrique de l'ouest et en Afrique centrale en général, les fruits frais sont utilisés comme aphrodisiaques, et la décoction de racine est utilisée par les mères nourricières pour contrôler la lactation et l'hémorragie postpartum (Iwu, 1993). Les rhizomes sont utilisés dans le traitement de la dysenterie et de la diarrhée (Dokosi, 1998), tandis que les graines sont mâchées pour soigner la dysenterie, comme sédatif contre les maux de dents, pour se protéger du rhumatisme et des migraines, et pour soigner la fièvre (Simon et al., 2007).

I.1.1.3. Données pharmacologiques et toxicologiques

L'extrait aqueux des graines deAframomum melegueta est un stimulant sexuel chez le rat (Kamtchouing et al., 2002b). Aframomum melegueta a présenté une activité anti-diarrhéique (Umukoro et Ashorobi, 2003) et anti-inflammatoire (Umukoro et Ashorobi, 2005 ; Okoli et al., 2007). Les graines de Aframomum melegueta auraient une activité hypotensive chez l'Humain (Lawal et al., 2007). L'extrait à l'éthanol des graines serait hypoglycémiant chez le rat (Nebojsa et al., 2010).

I.1.2. Mondia whitei (Hook. F.) Skeels (Périplocacées)

Cette plante (Fig. 2)est connue sous les dénominations de racine tonique, ou white ginger. Elle est largement distribuée en Afrique tropicale.Au Cameroun, elle est surtout retrouvée dans les régions du sud et de l'est (Watcho et al., 2005).

Figure 2 : Feuilles (a), inflorescences (b), et racines (c) de Mondia whitei(Acquaye et al., 1999)

I.1.2.1. Phytochimie

Des études chimiques sur des extraits de racines de Mondia whiteiont montré un alcaloïde inconnu et le 2-hydroxy-4-méthoxybenzaldehyde (Kubo et Kinst-Hori, 1999). La 5-chloropropacine a aussi été retrouvé dans les racines (Patnam et al., 2005). Dans la fraction organique de l'extrait brut au méthanol des racines, les composés suivants ont également été isolés : squalène, â-sitostérol, 6-méthoxy-7-hydroxycoumarine, 6-méthoxy-7,8-dihydroxycoumarine, propacine (Lamidi et Bourobou Bourobou, 2010).

I.1.2.2. Usages traditionnels

Dans toute l'Afrique, les racines sont très appréciées comme aphrodisiaque, pour traiter les dysfonctions sexuelles, prévenir l'éjaculation précoce et augmenter la production de sperme. La décoction ou l'infusion de racine ou d'écorce de racine se prend couramment pour traiter les affections gastro-intestinales, maux d'estomac et indigestions (Lamidi et Bourobou bourobou, 2010)

I.1.2.3. Données pharmacologiques et toxicologiques

Les extraits à l'hexane et au méthanol ontmontré une activité anti-inflammatoire(Lamidi et Bourobou Bourobou, 2010). L'extrait aqueux de l'écorce des racines à 400 mg/kg/jour administré par voie orale pendant 8 jours a augmenté la production de testostérone et la fertilité de rats mâles (Watcho et al., 2004). Dans une étude in vitro, l'extrait à l'hexane de la racine a fait ressortir un effet relaxant sur les contractions du spermiducte de rat induites à l'adrénaline et au KCl(Lamidi et Bourobou Bourobou, 2010). Une étude in vivo des effets de l'extrait à l'hexane à des doses de 500 et 1000 mg/kg/jour sur la concentration intratesticulaire en cholestérol, sur les caractéristiques hématologiques et sur la sensibilité à la norépinéphrine du canal déférent isolé de rat a montré un effet androgènique réversible (Watcho et al., 2005). Des spermatozoïdes humains ont été incubés in vitro avec l'extrait aqueux des racines et on a découvert que l'extrait stimulait aussi bien la motilité totale que la motilité progressive(Lamidi et Bourobou Bourobou, 2010).

La DL₅₀ de l'extrait aqueux des racines est supérieure à 15 g/kg pour les souris. Une administration par voie orale d'un extrait d'écorce de racine à 400 mg/kg/jour pendant 55 jours a provoqué des lésions testiculaires donnant lieu à un arrêt de la spermatogenèse, des modifications dégénératives dans les tubules séminifères et l'épididyme. Ce traitement a également eu pour conséquence un effet contraceptif partiel. Après une période de rétablissement, la spermatogenèse et la fécondité étaient normales, ce qui fait penser que les effets antispermatogène et contraceptif sont réversibles. L'huile volatile des racines entraîne une inflammation et une rougeur de la peau, une irritation des muqueuses et relâche les muscles lisses dans les intestins des mammifères (Lamidi et Bourobou Bourobou, 2010).

I.1.3. Piper guineense Schum. et Thonn (Pipéracées).

Cette plante (Fig. 3) est communément appelée poivre de guinée, poivre ashanti, poivre noir d'Afrique de l'Ouest, ou poivre noir tout court. C'est une espèce des forêts denses humides, dispersée de la Guinée en Ouganda (Adjanahoun et al., 1996). Au Cameroun, Piper guineense se retrouve dans les régions du Centre, du Littoral, de l'Ouest et de l'Est (Noumi et al., 1998).

Figure 3 : Feuilles (a) et graines (b) de Piper guineense(Photos prises par Karlostachys, 2009)

I.1.3.1. Phytochimie

L'huile essentielle serait constituée de myristicine, sarisan, safrone, et elemicine comme constituants majeurs, et de 51 mono et sesquiterpenoïdes comme composant mineurs (Ekundayo et al., 1988). Le goût piquant des fruits serait dû à la présence de résines variées, en particulier la chavicine et un alcaloïde jaune, la pipérine, qui constitue 5-8% du poids du poivre noir (Rehn et Espig, 1991 ; Lale, 1992). Onyenekwe et al. (1997) ont isolé de l'huile volatile des fruits de Piper guineense 45 composant dont les plus dominants étaient le â-caryophellene, le germacrene-D, l'á-ylangene, le limonene et le myrcene.

I.1.3.2. Usages traditionnels

Au Cameroun, Les feuilles de Piper guineense sont utilisées pour le traitement des maladies respiratoires et la correction des problèmes d'infertilité féminine. Les graines sont utilisées comme aphrodisiaques (Noumi et al., 1998 ; Mbongue et al., 2005). Au Nigéria, les graines sont consommées par les femme après l'accouchement pour amplifier les contractions utérines pour l'expulsion du placenta (Udoh et al., 1999), comme adjuvant dans le traitement des douleurs rhumatismales, comme antiasthmatique (Sofowora, 1982), contre le vomissement, les angines, et les douleurs d'estomac (Ndukwu et Ben-Nwadibia, 2005).

I.1.3.3. Données pharmacologiques et toxicologiques

Une activité anti-convulsivante de Piper guineense a été rapportée (Abila et al., 1993). Les extraits de feuilles et des graines ont montré une activité dépolarisante neuromusculaire (Udoh et al., 1999). Il a été rapporté que les extraits du poivre noir stimulaient la digestion des aliments en stimulant la sécrétion d'enzymes digestives : l'amylase pancréatique, la trypsine, et la chymotrypsine (Platel et Srinivasan, 2000). Il a été montré que l'extrait aqueux de Piper guineense est un stimulant sexuel chez le rat (Kamtchouing et al., 2002b). L'extrait aqueux des fruits stimulerait les sécrétions des testicules, de l'épididyme, et des vésicules séminales (Mbongue et al., 2005). Les grains de poivre noir contracte les muscles lisses gastro-intestinaux du Cochon d'Inde (Saba et Tomori, 2007).

L'extrait à l'éthanol des fruits a présenté une DL₅₀ de 1122 mg/kg par voie orale chez le rat ainsi que des ulcères gastriques (Raji et al., 2003). L'extrait aqueux des fruits de Piper guineense réduit de 20% la fertilité des rats mâles après 55 jours de traitement à la dose 122.5 mg/kg (Mbongue et al., 2005). L'extrait à l'éthanol des graines de Piper guineense semble inhiber la mise en place de la gravidité chez les souris, et provoque des inflammations testiculaires et ovariennes (Ekanem et al., 2010).

I.1.4. Zingiber officinale Roscoe (Zingibéracées)

Cette plante (Fig. 4) est encore connue sous l'appellation de gingembre. La culture de cette plante a commencée en Asie du sud, puis s'est étendue à l'Afrique de l'est et aux Caraïbes. Au Cameroun elle est retrouvée dans les régions du Nord, du Centre, du Littoral, de l'Ouest, du Nord-ouest, et de l'Est (Noumi et al., 1998).

Figure 4 : Plante entière (a), et rhizome (b) de Zingiber officinale (photos issues deIBIS médical, 2011)

I.1.4.1. Phytochimie

Plus de 50 composés de l'huile volatile ont été caractérisés. Ce sont principalement des monoterpenoïdes [b-phellandrène, (+)-camphene, cineole, geraniol, curcumene, citral, terpineol, borneol] et des sesquiterpenoïdes [a-zingiberene (30-70 %), b-sesquiphellandrene (15-20 %), b-bisabolene (10-15 %), (E-E)-a-farnesene, arcurcumene, zingiberol]. Le goût piquant du gingembre frais est dû essentiellement aux gingérols, dont le plus abondant est le 6-gingérol. Le goût piquant du gingembre sec résulte principalement des shogaols (Ali et al., 2008).

I.1.4.2. Usages traditionnels

Le gingembre est l'une des épices les plus utilisées dans le monde, spécialement dans les pays sud-est asiatiques. C'est aussi une plante médicinale qui a été largement utilisée dans les médicaments chinois et ayurvédiques, depuis l'antiquité, pour un large ensemble de maux tels que les constipations, les indigestions, l'hypertension, et les helminthiases. (Dedov et al., 2002; Jiang et al., 2006; Ali et al., 2008).Au Cameroun, Zingiber officinale est souvent utilisé comme aphrodisiaque et comme stimulant sexuel chez l'homme (Noumi et al., 1998).

I.1.4.3. Données pharmacologiques et toxicologiques

L'extrait à l'acétone du gingembre améliore le transit intestinal du repas au charbon chez des souris (Yamahara et al., 1990). L'extrait aqueux du gingembre aurait des propriétés androgéniques chez le rat (Kamtchouing, 2002a). L'extrait aqueux du gingembre administré oralement à la dose 50 mg/kg pendant 4 semaines chez des rats aurait une activité anti-thrombotique et anti-inflammatoire (Thomson et al., 2002). L'extrait brut induit une chute de la pression artérielle dose-dépendante chez le rat anesthésié, montre une activité cardiodépressive sur la fréquence et la force des contractions chez le cobaye, et relâche la contraction de l'aorte thoracique de lapin et de rat induite par la phényléphrine (Ghayur et Gilani, 2005). L'extraitau méthanol des rhizomes secs du gingembre produit une réduction significative des taux élevé de l'hyperlipidémie fructose-induite, du poids corporel, de l'hyperglycémie, et de l'hyperinsulinémie chez le rat (Kadnur et Goyal, 2005). Les mêmes extraits administrés à des souris pendant 8 semaines réduisaient les taux élevés de glucose et d'insuline, suggérant ainsi une activité insulinosensibilisante du gingembre (Goyal et Kadnur, 2006). L'extrait aqueux des rhizomes de Zingiber officinale possèderait des propriétés pro-fertilisante chez les rats mâles (Morakinyo et al., 2008).

La DL₅₀ de l'huile de gingembre chez le rat est supérieure 5 g/kg (Mascolo et al., 1989).Le gingembre peut causer des brûlures d'estomac et, à des doses supérieures à 6 g, peut être un irritant gastrique (Desai et al., 1990). L'exposition in utero au thé de gingembre chez le rat (15, 20, 50 g/l) entraine une élévation des pertes précoces d'embryon avec une élévation de la croissance chez les foetus survivants (Wilkinson, 2000). Chez l'Homme, le gingembre peut entrainer des reflux gastriques (Anonymous, 2003).Zingiber officinale, à de fortes doses, peut entrainer des arythmies cardiaques et une dépression du système nerveux central (Gruenwald, 2004). L'inhalation de la poudre de gingembre peut produire une allergie Ig-E médiée (Chrubasik et al., 2005). L'administration orale de 400 mg de gingembre 3 fois par jour pendant 2 semaines chez 12 volontaires humains sains a montré une légère diarrhée (1/12) pendant les 2 premiers jours de traitement (Ali et al., 2008).

