République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l'enseignement et de la recherche scientifique
Université A.Mira- Bejaia
Faculté des sciences de la nature et de la Vie
Département de Biologie physico-chimie

En vu de l^~obtention du diplôme de Master en Biologie
Option Biochimie Appliquée

Remerciements

Nous remercions Dieu le tout puissant de nous avoir donné le courage et la patience pour réaliser ce modeste travail.

La première personne que nous tenons à remercier est Mr HARFI T. d'avoir accepté de nous encadrer et qui a su nous laisser la liberté nécessaire à l'accomplissement de notre recherche, tout en y gardant un Sil critique et avisé. Merci pour votre rigueur scientifique et vos conseils toujours judicieux et aussi d'avoir eu la patience

de corriger notre mémoire et de nous avoir responsabilisées du début jusqu'à la fin de notre travail.

Nous aimerons remercier tout particulièrement Dr TOUATI A. pour nous avoir accueillies au sein du laboratoire de Microbiologie et permis ainsi d'effectuer ce travail dans la liberté totale, Merci pour votre générosité et votre bonne humeur.

Nous remercions MmeBEDJOU F. la présidente du jury c'est un honneur pour nous, et Melle TOUATIN. d'avoir accepté d'examiner notre travail.

Nous témoignons toute notre gratitude pour : Mr ADJAOUD A, Melle BOUGOFFA K., Mme BENACHOUR, Mr AMROCHE F.et Mr ZAIDIpour l'aide qu'ils nous ont apporté durant notre travail.

Nous exprimons aussi notre reconnaissance à : Mr MONKO D., Mr BOUADHAM S., MrBOUCHENOUA F., Mr BELMAHDI M., Mr BAKOUR S., Mr BETTACHE A., Melle TIGHIDET S. et Mme RAHMANI D. pour leur gentillesse, leur aide et précieux conseils durant notre travail au laboratoire.

Un grand merci Pour Mr GHERBI R., de la Polyclinique d'El-Kseur pour sa générosité et sa gentillesse.

Un merci spécial pour nos camarades et amis (es) qui ont participé de prés ou de loin pour accomplir notre recherche.

Védicaces

A mes très chers parents

Vous m'avez donné le jour et vous m'avez accompagné dans mes premiers pas.

Aujourd'hui, je suis le fruit de vos efforts et de toute votre attention. Soyez
infiniment remerciés. Sachez que je vous aime profondément et que je vous suis
reconnaissante. Que Dieu vous donne une longue vie.

A mes très chères sSurs :

Farida, Dihia, Hafsa ( ma jumelle) ; Nawel et Hanane, Je vous remercie
chalheureusement pour votre soutien et encouragements, vous êtes ma raison de
vivre.

A mon frère et sa femme.

A mes neveux adorés , une fois grands , ils comprendront ce travail: Tafath,

Maria, Massil, Asma et Yasmine.

A mes très chers amis de toujours Kahina et Mehdi qui m'ont beaucoup souenue.

Ainsi qu'à tous mes amis et camarades.

FOUZIA.

iv&Iicaces

Je dedie ce modeste travail à mes precieux parents qui m'ont tous donné, qui ont
toujours été la pour moi et toute mafamille surtout mes sSurs Aziza ,Karima et
son mari Hocine et leurs enfants Katia et Walid

A mon cher frére Kamel, sa femme Hassina et leur enfant Ilias.
A mon cher mari Fouad qui a été toujours à mes cotés et à toute sa famille
A mes meilleures amies : Lili, Amel, fayza.
A mes copines de chambre : Lahna, Myada, mirouche, souad, Lydia.

Et à ceux qui me sont très chers et qui m'ont aidé de prés ou de loins à réaliser ce

travail

Nouara

Chapitre I ; Généralités sur les plantes médicinales et leurs substances
antimicrobiennes

II.2.5. Techniques d'étude de l'activité antimicrobienne des huiles essentielle 12

II.3.3. L'activité antifongique de l'huile essentielle et composés phénoliques 35

I-3.3..Activité antifongique de l'huile essentielle et composés phénoliques de J.phoenicea. 48

Liste des abréviations

PDA : Patatos Dextrose Agar S.aureus: Staphylococcus aureus SXT: Trimethoprimsulfomethoxazol TE: Tétracycline.

Liste des figures

Figure	Titre	Page
1	Structures des composés terpéniques	08
2	Structure des composés aromatiques dérivés de phényle propane C6C3	08
3	Les fruits (baies) et feuilles de Juniperus phoenicea	16
4	Comparaisonentre lesactivitéscytotoxiquesdesdeuxfeuillesetde baieshuiles essentielles deJuniperusPhoeniceasurlignées cellulaires tumorales humaines	24
5	Photo des feuilles de Juniperus phoenicea utilisée pendant l'étude	25
6	Protocol d'extraction des composés phénoliques	29
7	Illustration de la méthode des aromatogrammes sur boite de Pétri	31
8	Illustration de la méthode des microatmosphére	33
9	Schéma de dilution de l'HE	34
10	Illustration de la méthode des puits	36
11	Activité antibactérienne de l'HE	42
12	Comparaison entre les antibiotiques et l'HE de J.phoenicea	42
13	Activité antimicrobienne en fonction du taux de dilution de l'HE	43
14	Activité antibactérienne de l'HE à l'état gazeux (microatmosphére)	43
15	Effet de l'HE de J.phoenicea sur les souches bactériennes sur milieu liquide	44
16	Aromatogramme des différents extraits phénoliques de J.phoenicea	46
17	Aromatogramme en milieu liquide sur E.coli 25928	46
18	Aromatogramme en milieu liquide sur Ps aerugenosa 27853	47
19	Aromatogramme en milieu liquide sur S.aureus 4330D	47
20	Aromatogramme en milieu liquide sur Bacillus sp	47
21	Effet des composés phénoliques de J.phoenicea sur Aspergillus flavus	49
22	Activité antifongique de l'HE de J.phoenicea. Méthode des disques	49
23	Activité antifongique de l'HE de J.phoenicea. Méthode des puits	49
24	Effet de l'HE de J.phoenicea à l'état gazeux (microatmosphére) sur Aspergillus flavus	50

Liste des tableaux

Tableau	Titres	Page
I	Structure de quelques composés phénoliques	06
II	Mode d'action de quelques composés phénoliques	07
III	Classification botanique de Juniperus phoenicea	15
IV	Composants majoritaires de Juniperus phoenicea dans différents pays	19
V	Structures possibles des flavonoïdes caractérisant Juniperus phoenicea d'Afrique du Nord	20
VI	Activité antibactérienne des feuilles de J. phoenicea.	21
VII	Activité antifongique des feuilles de J. phoenicea	22
VIII	Les différentes souches microbiennes utilisées et leurs origines	25
IX	Pouvoir pathogène des souches microbiennes utilisées	26
X	Solvants, réactifs et milieux utilisés	27
XI	Comparaison des rendements en huile essentielles de J.phoenicea de différents pays	38
XII	Résultats des colorations de Gram et test de catalase réalisés sur les différentes souches bactériennes utilisées	39
XIII	Résultats obtenus des pré-tests	40
XIV	Résultat de l'activité antibactérienne de l'HE de J.phoenicea sur milieu solide	41
XV	Résultats de l'aromatogramme à l'état gazeux (Microatmosphére)	43
XVI	Résultats de l'aromatogramme sur milieu liquide	44
XVII	Résultats de l'activité antimicrobienne des composés phénoliques de J. phoenicea	45
XVIII	Résultats de l'activité antifongique des extraits de J.phoenicea	48

Introduction

Depuis l'antiquité, et certainement bien avant, les plantes ont servi de pharmacothèque naturelle et pragmatique pour l'Homme. Personne ne cherchait à savoir pourquoi ou comment elles agissent, mais c'était un fait incontesté et qui paraissait magique. En effet il est étonnant qu'une feuille, une fleur ou une racine puisse guérir ou tout au moins soulager un état pathologique ou des troubles organiques (Schauenberg et Ferdinand, 2006).

Après quelques siècles de domination de la synthèse chimique, la pharmacologie, mais aussi la nutrition et l'agroalimentaire redécouvrent les vertus des plantes dites médicinales, ce qui est le cas de toutes les plantes. Elles sont de plus en plus considérées comme source de matières premières essentielles pour la découverte de nouvelles molécules nécessaires à la mise au point de futurs médicaments (Maurice, 1997).Mais leurs usages traditionnels n'ont jamais disparus, bien au contraire. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), en 2008, 80 % de la population mondiale repose sur la médecine traditionnelle pour leurs soins primaires (Pierangeli et al, 2009).

Dans la lutte perpétuelle contre les infections microbiennes, les antibiotiques, toutes catégories confondues, ont été considérés comme l'arme absolue. Mais le phénomène de transfert de l'antibiorésistance à travers les différents genres et espèces et les effets secondaires des médicaments de synthèse, sous-estimés (parfois volontairement !) ont remis d'actualité la phytofilière (Service, 1995. Mukherjee et al, 2002 ; Mazari et al, 2010 ; Cavaleiro et al, 2006).

Dans le bagage chimique des plantes, les huiles essentielles, les alcaloïdes et autres composés phénoliques, représentent des molécules de fortes valeurs, utilisées dans les industries pharmaceutiques, cosmétiques et agroalimentaires. Les activités antibactériennes de ces produits ont été rapportées dans de très nombreux travaux (Bouzouita et al, 2008).

Juniperus phoenicea, « Ara'ar » (Cupressaceae) est un arbuste indigène sur les terres du Nord riverains de la méditerranée (Bonnier et Douin, 1990 ; Derwich et al, 2011). Cette espèce est considérée comme une importante plante médicinale, largement utilisée dans la médecine traditionnelle de nombreux pays. (Dawidar et al, 1991 ; Adams et al, 1996). Elle est utilisée à l'état vapeur pour la bronchite et le contrôle de l'arthrite. Son huile est irritante pour les microbes (Derwich et al, 2010a). Ses feuilles sont utilisées pour traiter les diarrhées, les rhumatismes et le diabète (Bellakhder, 1997 ; Allali et al, 2008). Le mélange de feuilles

et de baies de cette plante est utilisé comme agent hypoglycémiant (Amer et al, 1994). Les fruits séchés et réduits en poudre peuvent guérir les ulcérations de la peau et les abcès (Akrout, 1999). En Algérie elle est surtout reconnue pour son activité anti-diarrhéique (Dob et al, 2008 ; Mazari et al, 2010) .

Dans cette optique nous nous proposons de tester l'activité antimicrobienne de deux types d'extraits majeurs de cette plantes :

Pour la mise en évidence de cette activité nous avons retenu diverses espèces bactériennes et fongiques, avec une attention particulière sur les germes courants des toxiinfections alimentaires : E. coli et S. Aureus.

Partie Bibliographique

] i

icLeset

iii

I

A

Chapitre I:

« L'histoire des plantes aromatiques et de leur utilisation en médecine se perd dans la nuit des temps etse trouve étroitement liée à chaque civilisation »

I. Les plantes médicinales

I.1. Etudes des plantes médicinales

La connaissance rationnelle des plantes médicinales date de l'Antiquité. C'est Hippocrate qui différencia l'usage interne et l'usage externe et qui définit la notion de dose qui permet de distinguer l'effet thérapeutique de l'effet toxique (Colette-Keller, 2004). Au cours des dernières décennies, les recherches scientifiques les plus modernes n'ont fait que confirmer le bien-fondé des vertus thérapeutiques de la plupart des plantes médicinales utilisées (Carillon, 2000). Ce savoir traditionnel ancestral se transmet de génération en génération est devenu aujourd'hui une mine d'informations extrêmement précieuses pour les chercheurs d'industrie pharmaceutique (Fouché et al, 2000).

Aujourd'hui la pharmacologie s'oriente de plus en plus vers des traitements à base de plantes, car l'efficacité de la synthèse chimique a largement atteint ses limites et n'arrive plus à être créative. L'exemple de l'antibiorésistance microbienne, à l'origine de la recrudescence des maladies nosocomiales se passe de tout commentaire (Iserin, 2001).

I.2. Intérêt de l'étude des plantes médicinales

La plupart des espèces végétales contiennent des substances qui peuvent agir, à un niveau ou un autre, sur l'organisme humain et animal. On les utilise aussi bien en médecine classique qu'en phytothérapie. Elles présentent en effet des avantages dont les médicaments sont souvent dépourvus (Iserin, 2001). La raison fondamentale est que lesprincipes actifs végétaux proviennent de processus biotiques répandus dans tout le monde vivant, alors que l'essentiel des médicaments de synthèse sont des xénobiotiques aux effets secondaires très mal maitrisés (Bruneton, 2009).

Les plantes médicinales sont donc importantes pour la recherche pharmaceutique et l'élaboration des médicaments, directement comme agents thérapeutiques, mais aussi comme matière première pour la synthèse des médicaments ou comme model pour les composés pharmaceutiquement actifs (Decaux, 2002). La tubocurarine, le relaxant musculaire le plus

puissant dérive du curare (Chondroendrontomentosum). La morphine,alcaloïde caractéristique des papavers (papaver somniferum) est l'analgésique le plus puissant, utilisé dans la chirurgie lourde et la thérapie anticancéreuse (Iserin, 2001 ; Bruneton 2009). Il est difficile d'imaginer le monde sans la quinine (dérivée du genre Cinchona) qui est un alcaloïde anti malarique, sans la digoxine (du genre Digitalis) qui est cardiotonique, ou encore l'éphédrine (du genre Ephédra) que l'on retrouve dans de nombreuses prescriptions contre le rhume :stimule l'automatisme cardiaque, elle est bronchodilatatrice et stimulante du centre respiratoire bulbaire. (Iserin,2001 ; Bruneton, 2009).

Les plantes aromatiques constituent une catégorie à part, par le fait qu'elles élaborent des substances volatiles, odorantes, caractéristiques appelées huiles essentielles. (Iserin ,2001). Ces plantes,connus depuis l'antiquité, sont généralement utilisées en médecinetraditionnellecomme agents antibactériens et antifongiques. Ces propriétés antifongiques ont été confirmées par de nombreux travaux sur les souches de levures, dermatophytes et Aspergillus (Pinto et al. 2003 ; Salgueiro et al. 2003), et présentent un potentiel thérapeutique, principalement dans les maladies fongiques impliquant les muqueuses, la peau et autres infections des voies respiratoires. Certaines espèces de Juniperus, sont aussi utilisées en médecine populaire comme antiseptiques (Newall et al. 1996). Juniperus communis est traditionnellement utilisée pour le traitement des infections urinaires, Juniperus oxycedrus est utilisée comme un remède pour les infections dermatologiques (Cosentinoet al, 2003) et Juniperus phoenicea est considérée comme antimicrobien et antioxydant (Bouzouita et al, 2008 ; Hayouni et al, 2007).

