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RÉPUBLIQUE DU BÉNIN
MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE
LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE (MESRS)
UNIVERSITE D'ABOMEY-CALAVI
(UAC)
ECOLE POLYTECHNIQUE D'ABOMEY-CALAVI (EPAC)
DEPARTEMENT DE GENIE DE BIOLOGIE HUMAINE
(GBH)
Option : Analyses Bio-Médicales (ABM)
POUR L'OBTENTION DU
DIPLOME DE LICENCE PROFESSIONNELLE
UTILISATION COMPAREE DE LA GELOSE CHOCOLAT A
BASE
D'HEMOGLOBINE EN GRANULEES ET DE LA GELOSE CHOCOLAT
A BASE DE SANG
DE MOUTON DEFIBRINE POUR LA CULTURE
DE TROIS ESPECES BACTERIENNES
MENINGEES
Présenté et Soutenu par : Sous la Direction
de :
Antoine A. DANSOU
&
Jacques F. SETONDJI
Tuteur:
Mr François HOUNSOU Inspecteur d'action
sanitaire A1 Laboratoire Central/ SNLSP MINISTERE DE LA SANTE
Superviseur :
Dr Honoré BANKOLE Microbiologiste
Maître-Assistant du CAMES EPAC/UAC
Composition du jury :
Président :
Pr Frédéric LOKO, Enseignant
à l'EPAC
Membres :
Dr Honoré BANKOLE, Enseignant à
l'EPAC Dr Lordson DOSSEVI, Enseignant à l'EPAC
Date de soutenance : 23 Septembre 2008
Année Académique 2007-2008
1ère
promotion
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
AU SEIGNEUR DIEU
Tout fut par toi et pour toi
Bénis sois-tu Père
Donne-moi de trouver dans l'exercice de mon métier, la
force et le courage de continuer. Amen.
A mon papa DOSSOU Dansou
« Que de privatisation pour tes enfants ». Je sais
que tant que je t'aurai, je ne manquerai ni de courage, ni de volonté
pour de meilleurs succès. Puisse Dieu te garder afin que tu jouisses des
fruits de ce travail. Je t'aime papa.
A toi ma mère DJIVO Azondékon
Tes conseils sont restés pour chacun de tes enfants la
force d'une réussite certaine de la vie. Aujourd'hui encore un de tes
rêves se réalise. Puisses-tu jouir des fruits de ce travail.
Je t'aime très fort.
A mon grand frère DOSSOU Gilbert
Vous qui avez connu des privatisations, de sacrifices pour que
ma vie soit meilleure ; qui avez été ravi de mon affection alors
que la route m'était encore largue pour la concrétisation de vos
rêves. Recevez toute mon affection et ma reconnaissance à travers
ce travail qui est également le votre.
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
A mes frères et soeurs, particulièrement
: DOSSOU Roger, DOSSOU Albertine, DOSSOU Albert, DOSSOU André
que ce travail soit pour vous un exemple à dépasser. Je compte
sur vous.
A toi DOSSOU Catherine
Je demeurerai toujours très sensible à tes gestes.
Je te prie d'accepter ma reconnaissance la plus sincère.
A mon oncle DOSSOU Adoundjo
Toute ma reconnaissance. Vos prières m'ont beaucoup
aidé.
A tous mes amis particulièrement SETONDJI Jacques,
HOUNSA Sahib et HOUNDJENOU Guy-Martin.
DANSOU A. Antoine
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Jacques Fêmi SETONDJI
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à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
A Dieu le Père tout Puissant
Je ne saurai jamais te remercier pour ton amour et ta
protection sur ma personne. Ce rapport est avant tout ta conception, ta
volonté. Aide-nous à faire davantage mieux.
A la mémoire de mon père SETONDJI Jacques
Que je ne peux sans cesse regretter l'absence. Que ton âme
repose en paix.
A la mémoire de ma mère GASSOGBE Marcelline
Qui pendant toute sa vie s'est battue pour notre réussite. Bon
repos dans l'éternel
A toi DANSOU Antoine
Nous avons su nous comprendre malgré nos multiples
difficultés.
A mes frères et soeurs
Que le Dieu Tout Puissant guide vos pas à accomplir
davantage vos rêves.
A tous mes oncles, tantes, cousins et cousines
Merci pour votre sollicitude et vos conseils.
A tous mes enseignants des cours primaire, secondaire, et
universitaire
Profondes reconnaissance.
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A tous mes amis (es)
Recevez ici l'expression de mon affection.
SETONDJI F Jacques H.
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base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
Nous exprimons avec déférence, notre reconnaissance
à l'Eternel Dieu, la source intarissable de notre vie,
pour tous ses bienfaits.
A notre superviseur Dr BANKOLE Honoré,
Maître Assistant du CAMES EPAC/UAC
Pour avoir accepté de superviser notre travail en
dépit de vos multiples occupations.
Tous les enseignants de L'Ecole Polytechnique
d'Abomey-Calavi (EPAC) particulièrement ceux du Département de
Génie de Biologie Humaine (GBH) pour avoir contribué
à notre formation.
A vous notre tuteur de stage, Mr HOUNSOU
François malgré vos multiples occupations, vous avez
toujours été disponible à nous écouter. Votre
simplicité, votre patience, votre dévouement à la
tâche, votre amour du travail bien fait et votre esprit de
synthèse font de vous un tuteur prestigieux, respecté et
respectable. Profonde gratitude.
A Mme HOUNWANOU Agnès pour la
qualité de l'éducation que vous nous avez donné tout au
long de notre stage.
A Mr DJOSSOU Emmanuel, nous vous remercions pour
nous avoir accepté comme vos enfants.
A tout le personnel du Laboratoire Central
Pour l'esprit de fraternité qui a régné tout
au long de notre stage.
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base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
RESUME
La présente étude a eu pour objectif
d'apprécier la capacité de la gélose chocolat à
base du sang de mouton défibriné par rapport à la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées, à permettre la culture de certaines espèces
bactériennes exigeantes.
Pour ce fait les souches de Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influanzae b ont été
mises en culture sur les deux types de gélose chocolat.
Toutes les trois souches bactériennes ont montré
les mêmes densités de colonies pour les mêmes suspensions
bactériennes sur les deux différents types de gélose
chocolat.
Il est alors possible de substituer la gélose chocolat
à base de l'hémoglobine en granulées à la
gélose chocolat à base du sang de mouton
défibriné.
Mots clés : gélose chocolat, hémoglobine en
granulées, sang de mouton défibriné
SUMMARY
The purpose of this study was to appreciate the perfomance of
the chocolate gelose with defibrine blood of sheep compared to that of
chocolate gelose with heamoglobin in granule, during the culture of certain
species of exacting bacterium.
Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae and
Heemophilus influenzae b stumps were used.
All the three stumps of bacterium have shown same density of
colonies for the same suspension of bacterium on the two different kinds of
chocolate gelose.