I.2.PRINCIPES DE TOXICOLOGIE

I.2.1. Notion de toxicologie

La toxicologie est l'étude des substances toxiques et, plus précisément, l'identification et l'évaluation quantitative des conséquences néfastes liées à l'exposition à des agents physiques, chimiques ou de toute autre nature (Silbergeld, 2000). Comme telle, elle fait appel, tant pour ses connaissances que pour sa démarche de recherche ou ses méthodes, à la plupart des sciences biologiques fondamentales, aux disciplines médicales, à l'épidémiologie et à divers domaines de la chimie et de la physique. Elle s'étend de la recherche fondamentale sur le mécanisme d'action des agents toxiques à la mise au point et à l'interprétation de tests normalisés permettant de caractériser les propriétés toxiques de ces agents. Elle fournit à la médecine et à l'épidémiologie des informations indispensables pour comprendre l'étiologie et établir le lien entre les expositions, y compris professionnelles, et les pathologies observées.

I.2.2. Les voies d'exposition aux produits toxiques

L'organisme doit être exposé à un produit toxique pour qu'un effet nocif se manifeste. Dans ce cas, le produit peut agir au point de contact (effet local) ou pénétrer dans l'organisme (effet systémique). Un produit peut être absorbé par plusieurs voies (Lapointe, 2004) :

I.2.2.1. La voie respiratoire

Les alvéoles respiratoires constituent le principal site d'absorptiondes voies respiratoires, en particulier pour les gaz (monoxyde de carbone, oxydes d'azote, dioxydes de soufre) et les vapeurs de liquides volatils (benzène, tétrachlorure de carbone). L'absorption est d'autant plus rapide que le gaz est soluble dans le sang. Les particules atmosphériques quant à elles sont différemment absorbées et éliminées en fonction de leur dimension. Selon leur taille, les particules peuvent atteindre différents niveaux de l'arbre respiratoire, les plus grosses sont rapidement éliminées au niveau du tractus supérieur, alors que les plus petites sont soit aspirées vers le haut et éliminées par la toux, soit absorbées dans les voies lymphatiques ou le sang (Tron et al., 2002).

I.2.2.2. La voie cutanée

La peau est une barrière qui recouvre la surface du corps et qui le protège. Cette enveloppe protectrice fait obstacle à la pénétration de nombreux contaminants. Toutefois, cette barrière n'offre pas une protection complète, car elle présente des failles, dont la base des poils et les pores. C'est un passage important, puisque plusieurs toxiques peuvent pénétrer dans l'organisme en traversant la peau à la suite d'un contact avec un liquide, un solide ou des vapeurs. L'absorption cutanée est influencée par de nombreux facteurs tant physico-chimiques (ex. : pureté, grosseur de la molécule, solubilité) qu'individuels (ex. : hydratation de la peau, présence de lésions cutanées) et anatomiques (ex. : endroit du corps mis en contact avec le toxique) (Lapointe, 2004).

I.2.2.3. La voie digestive

En général les toxiques pénètrent dans le tube digestif avec l'eau, les aliments ou isolément. En dehors de produits particulièrement caustiques, les effets ne se produisent qu'après absorption. Au niveau du tube digestif ce sont l'estomac et l'intestin(duodénum, intestin grêle) qui sont les sites d'absorptionprincipaux. Dans l'estomac les acides faibles, à l'inverse des bases faibles, sont facilement diffusibles. Dans l'intestin ce sont les bases faibles qui sont les plus facilement absorbées. D'autre part à ce niveau, des phénomènes de transport actif peuvent intervenir pour certains toxiques (thallium, plomb)(Tron et al., 2002).

I.2.2.4. Les autres voies

Il existe d'autres voies d'entrée appelées parentérales, d'une importance généralement moindre : les injections intraveineuses (IV), sous-cutanées (SC), intra-péritonéales (IP) et intramusculaires (IM). D'une façon générale, ces voies parentérales permettent une absorption plus rapide et plus complète des substances, surtout dans le cas de la voie intraveineuse. On obtient alors des pics de concentration de courte durée, mais élevés, à l'origine d'une plus forte toxicité de la dose administrée(Holmberg et al., 2000).

I.2.3. Le cheminement d'un toxique dans l'organisme

Un produit qui pénètre dans l'organisme peut avoir des effets bénéfiques ou néfastes. Inversement, l'organisme peut agir sur ce produit : c'est ce qu'on appelle le métabolisme. Plusieurs facteurs interviennent dans les processus d'action toxique, notamment les phases toxicodynamiques et toxicocinétiques (Lapointe, 2004) :

· La toxicodynamie s'intéresse à l'influence qu'exerce un toxique sur l'organisme et aux facteurs qui interviennent dans la réponse toxique.

· La toxicocinétiques'intéresse à l'influence qu'exerce l'organisme sur un toxique. Cette influence découle des processus (l'absorption, la distribution, le métabolisme, l'élimination) qui gouvernent le cheminement du toxique dans l'organisme.

I.2.3.1. L'absorption

On appelle absorption le processus de pénétrationd'un produit dans l'organisme. Il s'agit d'une étapeimportante, car, tant qu'il n'a pas pénétré dans lacirculation sanguine, un produit ne peut causerd'action toxique systémique.L'absorption peut se dérouler sur 3 sites principaux : le tube digestif, essentiellement au niveau de l'estomac et de l'intestin ; les poumons au niveau des alvéoles pulmonaires ; etla peau au niveau de l'épiderme et du derme (Tron et al., 2002).

I.2.3.2. La distribution

Après avoir atteint la circulation sanguine, le produit peut être transporté dans tout l'organisme. C'est ce qu'on appelle la distribution. En plus de l'oxygène, de divers éléments nutritifs essentiels au fonctionnement de l'organisme et des déchets, le sang transporte aussi des toxiques. Ceux-ci peuvent alors entrer en contact avec des cellules et se fixer dans certains tissus ou organes. Ainsi, les pesticides organochlorés comme le DDT se concentrent dans les tissus adipeux. Ils peuvent y rester emmagasinés sans causer d'effets toxiques pendant une période plus ou moins longue. En revanche, ils peuvent causer des effets toxiques dans d'autres tissus ou organes où ils sont présents en quantités moindres. La nature, l'intensité et la localisation de ces perturbations dans l'organisme diffèrent d'un produit à l'autre et dépendent souvent de la dose.Lors de leur transport sanguin, les toxiques peuvent être liées aux hématies, aux composants plasmatiques, ou se trouver à l'état libre non liées dans le sang. Le monoxyde de carbone, l'arsenic, le mercure organique et le chrome hexavalent ont une forte affinité pour les hématies, alors que le mercure inorganique et le chrome trivalent montrent une prédilection pour les protéines plasmatiques. De nombreuses autres substances sont également liées aux protéines plasmatiques. Seule la fraction libre est disponible pour la filtration et la diffusion vers les organes d'élimination. Ainsi, la liaison sanguine peut faire augmenter la durée du séjour dans l'organisme et diminuer la captation tissulaire au niveau des organes cibles(Lapointe, 2004 ; Holmberg et al., 2000).

I.2.3.3. La biotransformation (métabolisme)

Pendant ou après son transport dans le sang, le toxique peut entrer en contact avec différentes cellules de l'organisme qui ont la capacité de le transformer. L'ensemble des réactions de la transformation métabolique est appelée biotransformation, tandis que les produits de la biotransformation sont appelés métabolites. Deux types de réactions sont observés :

· Réactions de phase 2 : production d'un conjuguéou d'un métaboliteà partir du toxique d'origine.

Il peut en résulter un produit moins toxique (détoxification) ou plus toxique (activation), l'accumulation ou l'élimination du produit et de ses métabolites.La transformation des toxiques est surtout effectuée par le foie, véritable laboratoire chimique de l'organisme, qui contient une multitude d'enzymes. Il enrichit le sang d'éléments nutritifs et le purifie en concentrant et en éliminant beaucoup de substances. D'autres organes tels que les poumons et les reins peuvent aussi transformer des toxiques grâce aux enzymes métabolisant les toxiques(Lapointe, 2004 ; Tron et al., 2002).

I.2.3.4. L'excrétion

Ce processus consiste à rejeter le produit inchangé ou ses métabolites à l'extérieur de l'organisme. L'excrétionpeut se faire par voie rénale (l'urine), gastro-intestinale (les selles), pulmonaire (l'air expiré), cutanée (la sueur) ou lactée (le lait) (Lapointe, 2004).

I.2.4. L'effet toxique

I.2.4.1. Notion d'effet toxique

Lorsqu'un individu absorbe des produits chimiques, divers effets biologiques peuvent se produire et se révéler bénéfiques ou néfastes. La notion d'effet toxique suppose des conséquences nocives pour l'organisme. L'absorption d'une substance en faible quantité peut s'avérer très toxique et provoquer des lésions graves, tandis que l'absorption en grande quantité d'une autre substance peu toxique peut produire un effet bénin. L'effet toxique est ainsi lié à la notion de toxicité. Il s'agit de la capacité inhérente à une substance chimique de produire des effets nocifs chez un organisme vivant et qui en font une substance dangereuse.

L'effet néfaste est lié à la dose, à la voie d'absorption, au type et à la gravité des lésions ainsi qu'au temps nécessaire à l'apparition d'une lésion. Un effet aigu se fait sentir dans un temps relativement court, tandis qu'un effet chronique ne se manifeste qu'après un temps d'exposition relativement long et de façon permanente(Lapointe, 2004).

I.2.4.2. Comment survient et évolue un effet toxique

Ø L'atteinte toxique : Les organismes fonctionnent dans des conditions relativement constantes (pH, oxygène, autres). C'est ce que l'on appelle l'homéostasie ou la constance du milieu intérieur. Les organismes vivants cherchent à maintenir cet équilibre afin de conserver un degré optimal de fonctionnement. Le corps humain est un ensemble de systèmes finement rodés qui peut s'adapter à de nombreuses situations d'agression, tant biologiques que physiques ou chimiques. Les processus d'adaptation de l'organisme fonctionnent continuellement pour veiller à maintenir cet équilibre. Quand cet équilibre est perturbé, cela entraîne un dysfonctionnement, c'est l'effet toxique. Il y a alors mobilisation d'une partie de l'organisme et parfois de tout l'organisme ; des réactions diverses sont déclenchées pour répondre à l'agression et rétablir l'équilibre rompu. L'organisme peut résister à une agression toxique en autant qu'elle s'effectue à l'intérieur des limites de ses mécanismes de détoxication, d'homéostasie et de réparation. Au delà, les mécanismes de compensation ne peuvent suffire à la tâche. Le système de défense ne peut alors contrer les effets toxiques et des manifestations, réversibles ou non, peuvent s'ensuivre (Lapointe, 2004).

Ø Les effets fonctionnels et lésionnels : Les effets causés par un toxique peuvent se traduire en changements fonctionnels ou lésionnels. Les premiers touchent l'atteinte transitoire d'une fonction de l'organisme ou d'un organe sans créer de lésions et ils sont généralement réversibles. Les seconds causent une lésion à un ou à plusieurs tissus ou organes sans que le sujet présente des signes cliniques et sont souvent irréversibles. Enfin, des altérations biochimiques peuvent également se produire sans être accompagnées de changements morphologiques apparents (Lapointe, 2004).

Ø La réversibilité et l'irréversibilité : Certains effets toxiques sont réversibles tandis que d'autres sont irréversibles. Des changements adaptatifs causés par un produit chimique dans un tissu ou un organe peuvent être accompagnés de changements fonctionnels et morphologiques. De tels changements peuvent être réversibles si on prévient ou arrête l'exposition. Cependant, dans certains cas, l'interruption de l'exposition n'est pas suivie d'une récupération. Il s'agit alors de changements irréversibles. Ainsi, pour un tissu tel que celui du foie, qui a une importante capacité de régénération, la majorité des atteintes sont réversibles ; au contraire, elles sont généralement irréversibles lorsqu'il s'agit d'une atteinte du système nerveux central, les neurones ne pouvant pas être facilement remplacés (Lapointe, 2004).

I.2.4.3. La dose et ses relations avec les effets toxiques

Un principe important en toxicologie veut que toutes les substances chimiques soient toxiques, car il existe toujours une dose pouvant causer un effet nocif. La dose est la quantité d'une substance à laquelle un organisme est exposé. Des doses croissantes résultent généralement en une augmentation de l'intensité et de la diversité des effets toxiques. C'est ce qu'on appelle la relation dose-effet ou exposition-effet. La notion de seuil toxique est importante, car elle peut servir à fixer des normes. La valeur seuil représente la quantité minimale sous laquelle il ne se produit pas d'effet. Au-dessus de ce seuil, l'effet observé dépend de la dose, et ce, bien qu'il y ait théoriquement des exceptions. Ce seuil s'explique par le fait que le corps humain est constitué d'un grand nombre de cellules, de tissus et d'organes ayant une sensibilité variable et qu'il possède des mécanismes de défense ou d'adaptation. Le même principe s'applique à une population d'individus, car l'effet ou les nombreux effets possibles peuvent se manifester différemment chez plusieurs personnes exposées à une même dose d'un toxique. C'est la relationdose-réponse, ou la relation entre l'exposition et le nombre d'individus qui présentent un effet donné(Lapointe, 2004).