I. Substances antimicrobiennes d'origine végétale

Toutes les substances antimicrobiennes dérivent du métabolisme secondaire. Le métabolisme secondaire dérive du métabolisme primaire et fournit des métabolites à faibles quantités, mais dont l'application dans différents domaines, en particulier à intérêt pharmaceutique et cosmétique, voir nutritionnel, sont de la plus grande importance (Harbone, 1998). Les composés phénoliques, les alcaloïdes ainsi que les huiles essentielles font partis du groupe de métabolites secondaires (Haddouchi et Benmansour, 2008).

II.1. Les composés phénoliques (polyphénols)

Les polyphénols sont des groupes de molécules de structures variées (TableauN°I) (Richter, 1993). L'élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d'au moins un noyau benzoïque auquel est directement lié un groupe hydroxyle, libre ou engagé dans une autre fonction : éther, ester, hétéroside (Bruneton, 1999). Les composés phénoliques sont synthétisés à partir de métabolites primaires via deux voies : la voie de l'acide shikimique et la voie des poly-acétates (Bravo, 1998 ; Lugasi et al, 2003). Les phénols furent les premiers agents antiseptiques et désinfectants largement utilisés (Lansing et al, 2003).

II.1. 1. Classification des composés phénoliques

Les composés phénoliques sont classés en plusieurs groupes principaux qui se distinguent par le nombre d'atomes de Carbone constitutifs et la structure du squelette de base (Robard et al, 1999 ; Michalak, 2006) (ANNEXE 1).

II.1.2. Principaux composés phénoliques à pouvoir antimicrobien

De nombreuses études in vitro menées sur les composés phénoliques les ont confirmés comme agents antimicrobienscontre un grand nombre de microorganismes pathogènes, avec des spectres d'activités variables (Scalbert, 1999). En effet certains quinones présentent un effet bactériostatique sur les bactéries à Gram positif mais pas vis à vis des bactéries à Gram négatif (Riffel et al, 2002). Les acides-phénols ont des propriétés antiseptiques urinaires, antifongiques et antibactériennes (Bruneton, 1999).

Des récentes études ont montré que les coumarines exercent plusieurs activités antimicrobiennes (Benidicte et Hooper, 1998) : inhibitions de la croissance de Saccaromyces cerevisiae et de la germination des spores d~Aspergillus niger. Pour l'activité antibactérienne on note qu'ils sont plus efficaces contre les Gram positifs (Benkiki, 2006).

Les flavonoïdes avec leur différentes classes dont les plus importantes sont : les flavones, flavonols, flavonones, flavonones 3-oles, flavanes-3,4 dioles, et les anthocyanidines. (Marfak, 2003) ont un grand potentiel antibactérien (Alan et Miller, 1996) :

- en se complexant avec des composants des parois avec inhibition de la croissance microbienne (Rojas et al,1992 ; Perret et al,1995) ;

D'autre part, les tanins sont largement connus par leurs propriétés inhibitrices des microorganismes et des enzymes grâce à leur pouvoir à former des complexes stablesavec les protéines et en les précipitant (Nguz et al, 1996). Ils exercent une activité antibactérienne par interaction avec la membrane cellulaire qui induit un changement morphologique de la bactérie, en inhibant l'activité des protéases, des protéines de transport et des adhésines (Cowan, 1999). Des effets inhibiteurs de la réplication des virus ont été également décritsin vitro (Bruneton, 1999 ; Charpentier et al, 2008).

II.1.3.Mode d'action de quelques composés phénoliques (TableauII)

Tableau N°II: Mode d'action de quelques composés phénoliques (Cowan, 1999).

Différents composés phénoliques	Exemples	Mécanismes
Phénols simples	Catéchol	Privation de substrat
	Epicatechine	Interruption de la fonction membranaire
		Destruction de la paroi cellulaire
Acides phénoliques	Acide cinnamique	Désactivation des enzymes
		Fixation de l'adhesine
Quinones	Hypericin	Liaison aux protéines
Flavonoïdes	Abyssinone	Inhibition des enzymes
Tannins	Ellagotannin	Interruption de la fonction membranaire.

II.2. Les huiles essentielles

II.2.1. Définition

Une huile essentielle est un produit odorant, de composition complexe, obtenu à partir d'une matière première végétale botaniquement définie, soit par entrainement à la vapeur d'eau, soit par distillation sèche, soit par un procédé mécanique sans chauffage (Bruneton, 2009). Les végétaux riches en essences se trouvent surtout chez les Conifères, Myrtacées, Labiées les Ombellifères, Rutacées,& dans différents organes de la plante (Mautrait et Raoult.2009).

II.2.2. Composition chimique

De nombreux travaux scientifiques ont contribué à mettre en évidence la composition chimique des HE's.En générale chacune comporte un nombre important de composants (jusqu'à une centaine), tous ne sont pas encore identifiés malgré les progrès de la chimie analytique au cours des dernières années (Roquebert .2002).On trouve généralement de nombreux constituants dans une HE appartenant principalement à deux grands groupes

chimiques : les composésterpéniqueset les composés aromatiques dérivés du phenyl propane (C6-C3)

II.2.2.1. Composés terpéniques

On trouve surtout des monoterpènes (C10) et des sesquiterpènes (C 15) (les carbures peuvent être acycliques, monocycliques ou bi cycliques et porteurs de groupements fonctionnels variés (Alcools Cétones, Esters,&) (Roux et Catier, 2007).(Fig.1)

Figure N° 1 : Structures des Composés terpéniques(A : monoterpènes, B : sesquiterpènes) Bruneton (1999).

II.2.2.2. Composés aromatiques dérivés de phénylpropane

Ils sont moins répandus que les précédents ; ce sont souvent des allylphenols, quelques fois des aldéhydes tel l'Eugenol. La Vanillineest assez fréquente parmi les composés aromatiques.(Roux et Catier, 2007) (Fig. 2).

Figure N°2 : Structures des composés aromatiques dérivés de phenyl propane (C6-C3) (Roux et Catier, 2007).

II.2.3. Propriétés physiques

II.2.4. Activités biologiques des huiles essentielles

Les HE's par leurs propriétés nombreuses et variées sont utilisées dans différents secteurs : en parfumerie, en cosmétologie, en conserverie et dans les industries pharmaceutiques (Dorman et Deans, 2000 ; Lahlou,2004 ; Prabuseenivasan et al, 2006 ; Rota et al,2008)

II.2.4.1. Industrie alimentaire

Les plantes aromatiques, les épices et leurs HE's sont utilisées depuis des siècles dans la préparation alimentaire non seulement pour la flaveur qu'elles apportent, mais aussi comme conservateurs, pour empêcher le développement des contaminants alimentaires. (Mebarki, 2010).

Plusieurs travaux ont montré que les HE's de genévrier, de cannelle, de romarin, de clou de girofle et d'autres plantes aromatiques ont un effet inhibiteur sur la croissance et la toxinogenése de plusieurs bactéries et champignons responsables de toxi-infections alimentaires.(Valero et Francés, 2006 ; Mebarki, 2010).

II.2.4.2.Désinfection des locaux

Grâce à leur pouvoir antiseptique des HE's peuvent permettre d'assainir l'air ambiant ou du système de ventilation, notamment dans le milieu hospitalier, entrainant un effet bénéfique au niveau de la qualité de l'air et limitant aussi la propagation des germes microbiens. (Billerbeck, 2007).

Depuis longtemps, les HE's sont utilisées en thérapeutique, leurs applications sont vastes. Elles requièrent de bonnes connaissances de ces substances et le bon fonctionnement du corps humain car si leur pouvoir antiseptique est indiscutable, leur toxicité l'est aussi (Moreno-Rodriguez et al, 2006). L'usage des HE's en médecine ne fut jamais abandonné malgré la découverte des processus de synthèse organique et la naissance de l'industrie pharmaceutique. Elles sont considérées comme un véritable réservoir de molécules de base qui sont

irremplaçables (Ouraini et al, 2007). De nombreuses HE's se trouvent dans différentes préparationspharmaceutiques : sirop, gouttes, gélules, elles rentrent aussi dans la préparation d'infusion telle que : la verveine, thym, menthe et autres (Prabuseenivasan et al, 2006 ; Domaracky et al, 2007).

En phytothérapie les HE's sont utilisées contre les maladies infectieuses d'origine bactérienne, comme les bactéries endocanalaires ou la microflore vaginale, ou d'origine fongique comme les dermatophytes, les moisissures allergisantes ou les champignons opportunistes (Billerbeck, 2002). Elles représentent aussi des propriétés cytotoxiques qui les rapprochent donc des antiseptiques et désinfectants entant qu'agents antimicrobiens à large spectre (Billerbeck, 2007). Cette activité antimicrobienne est principalement en fonction de leur composition chimique, et en particulier de leurs composés volatils majeurs (Mebarki, 2010).

Une même plante aromatique présentera une composition différente en HE's, suivant les parties utilisées, la période de cueillette, la localisation géographique et même suivant le protocole d'extraction ou le mode d'utilisation (Iserin, 2001). C'est la notion de chemotype qui présente de grandes variabilités, quantitatives et qualitatives et qui explique les divergences des résultats rapportés pour une plante donnée (Garreta,2007).

Le principal facteur modulant le spectre d'activité des HE's est le type et la structure moléculaire des composants actifs présents dans les HE's ; ainsi in vitroon observe une activité antimicrobienne plus élevée des terpènes oxygénés en comparaison aux terpènes à hydrocarbures.(Dorman et Deans, 2000). La structure moléculaire semble présenter un rôle aussi important que le degré d'oxydationde la molécule de terpène : la caractéristique lipophile du squelette hydrocarboné ainsi que la propriété hydrophile des groupes fonctionnels sont déterminantes vis-à-vis de l'activité antimicrobienne des terpénoides (Dorman et Deans; 2000). Sur cette base l'ordre de l'activité antimicrobienne de ces composés est le suivant : (Ouraini et al, 2007 ; Bekhechi et al, 2008).

Le pouvoir antimicrobien des HE's est probablement en rapport avec leur fort contenu phénolique, (Sokmen et al, 2007), mais les phénols ne sont pas les seuls responsables de

l'intégralité de l'activité, la totalité de la composition chimique devant être prise en compte (Cosentino et al 1999). Lahlou (2004) a montré que les activités antimicrobiennes, antivirales, insecticides, larvicides des extraits totaux des HE's sont supérieures à celle des composés majoritaires testés séparément.Ces données ont été confirmées par Rota et al (2008) dans une étude in vitro sur les microbes pathogènes isolés des aliments.

Un autre paramètre important déterminant l'activité antimicrobienne des HE's est le type de microorganismes ciblés, c'est ce qu'on appelle le spectre d'activité. En général les différents microbes n'ont pas une sensibilité similaire vis-à-vis des HE's. (Mebarki, 2010).Car une HE peut être biocide vis-à-vis de certaines souches et biostatique en vers d'autre ou n'avoir aucun effet (Lahlou, 2004). Donc il est important de mentionner la dénomination complète: le Gram des microorganismes ainsi que l'espèce botanique et le chemotype des HE's. (Mebarki, 2010).

- Marzouk et al (2006) ont trouvé que les bactéries à Grampositif serait plus résistantes aux HE's que les bactéries à Gram négatif ;

- D'autres travaux rapportent que les bactéries à Gramnégatif apparaissent plus résistantes que celles à Grampositif vis-à-vis des HE's (Sokmen et al, 2004 ; Cosentino et al, 1999).

Ces affirmations n'ont cependant pas été confirmées par d'autres travaux. La susceptibilité des bactéries serait en effet indépendante du Gram (Bekhechi et al 2008 ; Sokmen et al, 2004) ou dépend des HE's utilisées (Prabuseenivasan et al, 2006). Ceci souligne encore l'importance de la notion de chemotype.

Les HE's attirent actuellement beaucoup d'attentions parce qu'elles ont montré une activité contre les pathogènes résistants aux antibiotiques tels que :

Du fait de la variabilité des teneurs et des profils des composants des HE's, il est probable que leur activité antimicrobienne n'est pas attribuable à un mécanisme unique, mais à différentes cibles d'action au niveau cellulaire (Carson et al, 2002). De façon générale il a été observé une diversité d'actions toxiques des HE's :

-La coagulation du contenu protéique des cellules &etc. (Dorman et Deans, 2000 ; Oussala et al, 2006 ; Bekhechi, 2008).

Cox et al (2000) ont rapporté que l'activité antifongique des HE's est due à une augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique suivie de sa rupture entrainant une fuite du contenu cytoplasmique et donc la mort de la cellule. Les composés terpéniques des HE's et plus précisément leurs groupements fonctionnel tels que les phénols et les aldéhydes réagissent avec les enzymes membranaires et dégradent la membrane plasmique de la levure (Glodani et Kaloastran , 2006).

II.2.5. Techniques d'étude de l'activité antimicrobienne des huiles essentielles

Les méthodes utilisées pour évaluer l'activité antimicrobienne in vitro des HE's sont nombreuses et donnent parfois des résultats différents selon les conditions expérimentales adoptées par chaque manipulateur (Suhr et Nielsen 2003).

Les méthodes d'évaluation les plus utilisées sont la méthode de diffusion sur l'Agar et la méthode de dilution. Dans la première méthode les HE's sont déposées sur des disques de papier ou dans des puits creusés dans l'Agar. Dans la seconde méthode, les HE's sont incorporées dans le bouillon de culture ou d'autres liquides dans lesquels les bactéries sont présentes. Ces différentes techniques sont répertoriées et décrites dans différentes publications. (Lahlou, 2004 ; Bosio et al, 2000). C'est ce qu'on appelle l'aromatogramme.

II.2.5.1. Définition de l'aromatogramme

L'aromatogramme est une méthode qui se réalise in vitro, basée sur une technique utilisée en bactériologie médicale, appelée antibiogramme ou méthode par diffusion en milieu gélosé ou encore méthode des disques. Le contact se fait par l'intermédiaire du disque de papier sur lequel on dispose une quantité donnée des extraits de plante. Cette méthode a l'avantage d'être d'une grande souplesse dans le choix des antibiotiques testés, de s'appliquer à un très grand nombre d'espèces bactériennes, et d'avoir été largement évaluée par 50 ans d'utilisation mondiale (Fauchère et Avril, 2002). L'aromatogramme se réalise aussi sur un milieu liquide par la méthode des disques (Belaiche, 1979).