Thus, it is possible to substitute the chocolate gelose with
defibrine blood of sheep to the chocolate gelose with heamoglobin in
granule.
Keys word: chocolate gelose, heamoglobin in granule, defibrine
blood of sheep
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LISTE DES ABREVIATIONS
UAC : Université d'Abomey-Calavi
EPAC : Ecole Polytechnique d'Abomey-Calavi
DEDTS : Direction des Explorations Diagnostiques
et de la Transfusion Sanguine
OMS : Organisation Mondiale de la
Santé
LCR : Liquide Céphalo Rachidien
CO2 : Dioxyde de Carbone
NaCl : Chlorure de Sodium ORL :
Oto-Rhino-Laryngologie
Hib : Haemophilus influenzae type b
pH : Potentiel d'Hydrogène
CTA : Cystine-Trypcase Agar TSA :
Trypcase-Soja
PNUD: Programme des Nations Unis pour le
Développement
UNICEF: Fonds des Nations Unies pour
l'Enfance
PBS : Soluté Salin tamponné au
Phosphate
% : pourcent
%o : pourmille
g : gramme
mL : millilitre
uL : microlitre
mm : millimètre
mm3 : millimètre cube
g/L : gramme par litre °C
: degré Celsius
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LISTE DES TABLEAUX
Tableau I : Affection à évoquer en
fonction du nombre de leucocytes dans le LCR.
Tableau II : Germes pouvant être
isolés dans le LCR.
Tableau III : Récapitulatif des germes
utilisés.
Tableau IV : Densités des colonies de
Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné. Tableau V : Densités
des colonies de Neisseria meningitidis W135 "deuxième souche"
sur la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné. Tableau VI : Densités
des colonies de Neisseria meningitidis Y "première souche" sur
la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné. Tableau VII : Densités
des colonies de Neisseria meningitidis Y "deuxième souche" sur
la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné. Tableau VIII : Densités
des colonies de Neisseria meningitidis Y "troisième souche" sur
la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné. Tableau IX : Densité
des colonies de Streptococcus pneumoniae sur la gélose chocolat
à base de l'hémoglobine en granulées et la gélose
chocolat à base du sang de mouton défibriné.
Tableau X : Densités des colonies de
Haemophilus influenzae sur la gélose chocolat à base de
l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat
à base du sang de mouton défibriné.
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LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Réalisation de suspension et
des dilutions à 10-1 et 10-2 Figure 2 :
Culture obtenue avec Neisseria meningitidis W135
"première souche" sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné Figure 3 : Culture obtenue avec
Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées
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trois espèces bactériennes méningées
La plupart des techniques bactériologiques : isolement,
identification, conservation, numération des
bactéries exigent l'utilisation des milieux de culture. Leur
étude est indispensable pour le bactériologiste qui devra choisir
les milieux de culture les mieux adaptés aux recherches
envisagées et aux exigences des bactéries en causes,
interpréter avec un maximum de précision et d'exactitude les
résultats obtenus [6].
Certaines souches responsables de la méningite :
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus
influenzae, bactéries fragiles et exigeantes, ont longtemps
posé aux bactériologistes des problèmes pour leur
isolement et leur conservation en particulier à partir des produits
polymicrobiens. Actuellement, la plupart des fabricants présentent pour
l'isolement de ces germes des milieux d'excellente qualité soit sous
forme « prêt à l'emploi », soit à préparer
à partir de base déshydratée, soit encore sous forme
précoulée en boite de Pétri. Pour ces différents
germes certaines conditions particulières demeurent indispensables pour
obtenir leur culture.
Au cours de notre stage dans la section bactériologique
au laboratoire central nous avons remarqué qu'après l'examen
direct avec l'étude cytologique et la coloration de Gram pour la
recherche des bactéries dans le LCR, il ensemence soit la gélose
chocolat à base de l'hémoglobine en granulés
"commercialisée" soit la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné stérile "maison". Pour des raisons
économiques nous avions choisi faire une étude sur l'utilisation
comparée de la gélose chocolat "commercialisée" et la
gélose chocolat "maison" pour la culture de trois espèces
méningées car la gélose commercialisée revient plus
chère au laboratoire.
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trois espèces bactériennes méningées
Ainsi pour bien poursuivre notre réflexion, nous nous
sommes fixés des objectifs ci-après :
Objectif général
Substituer la gélose chocolat "commercialisée"
à la gélose chocolat "maison".
Objectifs spécifiques
1-Cultiver Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae et Streptococcus pneumoniae sur la gélose
chocolat "commercialisée" et la gélose chocolat "maison".
2-Evaluer et comparer les cultures sur les deux milieux.
Après quelques généralités sur le
cadre de travail, le LCR et les milieux de cultures, tour à tour seront
exposés la méthodologie suivie, les résultats obtenus et
la discussion qui en découle ; ensuite la conclusion et les perspectives
que suscite cette étude. Une liste de références
bibliographiques complètera le document.
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I- PRESENTATION DU LABORATOIRE CENTRAL [5]
Le Laboratoire Central fait office du siège du Service
National des Laboratoires de Santé Publique, l'un des quatre services de
la Direction des Explorations Diagnostiques et de la Transfusion Sanguine
(DEDTS). Il constitue la tête de pont de tous les laboratoires de
santé publique du Bénin et est logé dans l'enceinte du
Ministère de la Santé. Il est chargé de :
· développer et pratiquer toutes les méthodes
d'analyses biologiques dans un but de diagnostic et de recherche ;
· organiser et mettre en oeuvre toutes les
enquêtes de surveillance épidémiologique des maladies en
général et des maladies transmissibles en particulier ;
· pratiquer toutes les analyses de santé publique
(hygiène et environnement) en collaboration avec les structures
concernées ;
· assurer l'organisation des stages pratiques des agents
en provenance des structures agréées de formation ainsi que le
recyclage, la formation en cours d'emploi des techniciens de laboratoire
d'analyses biomédicales.
Il est constitué des sections suivantes : Biochimie,
Bactériologie, Hématologie, Sérologie, Parasitologie,
Hygiène des Eaux et Aliments.
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II- RAPPELS PHYSIOPATHOLOGIQUES DE LCR
II-1- DEFINITION DE LCR [3]
Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide
clair qui baigne les méninges. Il occupe les quatre ventricules
cérébraux et le canal de l'épendyme. A l'état
normal, il est clair comme eau de roche.
II-2-EXAMEN MACROSCOPIQUE DE LCR
II-2-1-Observation lors du prélèvement
[8]
Il est nécessaire, tout d'abord, d'estimer la pression
avec laquelle s'écoule le liquide lors du prélèvement. Il
peut être hypertendu et s'écouler plus rapidement, en gouttes
pressées, voir en jet au moment où on retire le mandrin, dans les
méningites, les arachnoïdites, les blocages ventriculaires ; il est
normotendu s'il s'écoule en goutte à goutte.