I.2.4.4. Facteurs influençant les effets toxiques

Ø La toxicité : Les toxiques ne présentent pas tous le même degré de toxicité. Certains ont une faible toxicité, même si on les absorbe en grande quantité, par exemple le sel de table, tandis que d'autres ont une forte toxicité, même si on en absorbe de faibles quantités, notamment les dioxines. On peut en partie expliquer de telles variations par les différences qui existent entre la structure chimique des substances. Ces différences peuvent affecter la capacité des substances à perturber le fonctionnement de l'organisme. De plus, les caractéristiques physico-chimiques, par exemple la grosseur des poussières, la volatilité et la solubilité dans l'eau, interviennent également dans la réponse toxique (Lapointe, 2004).

Ø L'individu :Deux principales catégories de facteurs individuels contribuent à expliquer la nature et l'intensité des effets toxiques (Lapointe, 2004):

-Facteurs génétiques :Des différences génétiques peuvent intervenir dansla capacité des individus à transformer des toxiques.

· L'âge : La sensibilité aux effets toxiques est habituellement plus grande chez les enfants et les personnes âgées.

· Le sexe : Il existe des différences entre les hommes et les femmes, notamment en ce qui concerne le métabolisme des toxiques.

· L'état nutritionnel : La toxicité peut être influencée par la masse de tissus adipeux, la déshydratation, etc.

· L'état de santé : Les individus en bonne santé sont plus résistants, car ils métabolisent et éliminent les toxiques plus facilement que ceux qui souffrent de maladies hépatiques ou rénales.

· La grossesse : Il se produit des modifications de l'activité métabolique des toxiques au cours de la grossesse.

Ø L'environnement : Certains facteurs environnementaux, peuvent influencer la toxicité. La lumière et la température peuvent notamment modifier les effets d'un toxique. Mentionnons comme exemple la réaction photoallergique au cours de laquelle la peau exposée à l'éthylène diamine peut devenir plus sensible à la lumière. L'exposition simultanée ou séquentielle à plusieurs produits peut entraîner des conséquences imprévues qui peuvent différer de la somme des réponses causées par chacun des composants du mélange. C'est ce que l'on appelle une interaction toxicologique. Il existe différents termes pour décrire les interactions toxicologiques (Lapointe, 2004) :

· Addition (additivité) : la réponse est égale à la somme des réponses des substances prises individuellement, il n'y a pas d'interaction.

· Synergie : la réponse est supérieure à la somme des réponses des substances prises individuellement.

· Potentialisation : elle se produit lorsqu'une substance ayant peu ou pas de toxicité augmente la réponse d'une autre substance.

· Antagonisme : la réponse est inférieure à la somme des réponses des substances prises individuellement.

I.2.5. Les manifestations toxiques : descriptionparquelques organes cibles

I.2.5.1. L'hépatotoxicité

C'est une atteinte du foie. Le foie est un organevital, tout comme le coeur et les poumons. Il remplitde multiples fonctions et son rôle est très importantdans le maintien de l'équilibre général. Il participeà la digestion, à l'emmagasinage des aliments ainsiqu'à la détoxication, en aidant l'organisme à sedébarrasser de ses poisons, et à l'élimination. Ila un rôle important dans la transformation dessubstances circulant dans le sang, dont lessubstances toxiques qui y sont véhiculées et quidans plusieurs cas peuvent y être neutralisées (Lapointe, 2004).

Les atteintes du foie sont complexes et diverses.Le tableau I ci-après résume les principaux effets toxiques observés.

I.2.5.2. La nephrotoxicité

C'est un effet toxique sur le rein. Le rein est l'organed'élimination responsable de la sécrétion de l'urine.Il joue un rôle dans la régulation de l'équilibre desliquides du corps et contribue à débarrasser le sangde ses impuretés, et notamment de certains toxiques(Lapointe, 2004).

Les atteintes rénalesconcernent principalement le glomérule en diminuant la filtration, mais également les tubules proximaux qui concentrent les toxiques du fait de leur forte activité d'absorptionet de sécrétion. D'autre part leur forte teneur en cytochrome P₄₅₀leur permet de détoxifier ou d'activer les toxiques. Les principaux néphrotoxiques sont les métaux lourds, les antibiotiques, les analgésiques et certains hydrocarbures halogénés (dérivés chlorés) (Lu, 1992).

I.2.5.3. La toxicité de l'appareil respiratoire

L'appareil respiratoire est constitué des voiesaériennes supérieures (nez, pharynx ou gorge),de la trachée, des bronches, des bronchioles etdes alvéoles pulmonaires. L'humain est exposé parinhalation à divers agents qui existent sousplusieurs formes (gaz, vapeur, gouttelettes, finesparticules) et en diverses tailles et qui ont leurtoxicité et leurs caractéristiques physiques propres (Lapointe, 2004).

· Irritation locale : Les gaz irritants par exemple, l'ammoniac et le chlore entraînent des effets locaux de type bronchoconstriction, oedème et dyspnée.

· Lésions cellulaires et oedème : Ces effets surviennent après inhalation de toxiques sous forme de particules de petite taille (dérivés du béryllium, du bore, et du nickel). Des solvants organiques après absorption sont distribués dans différentes parties du corps, biotransformés dans le foie pour regagner le poumon par le sang où ils causent des lésions cellulaires et de l'oedème.

· Fibrose et emphysème : La fibrose pulmonaireest occasionnée par des formes cristallines (quartz), des fibres minérales (amiante) et d'autres substances fibrogènes (kaolin, talc, aluminium...). L'aluminium, l'oxyde de cadmium, les oxydes d'azote et l'ozone peuvent occasionner l'emphysèmepulmonaire.

· Allergie : Certains toxiques en se liant aux protéines sanguines et pulmonaires forment des antigènes qui entraînent la formation d'anticorps. L'asthme est la principale réponse. Les expositions prolongées peuvent induire bronchite chronique ou fibrose.

· Cancer du poumon : Arsenic, chromates, nickel, uranium, amiante augmentent l'incidence des cancers du poumon.

· Effets sur les voies respiratoires supérieures : Les particules de grandes tailles déposées dans les fosses nasales peuvent entraîner des lésions locales : congestion, métaplasie, hyperplasie, ulcérations, carcinomes. Le larynx, la trachée, les bronches peuvent être irritées par l'inhalation de vapeurs toxiques.

· Effets après exposition par d'autres voies : Certains toxiques, comme le paraquat (herbicide), peuvent entraîner des lésions pulmonaires secondaires.

I.2.6. L'évaluation des effets toxiques

L'évaluation de la toxicité s'appuie sur des études qualitatives ou quantitatives adéquates. Il existe plusieurs types d'études qui nous permettent d'évaluer les effets d'un toxique. On peut les classer dans quatre catégories (Lapointe, 2004) :

- Les études épidémiologiques, qui comparent plusieurs groupes d'individus ou les études de cas;

- les études in vitro, effectuées sur des cultures de tissus ou des cellules et ;

On utilise fréquemment une terminologie pratique mais arbitraire pour désigner les diverses formes d'intoxication selon la fréquence et la durée de l'exposition (tableau II).

^*On parle souvent d'intoxicationsubaiguë, mais ce terme est considéré comme sémantiquement incorrect (OCDE, 1979)

I.2.6.1. La toxicité aigue

La toxicité aiguë est habituellement définie comme l'ensemble des effets néfastes se produisant immédiatement ou peu de temps après une exposition unique ou répétée sur une période de moins de 24 heures à une ou plusieurs substances (Walum, 1998). Le terme toxicité orale aiguë est plus souvent utilisé en liaison avec les déterminations de la létalité et de la DL₅₀. La DL₅₀ est un terme qui a été introduit et développé par Trevan en 1927. Elle est définie comme la dose déterminée statistiquement qui, lorsqu'elle est administrée dans un test de toxicité aiguë, est susceptible de causer la mort de 50% des animaux traités sur une période donnée (Oliver, 1986).

La méthode classique d'étude de la toxicité orale aiguë d'une substance (Trévan, 1927) consiste en une administration de ladite substance à différentes doses, par voie orale, à plusieurs groupes d'animaux d'expérience (généralement des rats ou des souris des deux sexes), à raison d'une dose par groupe. Les animaux traités sont observés de près durant les premières 24 heures et ensuite quotidiennement pendant 2 semaines et les éventuels changements de l'apparence et du comportement, ainsi que la létalité (DL₅₀) sont notés. Des questions se posent encore concernant l'utilisation de l'évaluation pathologique élargie en tant que partie d'une étude de toxicité aiguë. Cependant, l'autopsie macroscopique est le minimum requis par la plupart des corps de régulations gouvernementaux, comme le sont les déterminations du poids corporel peu de temps avant le traitement et après une, puis deux semaines (Walum, 1998).

La valeur absolue de la DL₅₀ d'un composé varie beaucoup entre les laboratoires, et ces variations ont été attribuées aux différences, par exemple, dans les détails protocolaires, les souches animales, l'encagement, et la source de la substance chimique d'essai. La DL₅₀ et des méthodes alternatives pour l'évaluation de la toxicité aiguë ont été considérablement discutées dans différents forum internationaux au cours des années 80 et 90 (Rhodes et al., 1993 ; Oliver, 1986 ; Clark et al., 1991 ; Fielder, 1995 ; Lindgren et al., 1983 ; Seibert et al., 1996). Le résultat de ces discussions intensives est qu'aujourd'hui les autorités ne demandent habituellement pas des tests de DL₅₀ classiques impliquant un grand nombre d'animaux. Au contraire, les lignes directrices n° 420 (OCDE, 2001a), 423 (OCDE, 2001b), et 425 (OCDE, 2008b) de l'OCDE décrivent des méthodes alternatives bien établies et validées qui réduisent les souffrances des animaux et/ou utilisent beaucoup moins d'animaux que la méthode classique de Trevan. Cette dernière a été officiellement abrogée en décembre 2002 par l'OCDE, l'Union Européenne et les États-Unis d'Amérique (Schlede et al., 2005).

I.2.6.2. Toxicité a court terme avec administration de doses répétées et toxicitésubchronique

Alors que la toxicité aiguë concerne les effets nocifs dus à des doses uniques, une forme plus commune de l'exposition humaine à de nombreux produits chimiques se fait par la répétition de doses qui ne produisent pas d'effets toxiques immédiats. Des effets tardifs peuvent survenir à cause de l'accumulation du produit dans les tissus ou à cause d'autres mécanismes, et il est important d'identifier toute possibilité de ce genre par des études subchroniques. La limite distinguant les régimes subchroniques et chroniques d'administration des doses est souvent prise comme égale à 10% de la durée de vie des animaux d'expérience. Des périodes d'administration de doses s'étendant entre une simple dose et 10% de la durée de vie sont souvent qualifiées de mode d'administration subaiguë. Ce terme est considéré comme sémantiquement incorrect et par conséquent, pour distinguer de telles périodes des périodes décrites classiquement comme subchroniques on doit les décrire comme « études à court terme avec administration de doses répétées ». Ceci s'applique aux études portant sur 14, 21 et 28 jours. Les durées d'étude réalisées ont été principalement de 14, 28 et 90 jours. D'autres durées d'étude ont été utilisées en Toxicologie, mais on considère que le choix de ces trois durées principales qui ont le soutient de l'expérience ou pour lesquelles il existe des prescriptions en matière de réglementation, représente une approche raisonnable(OCDE, 1979).

La substance à tester est administrée quotidiennement à différents niveaux de dose à plusieurs groupes d'animaux, à raison d'un niveau de dose par groupe. De manière générale, au moins trois groupes d'essai et un groupe témoin doivent être utilisés. La dose la plus élevée doit provoquer des effets toxiques, sans être létale ou causer de sévères souffrances. Une séquence de doses décroissantes doit ensuite être sélectionnée en vue de mettre en évidence tout effet lié à la dose ainsi qu'une concentration sans effet nocif observé à la dose la plus faible(OCDE, 2008a).

I.2.6.3. La toxicité chronique

Le but d'une étude de toxicité chronique est de déterminer les effets d'une substance d'essai, chez une espèce de Mammifère donnée, à la suite d'une exposition prolongée et répétée(OCDE, 1979).