II.2.5.2. Méthode du puits ou cylindre

Proposé par Cooper et Woodman en 1946, reprise par Shroder et Messing (1949), elle mesure une diffusion radiale de l'HE à partir d'un puitsen donnant une zone d'inhibition claire et facilement mesurable. Elle consiste à découper un tronc circulaire vertical dans la gélose et d'y verser une solution d'HE de concentration connu. L'HE diffusant radialement créant une zone d'inhibition circulaire à la surface de la gélose préalablement ensemencée avec la suspension bactérienne ou fongique.(Bousbia, 2004).

II.2.5.3.Méthode de dilution

Les HE's à tester peuvent également être directement mélangées en concentration connue au milieu de culture, qu'il soit solide ou liquide sans oublier que les techniques de dilutionsexigent une dispersion homogène. Le milieu est ensuite inoculé à un taux déterminé de microorganismes et après incubation on note la présence ou l'absence de culture; la lecture peut être visuelle ou spectrophotométrique car le degré d'inhibition est en rapport avec la turbidité du milieu (Ferhat, 2004).

Chapitre II ;

Notions sur la plante etudiee

III. Biologie de Juniperus phoenicea (Genévrier)

I-1- Description du Genévrier

Le genévrier (juniperus) appartient à la famille des cupressacées où il avoisine les cupressus (Seigue ; 1985). Il comprend approximativement 60 espèces reparties dans l'hémisphère Nord (Rezzi et al, 1999). Le genre Juniperus est divisé en trois sections: Caryocedrus (une espèce : J. drupacea Labille) ; Juniperus oxycedrus ( neuf ou dix espèces) ; et Sabine (environs 50 espèces) (Adams, 1998) .C'est un arbre ou arbrisseau qui peut avoir cinq à dix mètre de hauteur (Huguette, 2008) à feuilles persistantes, étroites, linéaires, épineuses ressemblant à des aiguilles. (Fig. 5) Ses fleurs donnent des fruits improprement qualifiés de bais, globuleux et charnus (Bruneton, 2009 ; Huguette, 2008).

Le genévrier croit à l'état sauvage sur les terres arides, pierreuses exposées à la sécheresse, en Asie, en Amérique septentrionale, en Europe et sur le pourtour méditerranéen. Très rustique, il est cultivé dans tous les pays à climat tempéré. (Huguett, 2008).

Les feuilles et les fruits de plusieurs espèces du genre Juniperus sont utilisés en médecine traditionnelle et leurs composés chimiques sont incorporés dans des préparations pharmaceutiques d'usage particulièrement antiseptique attribué à la présence d'huiles essentielles (Medini et al, 2007). L'HE de baies du genévrier a des propriétés diurétiques et irritantes pour le tractus gastro-intestinal. La teneur en HE dans la gamme de baie est de 0,5 à 2,5 (v /m) et ses principaux composants sont des hydrocarbures monoterpéne tels : Pinène - Myrcéne - Sabinéne --Thuyone - Limonène,&etc. l'HE contient aussi des hydrocarbures sesquiterpènes tels : Caryophylléne - Cadinéne et Elemene (Pepeljnjak et al, 2005). Bien que les HE's des espèces juniperus, contiennent des composés phénoliques, ces derniers ne sont pas des constituants majors des huiles. (Barceloux, 2008).

Autres noms : Genévrier rouge - Genévrier de la Phénicie. Genévrier de Lycie. Appelé également « zimba » (en chaoui) ou "ara'ar" en Algérie.

Les provençaux l'appellent « mourven » ou genévrier à fruits rouges. Ces fausses baies comme celles des autres genévriers sont en fait des cônes globuleux à écailles charnues appelée globules, elles sont bien rondes, marquées de petits blafards et prennent la deuxième année une couleur brun mordorée attrayante. L'étiquette phoenicea viendrais plus de la couleur que du pays lui même ; le «rouge phénicien » étant un brun rouge puissant. (Seigue, 1985 ; Varlet, 2008).

Fleurs : Cônes males et cônes femelles habituellement sur le même pied, mais pouvant être aussi sur des pieds distincts. Mars à Avril.

Le tronc : est droit, l'écorce brun rougeâtre le système racinaire est profond. Gris brun, étalé et dressé.

Habitat: Régions méditerranéennes, littorales, collines et basses montagnes sèches et ensoleillées (espèce héliophile). Peu exigeant, s'accroche parfois aux roches et parfois abrupte. Peut se développer dans les fissures des roches. (Seigue, 1985 ;Ghrabi, 2001 ; Adams, 2004 ;Varlet, 2008 ;Rameau et al, 2008).

Cette espèce est caractérisée par sa grande résistance au vent, elle est indifférente au sol, supporte l'argile, les sables, les sols calcaires ou dolomitiques, les marnes et les sols volcaniques. En Afrique du nord elle peut vivre avec 250 mm d'eau par an, à la limite du Sahara et de la végétation de l'Alfa. En Espagne, dans la « Sierra del Cabo de Gata », station la plus aride, elle se contente de 200mm de précipitation compensés, par une grande humidité de l'atmosphère. (Seigue, 1985 ;Ghrabi, 2001 ;Adams, 2004 ;Varlet, 2008 ; Rameau et al, 2008 ; Escolà et Askew, 2009).

Figure N°3: Les fruits (baies) et feuilles de Juniperus phoenicea : A : fruits immatures (Saule, 2002). B : Fruits matures (Ghrabi ,2001)

I.4. Variation géographique est systématique de Juniperus phoenicea

Juniperus phoenicea est une espèce qui se produit au Sud de l' Europe, Ouest d'Asie et le Nord Africain en Algérie (Cet arbre constitue au côté du cèdre, la principale couverture végétale dans les montagnes des Aurès ) , au Maroc et Tunisie, également dans l'Est de Portugal jusqu'en Turquie et l'Egypte , dans les iles Canaries, et dans les montagnes de l'Ouest de l'Arabie Saoudite, mais il est plus fréquent dans la partie Ouest des régions méditerranéennes (Maatooq et al, 1998 ; Mazur et al, 2003 ; El-Sawi et Motawe ,2008 ; Achak et al, 2009 ; Derwich et al, 2010a).

J.phoenicea est une espèce qui appartient à la section Sabina, du genre Juniperus, c'est une espèce très variable, caractérisée par la présence de variations morphologiques, biochimiques et moléculaires, pour cette raison on distingue trois sous espèces (Mazur et al

2003 ; Adams et al, 2002 ; Mélanie et al, 2006) : J phoenicea subsp phoenicea, J. phoenicea Subsp eu-mediterranea et J. phoenicea var. turbinata (Adams et al, 1996). J phoenicea subsp phoenicea est caractérisée par des cônes femelles globuleux, et subaigüe à l'échelle des feuilles, par contre J. phoenicea var. turbinata est caractérisée par des cônes femelles allongés et aigue à l'échelle des feuilles. (Rezzi et al, 2001).

Plusieurs autres taxons interspécifiques sont trouvés dans les iles de Canaries et les zones littorales de France et du Maroc (Meloni et al, 2006). L'examen des terpenoides de feuilles de J.phoenicea var phoenicea de Grèce et Espagne, J.phoenicea var turbinata de dunes de sable de Tarifa, Espagne et de J. phoenicea subsp. eu.mediterranea de Portugal ; et la conclusion est que J .phoenicea var turbinata et conspecifique avec J. phoenicea subsp. eu.mediterranea (Adams, et al 2009).

II. Etude phytochimique de Juniperus phoenicea

II.1. Composition chimique

La majorité des composants chimiques isolés des feuilles et des cônes (fruits) de Juniperus phoenicea sont des huiles volatiles (Cosentino et al, 2003 ; Angioni et al, 2003). (El-Sawi et al, 2007). Des études phytochimiques antérieures de cette espèce ont montré que cette plante accumule des terpenoides, en particulier des monoterpéne, sesquiterpènes et diterpénes (Comte et al, 1997a). Cette espèce ne comprend que de petites quantités de dérivés phénoliques : Bisflavones et Lignanes, (Cairnes et al, 1980 ; Comte et al, 2007b) ; la même source a signalé la présence de phenylpropanes glycosides, juniperosides, rosarin et Skimmin et deux dérivés furanones glucosides. Stérol et hydrocarbures (AboulEla et al, 2005).

Comte et al (1996) ont démontré la présence de phoenicerosides : un pseudo dimères des deux furanones précédents, et apparition de phenylpropanes dérivé de la même espèce.

El-Sawi et Motawe (2008) en Egypte ont identifié sept nouveaux composants diterpeniques extraits des fruit de J.phoenicea à l'éther et un stérol (2-sitosterol), ces diterpénes appartiennent aux groupes Labdane, Pimarane et Abietane .

II.1.1. Composition en huiles essentielles

Divers études ont été apportées sur la composition chimique des HEs des feuilles et des baies de Juniperus phoenicea : Au Maroc (Derwich et al, 2010a ; Derwich et al, 2010b ; Derwich et al, 2011), en Egypte (El-Sawi et al, 2007), en Tunisie ( Akrout, 1999 ; Bouzouita et al, 2008.), En Algérie (Dob et al , 2008 ;Kilani et al, 2008 ; Mazari et al, 2010), aux Iles de Canaries et Madère (Adams et al, 2009), en Portugal (Cavaleiro et al, 2001), en Afrique du Nord (Barrero et al, 2006).

Les HE's ont été extraites par hydrodistillation et leur composition chimique a été analysée par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (CG/FID), et une Chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectroscopie de masse (CG/SM) (Derwich et al, 2010a).

Tableau N°IV: Composants majoritaires de Juniperus phoenicea dans différents pays.

Pays	Rendement	Composants	Auteurs
Portugal	0,41%	#177;-pinène (34,1% ) 2-phelandréne (19,2%), 2-caryophyllene (0.22%, )	Robert et al (1996)
Espagne	0,66%	#177;-pinène 53,5% 2-phelandréne 5,9% 2-caryophyllene 1.0%
Grèce	0,58%	#177;-pinène 41,8%), 2-phelandréne 0.5%,. 2-caryophyllene 3,5%)
Egypte	0,36 %	#177;-pinène 39.30%, #177; -Cedrol (31.23%) Sabinéne (24.29%).	El-Sawi etal (2007)
Maroc	1,62 %	#177;-pinene 49.15 %, #177;-phellandrene 7.39 %, 2-pinen 3.58 %	Derwich et al (2011)
Tunisie	0,5 %	#177;-Pinène 59,1%, Myrcène 1,14 %, Linalool 3,34 %	Bouzouita et al (2008)
Algerie (Djelfa)	0,8 %	#177;-pinene 40.2 %, #177;-phellandrene 14,1 %, #177;-pinene 2,0%	Dob et al (2008)
Algerie (Souk Ahras)	1,27%	#177;- pinène 47,71 %, et l'#177;- thujène 35,35%	Bouzabata et Hadef (2009)
Algerie (Batna	1,11%	#177;- pinène 50,71%, et l'#177;- thujène 37,20%	Bouzabata et Hadef (2009)
Algerie (Tlemcen )	NM	#177;-Pinene 34.5 %, 2-Phellandrene 22.4 %, #177;-Terpinyl acetate 14.7%	Mazari et al ( 2010)

II.3. .2. Composition en polyphenols :

II.3.1.1. Caractérisation des flavonoïdes :

La caractérisation des flavonoïdes de J.phoenicea d'Afrique du Nord a été réalisée par la réaction de coloration dite réaction de la Cyanidine et l'examen de la fluorescence sur plaque de chromatographie sur couche mince a révélé que cette espèce contient des flavonoïdes. L'analyse basée sur la Rf et fluorescence ont donné les résultats suivants : (Lamnaouer, 2002)

Tableau N^° V: Structures possibles des flavonoïdes caractérisant Juniperus phoenicea de l'Afrique du Nord (Lamnaouer, 2002)

III. Les différentes activités de Juniperus phoenicea

III.1. Activité antimicrobienne

Divers études ont été menées sur le pouvoir antimicrobien de Juniperus phoenicea. III.1.1 Activité antibactérienne

Région	Souches utilisés	La concentration minimale d'inhibition	Zones d'inhibition	Références
Algérie	Staphylococcus aureus.	-	10 ,3
	Enterococcus feacalis.	7	15,6
	Bacillus cereus.	-	7,0	*(Mazari et al.* 2010)**
	Escherichia coli	-	9,6
Maroc	Klebsiella pneumonia.	0,18	14
	Pseudomonas aeroginosa.	0,22	10	(Derwich et al,
	Bacillus subtilis.	0,32	10	2010)
	Streptococcus mutans.	0,40	8
Egypte	Escherichia coli.	12.34	20
	Staphylococcus aureus.	-	-
	Bacillus subtilis.	12.34	25	*(El-Sawi et al,* 2007)**
	Bacillus cereus.	-	0

III.1.2. Activité antifongique

Région	Souches utilisés	Zones d'inhibition	Références
Algérie	Aspergillus flavus.	40,6
	Fusarium oxysporum.	47,1	(Mazari et al. 2010)
	Rhizopus stolonifer	0,0
Egypte	Fusarium oxysporium	-
	Aspergillus niger	20	(El-Sawi et al, 2007)
	Aspergilus flavus	18

III.2. Activité antioxydante

L'étude est faite par les tests de DPPH et ABTS a montré que Les flavonoïdes de J.phoenicea présentent une bonne activité antioxydante. (Ennajer et al, 2009).

Test sur le saindoux (Corps gras) et l'huile de Soja. Une comparaison a été effectuée avec un antioxydant usuel '-Tocophérol : suivi de l'indice de peroxyde du saindoux et de l'huile de Soja en fonction de temps et pendant 17 jours de conservation à 65C° en présence de l'HE de J.phoenicea à une concentration de 200 ppm et comparaison avec le '-Tocophérol à la même concentration. Ces tests ont montré qu'une protection contre l'oxydation est assurée en présence de cette huile essentielle pour le saindoux et l'huile de soja (Bouzouita et al, 2008).

III.3. Activité insecticide

La propriété insecticide de l'HE de J. phoenicea est testée contre un insecte des denrées stockées Tribolium confusum, cette huile a manifesté un effet anti-appétant intéressant. Une étude préliminaire a montré que cette huile présente une toxicité élevée vis-à-vis de cet insecte. (Bouzouita et al, 2008)

III.4. Effet anti-fécondité (effet stérilisant)

Des rats males albinos ont reçu des injections quotidiennes par voie péritonéale de 400 ou 800 mg/Kg des extraits ethanoliques de cônes de J.phoenicea, durant 21 jours consécutifs. Les résultats ont montré :

- Diminution du nombre et la motilité des spermatozoïdes (prélevé de la queue de l'epididyme) des rats traités par rapport aux rats témoins.