II-2-2-Aspect du liquide céphalo-rachidien [2]
-Liquide clair :
· Normalement un LCR se présente comme un liquide
limpide, incolore, « eau de roche »
· Un liquide clair peut cependant être pathologique
car une réaction cellulaire importante est nécessaire pour
créer un trouble visible à l'oeil
nu. (Plus de 300 éléments cellulaires par
mm3)
-Liquide trouble, soit
légèrement opalescent, louche « eau de riz », soit
grisâtre, purulent ou même de teinte verdâtre pouvant
déjà évoquer une étiologie pneumococcique. C'est le
signe d'une réaction leucocytaire importante. Elle traduit
généralement une méningite bactérienne.
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-Liquide hématique, sanglant ou
simplement rosé. Le sang peut provenir :
· de la piqûre d'un vaisseau au moment de la
ponction, le premier tube est alors plus coloré que les deux autres,
· d'une hémorragie méningée, les trois
tubes sont également colorés.
Si tout le LCR a été prélevé dans un
seul tube, laisser sédimenter les hématies ou centrifuger
légèrement.
· Le liquide surnageant est limpide et incolore avec des
caillots au fond du tube, il s'agit d'une piqûre accidentelle.
· Le liquide surnageant est légèrement
rosé avec un caillot hématique non coagulé
constitué d'hématies pouvant être remises en suspension ;
il s'agit d'une hémorragie méningée.
-Liquide xanthochromique : c'est-à-dire
jaune et transparent. Cet aspect peut traduire :
· une hémorragie méningée ancienne
· une compression médullaire
· ictère grave.
II-3-EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DU LCR
II-3-1-Examen cytologique du LCR [2]
L'examen cytologique vise à l'étude
quantitative et qualitative des éléments de la réaction
cellulaire, il doit être réalisé le plus tôt possible
après le prélèvement car les cellules se lysent
rapidement. Ces cellules sont généralement des leucocytes mais
d'autres éléments cellulaires peuvent être observés.
Il regroupe la numération des éléments figurés
(leucocytes et hématies) et l'établissement de la formule
leucocytaire.
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Normalement, il y a moins de 3 leucocytes/mm3 dans
le LCR. La numération est effectuée avec la cellule de Malassez.
Elle consiste surtout à faire une étude quantitative des
leucocytes dont la présence en nombre élevé (>5
leucocytes/mm3), détermine un liquide pathologique. Un tel
résultat nous conduit à l'établissement de la formule
leucocytaire à partir du culot de centrifugation (2000tours/minutes
pendant 10 minutes). Cette étude qualitative offre deux alternatives
:
· Soit la formule est à prédominance des
polynucléaires neutrophiles : il s'agit des méningites
suppurées.
· Soit la formule est à prédominance des
lymphocytes : il s'agit essentiellement des méningites virales, des
méningites tuberculeuses, sans oublier les méningites
bactériennes.
La présence du sang dans le LCR fausse le
résultat de l'examen car les leucocytes auront été
amenés par le sang.
Si le LCR est vraiment sanglant, la numération est
impossible. S'il est simplement rosé, un peu hématique, on peut
néanmoins reconnaître la présence de leucocyte
témoin d'une infection. Pour cela, comparer le nombre des leucocytes et
celui des hématies trouvés dans le LCR. Si leur rapport est le
même que dans le sang périphérique du sujet, les leucocytes
ont été exclusivement apportés par le sang. Si les
globules blancs sont en grand nombre, il traduit une inflammation
méningée.
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Tableau I : Affection à évoquer
en fonction du nombre de leucocytes dans le LCR [8]
Nombres de leucocytes/mm3 Affections à
évoquer
5 à 200/mm3 Trypanosomiase
10 à 100/mm3 Méningite tuberculeuse
(début)
100 à 1000/mm3 Méningite tuberculeuse
(phase
aiguë)
10 à 400/mm3 Syphilis (phase nerveuse)
10 à 1000/mm3 Méningite à
pneumocoque
200 à 1000/mm3 Méningite à
Haemophilus
influenzae
1000 à 2000/mm3 Méningite à
méningocoque
II-3-2-Examen bactériologique
L'examen bactériologique comporte deux étapes :
-L'examen microscopique direct est un temps essentiel,
toujours réalisable sur place. Associé à l'examen
cytologique précédent il fournit un maximum de renseignements.
-La culture bactériologique est réalisable
seulement dans un laboratoire
auquel on adressera le LCR. Les
réponses toujours tardives et les
résultats aléatoires,
dépendent en partie des conditions du transport et
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surtout de sa rapidité. Le laboratoire confirme la nature
du germe et détermine sa sensibilité aux antibiotiques.
L'examen bactériologique est orienté par l'aspect
du LCR et par l'examen cytologique.
· Liquide trouble
L'examen cytologique montre le plus souvent un LCR riche en
polynucléaires plus ou moins altérés. Cependant l'examen
cytologique de certains LCR louches révèle parfois une
lymphocytose. Il s'agit des méningites lymphocytaires à forte
réaction cellulaire.
*Recherche directe des germes
Colorer par la coloration de Gram une des lames
préparées par l'étalement du culot de centrifugation.
Examiner à l'objectif à immersion. Les germes sont parfois
très rares, L'observation doit être prolongée et
minutieuse. Sa négativité n'élimine pas une
étiologie bactérienne. [2]
Les germes les plus fréquemment rencontrés sont
:
-Les pneumocoques (Streptococcus pneumoniae) ; cocci
Gram positifs, lancéolés en flamme de bougie, groupés en
diplocoques, en courtes chaînettes, un halo clair visible autour des
corps bactériens traduit l'existence d'une capsule polysaccharidique
définissant plus de 84 sérotypes. Les germes sont toujours
abondants et accompagnés de polynucléaires. Les pneumocoques sont
des hôtes habituels des voies aériennes supérieures ; Ils
colonisent fréquemment le rhino-pharynx et déclenchent de
fréquentes infections des voies aériennes (otites, sinusites).
Les bactéries peuvent parfois être disséminées par
voie sanguine et donner des méningites, des péritonites, des
arthrites, des endocardites. Sa croissance nécessite des milieux
enrichis [4].
-Les méningocoques (Neisseria meningitidis) :
cocci Gram négatifs, groupés en diplocoques « grain de
café » intra ou extra-cellulaires, peu
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nombreux, souvent rares sur un fond de polynucléaires
intacts ou altérés. C'est un germe fragile (froid, dessiccation)
qui croît sur milieux enrichis en présence de CO2. C'est une
bactérie capsulée, possédant une capsule polysaccharidique
permettant de distinguer 12 sérogroupes (A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z,
29E et W135). Neisseria meningitidis est une
bactérie strictement humaine, retrouvée dans le
rhino-pharynx transmise par voie aérienne. A partir d'un portage dans le
rhino-pharynx très fréquent durant l'hiver, la bactérie
peut passer dans le sang dans un faible pourcentage de cas (septicémie)
et gagner les méninges, produisant une méningite [4].