La substance d'essai est administrée quotidiennement à plusieurs groupes d'animaux d'expérience à des doses progressives, en général pendant une période de 12 mois, bien quedes durées plus longues ou plus courtes puissent aussi être choisies, en fonction des exigences réglementaires. Cette durée est assez longue pour permettre aux effets de toxicité cumulée de se manifester, tout en évitant les effets perturbateurs des changements liés au vieillissement. Il convient d'utiliser au moins trois doses et un groupe témoin. À moins de contraintes dues à la nature physico-chimique ou aux effets biologiques de la substance d'essai, le niveau de dose le plus élevé est choisi de manière à permettre d'identifier les principaux organes cibles et les effets toxiques de la substance, tout en évitant la souffrance, une toxicité sévère ou une forte morbidité ou létalité chez les animaux testés(OCDE, 2009).

I.2.6.4. Méthodes substitutives à l'expérimentation animale

Des progrès scientifiques considérables ont permis le développement de modèles in vitro pertinents pour évaluer les effets toxiques des médicaments ou produits chimiques sur la santé humaine et la qualité de l'environnement. Cependant, dans l'état actuel de nos connaissances, les méthodes alternatives ne peuvent pas se substituer à l'animal lorsque les études portent sur l'organisme entier. En effet, les méthodes in vitro, même utilisées en batterie complémentaire, ne peuvent reproduire les mécanismes de régulation complexes et d'interactions entre cellules et organes. En revanche, la mise en place de stratégies dites « intelligentes » intégrant le principe des 3R (Réduction, Raffinement et Remplacement), telles que celles proposées dans le programme européen REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and restriction of Chemicals), permettront de réduire de manière significative l'expérimentation animale. Des collaborations plus efficaces au niveau international doivent maintenant se mettre en place aussi bien au niveau des structures de validation, ECVAM (European Center for the Validation of Alternatives Methods), ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the validation of alternative methods), JaCVAM (Japanese center for the validation of alternative methods) qu'au niveau des autorités réglementaires que sont l'UE (Union européenne), l'OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economique), l'ICH (International Conference on Harmonisation), pour que les méthodes validées soient réellement appliquées. Enfin, la collaboration entre les différents secteurs industriels, de la chimie, du médicament, du produit cosmétique, doit être encouragée afin d'éviter la répétition des efforts de recherche, de favoriser le partage des données sur les substances mais également le partage de l'expérience acquise sur les méthodes alternatives à l'expérimentation animale (Fabre, 2008).

II.1.LE MATÉRIEL VÉGÉTAL

II.1.1. Préparation de l'extrait(Figure 5)

Les graines sèches de A. melegueta et de P. guineense, les rhizomes frais de Z. officinale, et les racines fraiches de M. whitei ont été acheté au marché Mokolo de Yaoundé (Cameroun). Les racines fraiches de M. withei etles rhizomes frais de Z. officinale ont été découpés en petits morceaux et séchés à l'étuve (45° C) pendant 5 à 6 jours. Les racines, rhizomes et graines ont été broyés séparément à l'aide d'un moulin à écraser. Une masse de 100g de la poudre obtenue de chacune des plantes (soit 400g de poudre) a été introduit dans 3 litres d'eau distillée. Le mélange a été homogénéisé pendant plusieurs minutes à l'aide d'une grande baguette propre en bois puis laissé reposer pendant 24 heures. Le macérât brut obtenu a ensuite été séparé de la poudre résiduelle par essorage, puis a été filtré à l'aide d'un papier filtre Wattman N°3. Le filtrat obtenu a été évaporé à l'étuve pendant 2 à 3 jours (50-55°C), et l'extrait aqueux fluide de texture pâteuse et de couleur brun-noirâtre a été obtenu.

Un volume de 167 ml de filtrat ont permis d'obtenir 4 g d'extrait aqueux. La concentration du macérât aqueux étaitdonc de 24 mg/ml. Ceci suggère que les 3 litres du macérât obtenu contenait 72 g d'extrait aqueux, soit un rendement (r) de :

A. melegueta (graines) + M. whitei (racines) + P. guineense (graines) + Z. officinale (rhizomes)

Figure 5 : Schéma du procédé utilisé pour l'extraction aqueuse du mélange de Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale.

II.1.2. Préparation des solutions d'essai

L'extrait à été dissous dans de l'eau distillée, puis le mélange a été homogénéisé par agitation (5-10mn) à l'aide d'un agitateur magnétique. La solution obtenue était conservé dans un bocal en plastique fermé et placé dans un réfrigérateur après chaque séance d'administration orale de l'extrait aux animaux. Le volume de solution à administrer aux animaux à été calculé par la formule ci-après :

Le volume maximal de liquide qui pouvait être administré en une seule fois était V_max = 2ml/100g de poids corporel (OCDE, 2001b). Ainsi, la concentration minimale (C_min) des solutions qui pouvaient être administrées aux animaux était calculée par la formule ci-après :

II.2.LES ANIMAUX

L'espèce animale choisie pour cette étudeétait le rat (Rattus norvegicus) albinos de la souche Wistar. Les rats étaient élevés au sein de l'Animalerie du Laboratoire de Physiologie Animale de la Faculté des Sciences de l'Université de Yaoundé I à température ambiante. Les conditions d'aération étaientbonnes, et l'éclairage était naturel. Les animaux recevaient de la provende en guise de nourriture et de l'eau potable en guise de boissonad libitum. Parmi les animaux d'élevage, 60 jeunes rats des deux sexes (essai aigu : 9-10 semaines, 98-110 g ; essai subchronique : 6-7 semaines, 84-113 g femelles, 105-134 g mâles) et apparemment sains ont été sélectionnés, et répartis au hasard dans les différents groupes témoins et essais. Les femelles sélectionnées étaient nullipares et non gravides. Aucun de ces animaux n'avait été sujet à des expériences antérieures.

II.3.PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL

II.3.1. Toxicité orale aiguë

La toxicité orale aiguë de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, de M. whitei, de P. guineense, et de Z. officinale à été évaluée chez le rat conformément à la ligne directrice n° 423 de l'OCDE pour les essais des substances chimiques adoptée le 17 décembre 2001.

II.3.1.1. Principe de l'essai

Le principe de cet essai est qu'avec un processus séquentiel, utilisant un nombre minimum d'animaux par étape, des informations suffisantes sur la toxicité aiguë de la substance peuvent être obtenues pour permettre sa classification. Une dose déterminée de la substance est administrée par voie orale à un groupe d'animaux. La substance est testée dans un processus séquentiel dans lequel trois animaux d'un seul sexe (le plus sensible) sont utilisés à chaque étape. L'absence ou la manifestation de mortalité liée à la substance dans un groupe ayant reçu une dose à une étape donnée détermine l'étape suivante, c'est-à-dire :

3) Administration de la dose immédiatement supérieure ou inférieure à trois animaux supplémentaires.

Des détails concernant le mode opératoire pour la dose initiale de 2000 mg/kg choisie pour cette étude sont décrits en annexe (page 69). Uniquement des femelles (âge : 9-10 semaines ; poids : 98-110 g) ont été utilisées pour ce test (OCDE, 2000). L'analyse des publications sur les essais classiques de détermination de la DL₅₀ montre en effet que, bien que la différence de sensibilité entre les deux sexes soit généralement faible, dans les cas où l'on constate une différence, les femelles sont généralement un peu plus sensibles (Lipnick et al., 1995).

II.3.1.2. Administration de la substance d'essai

Les animaux étaient privés de nourriture mais pas d'eau pendant la nuit précédant l'essai. Après le jeûne, les animaux étaient pesés et la substance d'essai leur était administrée oralement par gavage à l'aide d'une sonde oesophagienne. Après l'administration de la substance, les animaux étaient à nouveau privés de nourriture, pendant 3 à 4 heures. L'intervalle de temps entre l'administration de chaque niveau de dose a été fixé à 48 heures. Néanmoins, cette période pouvait varier en fonction du moment de l'apparition d'effets toxiques éventuels, de leur durée et de leur sévérité. Le cas échéant, l'administration de la dose suivante devait être retardée jusqu'à ce qu'on ait obtenu la certitude que les animaux précédemment soumis au traitement survivraient.

II.3.1.3. Observations

Après traitement, les animaux étaient observés individuellement au moins une fois pendant les premières 30 minutes et régulièrement pendant les premières 24 heures après le traitement, avec une attention particulière pendant les premières 4 heures. Ils étaient ensuite observés quotidiennement pendant 14 jours après l'administration de la substance. Les observations portaient sur les modifications de la peau, des poils, de l'activité somato-motrice et du comportement. L'attention se portait en particuliersur l'observation des diverses manifestations de tremblement, convulsion, salivation, diarrhée, léthargie,sommeil et coma.

II.3.1.4. Poids corporels

Le poids individuel de chaque animal a été déterminé peu de temps avant l'administration de la substance d'essai, puis tous les 2 jours après administration de la substance d'essai pendant 14 jours. Les gains pondéraux sur 2 jours ont été calculés, enregistrés et comparés le 2^e, 8^e et 14^e jour après le traitement. La formule ci-dessous a été utilisée pour le calcul :

II.3.1.5. Autopsie générale

Tous les animaux d'essai ont été euthanasiés et soumis à une autopsie à l'échelle macroscopique à la fin du traitement. L'attention était portée sur les reins, le foie, le coeur, les poumons, la rate, et le tube digestif.

II.3.2. Toxicité orale subchronique

La toxicité orale subchronique de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, de M. whitei, de P. guineense, et de Z. officinale à été évaluée chez le rat conformément à la ligne directrice n° 407 de l'OCDE pour les essais de produits chimiques adoptée le 3 octobre 2008.

II.3.2.1. Nombre et sexe des animaux

10 animaux (5 par sexe) (poids : 84-113 g pour les femelles et 105-134 g pour les mâles ; âge : 6-7 semaines) ont été utilisés pour chaque dose.

II.3.2.2. Dosage

Trois doses (100, 200, 400mg/kg) et un groupe témoin ont été utilisés. Les doses ont été choisies sur la base de l'estimation de la dose thérapeutique chez l'Homme. Le traitement chez l'Homme préconise l'ingestion du macérât aqueux d'environ 11 g de poudre du mélange de plantes par jour pendant 8 jours. En considérant que le poids biologique moyen d'un être humain est de 70 kg, et que la quantité d'extrait aqueux que l'on peut théoriquement obtenir par macération à partir de ces 11 g de poudre est d'environ 2 g (rendement 18 %), le traitement chez l'Homme consiste en l'ingestion quotidienne d'un peu moins de 30 mg/kg de poids corporel d'extrait aqueux pendant 8 jours. Cette valeur à été multiplié par 3 pour pallier à une différence de biodisponibilité éventuelle existant entre l'Homme et les rats de laboratoires, soit une valeur obtenue d'environ 90 mg/kg. La valeur de 100 mg/kg à finalement été choisi comme dose minimale, correspondant à l'estimation maximale de la dose pharmacologique chez le rat. Cette valeur a été multipliée par 2, puis par 4, pour trouver respectivement la dose intermédiaire et la dose maximale.

II.3.2.3. Administration de la substance d'essai

Les animaux ont reçu par gavage à l'aide d'une sonde oesophagienne une dose quotidienne de la substance d'essai pendant 33 jours conformément aux recommandations de l'OMS sur la durée des études de toxicité d'une substance chez l'animal en fonction de l'administration clinique prévue (OMS, 2000). Les séances de gavage étaient menées au même moment de la journée. Les quantités d'extrait à administrer étaient régulièrement ajustées pour rester constante par rapport au poids de l'animal. Le groupe témoin recevait le plus grand volume d'eau distillée utilisé.

II.3.2.4. Observations

La période d'observation a duré 33 jours. Deux fois par jour au minimum, au début et à la fin de chaque journée, un examen de tous les animaux avait lieu, afin d'y déceler des symptômes de morbidité et de mortalité. Des observations ont été faites sur tous les animaux au moins une fois avant la première exposition (pour pouvoir effectuer des comparaisons sur un même individu), et ensuite une fois par semaine. Les symptômes relevés incluaient, de façon non limitative, les changements affectant la peau, la fourrure, la respiration, la démarche, de stéréotypes (par exemple, soins corporels excessifs, animaux tournant en rond de façon répétitive) et de comportements bizarres (par exemple, automutilation, marche à reculons). A partir de la quatrième semaine d'exposition, la réactivité sensorielle à des stimuli auditifs et proprioceptifs, la force de préhension, et l'activité motrice ont été évaluées quotidiennement :

· l'audition était évaluée en appréciant la réaction des animaux à un claquement brusque des mains ;

· la proprioception en appréciant leur réaction à une piqure de leurs pattes ;

· la force de préhension en appréciant leur capacité à s'agripper aux bords de la cage lorsqu'on essayait de les en sortir.