- Le taux de grossesse chez les femelles a été réduit de 60% ou 80% après accouplement avec les males traités par 400 ou 800 mg/Kg respectivement.

- Des baisses significatives ont été détectées dans les vésicules séminales et le poids des testicules des rats ayant reçu 800 mg/kg du traitement.

- Histologiquement : les tubules ont montré un arrêt de spermatogenèse et diminution de spermatozoïdes matures.

III.5. Rôle protecteur contre l' hépatotoxicité du CCl4

Les extraits méthanoliques de Juniperus phoenicea ont été étudiés pour leurs efficacités dans la réduction de la CCl4-hépatotoxicité induite chez le rat. Plusieurs paramètres ont été suivis, à savoir :

- d'une part les paramètres biochimiques : les transaminases sériques (AST et ALT), la phosphatase alcaline (ALP), la bilirubine (Bil), des triglycérides (TG) et le cholestérol total (HDL et LDL).

- d'autre part, les paramètres d'oxydations pour le foie: les peroxydes de lipide, le glutathion (GSH), les lipoprotéines (LP) et l'oxyde nitrique (NO). Les données obtenues ont démontré que les rats injectés avec une seule dose toxique de CCl4 et sacrifiés après 24 heures présentent des changements notables au niveau de tous les paramètres testés.

Cependant, pour les rats traités avec l'agent toxique durant un mois et demi et traités avec les extraits de Juniperus, on a mis en évidence des améliorations dans le sérum et les paramètres biochimiques du foie. Les extraits phénoliques de feuilles de J.phoenicea ont montré une grande activité contre l' hépatotoxicité par rapport à la récupération auto hépatique et peuvent donc être utile dans le traitement et la récupération sécuritaire des troubles hépatiques. (Maha et al, 2007 ; Sanna et al 2010).

III.6. Activité cytotoxique de Juniperus phoenicea

Des études ont montré une grande activité cytotoxique des HE's de J.phoenicea contre les lignées cellulaires tumorales testées. L'huile de baies possède les plus hautes activités de lutte contre une tumeur de cerveau et une lignée cellulaire du poumon, suivie par la lignée cellulaire du foie et la lignée cellulaire de cancer du sein. Tandis que les faibles activités ont été enregistrées contre la lignée cellulaire du col de l'utérus (fig. 6). (El-Sawi et Motawe , 2008).

Les activités de l'HE de feuilles ressemble à celle d'HE de baies contre une tumeur au cerveau et les lignés de carcinome du col utérin, tandis que les activités de l'huile des feuilles ont montré un ordre croissant de cancer du poumon, tumeurs du foie et du sein ; La figure N°6 montre que les activités de l'HE de baies contre la ligné de carcinome du poumon, tumeurs du foie et la ligné de carcinome du sein ont été plus élevées que ceux des l'HE's des feuilles, tandis que les huiles de feuilles et de baies présentent les mêmes activités contre la tumeur du cerveau et les lignées de carcinome du col utérin. (El-Sawi et al, 2007).

Les activités élevées de ces huiles peuvent être expliquées par la présence de taux élevé de monoterpènes dans leur composition (Buhagaiar et al. 1999).

Figure N°4: Comparaison entre les activités cytotoxiques des huiles essentielles de feuilles et de baies de Juniperus Phoenicea L sur des lignées cellulaires tumorales humaines (El-Sawi et al, 2007).

IC50 = concentration de l'extrait (ug / ml) nécessaire pour réduire la survie des cellules de 50%.

Partie Experimentale

Chapitre III ;

Materiel et Methodes

I. Matériel

I.1. Matériel végétal

La plante utilisée durant l'étude est achetée chez un Producteur-distributeur de plantes médicinales à l'échelle nationale: Safa Bio-vert, Groupe Al Chifaa, Algérie (produits garantis bio.)

Figure N^° 5: Photo des feuilles de Juniperus phoenicea utilisée pendant l'étude.

I .2.Matériel biologique

I.2.1. Souches microbiennes utilisées

Le tableau ci-dessous montre l'ensemble des souches microbiennes testées. Tableau N^° VIII: Les différentes souches microbiennes utilisées et leurs origines

I.2.2. Caractères biologiques des différentes souches utilisées

Tableau N^° IX : Pouvoir pathogène des souches microbiennes utilisées (Lansing et al, 2003; Joffin et Leyral, 2006 ; Assous et al, 1999)

Souches microbiennes	Familles	Pouvoir pathogène
Esherichia coli ATCC 25928	Enterobacteriacea	Différentes formes de diarrhées, dysenterie, rôle des enterotoxines, de l'endoxine, des adhesine, certains de ces facteurs sont également impliqués dans des infections des tissus profonds.
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	Pseudomonacea	Infection pulmonaire peut être primitive ou secondaire à une septicémie.
Staphylococcus aureus ATCC 4330 D	Micrococcacea	Staphylococcie cutanées, souscutanées et muqueuses, osseuses, pulmonaire, toxi-infection alimentaire, entérocolites aigue.
*Bacillus sp*	Bacillacea	Sont fréquemment en cause dans les infections oculaires succédants à des traumatismes accidentels ou chirurgicaux .Responsable de quelques cas de toxi-infections alimentaires.
*Aspergillus flavus NRRL*	Trichocomaceae	Aspergillose invasive nosocomiale. producteur d'aflatoxines B1 (la plus importante), B2, G1 et G2. L'aflatoxine B1 est actuellement considérée comme le plus important agent carcinogène d'origine naturelle connu.

I.3. Solvants, réactifs et milieux utilisés

Réactifs	Produit	Utilisation
	Méthanol	Extraction des composés phénoliques
	Eau distillée	Préparation de l'eau physiologique
	NaCl	Préparation de l'eau physiologique
	NaOH (2N) et HCl (2N)	Ajuster le pH de l'eau physiologique à 7.
	H2O2	Test de Catalase
	Violet de Gentiane - Lugol- Alcool et Fuchsine	Coloration de Gram
Milieux utilisés	Milieu Chapman	Isolement de Staphylococcus aureus
	Milieu Hektoen	Isolement d'E. coli.
	Gélose Nutritive (GN) Gélose PCA	Isolement et croissance de plusieurs souches bacteriennes.
	Gélose Mueller- Hinton Bouillon Nutritif	Aromatogramme
	Gélose Sabouraud	Croissance des champignons Aromatogramme

II. Méthodes

II.1. Méthodes d'extraction

Avant toute extraction, le séchage des feuilles du matériel végétale est effectué dans l'étuve durant 72h à 40C° dans le bute de compléter le séchage.

II.1.1. Extraction de l'huile essentielle de Juniperus phoenicea

L'HE est extraite par hydrodistillation en utilisant un appareil de type Clevenger: l'extraction a duré 3h30' en plaçant 200 g de feuilles sèches dans un ballon avec de l'eau distillée, puis chauffer, les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant et les huiles se séparent de l'eau par différence de densité.

L'huile essentielle obtenue est mise dans un flacon à l'abri de la lumière et stockée à 4C° jusqu'aux tests antimicrobiens.

Calcul du rendement : le calcul du rendement est définit comme étant le rapport entre la masse de l'huile essentielle obtenue et la masse de matière végétale à traiter (Belyagoubi ,2006) :

Ms : Quantité de matière végétale utilisée pour l'extraction exprimée en g.

II.1.2. Extraction des composés phénoliques

Le Protocol d'extraction des composés phénoliques par macération dans le méthanol est schématisé dans la figure 6.

Culot

Surnagent

Filtration sous vide à ( 0,22
um)

Extrait sec

Séchage à
40C°

Reconstitution;
1- Méthanol: eau (80 :20)
2- dans le DMSO

Extrait phénolique

Figure N°6: Protocol d'extraction des composés phénoliques : (Hayouni et al, 2007)

II.2. Isolements et Tests de confirmation

II.2.1. Isolements des souches

Le contrôle de pureté des souches a été fait par ré-isolement de chacune des souches utilisées sur le milieu d'isolement spécifique. Le repiquage des souches s'est fait à partir du milieu de sélection sur le milieu de conservation, avec incubation à 37C° pendant 24 heures. II.2.2. Tests de confirmation

Dans le but de vérifier les caractères bactériologiques des différentes souches bactériennes, des colorations de Gram et le test de la catalase sont réalisés :

Selon Singleton et Sainsbury (1984) : Ce test permet de déceler l'enzyme de la catalase dans une souche bactérienne.

II.3. Activité antimicrobienne

II.3.1. Activité antibactérienne de l'huile essentielle

On a effectué des pré-tests dans le but de sélectionner les souches sensibles à l'huile essentielle de la plante étudiée.

· Mode opératoire : Le Protocol suivi est celui décrit par Mazari et al (2010), avec quelque modification (gélose PCA à la place de Mueller-Hinton, étalement de la suspension à la place d'écouvillonnage) :

- 0.1ml de chaque suspension est étalée sur la gélose PCA avec un râteau. Laisser sécher.

- A l'aide d'une pince stérile, imbiber un disque de papier Whatman (6 mm de diamètre) dans 10 ul de l'huile essentielle puis le déposer au milieu de la gélose ensemencée, après diffusion de l'extrait durant 1 heure étuver les boites à 37C° durant 24 heures.

Les préparations des inoculums sont faites selon les méthodes traditionnelles.

Les concentrations bactériennes des inoculums sont évaluées par turbidité et sont exprimées par la mesure de la Densité Optique (DO à 600 nm) sur un spectrophotomètre. Une DO de 0.08-0.1 correspond à 10⁸ UFC/mL. (Haddouchi et al, 2009)

II.3.1. 1. Aromatogramme sur milieu solide

Figure N°7 : Illustration de la méthode des aromatogrammes sur boite de Pétri (Zaika , 1988).

- ensemencer la gélose Mueller-Hinton avec la suspension par la méthode d'écouvillonnage. Laisser sécher.

- Les disques de papier Whatman (6 mm de diamètre) stériles imprégnés dans l'huile essentielle à raison de 10 1/4l par disque, sont déposés stérilement sur la surface de la gélose. ensemencée. . Le solvant DMSO a été utilisé comme contrôle négatif. Des antibiotiques standards : Tétracycline « TE » (30 1/4g / disque), Trimethoprimsulphamethoxazol « SXT » (1.25 /23.75) 1/4g / disque) et la Céfalexine

« CN » (30 1/4g / disque) ont été utilisés comme témoins positifs. Chaque test est effectué en triple.

- Après diffusion de l'extrait durant 1 heure ,étuver les boites à 37C° durant 18 à 24 heures.

- L'activité antimicrobienne est déterminée à l'aide d'une règle mesurant le diamètre de la zone d'inhibition.

II.3.1. 2. Aromatogramme sur milieu liquide Mode opératoire

- à l'aide d'une pince stérile saisir un disque de papier Whatman (de 6mm de diamètre) et l'imprégner dans 10 ul de l'HE , le déposer dans le tube contenant la suspension bactérienne.

- incuber à 37C° durant 18 à 24 heures, puis mesurer la densité optique (DO). - le test est effectué une seule fois.

II.3.1. 3. Activité de l'HE en phase gazeuse (Microatmosphére)

Dérivée de la méthode précédente le procédé est techniquement proche de celui des aromatogrammes. La différence réside principalement dans la position du disque imprégné. Dans cette technique, le disque est déposé au centre du couvercle de la boîte de Pétri, renversée pendant la durée de l'expérience. Celui-ci n'est donc plus en contact avec le milieu gélosé (Fig. 8) (Pibiri ,2006).

Figure N^° 8 : Illustration de la méthode des micros atmosphères (Zaika, 1988)

- Un disque de papier Whatman (de 6 mm de diamètre) imprégné dans 10 ul d'huile essentielle est déposé au centre du couvercle d'une boîte de pétri contenant la gélose M-H ensemencée.

Le but de cette méthode est d'exploiter les propriétés de la phase volatile des huiles essentielles. Et de déterminer l'effet de l'HE des feuilles de J.phoenicea sur les souches testées.

II.3.1. 4. Activité en fonction de dilution

L'activité en fonction de dilution est estimée conformément aux procédures publiées par (Koneman et al, 1997 ; Derwich et al ,2010). Elle n'est évaluée que pour les microorganismes qui affichent une certaine sensibilité.

- Dilution de l'HE dans le Diméthylsulfoxyde (DMSO) (1 :2 ; 1 :4 ; 1 :8 et 1 :16)

- imprégner des disques de papier Whatman (de 6 mm de diamètre) dans 10 ul de chaque dilution et déposer sur la gélose M-H ensemencée de la suspension bactérienne par écouvillonnage.

- Un contrôle négatif est également effectué en utilisant un disque de papier immergé dans 10 ul de DMSO pour vérifier l'activité possible de ce solvant contre les bactéries testées.

- Diffusion de l'extrait durant 1 heure.
- Incubation à 37 C° durant 24 heures.

II.3.2. Activité antibactérienne des composés phénoliques

La méthode sur le milieu gélosé utilisée est celle citée par (Hayouni et al, 2007)

- A l'aide d'une pince stérile des disque de papier Whatman (de 6mm de diamètre)

sont imbibés dans 10 ul des extraits (extrait phénolique reconstitué dans le MéthanolEau ( 80 : 20), et extrait phénolique reconstitué dans le DMSO ) puis déposés sur la gélose M-H ensemencée de suspension bactérienne par écouvillonnage un contrôle négatif a été effectué en utilisant un disque de papier trempé dans 10 ul de DMSO et Méthanol --Eau (80 : 20) pour vérifier l'activité éventuelle de ces solvants contre les souches bactériennes testées.

L'évaluation de l'activité antibactérienne des composés phénoliques est également effectuée sur milieu liquide , selon le protocole de Bosio et al, (2000) :

- à l'aide d'une pince stérile saisir un disque de papier Whatman (de 6mm de diamètre)

et l'imprégné dans 10 ul de chaque extrait, le déposer dans le tube contenant la suspension bactérienne.

- incuber à 37C° durant 18 à 24heures, puis mesurer la densité optique (DO). - Les tests sont effectués une seule fois.