Une méningite purulente dans laquelle on ne trouve pas de
germe, doit faire suspecter une étiologie méningococcique [2].
- Bacilles de Pfeiffer (Haemophilus influenzae),
petits bacilles Gram négatifs, coccobacillaires intra ou
extra-cellulaires. Haemophilus influenzae est un bacille fragile,
croissant sur milieux enrichis. Il possède une capsule polysaccharidique
avec 6 sérotypes (a, b, c, d, e et f). Le sérotype b est celui
qui pose de loin le plus de problèmes de Santé Publique car il
est le principal responsable d'infections invasives (méningites,
pneumonie, septicémie, arthrites....). Les autres sont responsables
surtout d'otites. Haemophilus influenzae est une bactérie
strictement humaine, transmise par voie aérienne. Les bactéries
colonisant le rhino-pharynx peuvent induire des infections ORL
(otorhino-laryngologie) très fréquentes et parfois pulmonaires
(otites, sinusites, épiglottites, pneumonies). Les bactéries
peuvent disséminer par voie sanguine chez quelques enfants donnant une
septicémie isolée (rare) souvent infectant les méninges
(méningites) ou éventuellement les
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articulations (arthrites). L'association de forme
coccobacillaires, de bâtonnets et de formes longues est relativement
fréquente. [4]
Rappelons que cette méningite à Haemophilus
influenzae est l'apanage des enfants de 3 mois à 3 ans
[2].
D'autres germes peuvent être observés :
- Les staphylocoques, cocci Gram positifs, réguliers de
forme et de taille groupés en amas caractéristique (grappe de
raisin).
- Les streptocoques, cocci Gram positifs plus ou moins
réguliers, disposés en chaînettes.
- Les entérobactéries : bacilles Gram
négatifs.
- Les listeria : bacilles Gram positifs de petites tailles
non sporulés, non capsulés, isolés, groupés par
pair ou en petits « amas palissadiques », intra ou extra-cellulaires.
[2]
Tableau II : Germes pouvant être
isolés dans le LCR [8]
Groupe
|
Gram
|
Aspect
|
Germe
|
|
|
Souvent abondants lancéolés,
|
|
Cocci
|
|
|
|
|
+
|
par deux ou en courtes
chaînettes capsulés
|
Pneumocoque
|
Cocci
|
|
Souvent rares, en grains de
|
|
|
-
|
café, intra ou extra cellulaires
|
Méningocoque
|
Bacille
|
|
|
Haemophilus
|
|
-
|
Intra ou extra cellulaires
|
influenzae
|
Cocci
|
|
|
|
|
+
|
Régulier en amas
|
Staphylocoque
|
Cocci
|
+
|
En chaînette
|
Streptocoque
|
|
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Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Bacille + Isolé ou en palissade, intra ou Listeria
extracellulaire
· Liquide clair [2]
L'examen cytologique montre le plus souvent des lymphocytes,
parfois quelques polynucléaires.
- LCR clair à lymphocytes prédominants :
Deux étiologies dominent :
" Les méningites virales, de loin les plus
fréquentes.
" Les méningites tuberculeuses, relativement rares.
Il ne faut pas omettre la possibilité d'une
méningite bactérienne au début. Le
diagnostic est orienté par le contexte clinique et
relativement par les examens biochimiques.
Si on soupçonne une tuberculose méningée
: effectuer une coloration de Ziehl-Neelsen sur une des lames
d'étalement du culot de centrifugation à la recherche des
bacilles tuberculeux acido-alcoolorésistants. Ce sont des bacilles fins,
grêles gardant la coloration de la fuchsine, le plus souvent
isolés ou en petits amas. En raison de leur rareté, cette
recherche doit être minutieuse et prolongée.
- LCR avec polynucléaires prédominants : Il s'agit
d'une méningite à réaction cellulaire faible :
" Soit parce qu'on se trouve à un stade très
précoce de la méningite purulente. L'examen minutieux du culot de
centrifugation après coloration de Gram, doit s'efforcer de
découvrir le germe en cause.
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à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
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culture de trois espèces bactériennes méningées
v' Soit il s'agit d'une méningite purulente
décapitée par une antibiothérapie.
III- IDENTIFICATION DES PRINCIPAUX GERMES DE LA
MENINGITE BACTERIENNE [7]
III-1- IDENTIFICATION DE Neisseria meningitidis
On obtient de bon résultat avec des cultures de 18-24
heures. Toujours vérifier la pureté de la culture par une
coloration de Gram. Au Gram les méningocoques se présentent comme
des diplocoques négatifs ressemblant à des grains de café.
Faire si nécessaire des repiquages pour obtenir une culture pure. La
recherche de l'oxydase se fait à partir des colonies obtenues sur
gélose au sang par le test de Kovac ; on possède ensuite au
sérogroupage.
-Test de l'oxydase de Kovac
Le test de l'oxydase permet de mettre en évidence un
cytochrome oxydase. Le chlorhydrate de
tétraméthyl-p-phenylène diamine est oxydé en un
composé violet par les bactéries qui possèdent le
système cytochrome C dans leur chaîne respiratoire.
Réalisation du test
A l'aide d'une anse jetable en plastique ou un bâtonnet
de bois, prélever un fragment de la colonie et l'étaler sur une
bandelette de papier filtre imprégnée. Ne pas utiliser d'anse
à nichrome qui peut donner un faux positif.
Lecture des résultats
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Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Une coloration violette qui apparaît dans les dix
secondes indique une réaction positive. Des réactions plus
tardives peu probables avec Neisseria meningitidis. Ce test, utile
pour identifier Neisseria meningitidis, peut aussi
être positif avec d'autres espèces du genre Neisseria, ainsi
qu'avec d'autres espèces bactériennes non apparentées.
-Identification du sérogroupe de Neisseria
meningitidis
On connaît actuellement 12 sérogroupes,
définir par leurs polyosides capsulaires : A, B, C, H, I, K, L, X, Y, Z,
Z' (29E) et W135.
A, B, C, W135 et Y sont les sérogroupes les plus
fréquemment isolés au cours des méningites à
méningocoque. Le sérogroupe A est la cause la plus
fréquente en Afrique et en Asie suivi du sérogroupe C. Les
immunsérum pour la détermination des groupes de Neisseria
meningitidis sont disponibles dans le commerce.
Réalisation du test
-Nettoyer une lame à l'alcool. Diviser la lame en trois
zones de 10 x 4 mm à l'aide d'un crayon gras ou autre marqueur.
-Porter 10 ul de formol à 0,5% salé au bas de
chacune des trois zones. -Prélever un fragment de colonie à la
surface d'une gélose au sang à l'aide d'une anse stérile,
d'une aiguille ou d'un bâtonnet stérile. Emulsionner pour obtenir
une suspension légèrement opalescente.