II.3.2.5. Poids corporels

Tous les animaux ont été pesés peu de temps avant le début du traitement, puis tous les 7 jours, et enfin le jour du sacrifice. Les variations pondérales hebdomadaires étaient calculées et enregistrés. La formule utilisée pour le calcul était :

II.3.2.6. Hématologie et biochimie clinique

Les animaux ont été mis à jeun durant la nuit qui a précédé la prise de sang. A la fin de la période d'essai, des échantillons de sang arteroveineux ont été prélevés au cours du sacrifice des animaux, une partie dans des tubes à héparine, et l'autre partie dans des tubes secs de 5 ml. Le sang contenu dans ces derniers a été centrifugé pour obtenir le sérum. Avec le sang contenu dans les tubes à héparine, les examens hématologiques de Numération Formule Sanguine (NFS) ont été effectués : hématocrite, concentration d'hémoglobine, numération des érythrocytes et des réticulocytes, numération et formule leucocytaire, numération des plaquettes. Le sérum obtenu a été utilisé pour des dosages biochimiques, effectués conformément aux protocoles fournis avec les kits commerciaux Fortress Diagnostics révisés en octobre 2007. Il s'agit:du cholestérol total, du HDL-cholestérol, des triglycérides, de la créatinine, de la bilirubine totale, de l'alanine aminotransférase (ALAT), et de l'aspartate aminotransférase (ASAT). Les protéines totales ont aussi été dosées, à l'aide de la méthode du Biuret décrite par Gornall et al., (1949).

-Principe du test : Le cholestérol est présent dans le sérum sous la forme d'esters de cholestérol et de cholestérol libre. Les esters de cholestérol présents dans le sérum sont hydrolysés par la cholestérol-esterase puis le cholestérol est mesuré en l'oxydant avec la cholestérol-oxydase pour produire du peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène à son tour réagit avec le phénol et le 4-amino-antipyrine en présence de la peroxydase pour produire la quinoneimine à coloration rouge. L'intensité de la coloration produite est directement proportionnelle à la concentration de cholestérol dans l'échantillon.

- Principe du test :Les LDL sont précipités par addition de l'acide phosphotungstique en présence des ions magnésium. La fraction HDL reste dans le surnageant et est déterminée par le dosage du cholestérol.

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit :
		Macro	Semi Micro
Échantillon		500 ul	200 ul
Précipitant HDL		1000 ul	-
Précipitant dilué		-	500 ul
Les préparations ont été homogénéisées puis incubées pendant 10 minutes à température ambiante. Elles ont ensuite été centrifugées à 4000 trs/mn. Le contenu en cholestérol a été déterminé dans le surnageant clair dans les 2 heures qui suivaient, par la méthode CHOD-PAP.
PROCEDURE DU CHOD-PAP CHOLESTEROL : Un seul réactif blanc a été utilisé par série. Le Pipetage s'est fait dans les tubes d'essai comme suit :
	Réactif blanc	Standard	échantillon
Eau distillée	100 ul	-	-
Surnageant	-	-	100 ul
Standard	-	100 ul	-
Réactif	1 ml	1 ml	1 ml
Les préparations ont été homogénéisées puis incubées 10 minutes à température ambiante. Puis l'absorbance du standard et des échantillons a été lue contre celle du réactif blanc dans l'heure.

- Principe du test :Les triglycérides sont hydrolysés par la lipoprotéine lipase pour donner le glycérol et des acides gras. Puis, par l'action successive de la glycérol kinase en présence de Mg²⁺ et de la glycérol phosphatase en présence d'ATP, le glycérol est convertit en dihydroxyacétone phosphate et peroxyde d'hydrogène. Le peroxyde d'hydrogène à son tour réagit avec le chlorophénol et le 4-amino-antipyrine en présence de la peroxydase pour produire le 4-(p-benzoquinone-monoimino)-phenazone coloré. L'intensité de la coloration produite est directement proportionnelle à la concentration de triglycérides dans l'échantillon.

Tampon :	Tampon pH 7.8	50 mmol/l
	p-chlorophénol	2 mmol/l
	Lipoprotéine Lipase	150000 U/l
	Glycérolkinase	800 U/l
	Glycérol-3-P-oxydase	4000 U/l
	Peroxydase	440 U/l
	4-aminoantipyrine	0,7 mmol/l
	ATP	0,3 mmol/l
	Mg²⁺	40 mmol/l
	Na-cholate	0,20 mmol/l
	Potassium-Hexacyanoferrate(II)	1 umol/l
Standard :	Concentration de triglycérides de 200 mg/dl	2,24 mmol/l

- Principe du test :La créatinine réagit avec l'acide picrique en milieu alcalin pour former un complexe jaune intense. La quantité de complexe formé est directement proportionnelle au taux de créatine dans l'échantillon.

Le changement dans l'absorbance de l'échantillon/standard (Äabs) = abs. à 150 secondes - abs. à 30 secondes.

- Principe du test :La bilirubine totale réagit avec le 2,4-dichloroaniline pour former l'azobilirubine. La bilirubine liée à l'albumine est libérée par un détergent.

Le réactif DCA (dichloroaniline) est mélangé à égal volume avec le réactif nitrite.

La méthode du Biuret décrite par Gornall et al., (1949) a été utilisée pour doser les protéines sériques.

- Principe : En milieu basique, le tartrate forme avec le sel cuivrique un complexe soluble. L'addition d'une protéine déplace le cuivre complexé pour former un autre complexe cuivro-protéique de couleur violette. L'intensité de coloration est proportionnelle à la concentration des protéines dans la solution à doser.

Les tubes utilisés pour le dosage des protéines ont été préparés et complétés avec les différents réactifs suivant l'ordre présenté dans le tableau IIIci-après.

N° tube	0	1	2	3	4	5	6	X₁	...	X_n
SAB (5 mg/mL)	0	0,25	0,5	0,75	1	1,25	1,75	0	...	0
Eau distillée (mL)	3	2,75	2,5	2,25	2	1,75	1,25	2,95	...	2,95
Réactif de Biuret (mL)	2	2	2	2	2	2	2	2	...	2
Sérum (uL)	0	0	0	0	0	0	0	50	...	50
Quantité de protéines (mg)	0	1,25	2,5	3,75	5	6,25	7,5	?	...	?

Tube 0 : tube blanc ; Tube 1 à 5 : tubes étalons ; Tubes X1 à Xn : tubes échantillons

Dans une série des tubes à essai a été introduit successivement 50 uL de sérum puis 2 ml de la solution de Biuret. L'ensemble a été homogénéisé par le vortex et incubé pendant 20 minutes à température ambiante. Dans le tube témoin, le sérum a été remplacé par l'eau distillée. L'absorbance est lue à 540 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (type Genesis) contre le témoin. La concentration des protéines dans les différents tubes échantillons a été déterminée à partir de la courbe d'étalonnage réalisé avec une solution de SAB (Figure 6).

Figure 6 : Courbe d'étalonnage du dosage des protéines par la méthode de Biuret

- Principe du test :Le dosage repose sur le transfert enzymatique médié parL'ALAT d'un groupement amine de la L-alanine au á-oxoglutarate pour obtenir le L-glutamate et le pyruvate.

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit (37°C):
	Réactif blanc	Test
Echantillon	-	100 ul
Tampon ALAT (R1)	500 ul	500 ul
Eau distillée	100 ul	-
Les préparations ont été homogénéisées et incubées pendant exactement 30 minutes à 37°C dans un bain-marie.
Réactif coloré ALAT (R2)	500 ul	500 ul
Les préparations ont été homogénéiséeset incubées pendant exactement 20 minutes à température ambiante.
NaOH (dilué)	5,0 ml	5,0 ml
Les solutions ont été homogénéiséespuis l'absorbance a été lue contre le réactif blanc après 5 minutes. L'activité de l'ALAT correspondante à la densité optique lue s'est faite via la courbe d'étalonnage de (Figure 7).

- Principe du test :Le dosage repose sur le transfert enzymatique médié par l'ASATd'un groupement amine de la L-aspartate au á-oxoglutarate pour obtenir le L-glutamate et l'oxaloacétate.

Le Pipetage s'est fait dans les tubes à essai comme suit (37°C):
	Réactif blanc	Test
Echantillon	-	100 ul
Tampon ASAT (R1)	500 ul	500 ul
Eau distillée	100 ul	-
Les préparations ont été homogénéiséeset incubées pendant exactement 30 minutes à 37°C dans un bain-marie.
Réactif coloré ASAT (R2)	500 ul	500 ul
Les préparations ont été homogénéisées et incubées pendant 20 minutes à température ambiante.
NaOH (dilué)	5,0 ml	5,0 ml
Les solutions ont été homogénéisées puis l'absorbance a été lu contre le réactif blanc après 5 minutes. L'activité de l'ASAT correspondante à la densité optique lue s'est faite via la courbe d'étalonnage (Figure 8).

II.3.2.7. Pathologie

Ø Autopsie générale : Tous les animaux de l'étude ont fait l'objet d'une autopsie générale. Le foie, les reins, les poumons, la rate, les gonades et le coeur de tous les animaux (à l'exception des animaux sacrifiés ou mort avant la fin de l'essai) ont été débarrassés de tout tissu adhérent et pesés à l'état frais aussitôt après la dissection, afin d'éviter leur dessiccation. Après la pesée, ces organes ont été conservés dans du liquide de Bouin aqueux fort pour les examens histopathologiques. Le poids relatif du foie, des reins, des poumons, de la rate, des gonades, et du coeur a été déterminé par la formule :

Ø Histopathologie : Les organes d'intérêts ont été conservés dans du Bouin aqueux fort pour y être fixés. Le liquide de Bouin aqueux fort a été obtenu après mélange homogénéisé des substances suivantes : Acide acétique glacial (1 volume), Formol pur du commerce (5 volumes), Acide picrique à saturation dans l'eau (15 volumes). Le mode opératoire suivant a ensuite été employé pour la réalisation des coupes histologiques :

1)- « Trimming » : des tranches fines et régulières de chaque organe fixé ont été prélevées à l'aide d'un bistouri, puis rangées dans des cassettes.

2)- Déshydratation :les cassettes ont ensuite été passées dans des bains d'éthanol de concentration croissante : éthanol 50° (1h) ? éthanol 70° (1h) ? éthanol 95° n°1 (1h) ? éthanol 95° n°2 (1h30mn) ? éthanol 100° n°1 (1h) ? éthanol 100°n°2 (1h30mn) ? éthanol 100°n°3 (2h) ; les cassettes ont ensuite été passées dans 2 bains de xylènes respectivement 1h et 2h ; les cassettes ont enfin été passées dans 3 bains de paraffine à 60°C respectivement 1h, 1h30 et 2h.

3)- Inclusion :les tissus ont ensuite été placés dans des moules remplis de paraffine en fusion qui a ensuite été mise à solidifier sur une surface froide après orientation appropriée du tissu dans le bloc.

4)- Coupes :des coupes de 5 um des blocs ont été réalisée à l'aide d'un microtome. Une fois coupées, les sections ont été mises à déplissées dans un bain-marie (environ 40°C) puis récupérées sur des lames. Les lames ont ensuite été laissées 24h à l'étuve (45°C) avant la coloration.

5)- Coloration :les coupes ont ensuite été passées dans une batterie de déparaffinage constituée d'une série de bains de 5 à 10 mn chacun selon la séquence suivante : xylène n°1 ? xylène n°2 ? xylène n°3 ? éthanol à 100° n°1 ? éthanol à 100° n°2 ? éthanol à 100° n°3 ? éthanol à 95° ? éthanol à 70° ? eau distillée. Les coupes ont ensuite été immergées 10 mn dans un bac contenant de l'hématoxyline de Mayer, puis rincées pendant 10 mn à l'eau du robinet courante. Les coupes ont ensuite été passées dans un bain d'éthanol 95° pendant 5 mn, puis elles ont été immergées 5 mn dans de l'éosine alcoolique 0,5% + 40 ul d'acide acétique par 100 ml de solution. Les coupes ont ensuite été déshydratées dans de l'éthanol 100° (3 × 5 mn), éclaircies dans du xylène (3 × 5 mn).

6)- Montage :une fois sortie du xylène, quelques gouttes de résine ont été déposées sur les coupes, puis ces dernières ont été recouvertes d'une lamelle de verre pour l'observation au microscope.

II.3.2.8. Traitement statistique des résultats

L'analyse des résultats s'est faite à l'aide du logiciel GraphPad Instat^® Version 3.05. Toutes les données ont été exprimées sous forme de moyenne #177; erreur standard sur la moyenne (ESM). La significativité des différences entre les groupes traités et témoins a été évaluée par le test t de student. Les différences étaient considérées comme significatives pour p < 0,05.