II.3.3. Activité antifongique de l'huile essentielle et composés phénoliques de J.phoenicea

Dans le cadre de notre étude, On a essayé trois méthodes pour l'activité antifongique de l'HE de J.phoenicea et une méthode pour les composés phénoliques :

II.3.3.1. Méthode des puits

Dans cette méthode le milieu utilisé est la gélose Sabouraud. La procédure suivie est celle d'Ismail et al (2008) :

- Des spores d'Aspergillus flavus d'une semaine sont mises en suspension, 1mL de la

- creuser des puits de 6 mm de diamètre à l'aide d'une pipette Pasteur stérile. Dans le

but d'éviter la diffusion des extraits sous la gélose, 20 uL de la gélose blanche est déposée dans chaque puits (Fig. 10).

- La deuxième boite : dans un puits déposer 50 uL d'extrait phénolique reconstitué dans le MeOH- Eau (80 :20), et le deuxième puits, 50 uL d'extrait phénolique reconstitué dans le DMSO.

Réalisation des puits de 6 mm de diamètre sur le milieu ensemencé et injecter 50 ul de l'extrait dans chaque puits

Mesure des diamètres des zones d'inhibition après 24 - 48 h et 7 jours d'incubation

Figure N ° 10 : Illustration de la méthode des puits. II.3.3.2. Méthode des disques

Le protocole suivi est celui d'El-Sawi et al (2007) avec une légère modification (gélose Sabouraud à la place de la gélose PDA) :

- Ensemencement d'une gélose Sabouraud avec 1mL de la suspension de spores d'Aspergillus flavus par inondation.

- Des disques de papier Whatman de 7 mm de diamètre sont imprégnés dans 20 uL de l'HE, et déposer stérilement sur la gélose.

- Des disques de papier Whatman de 7 mm de diamètre sont imprégnés dans 20 uL de

l'HE, et déposer stérilement sur le couvercle de la boite. Laisser diffuser durant 1heure - Incuber à 28 C^°, durant 48 heures.

Chapitre Iv ;

Resultats et Discussion

I. Résultats

I.1. Extraction de l'huile essentielle

L'huile essentielle de Juniperus phoenicea obtenue par hydrodistillation est un liquide visqueux, limpide d'une coloration jaunâtre et à odeur forte caractéristique du genévrier.

Le rendement en huile essentielle de J. phoenicea local est de 0,42. Il diffère d'un pays à un autre (Derwich et al, 2010b). (Tableau N° XI).

Tableau N° XI : Comparaison des rendements en huile essentielle de J.phoenicea de différents pays.

I.2. Tests de confirmation

Les résultats des colorations de Gram et du test de catalase effectués sur les différentes souches bactériennes utilisées sont indiqués dans le tableau N° XII:

Tableau N° XII : Résultats des colorations de Gram et test de catalase réalisés sur les différentes souches bactériennes utilisées :

I.3. Activité antimicrobienne

I.3.1. Activité antibactérienne de l'huile essentielle

Souches bactériennes	Résultats (Activité)	D (mm)	E1 (mm)	E2 (mm)	E3 (mm)
Escherichia coli 25 928	+	14.0 mm	9mm	9mm	11mm
Pseudomonas aeruginosa 27853	-	/	/	/	/
Staphylococcus aureus 4330D	++	31.78 mm	15mm	10mm	10mm
*Bacillus*	+	9.0 mm	NT	NT	NT

+: HE active. ++ HE très active. - HE n'est pas active. /: Pas de zone. NT : Non testée.

I.3.1.1. Aromatogramme sur milieu solide

Tableau N° XIV: Résultat de l'activité antibactérienne de l'HE de J.phoenicea sur milieu solide

Souches	Zones d'inhibition (D1) en mm	Contrôle positif			Zones d'inhibition fonction du taux de dilution (D2) en mm
		TE	CN	SXT
Escherichia coli ATCC 25 928	11 mm	25mm	R	28mm	00
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853	-	NT	NT	NT	NT
Staphylococcus aureus ATCC 4330D	19,5 mm	25mm	26mm	30mm	19 mm
*Bacillus sp*	16 mm	28mm	25mm	15mm	11 mm

Les résultats de l'activité antibactérienne de l'HE de J.phoenicea utilisant la méthode des disques sur milieu gélosé ont montré que l'HE exhibe une activité contre trois souches bactriennes sur quatre germes testés en dépit de leur morphologie et de leur Gram. En effet l'HE de J.phoenicea exerce une forte activité sur les bactéries à Gram positif, comme on peut le voir dans le Tableau N° XIV, S.aureus 4330D est la souche la plus sensible avec une zone d'inhibition maximale de 19,5 mm, suivie de Bacillus sp avec 16 mm et une zone minimale de 11 mm pour E .coli 25 928 . Nous avons enregistré une absence d'activité sur Pseudomonas aeruginosa 27853 (Fig. 11). Toutefois, des zones d'inhibition ont été plus faibles que celles des antibiotiques, qui ont montré une inhibition très forte de la croissance bactérienne. (Fig. 12).

Pour les zones d'inhibition obtenues à partir de l'huile diluée en (1 :2, 1 :4, 1 :8 et 1 :16),
nous avons remarqué une inhibition de croissance maximale pour l'huile diluée en 1 :2 , pour
S.aureus 4330D une zone d'inhibition de 19 mm de diamètre , Bacillus sp 11 mm de

diamètre , et sur E. coli 25 928, l'huile diluée n'est pas active avec 0, 00 mm de diamètre. Les résultats ont montré que l'activité diminue avec les dilutions. (Fig. 13).

Figure N^° 11 : Activité antibactérienne de l'HE (1 ,2 ,3 tests en triple. 4 : l'HE diluée dans le DMSO à 1/10) .A : E. coli 25 928 .B : Ps.aeruginosa 27853 .C : S.aureus. 4330D. D : Bacillus sp.

Figure N° 12 : Comparaison entre les antibiotiques et l'HE de J.phoenicea. A : E. coli 25 928 .B : S.aureus. 4330D. C : Bacillus sp. HE : Huile Essentielle. CN : Cefaléxine, TE : Tétracycline. SXT : Trimethoprimsulphamethoxazol.

Figure N^° 13 : Activité antimicrobienne en fonction du taux de dilution de l'HE. A : E. coli 25 928 .B : Ps.aeruginosa 27853 .C : S.aureus. 4330D D : Bacillus sp.

I.3.1.2. Micro-atmosphère (état gazeux)

Tableau N^° XV : Résultats de l'aromatogramme à l'état gazeux (Microatmosphére)

L'activité antimicrobienne de l'HE est évaluée par la méthode de micro-atmosphère, les résultats ont montré une inhibition que pour Bacillus sp avec une zone de 20mm de diamètre et S. aureus 4330D avec une zone de 15 mm de diamètre, par contre on a observé une croissance d'E. coli 25 928. (D= 0, 00 mm de diamètre) (Fig. 14). L'HE de J.phoenicea a exercé sa propriété volatile sur les souches inhibées.

Figure N°14 : Activité antibactérienne de l'HE à l'état gazeux (microatmosphére) A : E. coli 25 928. B : S.aureus. 4330D. C : Bacillus sp.

I.3.1.3. Aromatogramme sur milieu liquide

Figure N° 15 : Effet de l'HE de J.phoenicea sur les souches bactériennes sur milieu liquide. 1 : E. coli 25 928. 2 : S.aureus. 4330D. 3 : Bacillus sp. A : avant incubation. B : après incubation à 37C^° durant 24 heures.

L'activité antimicrobienne de l'HE est effectuée uniquement sur trois souches bactriennes, les résultats ont montré une diminution de la densité optique (DO) des suspensions bactriennes des trois germes testés, donc pas de croissance bactérienne.

I.3.2. Activité antibactérienne des composés phénoliques

Les résultats de l'activité antibactérienne des composés phénoliques sur milieu solide et sur milieu liquide sont illustrés dans le tableau ci- dessous.

Tableau N° XVII : Résultats de l'activité antimicrobienne des composés phénoliques de J. phoenicea

Méthode Souches	Milieu liquide						Milieu solide
	CPM			CPD			CPD	CPM
	DO0	DO1	DO2	DO0	DO1	DO2
Staphylococcus aureus ATCC 4330D	0,521	1,436	43,1	0,703	1,160	40,5	-	-
Escherichia coli ATCC 25 928	0,265	1,257	38,6	0,354	1,634	48,2	-	-
*Bacillus sp*	0,331	1,958	40,5	0,206	1,940	40,5	-	-
*Pseudomonas* aeruginosa ATCC 27853	0 ,257	1,659	16,1	0,208	1,828	16, 4	-	-

- DO0 : densité Optique de la suspension bactérienne avant l'aromatogramme

- DO1 : densité Optique de la suspension bactérienne après l'aromatogramme et incubation durant 24heures.

- DO2 : densité Optique de la suspension bactérienne diluée après l'aromatogramme X l'inverse de la dilution (X 10 2)

L'activité antimicrobienne des composés phénoliques de J.phoenicea a été évaluée sur quatre souches bactériennes par deux méthodes : la méthode des disques sur milieu solide et sur milieu liquide, les résultats de la méthode de diffusion sur milieu gélosé ont montré une absence de zone d'inhibition chez toutes les bactéries testées. On a observé une présence d'une croissance microbienne sur le milieu liquide (augmentation de la DO), ce qui signifie

une absence d'activité des composés phénoliques vis à vis des germes testés. (Fig. 16, 17, 18, 19,20).

Figure N° 16: Aromatogramme des différents extraits phénoliques de J.phoenicea. CPD (Extrait phénolique reconstitué avec DMSO), D : DMSO. CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH : Eau (80 :20). ME : MeOH : Eau. A : E. coli 25 928 .B : Ps.aeruginosa 27853 .C : S.aureus. 4330D D : Bacillus sp.

Figure N° 17: Aromatogramme en milieu liquide sur E.coli 25928 (A : avant test, B : après le test). CPD : Extrait phénolique reconstitué avec le DMSO. D : DMSO. CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH- Eau (80 :20) . M-E : MeOH : Eau ( 80 :20).

Figure N° 18 : Aromatogramme en milieu liquide sur Ps aeruginosa 27853. (A : avant test, B : après le test) .CPD : Extrait phénolique reconstitué avec DMSO. D : DMSO. CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH- : Eau (80 :20). M-E : MeOH : Eau (80 :20).

Figure N^° 19 : Aromatogramme en milieu liquide sur S.aureus 4330D (A : avant test, B : après le test) .CPD : Extrait phénolique reconstitué avec DMSO. D : DMSO. CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH- : Eau (80 :20). M-E : MeOH : Eau (80 :20).

Figure N^° 20 : Aromatogramme en milieu liquide sur Bacillus sp (A : avant test, B : après le test) CPD : Extrait phénolique reconstitué avec DMSO, D : DMSO. CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH : Eau (80 :20). ME : MeOH : Eau (80 :20)

I-3.3. Activité antifongique de l'huile essentielle et composés phénoliques de J.phoenicea.

Les résultats de l'activité antifongique de l'HE et composés phénoliques sont présentés dans le tableau suivant :

Tableau N° XVIII : Résultats de l'activité antifongique des extraits de J.phoenicea :

Souche	Méthodes	Extraits
Aspergillus flavus NRRL		HE			CPM	CPD
		D après 24heures	D après 48heures	7 jours
	Méthode des disques	15.5 mm	17mm	C	NT	NT
	Méthode des puits	11 mm	8 mm	C	-	-
	Microatmosphére	00 mm	00 mm	/	NT	NT

- CPD : Extrait phénolique reconstitué avec DMSO), CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH : Eau (80 :20)

Pour les tests antifongiques utilisant la méthode des disques et la méthode des puits trois observations sont effectuées, la première après 24heures d'incubation et la deuxième après 48 heures et la troisième après 7 jours d'incubation .à 28 C

L'huile essentielle et extraits phénoliques isolés à partir des feuilles de J. phoenicea sont testés pour l'activité antifongique contre une souche de champignon Aspergillus flavus utilisant trois méthodes pour l'effet de l'huile essentielle et une méthode pour tester l'effet des composés phénoliques ( Tableau N° XVIII), pour ces derniers , utilisant la méthode des puits , les résultats des analyses ont montré que l'activité antifongique est nulle , en effet on observe aucune zone d'inhibition ( Fig. 21) .

L'huile essentielle a modérément réduit la croissance d'Aspergillus flavus par la méthode des disques (diffusion sur milieu gélosé), avec une zone de 17 mm (après 48 heures d'incubation) , après 7 jours d'incubation nous avons remarqué une reprise de croissance du champignon dans la zone d'inhibition (Fig. 22). Par contre on a observé avec la méthode des puits, une zone d'inhibition de 8 mm de diamètre, bien que la souche soit sensible, la technique des

puits semble inefficace ! Nous avons remarqué une croissance du champignon dans la zone d'inhibition après 7 jours d'incubation (Fig. 23). L'HE de J.phoenicea n'a cependant pas exercé ses propriétés de volatilité contre A. flavus, cela est montré par le résultat obtenu lors de la microatmosphére.

Figure N^° 21 : Effet des composés phénoliques de J.phoenicea sur Aspergillus flavus. CPD : Extrait phénolique reconstitué avec DMSO. CPM : Extrait phénoliques reconstitué avec MeOH- : Eau (80 :20).

Figure N° 22 : Activité antifongique de l'HE de J.phoenicea. Méthode des disques : A : après 24 heures d'incubation. B : après 48heures et C : après 7 jours d'incubation.

Figure N^° 23 : Activité antifongique de l'HE de J.phoenicea. Méthode des puits : A : après 24 heures d'incubation. B : après 48heures et C : après 7 jours d'incubation.

Figure N^° 24: Effet de l'HE de J.phoenicea à l'état gazeux (microatmosphére) sur Aspergillus flavus.

II. Discussion

Plusieurs paramètres peuvent être à l'origine de la présence ou l'absence de l'activité antimicrobienne.

La taille de l'inoculum : un inoculum trop dense peut conduire à des résultats faussement négatifs. Un inoculum trop faible peut conduire à des résultats faussement positifs. Pour notre étude on a choisi un inoculum dont la densité est de 0,08- 0,10, pour avoir un tapis régulier

D'après les résultats des tests antibactériens, on constate que trois souches bactériennes sur quatre présentent une certaine sensibilité.

Ces résultats montrent une activité vis-à-vis des Gram positifs que les Gram négatifs. D'après (Nikaido, 2003), ces résultats pourraient être dus à la composition de la membrane des bactéries Gram négatifs. En effet, ces dernières possèdent une membrane qui présente une perméabilité sélective; la surface des lipopolysacharides contient des charges négatives, qui empêchent la diffusion des molécules hydrophobes, et des porines qui bloquent le passage des molécules à haut poids moléculaire (Garrett et Grisham, 2000). Pseudomonas aeruginosa contient dans sa membrane des porines de faibles perméabilités. Contrairement aux Gram négatif, les bactéries à Gram positif se sont montrées plus sensibles.