-En haut de chacune des trois zones de la lame, Ajouter 10 ul de
chacun des immunsérums choisis dans deux des zones et 10 ul de
soluté salin ou de PBS (non formolé) dans la troisième
pour servir de témoin. -Mélanger chacun des antisérums et
le soluté salin avec la suspension à tester, imprimer à la
lame un mouvement de balancier pendant une à deux minutes (le temps peut
varier en fonction du fournisseur de l'antisérum). Lire sous un bon
éclairage et au dessus d'un fond noir.
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Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Lecture des résultats
L'agglutination doit se produire avec un seul des
immunsérums et pas avec le soluté salin. L'agglutination en
soluté salin caractérise les souches autoagglutinables.
L'agglutination avec plusieurs immunsérums en absence d'agglutination
avec le soluté salin caractérise les cultures polyagglutinables.
L'absence d'agglutination avec l'un ou l'autre des immunsérums et avec
le soluté salin caractérise une souche non groupable. Ces
résultats sont rares avec l'isolement fraîchement obtenu du LCR ou
du sang, mais peuvent se voir occasionnellement. Conserver les
immunsérums et le soluté salin PBS au réfrigérateur
à 4°C quand ils ne sont pas utilisés.
III-2-IDENTIFICATION DE Streptococcus pneumoniae
Sur gélose au sang et gélose chocolat, les
colonies de Streptococcus pneumoniae sont petites, grisâtres,
muqueuses (en gouttes de rosée) entourées par une zone
verdâtre d'hémolyse alpha. Une loupe grossissement 3fois ou un
microscope (30x-50x) permet de distinguer les pneumocoques des streptocoques
"viridans" alpha hémolytiques. Les types de colonies sont bombés
quand elles sont jeunes, mais après 24-48 heures le centre des colonies
de pneumocoques se déprime alors que les colonies de streptocoques
"viridans" gardent leur apparence. Pour optimiser les résultats, il est
recommandé de toujours incuber les boites sous CO2.
-Test de sensibilité à
l'optochine
Identification présomptive de Streptococcus
pneumoniae consiste à examiner la sensibilité de la souche
à l'optochine.
Réalisation du test
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Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
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culture de trois espèces bactériennes méningées
-Toucher une colonie suspecte alpha hémolytique avec une
anse stérile et ensemencer en stries sur la gélose au sang.
-Déposer un disque à l'optochine ou un disque
"p" de 6mm de diamètre (contenant 5ug
d'éthylhydrocupréine) à l'extrémité de la
strie, là où a commencé l'ensemencement. Trois ou quatre
colonies peuvent être testées sur la même boite.
-Incuber 18-24 heures à 35°C dans un incubateur
à C O2 ou sous une
cloche à bougie.
Lecture des résultats
Les souches alpha hémolytiques présentant une
zone d'inhibition supérieure à 14mm sont des pneumocoques. Les
souches alpha hémolytiques sans zone d'inhibition sont des streptocoques
"viridans"
III-3-IDENTIFICATION DE Haemophilus influenzae
Des petits bacilles ou coccobacilles Gram négatifs,
qui ne se cultivent qu'en présence des facteurs x et v, qui poussent sur
gélose chocolat et pas sur gélose au sang, qui ont une odeur
âcre d'indole et n'agglutinent pas avec un immunsérum
anti-méningocoque peuvent être Haemophilus influenzae. En
absence de vaccination, la plupart des cas de méningite à
Haemophilus influenzae sont de sérotype b.
-Détermination du sérotype l'
Haemophilus influenzae
La réalisation du test est comparable à celle
décrite pour Neisseria meningitidis, si ce n'est le choix de
l'immunsérum. Les isolements de Hib présumés seront
testés à la fois avec l'immunsérum anti Haemophilus
influenzae type b, un antisérum vis-à-vis de l'un des autres
types et un soluté salin. Une forte réaction positive avec
l'immunsérum anti-b et l'absence de réaction antisérum
dirigé contre un autre type et le soluté
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à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
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culture de trois espèces bactériennes méningées
salin sont des éléments de présomption
en faveur de Haemophilus influenzae type b (Hib). Si l'isolement n'est
pas agglutiné par l'antisérum anti-b, il faut le tester avec un
antisérum polyvalent. En cas de positivité, tester les
sérums monovalents (a, c, d, e, f) pour déterminer le
sérotype. Si le résultat est négatif, la souche est
probablement non typable. La mise en évidence des besoins en facteur x
et v est nécessaire pour confirmer l'identification de Haemophilus
influenzae ou envisager une autre espèce de
l'Haemophilus.
Réalisation du test
-Faire une suspension opalescente de bactéries dans 10ul
de formol à 0,5% salé, après une nuit d'incubation sur
gélose chocolat.
-Transférer une anse (5ul) de la suspension
bactérienne sur une lame nettoyée à l'éthanol
divisée en trois zones.
-Dans chacune des zones ajouter respectivement un même
volume d'un antisérum anti-Hib, d'un antisérum spécifique
d'un type différent, et de soluté salin.
-Mélanger avec un bâtonnet et agiter doucement la
lame par un balancement pendant une minute.
Lecture des résultats
Seules les réactions d'agglutination nette sont
considérées comme positives. Les bactéries sont alors
agglutinées et le liquide de suspension paraît clair. Si une
souche réagit avec plus d'un antisérum, elle est
considérée comme non typable.
IV- LES MILIEUX DE CULTURES
IV-1-DEFINITION
Les milieux de culture sont des supports nutritifs
stériles qui permettent aux microorganismes placés à leur
contact d'y trouver les
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culture de trois espèces bactériennes méningées
divers éléments nécessaires à leur
croissance : source de carbone, source d'azote, aliment
énergétique, oligo-éléments.
IV-2-MODE GENERAL DE PREPARATION [6]
Pour se procurer les milieux de culture qui lui sont
nécessaires le bactériologiste a le choix entre diverses
possibilités, choix tenant compte :
-de l'équipement du laboratoire en personnel et en
matériel,
-du rythme d'utilisation,
-du prix de revient,
-de la nature du milieu,
-des possibilités d'approvisionnement.
Sont actuellement commercialisés :
· Des milieux « prêts à l'emploi
», conditionnés en boite de Pétri (milieu
précoulé) ou en tube ; pour les laboratoires de petite ou moyenne
importance cette solution permet une organisation simple et rationnelle du
travail avec une bonne garantie de qualité.
· Des milieux « prêts à l'emploi
», non conditionnés sous leur forme définitive, mais en
flacon de 30mL à 1L ; le coût est moins élevé que
précédemment, les délais de conservation de milieux plus
longs, mais il faut prévoir un service de préparation plus
important et surtout des possibilités de stockage.