III.1.TOXICITÉ ORALE AIGUE

III.1.1. Effets de l'extrait sur l'aspect général, le comportement, et la mortalité des animaux

Le résumé des observations effectuées sur les animaux en essai aiguë est présenté dans le tableau IV. Les animaux n'ont montré aucun changement dans l'apparence physique générale et dans la somatomotricité durant la période d'observation. Aucune manifestation de tremblements, convulsions, salivation, diarrhée, coma, ou de comportements anormaux tels que l'automutilation ou la marche à reculons n'a été observé. Des manifestations de sommeil ont été observées chez les témoins et les traités les 30 premières minutes après le gavage. Ce sommeil était fugace chez les témoins, mais n'était réversible qu'après quelques heures chez les traités. Une léthargie transitoire s'observait chez les animaux traités quelques heures après le gavage. Aucune autre modification liée au traitement, ni aucune morbidité/mortalité, n'a été observée chez les animaux sur la période de 14 jours suivant l'administration oral d'une dose unique d'extrait à la dose 2000 mg/kg. La DL₅₀ a donc été estimée supérieure à 2,5 g/kg comme décrit dans le schéma de l'annexe (page 69).

III.1.2. Effets de l'extrait sur le poids corporel

La figure 9 présente l'évolution des poids corporels des animaux d'essai pendant la période d'observation.

L'analyse de ce graphe montre une augmentation significative du poids corporels chez les animaux traités comparativement aux témoins le 8^e (p < 0,05) et le 14^e jour (p < 0,05).

Figure 9 : Variations des poids corporels en essai aiguë. Les points représentent les poids moyens #177; ESM (n=3). *p<0,05 : différence significative par rapport au témoin

III.1.3. Autopsie générale

L'autopsie des animaux d'essai n'a révélé aucune anomalie liée au traitement.

III.2.TOXICITÉ ORALE SUBCHRONIQUE

III.2.1. Effets de l'extrait surla mortalité, l'aspect général, et le comportement des animaux

Des 40 animaux initialement sélectionnées, 34 ont survécu sur toute la période d'observation, soit 6 décès :

· 1 des 6décès (mâle-200 mg/kg) résultait d'une euthanasie car l'animal en question présentait des signes de morbidité attribués à une anomalie fréquemment observée chez les animaux pendant l'élevage (torticolis ; tourne en rond de façon continu).

· 1 des 6 décès (mâle-100 mg/kg) a probablement été la conséquence d'un étouffement nocturne. En effet, le jour précédant celui de la découverte de la dépouille, l'animal présentait les symptômes du rhume des foins (éternuement et écoulement nasal), avec une légère maigreur et une fourrure légèrement hérissée.

· Dans 4 des 6 décès, les animaux avaient en commun 4 symptômes d'intoxication avant la mort (fourrure hérissée + maigreur + léthargie + tachypnée) : 3 animaux à la dose 400 mg/kg (1 mâle, 2 femelles), et 1 animal à la dose 200 mg/kg (mâle).

Lors de la dernière semaine de traitements, seule une femelle (400 mg/kg) présentait une réduction des facultés nociceptive, motrice, et préhensile. Toutes les modifications observées sont résumées dans le tableau V.

III.2.2. Effets de l'extrait sur le poids corporel

La figure 10 présente l'évolution des poids corporels des animaux mâles (A) et femelles (B) ayant survécue jusqu'à la fin de la période d'observation.

Aucune différence significative n'a été notée dans les gains pondéraux moyens chez les mâles et les femelles traités comparativement à leurs témoins respectifs.

Figure 10 :Evolution des poids corporels chez les survivants mâles (A) et femelles (B) en essai subchronique. Les points représentent les poids moyens #177; ESM (n=5, sauf aux doses : 100 mg/kg et 400 mg/kg mâles où n=4, 200 mg/kg mâles et 400 mg/kg femelles où n=3).

		Semaine 1		Semaine 2		Semaine 3		Semaine 4
		Nombre d'animaux présentant des signes de toxicité et nature de ces signes	Morbidité ou Mortalité	Nombre d'animaux présentant des signes de toxicité et nature de ces signes	Morbidité ou Mortalité	Nombre d'animaux présentant des signes de toxicité et nature de ces signes	Morbidité ou Mortalité	Nombre d'animaux présentant des signes de toxicité et nature de ces signes	Morbidité ou Mortalité
Mâles	Témoin	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	100 mg/kg	0/5	0/5	1/5 : rhume, maigreur, fourrure hérissée	1/5	0/4	0/4	0/4	0/4
	200 mg/kg	1/5 : léthargie, maigreur, tachypnée, fourrure hérissée	1/5	1/4 : insensibilité des pattes latérales gauches, torticolis poussé, tourne en rond sur lui-même de façon répétitive	1/4	0/3	0/3	0/3	0/3
	400 mg/kg	1/5 : léthargie, maigreur, tachypnée, fourrure hérissée	1/5	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4	0/4
Femelles	Témoin	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	100 mg/kg	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	200 mg/kg	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5	0/5
	400 mg/kg	1/5 : maigreur	0/5	2/5 : léthargie ; maigreur ; tachypnée ; fourrure hérissée ; insensibilité des pattes avant (1/5)	1/5	1/4 : légère léthargie	1/4	1/3 : léthargie, tachypnée, maigreur, fourrure hérissée	0/3

III.2.3. Effets sur quelques paramètres hématologiques et biochimiques

L'effet de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, M. whitei, P. guineense, et Z. officinale sur quelques paramètres hématologiques est présenté dans le tableau VI. Chez les mâles, aucune différence significative n'a été notée entre les taux moyens des différents paramètres hématologiques évalués chez les animaux survivants des groupes traités et leurs valeurs dans les groupes témoins correspondants. Chez les femelles survivantes par contre, la concentration moyenne en hémoglobine corpusculaire était significativement réduite de 14% (p < 0,05)dans le groupe traité à la dose 400 mg/kg par rapport au témoin.

MALES
	Témoin	100 mg/kg	200 mg/kg	400 mg/kg
Globules blancs (10³/uL)	7,0 #177; 1,0⁽⁴⁾	9,0 #177; 2,0⁽⁴⁾	6,9 #177; 1,4⁽³⁾	6,0 #177; 1,0⁽⁴⁾
Lymphocytes (%)	78,9 #177; 4,4⁽⁴⁾	69,1 #177; 3,8⁽⁴⁾	72,0 #177; 3,0⁽³⁾	74,2 #177; 4,8⁽⁴⁾
Monocytes (%)	13,1 #177; 2,6⁽⁴⁾	17,9 #177; 1,6⁽⁴⁾	17,2 #177; 2,4⁽³⁾	14,7 #177; 2,2⁽⁴⁾
Granulocytes (%)	8,0 #177; 1,9⁽⁴⁾	13,1 #177; 2,8⁽⁴⁾	11,0 #177; 0.90⁽³⁾	11,1 #177; 2,8⁽⁴⁾
Globules rouges (10³/uL)	9,8 #177; 0,76⁽⁴⁾	9,6 #177; 1,1⁽⁴⁾	8,0 #177; 0,72⁽³⁾	8,4 #177; 1,2⁽⁴⁾
Hématocrite (%)	44,7 #177; 2,9⁽⁴⁾	46,0 #177; 6,0⁽⁴⁾	39,0 #177; 2,0⁽³⁾	41,2 #177; 6,3⁽⁴⁾
Volume corpusculaire moyen (fL)	49,0 #177; 2,0⁽⁴⁾	50,0 #177; 0,80⁽⁴⁾	48,0 #177; 0,60⁽³⁾	67,0 #177; 15,0⁽⁴⁾
Hémoglobine corpusculaire moyen (pg)	19,0 #177; 0,30⁽⁴⁾	18,0 #177; 0,90⁽⁴⁾	19,1 #177; 0,87⁽³⁾	29,8 #177; 11,5⁽⁴⁾
Hémoglobine corpusculaire moyen (g/dl)	41,0 #177; 1,0⁽⁴⁾	37,0 #177; 2,0⁽⁴⁾	38,8 #177; 1,1⁽³⁾	60,2 #177; 22,5⁽⁴⁾
Concentration d'hémoglobine (g/dL)	18,0 #177; 1,0⁽⁴⁾	17,0 #177; 2,2⁽⁴⁾	15,3 #177; 0,88⁽³⁾	29,0 #177; 16,0⁽⁴⁾
FEMELLES
	Témoin	100 mg/kg	200 mg/kg	400 mg/kg
Globules blancs (10³/uL)	8,0 #177; 2,0⁽⁵⁾	7,7 #177; 2,0⁽⁵⁾	5,1 #177; 0,88⁽⁵⁾	9,0 #177; 7,0⁽³⁾
Lymphocytes (%)	71,7 #177; 4,4⁽⁵⁾	71,7 #177; 5,4⁽⁵⁾	69,0 #177; 1,0⁽⁵⁾	50,1 #177; 19,7⁽³⁾
Monocytes (%)	15,5 #177; 1,6⁽⁵⁾	16,6 #177; 2,6⁽⁵⁾	18,2 #177; 1,1⁽⁵⁾	20 #177; 8,0⁽³⁾
Granulocytes (%)	12,8 #177; 3,1⁽⁵⁾	12,0 #177; 3,0⁽⁵⁾	13,0 #177; 0,20⁽⁵⁾	30,0 #177; 13,0⁽³⁾
Globules rouges (10³/uL)	8,0 #177;1,0⁽⁵⁾	8,0 #177;0,836⁽⁵⁾	7,0 #177;0,60⁽⁵⁾	4,3#177;2,1⁽³⁾
Hématocrite (%)	37,1 #177; 1,2⁽⁵⁾	40,3 #177; 4,4⁽⁵⁾	35,0 #177; 3,0⁽⁵⁾	27,9 #177; 11,9⁽³⁾
Volume corpusculaire moyen (fL)	49,0 #177; 2,0⁽⁵⁾	50,0 #177; 0,80⁽⁵⁾	48,0 #177; 0,60⁽⁵⁾	67,0 #177; 15,0⁽³⁾
Hémoglobine corpusculaire moyen (pg)	18,9 #177; 0,17⁽⁵⁾	19,0 #177; 0,50⁽⁵⁾	18,0 #177; 0,50⁽⁵⁾	22,5 #177; 5,3⁽³⁾
Hémoglobine corpusculaire moyen (g/dl)	39,0 #177; 1,0⁽⁵⁾	37,2 #177; 0,88⁽⁵⁾	37,9 #177; 1,0⁽⁵⁾	33,4 #177; 1,4*⁽³⁾
Concentration d'hémoglobine (g/dL)	14,0 #177; 0,20⁽⁵⁾	15,0 #177; 1,0⁽⁵⁾	13,0 #177; 0,87⁽⁵⁾	9,7 #177; 4,2⁽³⁾

⁽³⁾n=3 ; ⁽⁴⁾n=4 ; ⁽⁵⁾n=5 ; Les valeurs représentent les moyennes #177; ESM ;*p<0,05 :différences significatives par rapport aux témoins

L'effet de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, M. whitei, P. guineense, et Z. officinale sur quelques paramètres biochimiques est présenté dans le tableau VII.Chez les mâles, aucune différence significative n'a été notée entre les taux moyens des différents paramètres biochimiques évalués chez les animaux survivants des groupes traités et leurs valeurs dans les groupes témoins correspondants. Chez les femelles survivantes par contre, dans le groupe traité à la dose 200 et 400 mg/kg, le taux moyen de cholestérol total sérique était significativement réduit respectivement de 73,79% (p < 0,01) et de 64,11% (p < 0,01) par rapport au témoin; le taux moyen d'ASAT augmentait significativement de 37,74% à la dose 100 mg/kg (p < 0,05), de 62,98% à la dose 200 mg/kg (p < 0,01), et de 84,94% à la dose 400 mg/kg (p < 0,01) par rapport au témoin; le taux moyen d'ALAT diminuait significativement à la dose 100 (p < 0,001) et 200 mg/kg (p < 0,001) respectivement de 91,45% et de 92,8% par rapport au témoin.