Nos observations concordent avec les résultats obtenus sur l'activité antimicrobienne des huiles essentielles de Juniperus phoenicea sur les bactéries à Gram positifs à Gram négatifs (Bouzouita et al, 2008) et avec d'autres travaux sur le fait Pseudomonas aerogenosa résistait aux extraits de J. phoenicea. (Mazari et al, 2010)

On constate également que les zones d'inhibition étaient inférieures à celles des antibiotiques, qui ont montré des zones d'inhibition larges par apport à celles obtenues en testant l'huile essentielle de J. phoenicea.

Divers paramètres contribuent à expliquer cette différence d'efficacité entre les antibiotiques et les huiles essentielles :

Les huiles essentielles de J. phoenicea ont été examinées également pour l'activité antifongique contre Aspergillus flavus. Les résultats ont prouvé que les huiles essentielles ont modérément réduit la croissance de ce champignon. Ces résultats sont conformes à ceux obtenus dans une autre étude en Algérie (Mazari et al ,2010). Après 7 jours d'incubation à 28 C°, il y a eu croissance d'A. flavus dans les zones d'inhibition, ce qui nous conduit à déduire que l'effet de l'huile essentielle de J.phoenicea sur la souche fongique testée est fongistatique.

L'activité antimicrobienne des huiles essentielles des feuilles de J. phoenicea pourrait, en grande partie, être associés à ses principaux constituants : les monoterpénes hydrocarbures tels #177;- pinène, 2-phellandrène et 2-pinène, qui ont montré les propriétés antimicrobiennes (Derwich et al, 2010b ; Mazari et al, 2010). ). En effet #177;-pinène, est connu pour exercer une activité inhibitrice sur E.coli, S.aureus et B. subtilis (Bourkhiss et al, 2007), les mêmes espèces que nous avons détectées comme sensibles. Ces activités ont été reliées aux terpènes C10 et C15 avec les noyaux aromatiques et les groupes d'hydroxyles phénoliques capables de former des liaisons hydrogène avec les sites actifs des enzymes des cellules-cibles ( Derwich et al, 2010 b). D'autres terpènes actifs comme des alcools, des aldéhydes et des esters puissent contribuer à l'effet antimicrobien global des huiles essentielles (Belletti et al, 2004 ; Derwich et al, 2010 b).

De plus, divers composants mineurs peuvent également contribuer à l'activité antimicrobienne des huiles essentielles impliquant une synergie avec les autres composés actifs (Mazari et al, 2010).

Les résultats de l'aromatogramme sur milieu liquide de l'HE ont montré une diminution prolongée de la densité optique des suspensions bactériennes des germes testés ; cela ne peut être dû qu'à une mort cellulaire, Ce qui nous conduit à déduire que l'effet de l'HE sur les bactéries testées est bactéricide. En effet les huiles essentielles peuvent avoir : une activité létale (bactéricide) et une inhibition de la croissance (bactériostatique). L'activité des huiles essentielles est souvent assimilée à une activité bactériostatique. Cependant des études ont montré que les huiles essentielles peuvent avoir aussi des propriétés bactéricides (Lambert et al, 2001).

De plus, si les résultats obtenus en milieu liquide sont supérieurs à ceux obtenus en milieu solide, c'est que surtout, en milieu liquide, l'évaporation des huiles essentielles est nulle et donc ces huiles exercent leur activité de manière plus efficace et plus prolongée.

Les tests en micro-atmosphère ont donné une inhibition certaine, dans la mesure où on n'observe une inhibition qu'au dessus des zones correspondantes à l'exposition aux vapeurs des huiles essentielles.

Pour les composés phénoliques de J.phoenicea, les résultats obtenus n'ont indiqué aucune zone d'inhibition, donc aucune activité antimicrobienne vis a vis des cinq souches utilisées, que ça soit les souches bactériennes ou Aspergillus flavus, et ceci contrairement aux résultats obtenus dans d'autres études (Hayouni et al, 2007).

Nos extraits phénoliques ne sont pas actifs sur aucune des différentes souches testées, cela peut être dû à la méthode ou le solvant utilisé pour l'extraction. En effet Hayouni et al (2007) ont montré que la méthode d'extraction et la nature du solvant peuvent influencer sur l'activité antibactérienne des composés phénoliques de J.phoenicea. La sensibilité des germes utilisés aux extraits phénoliques peut aussi être dû au fait que J.phoenicea utilisée durant notre étude contient peu de composés phénoliques qui peuvent exhiber une activité antimicrobienne.

Les résultats montrent que l'activité antimicrobienne du genévrier est un fait confirmé. Dans le cas de notre échantillon cette activité semble véhiculée uniquement par les huiles essentielles. Nos résultats montrent que cette activité reste efficace sur les germes sensibles quel que soit le mode d'administration : liquide, solide ou gazeux (vapeurs).

De plus les germes testés positifs justifient l'usage populaire de cette plante et confirme son activité thérapeutique anti-diarrhéique: S.aureus, E.coli et Bacillus sont des germes très souvent impliqués dans les toxi-infections alimentaires. Nous regrettons beaucoup que des problèmes de contaminations nous aient empêchées de tester ces huiles sur une star des intoxications alimentaires : Salmonella.

Nous terminerons en mentionnant une extraction effectuée avec un échantillon identique à tous ceux qui ont été utilisés dans cette étude et dont l'huile essentielle s'est pourtant montrée totalement inactive sur toutes les souches testées.

Ceci souligne le défaut majeur qui est toujours reproché aux plantes médicinales : un manque de stabilité des principes actifs.

- caractéristiques régionales et variétales (Melani et al, 2006 ; Adams ,2002) ; - période de la récolte/cueillette ;

Malgré toutes ces réserves le potentiel thérapeutique des plantes est indiscutable et si elles ont beaucoup de mal à s'imposer comme véritable alternative pour la pharmaco-synthèse c'est uniquement pour des raisons politico-économiques.

Conclusion

L'échantillon de genévrier testé est un échantillon représentatif de la plante pour le Nord d'Algérie. En effet la plante provient de récoltes de plantes spontanées de différentes régions d'Algérie. Elle est garantie 'Bio', par le laboratoire qui la récolte et la distribue.

- les extraits phénoliques de poudre desfeuilles, dans les conditions d'extraction retenues ne présentent aucun effet inhibiteur sur la croissance ni des bactéries ni des champignonstestés ;

- à l'inverse, l'essai qualitatif de l'huile essentielle extraite par hydrodistillationa révélé une activitéantimicrobienne certaine. En effet elle a inhibé la croissance de trois des quatre souches bactériennes testées, ainsi que d'une souche fongique , quelle que soit la méthode d'application utilisée (sur milieu solide, milieu liquide ou état gazeux),

Des étudesantérieures effectuées sur l'évaluation du potentiel antimicrobien de l'HE de J. phoenicea provenant dedifférentesrégions d'Algérie, et différents pays du monde, ont déjà montrés des résultats similaires( Mazari et al 2010 ;Derwich etal, 2010b).

Il est important de souligner que dans ce travail et, pour des raisons pragmatiques, nous n'avons envisagé ni l'optimisation de l'extraction, ni l'optimisation de l'activité.

Nous avons voulu nous mettre dans les conditions de son utilisation traditionnelle.

Nous remarquons que les germes testés qui ont manifesté une sensibilité aux huiles essentielles du genévrier sont des germes souvent rencontrés dans les toxi-infections 'grand public' qui s'accompagnent souvent de manifestations diarrhéiques. Ainsi l'utilité thérapeutique que lui reconnait la médecine populaire est, en grande partie justifiée.

Cette démonstration indiscutable, obtenue avec un protocole simple (pour ne pas dire simpliste) et des moyens dérisoires laissent voir à quel point il serait complètement irresponsable de négliger la phytofilière sur le plan recherche et sur le plan exploitation, surtout pour les pays émergeants.

Ildrences libliographiques

Aboul-Ela, M.; El-Shaer, N. and El-Azim, TA.( 2005). Chemical constituents and antihepatotoxic effect of the berries of Juniperus Phoenicea Part II. Natural Produc. Sciences. 11(4):240-247.

Achak N., Romane A., Alifriquie M., Adams RP. (2009). Chemical Studies of Leaf Essential Oil of Three Species of Juniperus From Tensift Al-Haouz - Marrakech Region (Morocco). Journal of Essent oil Res. 21 : 337-341

.Adams RP. Barrero AF., Lara A. (1996). Comparisons of the leaf essential oils of juniperus phoenicea, J.phoenicea subsp. eu-mediterranea , Lebr & Thiv. and J.phoenicea var turbinata ( Guss.) Parl. Journal of Essent oil Res . 8 : 367- 371 .

Adams RP. (1998). the Leaf Essential Oils And Chemotaxonomy Of Junuperus Sect. Juniperus. . Biochemical systematics and Ecology. 26 : 637- 645

Adams, RP. (2004). Junipers of the World: The genus Juniperus. Trafford Publishing, Vancouver, BC, Canada

Adams RP. (2011). Species Descriptions, Distribution Map and Plant Photo. In juniperus of the word: the genus juniperus, 3^rd edition Trafford rev, USA . p 436.

Adams RP, Pandey N, Rezzi S, Casanova J., (2002). Geographic variation in the Random Amplified Polymorphic DNAs (RAPDs) of Juniperus phoenicea, J. p. var. canariensis, J. p. subsp. eumediterranea, and J. p. var. turbinata. Biochemical Systematic Ecology 30: 223-229 Adams RP., Rumeu B., Nogales M., Fontinha SS.,(2009 ) . Geographic variation and systematics of Juniperus pheonicea L. from Madeira and the Canary Islands : Analyses of leaf volatile oils. Phytologia . 91(1) :40-53.

Akrout A., (1999). Etude des huiles essentielles de quelques plantes pastorales de la région de Matmata (Tunisie). Institue des régions arides, 4119 Médenine- Tunisie

Alan L., Miller N.D. (1996) . antipxydant flavonoides, function and clinical usage. Alternative Medecine, Review. 1(2) : 4-10 .

Allali H., Benmehdi H., Dib MA., Tabti B., Ghalem S., Benabadji N. (2008). Phytotherapie of diabéte in west Algeria . Asian J. Chem. 20 : 2701- 2710

Angioni, A., Barra, A., Russo, MT., Coroneo, V., Dessi, S. and Cabras, P. (2003). Chemical composition of the essential oils of Juniperus from ripe and unripe berries and leaves and their antimicrobial activity. J Agric Food Chem. 51(10): 3073-3078.

Amer MMA., Wasif MM. , Abo Aytta AM (1994). Chimical and evaluation of Juniperus phoenicea as a hypoglycaemic agent. J. Agric. Res. 21 : 1077-1091.

Assous M-R., Basse- Guérineau A-L., Bourhy R-D et Paugam A. (1999). Microbiologie et Pathologie Infectieuse. 2^eme Edition. Ed DeBoeck Université. P 979.

Barrero A F, Herrador, M M, Arteaga, P, Quílez Del Moral, J F, Et al (2006). Chemical Composition of the Essential Oil from the Leaves of Juniperus phoenicea L. from North Africa. J. of Essential Oil Research. 18 (2): 168- 169

Bekhechi C. Attk- Bekkara F. Abdelouhib D.E. (2008) .Composition et activité antimicrobienne des huiles essentielles de origanum glandulosum d'Algerie- phytotherapie . 6 : 153-159.

Bellaiche P. (1979). Aromatogramme. In Traité de phytotherapie et d'aromathérapie. Edition Maloine-S-A, tome I. pp. 9-20.

Bellakhder J. (1997). La pharmacopée marocaine traditionnelle. Ed :lbis press Paris , P 272 Belletti, N., Ndagihimana M., Sisto C., Guerzoni M., Lanciotti R.and Gardini F., (2004). Evaluation of the Antimicrobial Activity of Citrus Essences on Saccharomyces Cerevisae. J. Agric. Food Chem., 52: 6932-6938

Belyagoubi L-M (2006). Effet de quelques essences végétales sur la croissance des moisissures de détérioration de céréales. Thèse magistère. Université de Tlemcen. Benidicte F, Hooper D.C. (1998). Effect of mutation in GRIA of topoisomerase IV, from staphulococcus aureus on quinplene . ang. 42(8): 2109- 2112.

Benkiki N. (2006). Etude phytochimiques des plantes médicinales Algérienne : Ruta montana, Matricaria pubescences et Hypericum perfoliatum Thèse de Doctorat .Université de BATNA.

De Billerbeck V.-G., Roques1 C., Vanière P.,. Marquier P (2002) .Activité antibactérienne et antifongique de produits à base d'huiles essentielles ; HYGIENES - X (3) : 248- 251 Bonnier G., Douin R., (1990). La grande flore. Ed : Belin, Paris.

Bourkhiss, M., Hnach M., Bourkhiss B., Ouhssine M. and Chaouch A. ( 2007). Composition chimique et propriétés antimicrobiennes de l'huile essentielle extraite des feuilles de Tetraclinis articulata (Vahl) du Maroc. African Sci., 03: 232-242

Bosio K, Avanzini C, D'avolio A, Ozimo O, Savoia D (2000) . In vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes. Lett Appl Microbiol 31: 174-177.

Bouzabata A., Hadef Y., (2009) .Variability of the Yield and the Chemical Composition of Essential Oils of Juniperus Phoenicea L. coming from two regions of Algeria . TJMPNP. 2: 1-9.

Bouzouita N., Kachouri F., Ben Halima M., Chaabouni MM. (2008). Composition chimique et activité antioxydante, antimicrobienne et insecticide de l'huile essentielle de Juniperus phoenicea. Société Chimique de Tunisie. 10 : 119 - 125.

Bravo L., (1998). Polyphenols : chemistry, dietary sources, metabolisme, and nutritional signifiance ; nutrition reviews ; 56(11) : 317-333.

Bruneton J. (1999). Pharmacognosie : phytochimie, plantes médicinales. 3^e Ed : Lavoisier ; Paris. P.1120 .

Bruneton J. (2009). Pharmacognosie : phytochimie, plantes médicinales. 4^e Ed : Lavoisier ; Paris. P.1269

Buchbauer G. (2000). The detailes analysis of Essential Oil Leads to The Understanding of Their Properties . Perfumer & Flavorist . 25 : 64-67 .