· Des milieux déshydratés qui
réunissent un grand nombre d'avantages : leurs constituants apparaissent
assez constants d'un lot à l'autre, en raison de la fabrication à
grande échelle ; la conservation est
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aisé sous un encombrement restreint ; la
préparation simplifiée peut être confiée à un
personnel moins spécialisé. Un large choix des milieux est
proposé, permettant ainsi une excellente adaptation des méthodes
bactériologiques aux buts envisagés.
IV-3- QALITE DU MILIEU DE CULTURE [6]
Certaines qualités sont indispensables à un milieu
pour favoriser le développement bactérien ; elles concernent :
-La composition : Les éléments
de cultures doivent contenir quantitativement et qualitativement les aliments
exigés pour la croissance et l'entretien des microorganismes et
assimilable par eux :
> Aliments essentiels azotés et carbonés
> Eléments minéraux
> Facteurs de croissance (métabolites essentiels que
la bactérie est incapable de synthétiser)
> Facteurs stimulants ou facteurs de départ dont la
présence accélère le rythme de la multiplication
bactérienne
-Le pH : En général les
bactéries ne se développent qu'à un pH voisin de la
neutralité (7 à 7,6). Certaines espèces non
pathogènes pour l'homme oxydent le thiosulfate et la soude en acide
sulfurique et se développent à un pH voisin de O. A
l'opposé il y a des bactéries qui hydrolysent l'urée et
qui sont productrice d'ammoniaque et qui tolèrent des pH très
alcalin.
Certaines espèces pathogènes tels que les
pseudomonas et les vibrions se développent en milieu alcalin à
l'opposé nous avons les lactobacilles qui sont les bactéries de
la flore de doderlin qui se multiplie au pH 6,3 à 6,5.
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-L'isotonie : Elle comprend pour la plupart
des milieux à celle d'une solution de NaCl à 9%o.
-Le potentiel redox : En ce qui concerne le
potentiel d'oxydo-réduction, les bactéries ont des exigences
strictes, en rapport avec le type respiratoire.
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culture de trois espèces bactériennes méningées
I- MATERIEL
I-1- MATERIEL BIOLOGIQUE
Les échantillons utilisés sont des souches
pures des principaux germes méningés sous surveillances par l'OMS
au Bénin. Ces germes sont conservés dans du lait
écrémé à 10% au congélateur à
-30°C dans la section de bactériologie du Laboratoire Central. Ces
germes sont recensés dans le tableau ci-après :
Tableau III : Récapitulatif des
germes utilisés
Germes Nombre de souches
2
Neisseria meningitidis W135
3
Neisseria meningitidis Y
1
Streptococcus pneumoniae
Haemophilus influenzae 1
I-2- AUTRE MATERIEL -Balance
-Bec bunsen
-Bouteille à gaz
-Autoclave
-Etuve
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-Vortex (agitateur)
-Minuterie -Bain-marie -Microscope -Congélateur
-Réfrigérateur -Huiles à immersion
-Violet de gentiane
-Lugol
-Fuchsine -Alcool
-Eau physiologique
-Eau distillée
-Boite de milieu déshydraté
-Hémoglobine en granulées
-Sang défibriné stérile de mouton
-Polyvitex (vitamine)
-Eau de robinet.
-Pipettes stériles de 2mL
-Pipettes stériles de 10mL
-Marqueurs -Cuillères
-Anse
- Pinces
- Lames
-Lamelles -Bougie
-Jarre
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-Portoirs pour les tubes
-Poire à pipeter
- Seringues
- Tubes
-Baguette
-Râtelier
-Allumette
-Eprouvette graduée de 500mL -Casserole
-Flacons propres stériles
-Boites de Pétri
-Bande de contrôle de stérilité -Stylo
à bille
- Etiquettes
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II- METHODES
II-1- TECHNIQUE DE PREPARATION DE LA GELOSE
CHOCOLAT
II-1-1- A partir du trypcase-soja et de
l'hémoglobine en granulées
La gélose trypcase-soja est utilisée à
double concentration.
-Mettre en suspension 16g de la gélose TSA dans 200mL
d'eau distillée dans une casserole et bien
homogénéiser.
-Chauffer à l'aide de la flamme du bec bunsen
jusqu'à la dissolution complète en agitant fréquemment
avec une baguette.
-Laisser bouillir 1 à 2 minutes.
-Repartir la solution dans des flacons stériles.
-Mettre en suspension dans un flacon stérile 4g
d'hémoglobine en granulées soluble dans 200mL d'eau
distillée. Mélanger l'hémoglobine avec quelques
millilitres d'eau distillée jusqu'à l'obtention d'une pâte
lisse. Tout en mélangeant, ajouter progressivement l'eau
distillée restante jusqu'à la formation d'une solution
homogène.
-Autoclaver les flacons à 121°C pendant 45 minutes
puis les ramenés à 50°C.
-Ajouter aseptiquement 200mL de la solution
d'hémoglobine, 4mL de polyvitex (soit 1mL de polyvitex pour 100mL de
milieu) à 200mL de la solution de base TSA.
-Mélanger délicatement, mais soigneusement pour
éviter la formation de bulles d'air dans la gélose (Faire de lent
mouvement de 8 sur la paillasse).
-Couler la gélose dans des boites de Pétri avec
une épaisseur de 4mm. -Laisser solidifier à la température
ambiante.
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-Emballer les boites coulées dans un papier aluminium et
conserver à 4°C pour une utilisation ultérieure.
II-1-2- A partir de la gélose trypcase-soja et du
sang de mouton défibriné
-Mettre en suspension 16g de la gélose TSA dans 400mL
d'eau distillée et bien homogénéiser.
-Chauffer à l'aide de la flamme du bec bunsen
jusqu'à dissolution complète en agitant fréquemment avec
une baguette.
-Laisser bouillir 1 à 2 minutes.
-Le répartir dans un flacon stérile.
-Autoclaver à 121°C pendant 45 minutes puis laisser
refroidir à 50°C. -Ajouter 20mL du sang de mouton
défibriné.
-Placer le mélange au bain-marie à 80°C
pendant 15 minutes tout en homogénéisant de temps en temps.
-Ramener à 50°C et ajouter 4mL de polyvitex.
-Mélanger les ingrédients en évitant la
formation de bulles d'air.
-Couler la gélose dans des boîtes de Pétri
avec une épaisseur de 4 mm. -Laisser solidifier à la
température ambiante.
-Emballer dans un papier aluminium et conserver à
4°C pour une utilisation ultérieure.
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II-2-CONTROLE DE STERILITE
Après la préparation des milieux, nous avons
incubé une de chacune des boîtes coulées à
l'étuve pendant 24 heures.
La présence de souillure entraîne le rejet de la
gélose.
II-3- REPIQUAGE DES SOUCHES
A partir des souches précédemment retenues,
sept boites de gélose chocolat du laboratoire ont été
ensemencées. L'inoculum utilisé a été
ensemencé de telle sorte que le tiers de chaque plaque de gélose
ait été ensemencé en stries serrées puis le reste
en stries de manière à obtenir des colonies isolées. Les
plaques de gélose ont été placées en
anaérobiose et incubées à 35°C pendant 24 heures.