MALES
	Témoin	100 mg/kg		200 mg/kg		400 mg/kg
Cholestérol Total (mg/dl)	34,07 #177; 11,48⁽³⁾	21,46 #177; 3,03⁽³⁾		31,49 #177; 12,64⁽²⁾		39,62 #177; 14,48⁽²⁾
Triglycérides (mg/dl)	39,39 #177; 9,96⁽⁵⁾	83,17 #177; 31,68⁽⁴⁾		78,09 #177; 22,41⁽³⁾		54,65 #177; 9,46⁽⁴⁾
HDL-cholestérol (mg/dl)	12,03 #177; 0,239⁽⁵⁾	13,11 #177; 0,727⁽⁴⁾		13,89 #177; 1,43⁽³⁾		15,81 #177; 2,72⁽⁴⁾
Protéines Totales (mg/dl)	47,79 #177; 4,98⁽⁵⁾	41,28 #177; 5,02⁽⁴⁾		47,69 #177; 1,63⁽³⁾		45,58 #177; 7,54⁽⁴⁾
Bilirubine (mg/dl)	1,54 #177; 0,720⁽⁴⁾	2,00 #177; 0,600⁽⁴⁾		2,03 #177; 0,188⁽²⁾		1,41 #177; 0,390⁽⁴⁾
Créatinine (mg/dl)	0,440 #177; 0,0510⁽⁴⁾	0,290 #177; 0,0420⁽⁴⁾		0,730 #177; 0,140⁽³⁾		0,370 #177; 0,0650⁽⁴⁾
ASAT (U/l)	27,83 #177; 2,33⁽⁵⁾	23,60 #177; 0,297		24,07 #177; 0,339⁽³⁾		29,62 #177; 4,71⁽⁴⁾
ALAT (U/l)	109,50 #177; 50,84⁽⁴⁾	425,13 #177; 121,54⁽⁴⁾		381,83 #177; 238,16⁽³⁾		182,50 #177; 16,68⁽⁴⁾
FEMELLES
	Témoin		100 mg/kg		200 mg/kg		400 mg/kg
Cholestérol Total (mg/dl)	82,00 #177; 7,00⁽⁵⁾		87,96 #177; 9,49⁽⁵⁾		21,49#177; 9,14**⁽⁴⁾		29,43 #177; 4,44**⁽²⁾
Triglycérides (mg/dl)	107,39 #177; 27,80⁽⁵⁾		81,50 #177; 40,84⁽⁵⁾		56,18 #177; 12,48⁽⁵⁾		36,54 #177; 1,46⁽³⁾
HDL-cholestérol (mg/dl)	12,71 #177; 7,00⁽³⁾		10,53 #177; 1,81⁽⁵⁾		14,92 #177; 1,77⁽⁵⁾		11,64 #177; 0,623⁽³⁾
Protéines Totales (mg/dl)	43,08 #177; 6,92⁽⁵⁾		60,00 #177; 4,38⁽⁵⁾		51,59 #177; 5,79⁽⁵⁾		35,38 #177; 2,06⁽³⁾
Bilirubine (mg/dl)	0,894 #177; 0,769⁽²⁾		1,23 #177; 0,510⁽⁴⁾		0,900 #177; 0,400⁽⁴⁾		1,80 #177; 0,539⁽³⁾
Créatinine (mg/dl)	0,310 #177; 0,0960⁽⁵⁾		0,450 #177; 0,0610⁽⁵⁾		0,480 #177; 0,0940⁽⁵⁾		0,290 #177; 0,120⁽²⁾
ASAT (U/l)	11,53 #177; 1,63⁽³⁾		16,44 #177; 1,12*⁽⁵⁾		19,73 #177; 0,789**⁽⁵⁾		22,60 #177; 1,27**⁽³⁾
ALAT (U/l)	148,10 #177; 8,63⁽⁵⁾		6,7 #177; 2,86***⁽⁵⁾		4,7 #177; 1,43***⁽⁵⁾		143,33 #177; 1,72⁽³⁾

⁽²⁾n=2 ; ⁽³⁾n=3 ; ⁽⁴⁾n=4 ; ⁽⁵⁾n=5 ; Les valeurs représentent les moyennes #177; ESM ;*p<0,05 ; **p<0,01 ; ***p<0,001 : différences significatives par rapport aux témoins

III.2.4. Pathologie

III.2.4.1. Autopsie générale

L'autopsie des 6 animaux morts/euthanasiés au cours de l'étude a montré une rugosité et compacité du foie à la dose 400 mg/kg chez les mâles (1/6) avec une teinte sombre à toutes les doses aussi bien chez les mâles (2/6) que chez les femelles (1/6). Une compacité du colon proximal et de l'intestin grêle avec une teinte jaunâtre de ce dernierà la dose 400 mg/kg a aussi été observée chez les mâles (1/6). Un appareil digestif translucide était souvent observé aussi chez les mâles (2/6) à la dose 100 et 200 mg/kg. L'autopsie des animaux ayant survécu jusqu'à la fin de la période d'observation a montré un assombrissement général du foie et des reins chez les animaux traités par rapport aux témoins. L'examen de la cage thoracique d'une des femelles survivantes de la dose 400 mg/kg n'a pas permis d'individualiser les poumons, qui étaient dans un état inflammatoire avancé avec destruction tissulaire.

Le tableau VIII présente l'effet de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, M. whitei, P. guineense, et Z. officinale sur le poids relatif (%) de quelques organes. Aucune différence significative n'a été observée chez les mâles traités comparés aux mâles témoins. Chez les femelles, les poids relatifs moyens de la rate à la dose 200 mg/kg et des poumons à la dose 400 mg/kg étaient significativement réduits de 12,3% et 37,5% (p < 0,05 et p < 0,001) respectivement par rapport aux témoins.

Tableau VIII : Effets de l'extrait sur le poids relatifs de quelques organes (% du poids corporel)

MALES
	Témoin	100 mg/kg	200 mg/kg	400 mg/kg
Foie	3 #177;0,07⁽⁵⁾	3 #177;0,07⁽⁴⁾	3 #177;0,2⁽³⁾	3 #177;0,1⁽⁴⁾
Rein	0,3 #177;0,01⁽⁵⁾	0,3 #177;0,02⁽⁴⁾	0,3 #177;0,01⁽³⁾	0,3 #177;0,007⁽⁴⁾
Poumons	0,8#177;0,08⁽⁵⁾	0,8 #177;0,1⁽⁴⁾	0,6 #177;0,04⁽³⁾	0,7 #177;0,05⁽⁴⁾
Testicules	0,7#177;0,04⁽⁵⁾	0,7 #177;0,04⁽⁴⁾	0,7 #177;0,02⁽³⁾	0,6 #177;0,03⁽⁴⁾
Rate	0,2 #177;0,01⁽⁵⁾	0,3 #177;0,03⁽⁴⁾	0,2 #177;0,02⁽³⁾	0,4 #177;0,09⁽⁴⁾
Coeur	0,4#177;0,02⁽⁵⁾	0,4 #177;0,02⁽⁴⁾	0,3 #177;0,001⁽³⁾	0,3 #177;0,01⁽⁴⁾
FEMELLES
	Témoin	100 mg/kg	200 mg/kg	400mg/kg
Foie	3 #177; 0,2⁽⁵⁾	3 #177; 0,1⁽⁵⁾	3 #177; 0,1⁽⁵⁾	3 #177; 0,2⁽³⁾
Rein	0,3 #177; 0,01⁽⁵⁾	0,3 #177; 0,006⁽⁵⁾	0,3 #177; 0,01⁽⁵⁾	0,4 #177; 0,05⁽³⁾
Poumons	0,7 #177; 0,02⁽⁵⁾	0,9 #177; 0,1⁽⁵⁾	0,8 #177; 0,1⁽⁵⁾	0,6 #177; 0,04*⁽²⁾
Ovaires	0,06 #177; 0,006⁽⁵⁾	0,05 #177; 0,006⁽⁴⁾	0,07 #177; 0,01⁽⁵⁾	0,08 #177; 0,01⁽³⁾
Rate	0,4 #177; 0,03⁽⁵⁾	0,5 #177; 0,1⁽⁵⁾	0,3 #177; 0,01***⁽⁵⁾	0,4 #177; 0,2⁽³⁾
Coeur	0,4 #177; 0,019⁽⁵⁾	0,4 #177; 0,009⁽⁵⁾	0,4 #177; 0,02⁽⁵⁾	0,5 #177; 0,09⁽³⁾

⁽²⁾n=2 ; ⁽³⁾n=3 ; ⁽⁴⁾n=4 ; ⁽⁵⁾n=5 ; Les valeurs représentent les moyennes #177; ESM ;*p<0,05 ; ***p<0,001 : différences significatives par rapport au témoin

III.2.4.2. Histopathologie

La figure 11 présente des microphotographies de coupes de foie obtenues des animaux ayant survécus jusqu'à la fin de la période d'observation.Chez les femelles, des inflammations similaires à celle de la figure 11d ont été observées dans tous les groupes traitées à l'extrait. A la dose 100 mg/kg, on observait une congestion vasculaire (Fig. 11b). A la dose 200 mg/kg, on observait une dilatation des capillaires sinusoïdes (Fig. 11c).Chez les mâles, des inflammations très légères ont été observées aussi bien dans les groupes traités à toutes les doses que dans le groupe témoin. A la dose 100 mg/kg, on observait parfois une congestion vasculaire (Fig. 11b).

Figure 11 : Microphotographies des coupes de foie normal (Témoin)(a), de foie avec congestions vasculaires (100 mg/kg)(b), de foie légèrement enflammé + dilatation des capillaires sinusoïdes (200 mg/kg)(c), de foie enflammé (Toutes les doses)(d). Cn = congestion ; Hp = hépatocytes ; Sn = sinusoïdes ; I = foyer inflammatoire ; VCL = veine centrolobulaire ; EP = espace porte (HE×400).

La figure 12 présente des microphotographies de coupes de reins obtenues des animaux ayant survécus jusqu'à la fin de la période d'observation.Chez les femelles, une clarification tubulaire était observée à la dose 200 mg/kg (Fig. 12b). Chez les mâles, une clarification tubulaire était observée à la dose 200 mg/kg (Fig. 12b). En outre, une légère inflammation a été observée à la dose 400 mg/kg (Fig. 12c).

Figure 12 : Microphotographies de coupes de rein normal (témoin) (a), de rein présentant une clarification tubulaire (200 mg/kg)(b) ou une inflammation (400 mg/kg)(c). Gl = glomérule ; CT = clarification tubulaire ; I = foyer inflammatoire (HE×400).

La figure 13 présente une microphotographie de coupe de poumon obtenue des animaux ayant survécus jusqu'à la fin de la période d'observation.Chez les femelles, des inflammations ont été observées dans tous les groupes traités (Fig 13).Chez les mâles, des inflammations ont été observées aussi bien dans tous les groupes traités que chez le témoin (Fig 13).

Figure 13 : Microphotographies de coupes d'un poumon enflammé (Toutes les doses). Av = alvéole pulmonaire ; I = foyer inflammatoire. (HE×400)

La figure 14 présente unemicrophotographie de coupe d'ovaire obtenue des animaux femelles ayant survécus jusqu'à la fin de la période d'observation.Aucun signe de toxicité liée au traitementn'a été observé.

Figure 14 : Microphotographies de coupes d'un ovaire normal. Ov = Ovocyte(HE×400).

La figure 15 présente une microphotographie de coupe de testicule obtenues des mâles ayant survécus jusqu'à la fin de la période d'observation.De nombreuses cellules rondes immatures étaient observées dans la paroi des tubes séminifère de la membrane basale vers la lumière, aussi bien dans tous les groupes traités que dans celui du témoin (Fig. 15).

Figure 15 : Microphotographies de coupe d'un testicule présentant un grand nombre de cellules rondes (Toutes les doses). EI = espace interstitiel, MB = membrane basale, (HE×400).

Les données obtenues après un essai de toxicité orale aiguë chez l'animal peuvent être utilisées pour satisfaire à des besoins de classification du danger par le biais de la DL₅₀, et pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et/ou pour l'environnement (OECD, 2001). C'est sur cette base qu'une évaluation de la toxicité orale aiguë chez le rat de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, M. whitei, P. guineense, et Z. officinale, utilisée en médecine traditionnelle pour traiter les faiblesses sexuelles et l'asthénie chez l'homme a été réalisée. Une DL₅₀ orale estimée supérieure à 2,5 g/kg a été obtenue. Cette valeur de la DL₅₀ a permis de classer la toxicité de cet extrait dans la catégorie 5 du système de classification globalement harmonisé des substances chimiques, catégorie caractérisant les substances faiblement toxiques (OECD, 2001). Les seuls changements liés au traitement ont été observés les 2 premières heures après administration de l'extrait : les animaux présentaient des manifestations de sommeil et de léthargie, mais ces symptômes étaient fugaces. Aucun autre changement lié au traitement n'a été observé sur tout le reste de la durée d'observation, ni aucune diminution de la prise de poids. Ces résultats suggèrent donc que cet extrait présente de très faibles risques pour la santé en administration unique.