Buhagaiar, J. A.; Podesta, M. T.; Wilson, A. P.; Micallef, M. J.; and Ali, S. (1999). The induction of apoptosis in human melanoma, breast and ovarian cancer cell lines using an essential oil extract from the conifer Tetraclinis articulata. Anticancer Res. 19 (6B): 5435-43.

Cairnes, DA., Ekundayo, O. and Kingston, DGI. (1980). Plant anticancer agents. X. Lignans from Juniperus phoenicea. J. Nat. Prod. 43:495-497.

Carillon E. (2000). La phytothérapie face à l'évolution médicinale. Ed :Phyto . 10-15. Cavaleiro C., Pinto E, Goncalves M.J. and Salgueiro L. (2006), Antifungal activity of Juniperus essential oils against dermatophyte, Aspergillus and Candida strains, Journal of Applied Microbiology ISSN, 100:1333-133.

Charpentier B., Florence H-L., Alain H. (2008). Guide du préparateur en pharmacie 3em Edition Masson. p.1358.

Comte G., Allais D.P., Chulia A.J., Vercauteren J., Bosso C., (1996). Phoeniceroside, The First Natural Bis-Furanone Propane Derivative From Juniperus phoenicea L. Tetrahedron letters. 37 (17) : 2955-2960 .

Phenylpropanoids From Leaves Of Juniperus phoenicea . Phytochemistry. 45 (8):1679-1682. Comte G., Vekcauteren J., Chulia AJ., Allais DP. Delage C and Pinaud N. (1997). Three Phenylpropanoids From Juniperus phoenicea . Phytochemistry. 44 (6) : 1167-1173

Colette-Keller D. (2004). Les plantes médicinales. ALS (séance du 25 Avril 2004). P 58. Cosentino, S., Barra, A., Pisano, B., Cabisa, M., Pirisi, F. and Palmas, M. (2003) Composition and antimicrobial proprieties of Sardinian Juniperus essential oils against food borne pathogens and spoilage microorganisms. J Food Prot .66 : 1288-1291.

Cosentino S., Tuberoso CIG., Lisano B. et al (1999). Sarinian Thymus essential oils. Letters in Applied Microbiology.29:130-135.

Cowan M-M (1999) . Plant Products As Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews. 12 (4) : 564 582.

Cox S.D., Mann C.M., et al (2000). The mode of antimicrobial action of essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil) - Journal of applied Microbiology. 88( 1) : 170-175.

Dawidar, A. M., Ezmirly, S. T. and Abdel-Mogib, M. (1991). Sesquiterpenes and diterpenes from Juniperus phoenicea L. Pharmazie., 46 :472-473.

Decaux I. (2002). Phytothérapie : Mode d'emploie. Ed : Le bien public. Pp 6 Delaquis, P.J., Stanich K., Girard B.and Mazza G., (2001). Antimicrobial activity of

individual and mixed fractions of dill, cilantro, coriander and eucalyptus essential oils. Int. J. Food Microbiol., 74: 101-109

Derwich, E., Z. Benziane, Taouil R., Senhadji O., and Touzani M., (2010a). A Comparative Study of The Chimical Composition of The Leaves Volatil Oil of Juniperus phoenicea and Juniperus oxycedrus . Middl-East J.Res . 5(5): 416-424

Derwich, E.,. Benziane Z. and Boukir A., (2010b). Chemical composition of leaf essential oil of Juniperus phoenicea and evaluation of its antibacterial activity. Int. J. Agric. Biol., 12: 199-204.

Derwich E., Benziane Z. and Chabir R. (2011). Aromatic And Medicinal Plants Of Morocco: Chemical Composition of Essential Oils of Rosmarinus Officinalis And Juniperus phoenicea. IJABPT . 2(1):145-153.

Dob T., Dahmane D., Chelghoum C. ( 2008). Chemical Composition of the Essential Oil of Juniperus phoenicea L. from Algeria. Journal of essential oil. 20 (1): 15-20

Domaracky M., Rehak P., Juhas S., Koppel J.(2007).Effets of selected plant essential oils on the Growth and development of Mouse preimplentation Embryos in vitro Physiol.Res. 56: 97-104.

Dorman H.J.D., Deans S.G. (2000) .Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. - J. Appl. Microbiol. 88, 308-316

El-Sawi, S.A., Motawae, H.M. and Amal, M.A. (2007). Chemical Composition, Cytotoxic Activity and Antimicrobial Activity of Essential oils of leaves and berries of Juniperus phoenicea. Grown in Egypt. African J.of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 4(4) : 417-426

El- Sawi S.A. et Motawe H.M. (2008) .Labdane, Pimarane And Abietane Diterpenes From The Fruits Of Juniperus Phoenicea L. Grown In Egypt And Their Activities Against Human liver Carcinoma. Canadian Journal Of Pure And Applied Sciences .2( 1) : 115-122, Ennajar, M., Bouajila, J., Lebrihi, A., Mathieu, F., Abderraba, M., Raies, A. and Romdhane, M. (2009), Chemical Composition and Antimicrobial and Antioxidant Activities

of Essential Oils and Various Extracts of Juniperus phoenicea L. (Cupressacees). Journal of Food Science, 74: 364-371.

Escola A.R. & Askew R. R. (2009). Chalcidoidea (Hymenoptera) Reared From Fruits Of Juniperus Phoenicea, With Descriptions Of Three New Species. Boletín Sociedad Entomológica Aragonesa.45 : 109-121.

Fauchère, J.-L. et J.-L. Avril (2002). "Bactériologie générale et médicale" Ellipses Editions Paris. P 365.

Ferhat M. (2009) . Recherche de substances bio actives de Centaurea microcarpa coss et dur. Diplôme étude supérieur de biochimie Université de M'sila .

Fouché GP. , Marquet A. et Hambuckers A. (2000). Les plantes medicinale : de la plante au médicament. Exposition temporaire de 19.09 au 30.09.2000.

Garreta R. (2007). Des simples à l'essentiels : De l'herboriste à l'aromathérapie. Edition les Anthropologiques, Toulouse. P. 367.

Garrett R- H., Grisham Charles M.(2000). Les transports membranaires. In Biochimie. Ed DeBoeck. Pp 314.

Ghedira K. (2005). Les flavonoides : Structure, Propriétés Biologiques, Roles Prophylactiques et Emploie en Therapeutie . Phytothérapie. 4 : 162- 169.

Ghrabi Z., (2001) : La végétation de la zone littorale de Zouarâa. APAL. 25 p.

Glordani R. Kaloustian J. (2006). Action anticandidosique des huiles essentielles: leur utilisation concomitante avec des médicaments antifongiques. Phytothérapie.3 :121-124. Goli, A. H., Barzegar, M., & Sahari, M. A. (2004). Antioxidant activity and total phenolic compounds of pistachio (Pistachia vera) hull extracts. Food Chemistry, 92: 521-52

Haddouchi F., Benmansour A. (2008). Les Huiles Essentielles, Utilisation Et Activités Biologiques, Application de Deux Plantes Aromatiques. Les technologies de laboratoire. 8: 20-27.

Hajji, F. , Fkih-Tetouani S and. Tantaoui-Elaraki A.,(1993). Antimicrobial activity of twenty one Eucalyptus essential oils. Fitoterapia. L XIV., 1: 71-78

Harbone J.B. (1998). Phytochemical methods a guide to moderns techniques of plants analysis, 3^rd edition. p. 412.

Hayouni EA., Abedrabba M., Bouix M., Hamdi M. (2007). The effects of solvents and extraction method on the phenolic contents and biological activities in vitro of Tunisian Quercus coccifera L. and Juniperus phoenicea L. fruit extracts . Food Chemistry, 10 :10-16 Hong Yao, Bin Wu, Yiyucheng, Haibin Qu., (2009). High throughput chemiluninescence platform for evaluating antioxydative activity of total flavonoid glycosides from plant extracts. Food chemistry.115:380-386.

Huguette M. (2008). La route des épices, aromat, condiments et mélange d'épices. Ed : sang de la terre, Paris. p 190.

Iserin P., (2001). Encyclopedie des plantes medicinales. Ed : Larousse Bourdasse .Paris . p.335

Ismail H. ; Lemriss S. ; Ben Aoun Z.; Mhadhebi L. ; Dellai A.; Kacem Y.; Boiron P.; Bouraoui A. (2008). . Antifungal activity of aqueous and methanolic extracts from the Mediterranean sea cucumber, Holothuria polii. 18 (1) : 23-26

Joffin JN., Leyral G (2006). Microbiologie technique 1 dictionnaire des techniques. Volume 14 éme Ed. Biologie Technique p. 368

Jones G.A.T.A., McAllister I.A.D. and Cheng K-J. ( 1994). Effect of Sainfoin (Onobrychis viciifolia Scop) Condensed Tannins on Growth And Proteolysis bye four Satains of Rumminal Bacteriat . Applied and Environmental Microbiology. 60 (4): 1374-1378.

Koneman, E.W., Allen S.D., Janda W.M. Schreckenberger., P.C and. Inn W.C,(1997). Color atlas and textbook of diagnostic microbiology hiladelphia: Lippincott-Raven Publ., 13: 785-856.

Kilani S., Abdelwahed A., Ben Ammar R. (2008). Chemical Composition of the Essential Oil of Juniperus phoenicea L. from Algeria. Journal of essential oil. 20: 695-700

Kim, K., Kim Y., Yu H., Jeong S., Cha J., Kil B.and You Y., (2003). Antibacterial activity and chemical composition of essential oil of Chrysanthemum boreale. Planta Med., 69: 274- 277

Lahlou M. (2004). Methods to study the phytochemistry and bioactivity of the essential oilsphytotherapy research. 18: 435-448.

Lambert R-J., Skandamis P-N. (2001).A study of the minimum concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol . Journal of applied Microbilogy . 91(3) : 453- 462.

Lamnaouer D. (2002). Conduite d'essais d'extraction et d'analyse des huiles essentielles et des principes actifs des plantes médicinales et aromatiques. Programme de l'UICN en Afrique du Nord : Phase III ; 2- 10

Lansing M., Prescott J., Harley P.,. Klein DA. (2003) .Microbiologie. 2eme Edition française : De boeck . 1164 pages

Lugasi A, Hovari J, Sagi K.V and Biro L (2003). The Role of Antioxidant of the Flavonoids Luteolin. Mini-Reviews In Medicinal Chemistry. 9 : 31-59

Maatooq G.T., El-Sharkawy S .H., Afifi M.S. , Risazza J.Pn.(1998). Flavonoid From Cupressaceae Plants. Natural Product Sciences. 4(2) : 9-14

Marfak A. (2003). Radiolyse gamma des flavonoides . étude de leur réactivité avec les raducaux issus des alcools : formation des depsides ; these de Doctorat . Université de Limoges : 23-25.

Marzouk Z., Nefffati A., Marzouk B et al ( 2006) .Chemical composition and antibacterial and antimutgenic activity of Tunisian Rosmarinus officinalis L.oil from Kasrine. Journal of food Agriculture Environment.4:61-65.

Maurice N. (1997). De l'herboristerie d'antan à la phytothérapie moléculaire du XXIe siècle. Ed : Lavoisier, Paris.; 12- 14

Mautrait C. et Raoult R.( 2009) . la préparation : mode d'emploi (officine, sous-traitance et BP). 2eme édition. Porphyre France . P. 468.

Mazari K., Bendinerad N., Benkhechi Ch. et Fernandez X. (2010). Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil isolated from Algerian Juniperus phoenicea L and Cupressus sempervirens . Medicinal Plants Research. 4(10) : 959-964

Mazur M., Boratynska K., Marcysiak K., Gomez D., Tomaszewski D., Didukh J.,Boratynski A., (2003). Morphological variability of Juniperus phoenicea (Cupressacea) from three distant localities on Iberian peninsula . Acta Asocietatis Botanicorum Poloniae. 72 (1) : 71-78

Mebarki N. (2010). Extraction de l'huile essential de thymus fontanesii dt application à la formulation d'une forme medicamenteuse- antimicrobienne. These magister. Université de Boumerdes. Pp 124.

Medini H., Elaissi A., Chraief I., Bannour F., Farhat F., Ben Salah M., Khoudja M., Et Chemli R. (2007). Composition and variability of the essential oils of the leaves from Juniperus phoenicea L. from Tunisia. Revue des region arides. 1: 185-189

Meloni M., Perini D., Filegheddu R., Binelli G, ; (2006) . Genetic Variation in Five Mediterranean Populations of Juniperus phoenicea as Revealed by Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) Markers . Annals of Botany .97: 299-304,

Michalak A.(2006). Phenolic Compounds and their Antioxidant Activity in Plants Growing under Heavy Metal Stress. Polish Journal of Environ . Stud, 15 : 523-530

Moreno-Roohiguez JF., Sotomendivil E.A. et al (2006).Chemical composition and fungicidal activity of the essential oil of .T.Vulgaris against Alternaria citri.Z.Gnosis.4(16). Mukherjee PK. , Sarikha, GS., suresh, B. (2002). Antibactrial potentiel of two differents Hypercum species available in India. Phytothe. Res. 16 : 692 -695

Newall, C., Anderson, L. and Phillipson, J. (1996). Herbal Medicines. A Guide for Health Care Professionals. London: The Pharmaceutical Press

Nguz K. (1996). Evaluation de la degradation des tannins. Phytochimiques . 225-230.

Ourini D., Agouni A. , A.Alaoui MI.,Alaoui K., Alaoui MA et Belabbas MA.(2007) . Activité antifongique de l'acide oleique et des huiles essentielles de thymus saturjoides L.et

de mentha puleguim L. comparé aux antifongiques dans les dermatses nyosiques. Phetothérpie. 1 : 6

Oussala M., Caillet S., Saucier L, Lacroix M.(2006) . Aantimicrobial effect of selected plant essential oils on the growth of a Pseudomonas putida strain isolated from meat. Meat science..73: 236-244.

Perrett S., Whitfield P.J., Sanderson L., Bartelert A. (1995).The plant molluscide Millettia rhortningii ( leguminosae ) as a topical antischistonsomal agent . journal of Ethnopharmacology. 47 : 49-54.