II-4- CONTROLE DES SOUCHES
Un contrôle a été réalisé
sur les colonies qui se sont développées sur la gélose
chocolat. Pour ce faire des frottis ont été
réalisés puis colorés au Gram.
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II-5- REALISATION DES SUSPENSIONS ET CULTURES
II-5-1- Réalisation des suspensions
Pour chacune des espèces, nous avons
réalisé une suspension en prenant une colonie qui a
été émulsionnée dans 10mL d'eau physiologique
stérile. A partir de cette suspension deux dilutions dont l'une à
10-1 et l'autre à 10-2 ont été
réalisées (Figure 3 page 25).
10mL d'eau
9mL d'eau
1mL 1mL
9mL d'eau
Physiologique physiologique physiologique
stérile stérile stérile
Suspension Suspension Suspension
initiale au 1/10ème au 1/100ème
Figure 1 : Réalisation de suspension et
des dilutions 10-1 et 10-2
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II-5-2- Culture
A partir de chacune des suspensions et des dilutions, nous
avons ensemencé des plaques de gélose chocolat à base de
l'hémoglobine en granulées et de gélose chocolat à
base du sang de mouton défibriné.
Technique
-Disposer les plaques de gélose à ensemencer sur
la paillasse.
-Diviser les plaques de gélose par le dos de la boite de
Petri en trois bandes parallèles au moyen d'un marqueur.
-Numéroter les bandes : 1, 2 et 3.
-Ensemencer la suspension initiale sur la bande 1, la dilution
10-1 sur la
bande 2.et la dilution 10-2 sur la bande 3.
-Incuber à 35°C en anaérobiose pendant 24
heures.
Après incubation, la densité des colonies sur
les plaques de gélose a été évaluée à
l'aide d'une carte modèle d'identification de la densité des
colonies pour la numération des bactéries (Voir annexe1).
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I- RESULTATS
Figure 2: Culture obtenue avec Neisseria
meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat
à base du sang de mouton défibriné.
Figure 3: Culture obtenue avec Neisseria
meningitidis W135 "première souche" sur la gélose chocolat
à base de l'hémoglobine en granulées.
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Tableau IV : Densités des colonies de
Neisseria meningitidis W135 "première souche" sur la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné.
Géloses Gélose chocolat à Gélose
chocolat à
base de l'hémoglobine base du sang de
Suspensions en granulées mouton
défibriné
Initiale 106 106
1 /10 105 105
1/100 103 103
Après 24 heures de culture, Neisseria
meningitidis W135 "première souche" a montré les mêmes
densités de colonies pour les mêmes suspensions
bactériennes sur les deux différents types de géloses
chocolat.
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Tableau V : Densités des colonies de
Neisseria meningitidis W135 "deuxième souche" sur la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné.
Géloses
Suspensions
Gélose chocolat à
base de
l'hémoglobine
en granulées
Gélose chocolat à
base du sang de
mouton
défibriné
Initiale
|
106
|
106
|
1 /10
|
105
|
105
|
1/100
|
103
|
103
|
|
Après 24 heures de culture, Neisseria
meningitidis W135 "deuxième souche" a montré les mêmes
densités de colonies pour les mêmes suspensions
bactériennes sur les deux différents types de géloses
chocolat.
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chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Tableau VI : Densités des colonies de
Neisseria meningitidis Y "première souche" sur la gélose
chocolat à base de l'hémoglobine et sur la gélose chocolat
à base du sang de mouton défibriné.
Géloses Gélose chocolat à Gélose
chocolat à
base de l'hémoglobine base du sang de
Suspensions en granulées mouton
défibriné
Initiale 105 105
1 /10 104 104
1/100 102 102
Après 24 heures de culture, Neisseria
meningitidis Y "première souche" a montré les mêmes
densités de colonies pour les mêmes suspensions
bactériennes sur les deux différents types de géloses
chocolat.
34
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Tableau VII : Densités des colonies
de Neisseria meningitidis Y "deuxième souche" sur la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine et sur la
gélose chocolat à base de sang défibriné de
mouton.
Géloses Gélose chocolat à Gélose
chocolat à
base de l'hémoglobine base du sang de
Suspensions en granulées mouton
défibriné
Initiale 105 105
1 /10 105 105
1/100 103 103
Après 24 heures de culture, Neisseria
meningitidis Y "deuxième souche" a montré les mêmes
densités de colonies pour les mêmes suspensions
bactériennes sur les deux différents types de géloses
chocolat.
35
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Tableau VIII : Densités des colonies
de Neisseria meningitidis Y "troisième souche" sur la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées et sur la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné.
Géloses Gélose chocolat à Gélose
chocolat à
base de l'hémoglobine base du sang de
Suspensions en granulées mouton
défibriné
Initiale 106 106
1 /10 105 105
1/100 103 103
Après 24 heures de culture, Neisseria
meningitidis Y "troisième souche" a montré les mêmes
densités de colonies pour les mêmes suspensions
bactériennes sur les deux différents types de géloses
chocolat.
36
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Tableau IX : Densités des colonies de
Streptococcus pneumoniae sur la gélose chocolat à base
de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat
à base du sang de mouton défibriné.
Géloses
Suspensions
Gélose chocolat à
base de
l'hémoglobine
en granulées
Gélose chocolat à
base du sang de
mouton
défibriné
Initiale
|
102
|
102
|
1 /10
|
0
|
0
|
1/100
|
0
|
0
|
|
Après 24 heures de culture, Streptococcus
pneumoniae a montré les mêmes densités de colonies
pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux
différents types de géloses chocolat.
37
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Tableau X : Densités des colonies
d'Haemophilus influenzae b sur la gélose chocolat à base
de l'hémoglobine en granulées et sur la gélose chocolat
à base du sang de mouton défibriné.
Géloses
Suspensions
Gélose chocolat à
base de
l'hémoglobine
en granulées
Gélose chocolat à
base du sang de
mouton
défibriné
Initiale
|
103
|
103
|
1 /10
|
102
|
102
|
1/100
|
01
|
01
|
|
Après 24 heures de culture, Haemophilus
influenzae b a montré les mêmes densités de colonies
pour les mêmes suspensions bactériennes sur les deux
différents types de géloses chocolat.
38
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
II- COMMENTAIRE
L'objectif général du présent travail
était de substituer la gélose chocolat à base de
l'hémoglobine en granulées "commercialisée" à la
gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné
"maison" pour la culture des bactéries méningées.
La densité des colonies de trois espèces
bactériennes à savoir : Neisseria meningitidis, Streptococcus
pneumoniae, Haemophilus influenzae en culture sur les deux
différents types de gélose chocolat a été
recherchée.