Pour identifier les risques pour la santé humaine d'une exposition répétée à l'extrait, un test de toxicité subchronique a été réalisé. Lors de l'administration orale répétée de l'extrait aux doses 100, 200, et 400 mg/kg pendant 33 jours, sur les 40 animaux initialement sélectionnées pour l'étude de la toxicité subchronique de l'extrait, 34 ont survécu, soit 6 décès. L'un des 6 décès (1 mâle à la dose 200 mg/kg) résultait de l'euthanasie d'un animal parce qu'il présentait des signes de morbidité (torticolis, tournait en rond sur lui-même de façon répétitive). Ces symptômes étaient fréquemment observés chez les animaux lors de l'élevage, suggérant ainsi l'éventualité que la pathologie observée ne soit pas due au traitement. Par la suite, 4 des 6 décès, (3 animaux à la dose 400 mg/kg : 1 mâle + 2 femelles ; et 1 animal à la dose 200 mg/kg : 1 mâle) et les symptômes d'intoxication associés semblaient liés au traitement car :

· Les animaux témoins n'ont montré aucun signe d'intoxication sur toute la période d'observation, ce qui excluait fortement les conditions de manipulation comme causes des décès.

· Ces 4 animaux décédés manifestaient communément avant leur décès 4 symptômes d'intoxication (fourrure hérissée + maigreur + léthargie + tachypnée).

Le dernier des 6 décès (1 mâle à la dose 100 mg/kg) a probablement été la conséquence d'un étouffement nocturne. En effet, le jour précédent la découverte de la dépouille, l'animal présentait les symptômes du rhume des foins (éternuement et écoulement nasal). Les causes de ce rhume n'ont pas pu être indubitablement reliées au traitement, mais l'hypothèse de liaison reste envisageable. En effet, il a été montré que Zingiber officinale pouvait être un irritant gastrique (Desai et al., 1990), provoquer des reflux gastriques (Anonymous, 2003) et des allergies (Chrubasik et al., 2005). Les reflux gastriques éventuels après gavage auraient pu irriter les parois des voies respiratoires chez l'animal et provoquer une réaction allergique.

Les symptômes sus cités (fourrure hérissée + maigreur + léthargie + tachypnée) ont été aussi observés chez un animal survivant (1 femelle à la dose 400 mg/kg) lors de la dernière semaine d'observation, associés à une réduction des facultés nociceptive, motrice, et préhensile. Une insensibilité des pattes a aussi été observée chez l'animal euthanasié et chez l'un des animaux décédé (1 femelle à la dose 400 mg/kg) peu de temps avant leur décès. Ceci suggère une activité neurotoxique de l'extrait à dose élevée. Ces résultats peuvent être soutenus par les travaux de Gruenwald (2004), quimontrentqueZingiber officinale peut entrainer une dépression du système nerveux central.

L'autopsie des animaux mort/euthanasiés en cours d'étude a montré des foies sombres, rugueux et compact, des intestins compacts et jaunâtres, et des appareils digestifs translucides (400 mg/kg essentiellement).Les observations faites sur le foie suggéraient clairement une activité hépatotoxique de l'extrait à dose élevée. La teinte jaunâtre prise par les intestins pouvait traduire un ictère. En effet, les ictères ont pour signe clinique majeur le jaunissement des muqueuses, de la peau, et des yeux, et sont généralement la résultante d'une affectionhépatique, ce qui rend cette hypothèse d'autant plus plausible.La rigidité des intestins pourraient être uneréaction en réponse à une irritation de ces derniers causée par l'extrait à dose élevée.En effet, il a été rapporté que M. whitei et Z. officinale pouvaient être des irritants digestifs (Lamidi et Bourobou Bourobou, 2010 ; Desai et al., 1990).

Excepté l'animal survivant signalé plus haut (femelle à la dose 400 mg/kg), aucune modification susceptible d'être reliée au traitement n'a été observée chez les animaux survivant sur toute la période d'observation. Ainsi, sur 28 animaux traités (l'animal euthanasié et l'animal enrhumé ont été exclu car leur décès n'a pas été strictement relié au traitement), 24 survivants ont été noté, soit 85,71% des animaux : 23 ont survécu et ont assez bien supporté le traitement soit 82,14% des animaux, 1 animal survivant manifestait des signes de toxicité liés au traitement, soit 3,57% des animaux. 4 décès liés au traitement ont été observés, soit 14,29% des animaux : 3 animaux à la dose 400 mg/kg (1 mâle + 2 femelles) soit 10,71% des animaux ; 1 animal à la dose 200 mg/kg (mâle) soit 3,57% des animaux. El-Thaher et al. (2001) ont eu un résultat similaire lors de l'étude de la toxicité subchronique d'un aphrodisiaque, Ferula harmonis, chez le rat. Ils ont recensé 6 décès sur 30 animaux traités à l'aphrodisiaque, dont 1/6 décès n'était pas lié au traitement.

Le système hématopoïétique est parmi les cibles les plus sensibles des toxiques, ce qui fait des affections de ce système un bon indice de toxicité d'une substance, comme l'est la diminution du poids corporel (Adeneye et al., 2006). L'extrait n'a entrainé aucune modification significative des paramètres hématologiques évalués chez les mâles, mais a entrainé une baisse significative de 14% de la concentration moyenne en hémoglobine corpusculaire chez les femelles à la dose 400 mg/kg comparativement aux témoins. Bien qu'étant non significative, une baisse de 46% du taux d'hématie par rapport au témoin (p = 7,30%) a aussi été observée chez les femelles à la dose 400 mg/kg. Ces observations suggèrent un effet anémiant de l'extrait à dose élevée, du moins chez les femelles. Ces résultats peuvent être soutenus par les travaux de Nebojsa et al., (2010) sur la toxicité de l'extrait à l'éthanol des graines de Aframomum melegueta chez le rat, qui ontrévéléune réduction(quoique dose-indépendante) des paramètres hématologiques de masse (hématocrite, hémoglobine, hématies) liée au traitement.El-Thaher et al. (2001) ont aussi obtenu des résultats similaires sur l'action del'aphrodisiaque Ferula harmonissur quelques paramètres hématologiques chez le rat. L'anémie pourraitrésulter des affections dues à la substance d'essai observées au niveau du foie. En effet des hépatopathies avancées peuvent être à l'origine d'anémie (Teeter et Franciscus, 2004).L'anémie pourrait aussi résulter d'une hémolyse ou de l'inhibition de la production des hématies au niveau de la moelle osseuse. Dans ce cas,l'extrait contiendrait des composésquià dose élevée, seuls où en interaction, ont une action délétère sur le système hématopoïétique.

L'extrait n'a entrainé aucune modification significative des paramètres biochimiques évalués chez les mâles. Chez les femelles, une baisse significative du taux de cholestérol total aux doses 200 et 400 mg/kg et une augmentation du taux d'ASAT aux doses 100, 200, et 400 mg/kg a été observée. L'activité hypocholesterolémiante manifeste de l'extrait à dose élevée est semblable à celle observée par El-Thaher et al. (2001) dans leur étude de la toxicité subchronique de Ferula harmonis chez le rat. Selon eux, l'activité oestrogénique de Ferula harmonis (Cotran et al., 1999), en inhibant la synthèse de cholestérol, pourrait être à l'origine de l'hypocholestérolémie. Cette hypothèse pourrait bien s'employer dans le cas de l'extrait aqueux du mélange de A. melegueta, M. whitei, P. guineense, et Z. officinale. En effet, P. guineense et A. melegueta sont utilisés en médecine traditionnelle pour le traitement des infertilités féminines (Noumi et al., 1998 ; Tane et al., 2005), ce qui laisse sous-entendre un potentiel effet oestrogénique de l'extrait, bien qu'aucune étude scientifique n'ait été retrouvée dans la littérature pour étayer ce propos. L'hypocholestérolémie peut aussi s'expliquer par l'activité hypolipémiante de Z. officinale (Kadnur et Goyal, 2005). L'hypocholestérolémie pourrait aussi être la conséquence de l'hépatotoxicité de l'extrait. En effet, le foie est le siège essentiel de la synthèse du cholestérol sanguin. Toute atteinte de la fonction hépatique pourrait donc inhiber cette synthèse et par la suite réduire les taux de cholestérol sanguin. L'augmentation du taux d'ASAT sérique peut traduire une atteinte cardiaque, des hépatopathies, des dystrophies musculaires, et des dommages aux organes internes. Les résultats des coupes histologiques suggèrent l'implication des affections hépatiques et pulmonaires dans cette augmentation. En effet, le foie et les poumons des femelles traités à toutes les doses manifestaient des inflammations liées au traitement. Ce résultat est renforcé par la valeur du poids relatif des poumons chez les femelles à la dose 400 mg/kg qui était significativement réduite de 12,3% par rapport au témoin.

Sur le plan histopathologique, comme il a été signalé plus haut, les foies chez les femelles à toutes les doses pouvaient être le siège d'inflammations, associées à des congestions vasculaires ou des dilatations des capillaires sinusoïdes, liées au traitement. Les congestions et dilatations vasculaires semblaient cependant bénignes. De très légères inflammations ont été observées chez les mâles, mais elles ne permettaient pas de conclure qu'elles étaient liée au traitement vu leur présence dans le groupe témoin. Une congestion vasculaire bénigne a été observéeet semblait liée au traitement. Il semble alors possible de conclure à unehépatotoxicité de l'extrait, du moins chez les femelles. Au niveau des reins, une clarification tubulaire bénignea été observée chez les femelles (200 mg/kg), de même que chez les mâles (200 mg/kg) avec une légère inflammation chez ces derniers (400 mg/kg), toutes liées au traitement. Ces résultats suggèrent une faible néphrotoxicité de l'extrait. Au niveau des poumons, des inflammations liées au traitement ont été observées chez les femelles (toutes les doses). Chez les mâles, les inflammations observées ne permettaient pas de conclure à un lien avec le traitement à cause de leur présence dans le groupe témoin. Ces résultats suggèrent alors une forte activité toxique de l'extrait sur les poumons, du moins chez les femelles. Cette conclusion peut être soutenue par l'observation faite lors de l'autopsie d'une femelle survivante chez laquelle les poumons semblaient avoir atteint un état inflammatoire avancé avec destruction de la structure tissulaire. Au niveau des ovaires, aucune affection liée à l'extrait n'a été mis en évidence. Au niveau des testicules, la présence de nombreuses cellules rondes en allant vers la lumière des tubes séminifèresa été observée dansles groupes traités et témoin, empêchant ainsi de conclure à une liaison avec le traitement. Ces résultats suggèrent une faible gonadotoxicité de l'extrait, du moins chez les femelles.

Il était question dans ce travail d'identifier les dangers potentiels pour la santé humaine que représente le traitement à l'extrait aqueux du mélange de Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale, utilisé en médecine traditionnelle pour traiter les infertilités masculines et l'impuissance sexuelle. Le test de toxicité orale aiguë chez le rat à permis d'obtenir une DL₅₀> 2,5 g/kg, caractéristique des substances à très faible toxicité. Aucun signe d'intoxication majeur lié au traitement n'a été observé sur toute la durée d'observation. Le test de toxicité orale subchronique (33 jours) aux doses 100, 200, et 400 mg/kg à entrainé le décès lié au traitement d'environ 14,29% des animaux traités, décès dont 75% appartenaient à la dose 400 mg/kg. L'extrait semblait présenter des propriétésneurotoxique, anémiant, hypocholestérolémiant, hépatotoxique, et de toxicité pulmonaire, essentiellement chez les femelles.

Ces résultats suggèrent que la consommation de l'extrait aqueux du mélange de Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinaleà dose thérapeutiqueprésente de faibles risques pour la santé masculine, soutenantainsi l'utilisation de ce produit dans le traitement des infertilités masculines et de l'impuissance sexuelle. Cependant, une éventuelle prise quotidienne à des doses plus élevéesexposeraitle mâleà de sérieuses affections, notamment hépatique et nerveuse, ce qui rend impératif le respect des doses prescrites lors du traitement traditionnel.

1) d'apprécier la persistance ou la réversibilité des effets toxiques après arrêt du traitement ;

2) d'évaluer la toxicité sur une période plus longue afin de mettre en évidence les effets nocifs après untraitement plus long ;

3) d'étendre l'évaluation des risques potentiels pour la santé à d'autres espèces de Mammifères, pour mettre en évidence les éventuels risques potentiels pour la santé qui ne se manifesterait pas chez le Rat.

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Etude de la toxicité systémique de l'extrait aqueux du mélange des plantes Aframomum melegueta, Mondia whitei, Piper guineense, et Zingiber officinale chez le rat

REMERCIEMENTS