Pibiri M-C. (2006). Assainissement microbiologique de l'aire et des systémes de ventilation au moyen d'huiles essentielles .Thèse doctorat. 36-44

Pierangeli, G., Vital, G. and Windell, R. (2009). Antimicrobial activity and cytotoxicity of Chromolaena odorata (L. f). King and Robinson and Uncaria perrottetii (A. Rich) Merr. Extracts. J. Medicinal Plants Res. 3(7) : 511-518

Pinto, E., Palmeira, A., Salgueiro, L., Cavaleiro, C., Goncalves, M.J., Pina-Vaz, C., Rodrigues, A., Oliveira, S. (2003). Antifungal activity of oregano oils (Lippia graveolens and Origanum virens) on dermatophyte species. Clin Microbiol Infec. 9 (1), 222- 230 Prabuseeninivasan S., Jajacumar M., IIgnacimuthus S. (2006).In vitro antibacterial activity of some plant essential oil. Biomed central complémentart and Alternative Medecine. 6 (39).

Rameau J-C., Mansion D., Dumé G. (2008) .Flore forestière française: Région méditerranéenne. Institue pour le développement forestier. P 2426.

Rezzi S., cavaleiro C., Salgueiro L., Bighelli A., Casanova J., and Proença da Cuncha A., (2001). Intraspecific Chimical Variability of The Leaf Essential Oil of Juniperus phoenicea subsp . turbinata from Corsica . Biochemical systematics and Ecology . 29 : 179- 188

Richter G., (1993). Metabolisme des vegetaux (physiologie et biochimie). Ed : presses polytechnique et universitaire Romandes. P 321.

Riffel A, Medina L-F, Stefani V, Santos R-C, Bizani, Brandelle (2002). In vitro antibacterial Activity of a new series of 1, 4- naphtaquinones. Brazillian journal of medical and biological research. 35(7). 811-818

Robards K, Prenzler P.D, Tueker G, Swatsitang P, And Glover W (1999) ; Antioxidant Properties of Phenolic Compounds . Trends in Plant Science. 2(4) : 152-159

Robert, P.A., Barrero A.F and Lara A., (1996). Comparisons of the Leaf Essential Oils of Juniperus phoenicea. J. Essent. Oil Res., 8: 367-371

Rojas A., Hernandez L., Perrada-Mirranda R., Matg R., (1992). Screening for antibacterial activity of crude drug extract and pure natural products from Mexican medicinal plants . journal of Ethnopharmacology. 35: 275-283.

Rota MC., Herrea A., Martinez C. et al (2008). Antibacterial activity and chemical composition of Thymus vulgaris.T.zygis and.T.lymolis essential oils. Food.control.19:681- 687.

Roquebert M-F. (2002). Les contaminants biologiques des biens culturels. Edition Elsevier. Paris. pp 419.

Salgueiro L.R., Cavaleiro, C., Pinto E., Pina-Vaz C., Rodrigues A.G., Palmeira A.,Tavares C., Costa-Oliveira S. et al. (2003). Chemical composition and antifungal activity of the essential oil of Origanum virens on Candida species. Planta Med. 69: 871-874.

Sanaa A A., Maha ZR., Nabawia AI., Mohga SA, Hayat MS, Magda MM. (2010). Protective role of Juniperus phoenicea and Cupressus sempervirens against CCl4 . World J Gastrointest Pharmacol. 1(6): 123-131

Saule M. (2002) , la grande flore illustrée des pyrenées. Ed RANDO / MILAN. P 730 Scalbert A. (1991). Antibacterial properties of tannins . Phytochemestry . 30 : 3875-3883. Schauenberg P . Ferdinand P. (2006). Guide des plantes médicinales. Ed : Detachaux et Niestlé. P-8

Seigue A. (1985). La foret circumméditerranéenne et ses problèmes. Ed : G.P Maisonneuve et Larose. P- 216.

Service, RF. (1995). Antibiotic that resists resistance. Science. 270: 724- 727

Shkukani H G., Ahmad M. D ., Shomaf M S, et Al Quadan, F.( 2008) Antifertility Effect of Ethanolic Extract of Juniperus phoenica (L.) in Male Albino Rats. Journal of Herbal Pharmacotherapy .7: 179-189

Singleton P. et Sainsbury D. (1984). Chapitre 11. In Bacteriologie. Edition Masson. pp 119- 129.

Sokmen A., Gulluce M., Akpulat HA. et al .(2004). The in vitro antibacterial and antioxidant activity of the essential oils and methanol extracts of endemic thymus spathulifolius Food control .15:627-634.

Suhr K.I. et Nielson P.V. (2003). Antifungal activity of essential oil evaluated by two different application techniques against rye bread spoilage fungi . Journal of Applied Microbiology. 94: 665-674.

Sun, T. & Ho, C. (2005). Antioxidant activities of buckwheat extracts. Food Chemistr. 90: 743-749.

Valero M., Francés E. (2006). Synergistic bactericidal effect of carvacrol cinnamaldehyde or thymol and refregiration to inhibit Bacillus cereus in carrot broth. Food Microbiology . 23: 68-73.

Valnet J. (2007).Plantes aromatiques : Traitement avec les essences de plantes. Edition livre de poche.

Varlet E. (2008). Description des espèces. In découvrez les fruits sauvages. Ed : Elleboresang de la terre. Paris .p 254.

Wang, H., & Helliwell, K. (2001). Determination of flavonols in green and black tea leaves and green tea infusions by high-performance liquid chromatography. Food Research International, 34: 223-227.

Zaika, L. L. (1988). Spices and Herbs - Their Antimicrobial Activity and Its determination. Journal of Food Safety. 9(2): 97-118.

Zuo, Y., Chen, H., & Deng, Y. (2002). Simultaneous determination of catechins, caffeine and gallic acids in green, oolong, black and pu-erh teas using HPLC with photodiode array detector. Talanta, 57:307-316.

Glossaire

Agar : polymère de l'agarose qui rentre dans la composition des milieux de culture solide en microbiologie. Appelé aussi gélose

Antifongique : se dit d'un médicament qui agit contre les infections provoqués par les champignons ou les levures parasites

Anti-inflammatoire : se dit d'un agent, d'un médicament qui fait dégonfler et diminuer l'irritation. La plus part des anti-inflammatoire sont aussi des antidouleurs.

Antioxydant : un antioxydant est une molécule qui diminue ou empêche l'oxydation d'autres substances chimiques

Antiseptique : se dit d'un agent, d'un médicament propre à prévenir les infections.

Arthrite : (du grec arthron : articulation) est une inflammation aiguë ou chronique des articulations dont l'origine est rhumatismale ou infectieuse. Elle ne désigne pas la pathologie répertoriée sous le nom d'arthrose, mais un signe clinique d'une des nombreuses maladies articulaires.

Cytotoxique : se dit d'un agent ou d'un produit qui a un effet nocif sur les cellules.

Insecticide : substance active ou une préparation ayant la propriété de tuer les insectes, leurs larves et/ou leurs Sufs.

Larvicide : substance active ou une préparation ayant la propriété de tuer les larves.

Monoterpéne : sont une classe de terpènes constitués de deux molécules d'isoprène _C5H8 et ont pour formule de base _(C5H8)2. Ils peuvent être linéaire ou contenir des cycles.

Sesquiterpène : sont une classe de terpène formée de 3 unités isoprènes et a comme formule moléculaire _C15H24. Sont présents dans les essences végétales aromatiques ou huiles essentielles,

Annexes

Tableau N°I : les différentes classes des composés phénoliques (Balasundram et al, 2006)

Classe	Structure
1- Phénols simple, benzoquinone	C6	2- Acide hydrox benzoïque
C6-C1	3- Acethophenones,acides phenyllacetique
C6-	4- Acides hudroxycinnamiques, phenylpropanoides (coumarine, isocoumarin, chromones, chroméne)
C6-C3	5- Naphtoquinone
C6-C4	6- Xanthone
C6-C1-C6	7- Anthraquinones
C6--C6	8- Flavonoïdes, isoflavonoides
C6-C3-C6	9- Lignanes, neolignanes 10- biflavonoides
(C6-C3)2	11- Lignine
(C6-C3-C6)2	12- Tannins condensés
(C6-C3)n
	(C6-C3-C6)n

Comme les huiles fixes, les huiles essentielles sont des solvants de l'Iode, mais à la différence des huiles fixes, elles dissolvent le Soufre et le Phosphore en plus de l'iode (Tableau II). Ce caractère souligne l'importance que peuvent avoir les huiles essentielles en désinfection préventive : le fait de dissoudre le soufre et le phosphore leur permet de participer aux réactions biochimiques majeures tant au niveau des membranes que lors de certaines réactions intracellulaires

Tableau N° II: Solubilité de l'iode du soufre et de phosphore dans les huiles essentielles (Roquebert 2002).

Tableau N° III : Résultat de l'activité antibactérienne de l'HE DE J.phoenicea sur milieu solide

Zone d'inhibition (D) souches	Zone d'inhibition (D1) en mm	Zone d'inhibition (D2) en mm	Zone d'inhibition (D3) en mm	Zone d'inhibition des trois tests.
Esherichia coli ATCC 25 928	12 mm	10 mm	06 mm	9,33mm
Pseudomonas aérugenosa ATCC 27853	-	-	-	-
Staphylococcus auréus ATCC 4330D	21 mm	18 mm	11 mm	16,66mm
*Bacillus sp*	17 mm	15 mm	15 mm	15,66 mm

Tableau N^° IV : Résultats de l'activité antibacterienne en fonction du taux de dilution

Tableau N^° V : Résultats de l'activité antifongique des extraits de J.phoenicea :

Souche	Méthode	Extraits
Aspergillus flavus NRRL		HE				CPM	CPD
		D après 24heures		D après 48heure
	Méthode des disques	14mm	17mm	20 mm	14 mm	NT	NT
	Méthode des puits	12mm	10 mm	8 mm	00 mm	-	-
	Microatmosphére	00 mm	00 mm	00 mm	00 mm	NT	NT

Réactifs	Produit	Fabriquant
	Méthanol	PROLABO de France
	NaCl	NM
	NaOH (2N) et HCl (2N)	NM
	H2O2	NM
	Violet de Gentiane - Lugol- Alcool et Fuchsine	NM
Milieux utilisés	Milieu Chapman	Institut Pasteur d'Algérie
	Milieu Hektoen	Institut Pasteur d'Algérie
	Gélose Nutritive (GN) Gélose PCA	Institut Pasteur d'Algérie
	Gélose Mueller- Hinton Bouillon Nutritif	Institut Pasteur d'Algérie
	Gélose Sabouraud	Institut Pasteur d'Algérie

La composition des réactifs et des différents milieux de cultures utilisés (Guiraud et Galsy, 1979 ; Odré et a l, 1982)

Gélose nutritives		Bouillon nutritif
Macération de viande & & & &1 litre (ou eau distillée +extrait de viande) Peptone trypsique& & & & & &15 g NaCl ou KCl& & & & & & & &5 g Agar &&&15 à 20 g pH =7,2		Macération de viande & & & &1 litre (ou eau distillée +extrait de viande Peptone trypsique& & & & & &15 g NaCl ou KCl& & & & & & & &5 g pH =7,2
Mueller-Hinton (g/Litre d'eau distillée)		Chapman (G/litre d'eau distillée)
Infusion de viande de bSuf &&&&.300g Hydrolysat de caséine&&&&&&&17,5 Amidon&&&&&&&&&&&&&1,5 Gélose&&&&&&&&&&&&&...17 pH= 7,4		Peptone&&&&&&&&&&&&...11 Extrait de viande &&&&&&&&...01 Chlorure de sodium&&&&&&&...75 Mannitol&&&&&&&&&&&&.15 Agar&&&&&&&&&&&&&&15 Rouge de phénol&&&&&&&&0,025 pH =7,8
Eau physiologique		Gélose Sabouraud
Eau distillée&&&&&&&&&&..1litre Chlorure de sodium&&&&&&&&.9g pH= 7		Peptone&&&&&&&&&&&&&..10g Glucose&&&&&&&&&&&&&..20g Agar&&&&&&&&&&&&&&...15g Eau distillée 100ml Vitamine et facteurs de croissance pH =6
Hektoen (g/Litre d'eau distillée)	PCA Formule en g/litre d'eau distillée.
Proteose peptone &&&&&. 12	Peptone de caséine&&&&&&&&&5
Extrait de levure&&&&&&&&&&03	Extrait de levure&&&&&&&&&.2,5
Chlorure de sodium&&&&&&&&...05	Glucose&&&&&&&&&&&&&.1
Thiosulfate de sodium&&&&&&&...05	Agar&&&&&&&&&&&&&&.18
Sels biliaire&&&&&&&&&&&&09	pH=7
Citrate de fermmoniacol&&&&&...&1,5
Salicine&&&&&&&&&&&&&..02
Lactose&&&&&&&&&&&&&..12
Saccharose&&&&&&&&&&&&.12
Fushine acide&&&&&&&&&&&0,1
Bleu de bromothymol&&&&&&&0,065
Agar&&&&&&&&&&&&&&...14
pH =7,5

Résumé:

Dans ce travail, l'activité antimicrobienne des composés phénoliques et de l'huile essentielle obtenus à partir de feuilles de Juniperus phoenicea ont été déterminés. Les composés phénoliques ont été obtenus par macération de poudre de feuilles dans le méthanol, et l'huile essentielle de J. phoenicea est obtenue par hydrodistillation, le rendement en huile était de 0,42%. L'activité antimicrobienne est étudiée in vitro sur quatre souches bactériennes de références: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp, et un champignon de référence Aspergillus flavus. Les souches bactériennes et le champignon testés ont été trouvés sensibles à l'huile essentielle, quelle que soit la méthode utilisée lors de l'étude. Exception pour Pseudomonas aeruginosa était la souche résistante. Les composés phénoliques n'avaient pas d'activité sur les souches microbiennes testées.

Mots clés: Juniperus phoenicea; Activité antimicrobienne ; Huiles essentielles ; Composés phénoliques.

Abstract :

In this work, the antimicrobial activity of , phenolic compounds and essential oil obtained from Juniperus phoenicea were determined. phenolic compounds were obtained by maceration of leaf powder in the methanol , and essential oils of J. phoenicea were obtained by hydro-distillation of the leaf .The yield of essential oil of J. phoenicea was 0.42%. Antimicrobial activity was studied in vitro on four bacterial strains references: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp , and one fungal strains references Aspergillus flavus. The bacterial strains and fungi tested were found to be sensitive to essential oils studied, whatever the method used during the study. Except Pseudomonas aeruginosa was resistant. Phenolic compounds against had not activity on the microbial strains tested.

Key Words: Juniperus phoenicea; Antimicrobial activity; Essential oil; Phenolic compound.

Contribution à l'étude de l'activité antimicrobienne du genévrier(Juniperus phoenicea ): essai des huiles essentielles et composés phénoliques