Par rapport à la préparation d'un volume
égal des deux différents types de gélose chocolat, il est
nécessaire d'utiliser les mêmes quantités de la
gélose trypcase soja. Le sang défibriné provenant des
moutons peut être obtenu par le biais des vétérinaires
à des coûts très bas, l'hémoglobine en
granulées est commercialisée. Ce qui rend coûteux la
gélose chocolat à base de l'hémoglobine et ne profite pas
au laboratoire. Notons aussi des risques de formation des grumeaux au moment de
la dissolution de l'hémoglobine.
Les résultats obtenus ont montré une bonne
concordance en ce qui concerne la densité des colonies pour la culture
de ces trois espèces méningées sur les deux types de
gélose chocolat.
De tout ce qui précède nous pouvons bel et bien
substituer la gélose chocolat à base de l'hémoglobine en
granulées "gélose chocolat commercialisée" à la
gélose chocolat à base du sang de mouton défibriné
"gélose chocolat maison".
39
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
40
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Au terme de cette étude, la gélose chocolat
à base de l'hémoglobine en granulées
"commercialisée" et la gélose chocolat à base du sang de
mouton défibriné ont donnée les mêmes
résultats pour la culture des bactéries exigeantes.
Il est alors possibles de substituer la gélose
chocolat à base de l'hémoglobine en granulées à la
gélose chocolat à base du sang de mouton
défibriné.
41
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
42
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat
à base d'hémoglobine en granulées et de la gélose
chocolat à base de sang de mouton défibriné pour la
culture de trois espèces bactériennes méningées
Nous ne pouvons terminer ce travail sans formuler les
suggestions ci-après :
· . A l'endroit des autorités du Ministère de
la Santé et des partenaires au développement sanitaire (OMS,
UNICEF, PNUD) :
v' Favoriser la vulgarisation de ces résultats afin d'en
permettre une utilisation réelle et correcte par les techniciens de
laboratoire.
v' Sensibiliser les techniciens de laboratoire sur
l'importance que révèle l'utilisation de la gélose
chocolat à base du sang de mouton défibriné
stérile.
v' Mettre à la disposition du personnel les
matériels et réactifs adéquats pour le bon fonctionnement
des services de laboratoire
· . A l'endroit des techniciens de laboratoire
v' L'utilisation de la gélose chocolat à base du
sang de mouton défibriné pour le diagnostic des principales
espèces méningées.
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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
1. Anonyme
DIAGNOSTIC Pasteur
Milieux et Réactifs de Laboratoire Pasteur
Microbiologie Immunologie.1987
2. Anonyme
MSP
Formation recyclage des TB pour le diagnostic des maladies
à haut risque épidémique : choléra,
méningite, fièvre jaune.1993
3. LOKO F.
Support de cours de Biochimie clinique 2006. P181.
EPAC-UAC
4. Internet
X. Nassif
Les bactéries des infections bactériennes du
système nerveux central
In BACTERIOLOGIE SYSTEMATIQUE de Faculté de
Médecine Necker-Enfants malades. 2002-2003 P.71-74
Http://www.google.com,
2008
5. Laboratoire Central du Ministère de la Santé
(République du Bénin)
Rapport d'activité 2007. P18
6. MARCHAL N., BOURDON J. L. et RICHARD C. L.
Généralités sur les Milieux
et techniques réservés à l'étude de certains germes
bactériens. In : Les milieux de culture pour l'isolement et
l'identification biochimiques des bactéries. DOIN EDITEURS Paris
1987. PP. 3-21 et 165-440
7. OMS
45
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
Technique de Laboratoire pour le Diagnostic des
Méningites à Neisseria meningitidis, à Streptococcus
pneumoniae et Haemophilus influenzae. 2000. P 71
8. BOUREE P
Liquide céphalo-rachidien in Examen de
laboratoire en Médecine Tropicale. Edition Masson Paris 1987. PP
99-100.
46
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
48
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
ANNEXE 2
BOUILLON TRYPCASE SOJA Formule en g/l d'eau
distillée
-Hydrolysant trypsique-caséine : 17,00 - Peptone papanique
de soja : 3,00 -Chlorure de sodium : 5,00
-Phosphate dipotassique : 2,50
-Glucose : 2,50
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Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
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Utilisation comparée de la gélose chocolat à
base d'hémoglobine en granulées et de la gélose chocolat
à base de sang de mouton défibriné pour la culture de
trois espèces bactériennes méningées
TABLE DES MATIERES
DEUXIEME PARTIE : MATERIELS ET METHODES
DEDICACES i
I- MATERIEL 19
REMERCIEMENTS v
I-1- MATERIEL BIOLOGIQUE 19
SUMMARY vi
I-2- AUTRE MATERIEL 19
LISTE DES ABREVIATIONS vii
II- METHODES 22
LISTE DES TABLEAUX viii
II-1- TECHNIQUES DE PREPARATION DE LA GELOSE
LISTE DES FIGURES ix
22
CHOCOLAT
INTRODUCTION 01
II-1-1-A partir de la trypcase-soja et de
l'hémoglobine en granulées.. 22 PREMIERE PARTIE :
GENERALITES
II-1-2- A partir de la trypcase-soja et du sang de mouton
défibriné 23
I- PRESENTATION DU LABORATOIRE CENTRAL 03
II-2- CONTROLE DE STERILITE 24
II- RAPPELS PHYSIOPATHOLOGIQUES SUR LE LCR
04
II-3- REPIQUAGE DES SOUCHES 24
II-1- DEFINITION DU LCR. 04
II-4- CONTROLE DES SOUCHES 24
II-2- EXAMEN MACROSCOPIQUE DE LCR 04
II-5- REALISATION DES SUSPENSIONS ET CULTURE
25
II-2-1- Observation lors du prélèvement
04
II-5-1- Réalisation des suspensions
25
II-2-2- Aspect du liquide céphalo-rachidien
04
II-5-2- Culture 26
II-3- EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DE LCR. 05
TROISIEME PARTIE : RESULTATS ET COMMENTAIRE
II-3-1- Examen cytologique 05
I- RESULTATS 27
II-3-2- Examen bactériologique 07
II- COMMENTAIRE 35
III- IDENTIFICATION DES PRINCIPAUX GERMES DE LA
12 CONCLUSION 36
MENINGITE BACTERIENNE
SUGGESTIONS 37
III-1- IDENTIFICATION DE Neisseria meningitidis 12
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 38
III-2- IDENTIFICATION DE Streptococcus pneumoniae
14
ANNEXES
III-3- IDENTIFICATION DE Haemophilus influenzae 15
IV- LES MILIEUX DE CULTURE 16
IV-1- DEFINITION 16
IV-2- MODE GENERAL DE PREPARATION 16
IV3- QALITE DU MILIEU DE CULTURE 17
50
Présenté et soutenu par Antoine A. DANSOU et
Jacques Fêmi SETONDJI
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